CORRELAÇÃO ENTRE O CRESCIMENTO … · Em março de 2005, ingressou no curso de Pós-graduação...
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CORRELAÇÃO ENTRE O CRESCIMENTO BACTERIANO EM PLACA COM A CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS (CCS) E A CONTAGEM BACTERIANA TOTAL (CBT) DE LEITE PROVENIENTE DE VACAS COM MASTITE SUBCLÍNICA DO NORTE E NOROESTE FLUMINENSE THIAGO FARIAS DA SILVA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2007
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CORRELAÇÃO ENTRE O CRESCIMENTO BACTERIANO EM PLACA COM A CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS (CCS) E A
CONTAGEM BACTERIANA TOTAL (CBT) DE LEITE PROVENIENTE DE VACAS COM MASTITE SUBCLÍNICA DO NORTE E NOROESTE
FLUMINENSE
THIAGO FARIAS DA SILVA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2007
CORRELAÇÃO ENTRE O CRESCIMENTO BACTERIANO EM PLACA COM A CONTAGEM DE CÉLULAS SOMÁTICAS (CCS) E A
CONTAGEM BACTERIANA TOTAL (CBT) DE LEITE PROVENIENTE DE VACAS COM MASTITE SUBCLÍNICA DO NORTE E NOROESTE
FLUMINENSE
THIAGO FARIAS DA SILVA
“Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal"
Orientador: Prof. Márcio Manhães Folly
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO – 2007
ii
“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo... Qualquer um pode recomeçar agora e fazer um novo fim”
(Francisco Cândido Xavier)
A minha mãe Adélia, pela Educação e Amor que sempre dedicou.
Ao meu pai Paulo Cezar, pelo exemplo de vida e família.
DEDICO
iii
AGRADECIMENTO
Ao Prof. Dr. Márcio Folly, pela orientação, incentivo e exemplo de
profissionalismo.
À CAPES pelo auxílio financeiro durante o Mestrado.
À Claudinha, Gina e Maria de Lourdes, técnicas de laboratório do LSA.
À Helen Monteiro pelo auxílio laboratorial.
Ao Prof. Alberto pela colaboração com as amostras enviadas para Embrapa.
Aos amigos Israel, Marlon, Jorge, Ricardo, Lívia, Catherine, Giselda, Iliani,
Cristina, Ritinha, Giseli, Melissa, Alessa, Fernanda e Carol.
À Prof. Celia Raquel pela colaboração na análise estatística.
À Jovanna e Etiene pelo auxílio, orientação e companheirismo.
Aos Professores do LSA: Olney, Carlos Eurico, Leonardo, Rose, Helena,
Eulógio, Sílvia Regina e Antônio.
Aos produtores de leite da região que permitiram a pesquisa.
Aos meus familiares pelo apoio durante toda a minha vida.
Ao meu irmão Cezar.
À minha namorada Priscila pelo apoio constante e dedicação em todos os
momentos.
A Deus e aos amigos espirituais de caminhada.
muito obrigado!!!
iv
BIOGRAFIA
Thiago Farias da Silva, nascido na cidade de Volta Redonda – RJ no dia 15
de abril do ano de 1980 e filho de Adélia Cristina Pires Farias da Silva e Paulo
Cézar da Silva.
Graduou-se em Medicina Veterinária pela Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro no ano de 2004.
Em março de 2005, ingressou no curso de Pós-graduação em Produção
Animal, mestrado, no Laboratório de Sanidade Animal do Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual Norte Fluminense, em
Campos dos Goytacazes, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do
curso, em fevereiro de 2007.
v
CONTEÚDO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................viii
LISTA DE QUADROS...............................................................................................ix
LISTA DE TABELAS..................................................................................................x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS..............................................................xii
RESUMO..................................................................................................................xiv
ABSTRACT...............................................................................................................xvi
1. INTRODUÇÃO........................................................... ………………………………..1
2. OBJETIVOS..............................................................................................................3
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................4
3.1. A Mastite.............................................................................................................4
3.1.1 Classificação de Mastite ................................................................................... ..5
3.2 Fatores ligados ao hospedeiro............................................................................7
3.2.1 Estágio de lactação.............................................................................................7
vi
3.2.2 Idade, raça e genética ........................................................................................8
3.2.3 Resistência Natural.............................................................................................8
3.3 Fatores ligados ao agente etiológico ................................................................11
3.3.1 Staphylococcus coagulase positivo: .................................................................12
3.4 Fatores ligados ao meio ambiente ....................................................................14
3.4.1 Ordenha ............................................................................................................14
3.4.2 Manejo e Clima .................................................................................................15
3.5 Qualidade e Inocuidade ....................................................................................16
3.6 Qualidade microbiológica do leite .....................................................................17
3.7 Legislação no Brasil ..........................................................................................18
3.8 Células Somáticas.............................................................................................20
3.8.1 Fatores que afetam a contagem de células somáticas ....................................22
3.8.2 Efeitos das células somáticas na produção e composição do leite .................23
3.9 Métodos de Detecção da Mastite......................................................................23
3.9.1 “California Mastitis Test” (CMT)........................................................................23
3.9.2 Contagem Eletrônica de Células Somáticas ....................................................24
3.9.3 Cultura de Amostras do Leite ...........................................................................25
3.9.4 Determinação da Qualidade microbiológica....................................................25
3.9.5 Determinação da contagem bacteriana do leite pelo método de citometria de
fluxo............................................................................................................................26
4. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................29
4.1 Coleta das amostras: ........................................................................................30
4.2 Procedimentos: .................................................................................................32
4.3 Análise estatística: ............................................................................................36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO:.............................................................................38
5.1 Resultados da contagem de células somáticas:...............................................38
5.2 Resultados do crescimento bacteriano em placa: ............................................39
5.3 Resultados da contagem bacteriana total:........................................................40
vii
5.4 Resultados do isolamento bacteriano:..............................................................41
5.5 Correlação entre ECS, ECBT e crescimento qualitativo: .................................47
6. CONCLUSÕES: ......................................................................................................49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ......................................................................50
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Média geométrica de CCS de vacas sem isolamento bacteriano em
diversos estágios de lactação................................................................39
Figura 2 - Contagem bacteriana total em função da temperatura de
armazenamento e da idade das amostras.............................................45
Figura 3 - “California Mastitis Test” com reação 3 cruzes......................................47
Figura 4 - Amostras identificadas com código de barras para CBT.......................48
Figura 5 - Aparelho Somacount 150......................................................................49
Figura 6 - Aparelho Bactocount 150......................................................................50
Figura 7 - Isolamento microbiológico em ágar sangue..........................................51
Figura 8 - Análise microbiológica qualitativa em ágar sangue classificada como
ECRTO=3..............................................................................................53
Figura 9 - Histograma com as médias de CCS e CBT das bactérias isoladas de
amostras de leite obtidas de vacas positivas no CMT...........................63
Figura 10 - Regressão Linear entre ECS e ECBT.................................................65
ix
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Requisitos microbiológicos para leite cru refrigerado a serem atingidos
em diferentes regiões do Brasil.............................................................31
Quadro 2 - Relação entre o escore de células somáticas (ECS) e a contagem de
células somáticas (CCS).......................................................................54
Quadro 3 - Escore do crescimento qualitativo em placas de Petri (ECRTO) dos
microrganismos......................................................................................54
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Contagem de Células Somáticas (CCS) em escore (ECS) das
amostras positivas para o California Mastitis Test (CMT), no período de
abril a dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro..................................................56
Tabela 2 - Crescimento bacteriano qualitativo em placa em escore (ECRTO) das
amostras positivas para o California Mastitis Test, no período de abril a
dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e Noroeste do
Estado do Rio de Janeiro.......................................................................57
Tabela 3 - Contagem bacteriana total das amostras positivas em escore (ECBT)
das amostras positivas para o California Mastitis Test, no período de
abril a dezembro de 2006, do leite de propriedades nas regiões Norte e
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro..................................................58
Tabela 4 - Bactérias isoladas das amostras de leite positivas para o California
Mastitis Test (CMT), no período de Abril a dezembro de 2006, de
propriedades nas regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de
Janeiro...................................................................................................61
xi
Tabela 5 - Médias de CCS e CBT das principais bactérias isoladas das 101
amostras obtidas de vacas positivas no CMT no período de abril a
dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e Noroeste do
Estado do Rio de Janeiro.......................................................................63
Tabela 6 - Correlação entre ECS e os valores de ECBT e crescimento qualitativo
em placa das amostras de leite analisadas, no período de abril a
dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e Noroeste do
Estado do Rio de Janeiro.......................................................................64
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
CMT California Mastitis Test
cel/mL Células por mililitro
CBT Contagem Bacteriana Total
CCS Contagem de Células Somáticas
CBP Contagem Bacteriana em Placa
CCTA Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias
ECS Escore de Células Somáticas
ECBT Escore de Contagem Bacteriana Total
ECRTO Escore de Crescimento qualitativo em placa
Log Logaritmo
IL Interleucinas
Ig Imunoglobulina
IN 51 Instrução Normativa 51
IIMs Infecções Intramamárias
IFN Interferon
TNF Fator de Necrose Tumoral
MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
MG Minas Gerais
NK Natural Killer
xiii
PNMQL Programa Nacional de Melhoria de Qualidade do Leite
ºC Graus Celsius
nm Nanômetros
mL Mililitros
mg Miligrama
Kg Quilograma
rpm Rotações por minuto
RIISPOA Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de
Origem Animal
UENF Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
UFC/mL Unidades Formadoras de Colônias por mililitro
xiv
RESUMO
SILVA, Thiago Farias; M.S. Universidade Estadual do Norte Fluminense. Fevereiro de 2007. Correlação entre o Crescimento Bacteriano em placa com a Contagem de Células Somáticas (CCS) e a Contagem Bacteriana Total (CBT) de leite proveniente de vacas com mastite subclínica do Norte e Noroeste Fluminense; Professor orientador: Márcio Manhães Folly. O objetivo deste trabalho foi estudar a correlação entre os escores de crescimento
bacteriano por zona em placa (ECRTO), escores de Contagem de Células
Somáticas (ECS) e os escores de Contagem Bacteriana Total (ECBT) de leite
proveniente de vacas com mastite subclínica selecionadas pelo teste “California
Mastitis Test” (CMT) com resultado de 3 cruzes. Foram analisadas um total de
101 amostras de leite cru provenientes de vacas primíparas e pluríparas, de
diferentes graus de sangue, pertencentes a 15 propriedades rurais de exploração
leiteira localizadas nas regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro. Os
resultados demonstraram que 72 (71,3%) das 101 amostras apresentaram
valores de CCS acima de 1x106 céls/mL representados pelos escores ECS 7, 8 e
9. Os escores encontrados foram: ECRTO 0 (20,8%); ECRTO 1 (27,72%);
ECRTO 2 (18,81%). Observou-se que as amostras com ECRTO 3
corresponderam a 32,67%. Quanto ao ECBT, 77 (76,33%) amostras
apresentaram resultados acima de 106 UFC/mL e encontravam-se de acordo com
a Instrução Normativa 51 do Ministério da Agricultura, que preconiza a qualidade
do leite, e 24 amostras (23,77%) estavam fora dos padrões da Instrução
xv
Normativa. Das 101 amostras obtidas, Staphylococcus aureus foi o
microrganismo mais isolado (20,8%), seguido por Streptococcus agalactiae
(6,93%), Staphyloccocus coagulase negativos (6,93%), Bacillus sp. (5,94%),
Streptococcus sp. (4,95%), Streptococcus dysgalactiae (4,95%), Corynebacterium
bovis (3,96%) e Staphylococcus sp. (2,97%). Outros microrganismos isolados em
associação totalizaram (8,91%) e 27 (26,73%) amostras de leite não
apresentaram crescimento bacteriano. A correlação entre as características ECS
e ECBT apresentou-se positiva e significativa (0,69). Observou-se coeficientes de
correlação baixos entre ECRTO com ECS (0,13) e ECRTO com ECBT (0,12).
Conclui-se que a relação entre ECS e ECBT do leite de vacas analisadas
individualmente é positiva e o Staphylococcus aureus é o agente predominante
nos casos de mastite subclínica na região Norte e Noroeste Fluminense.
Palavras-chave: Mastite, células somáticas, leite, bovinos, microbiologia.
xvi
ABSTRACT
SILVA, Thiago Farias; M.S. Universidade Estadual do Norte Fluminense. February of 2007. Correlation between scores of bacterial growth by plate zone with scores of somatic cells count (ESCC) and total bacterial count (EBCT) of milk originating from subclinical mastitis dairy cows located in North and Northwest areas of Rio de Janeiro state, Brazil; Guiding: Márcio Manhães Folly.
The main goal of this paper was to study the correlation between scores of
bacterial growth by plate zone (ECRTO), scores of somatic cells count (ESCC)
and scores of total bacterial count (EBCT) of subclinical mastitis dairy cows milk
tested by “California Mastitis Test” (CMT), with 3 plus scores. The study included
milk samples and dualy of then microbial profile. From 101 raw milk samples, from
primiparous and pluriparous cows analyzed, all from different breeding, and from
15 dairy farms, located in North and Northwest areas of Rio de Janeiro state,
Brazil. The results have shown that 72 (71,3%) out of the 101 samples, have
presented SCC values over 1x106 cells/mL and represented by scores ESCC 7, 8
and 9. It’s been noticed that the samples with score ECRTO 3, corresponded to
32,67% and for the following ECRTO which represented the most significant
result scores: ECRTO 0 (20,8%); ECRTO 1 (27,72%); ECRTO 2 (18,81%). The
EBCT, 77 (76,33%) corresponded to results over 106 UFC/mL which is in
agreement to Brazilian federal regulations of Ministério da Agricultura (Agriculture
Ministry of Brazil) that establishes milk quality regulations and 24 samples
(23,77%) were out of standards. From 101 milk samples, Staphylococcus aureus
xvii
was the most prevalent microorganism (20,8%), followed by Streptococcus
agalactiae (6,93%), Staphyloccocus coagulase negative (6,93%), Bacillus sp.
(5,94%), Streptococcus sp. (4,95%), Streptococcus dysgalactiae (4,95%),
Corynebacterium bovis (3,96%) and Staphylococcus sp. (2,97%). Other in
associated microrganisms isolated represented 8,91% and 27 (26,73%) milk
samples had no bacterial growth. The correlation between ESCC and EBCT
characteristics were positive significantly (0,69). A low coefficient correlation
between ECRTO and ESCC (0,13) and ECRTO and EBCT (0,12) was observed.
In conclusion, the relation between ESCC and EBCT of individually studied milk
samples was positive and Staphylococcus aureus is the prevailing agent in
subclinical mastitis in North and Northwest areas of Rio de Janeiro state.
KEY WORDS: Mastitis, somatic cells, milk, cows, microbiology
1
1. INTRODUÇÃO
A qualidade insatisfatória do leite produzido no Brasil é um problema
crônico, em que fatores de ordem social, cultural e econômico estão envolvidos.
Ao se promover uma melhora na qualidade deve-se levar em conta que o
controle inicia-se no processo de produção da fazenda através de aquisição e
manutenção de animais saudáveis e um manejo higiênico e sanitário adequados.
Conseqüentemente, o investimento em qualidade beneficia diretamente a
indústria, o consumidor e o produtor, que recebe melhor pagamento pelo produto,
através de premiação para cada uma das especificações de qualidade. Ao
mesmo tempo, o produtor é beneficiado indiretamente através do diagnóstico e o
combate à mastite, verificado pela quantidade de células somáticas, que levam a
menor perda de produção por vaca (RUBEZ, 2006).
A partir da década de 90 houve grande interesse em utilizar o leite de
tanque para diagnosticar problemas de mastite e qualidade nos rebanhos
leiteiros. Esta é uma ferramenta utilizada em muitos países e que pode trazer
informações sobre a ocorrência de problemas existentes e potenciais, como a
presença de resíduos de antibióticos, aumento na contagem de células somáticas
(CCS) e variações na contagem bacteriana total (CBT) (SANTOS, 2004a).
2
A CCS é um critério mundialmente utilizado por indústrias, produtores e
entidades governamentais para o monitoramento de mastite em nível individual e
de rebanhos e para a avaliação da qualidade do leite. Os resultados da CCS
podem ser obtidos a partir de amostras de quartos mamários (principalmente em
trabalhos de pesquisa), amostras compostas dos quatro quartos (monitoramento
de rebanhos) e de amostras do tanque (monitoramento da qualidade do leite). A
sua utilização como ferramenta para monitoramento de mastite e avaliação da
qualidade do leite teve início no final da década de 1970. A partir de 1992, os
países da União Européia adotaram como limite máximo legal para a CCS do
leite para consumo humano, o valor de 400.000 cel/mL, enquanto no Canadá e
nos EUA, os limites fixados são respectivamente: 500.000 e 750.000 cel/mL,
dependendo da região. A partir de 2005, a Instrução Normativa 51/2002
(Ministério da Agricultura e Pecuária - MAPA) estabeleceu o limite de
1x106céls/mL para o leite de tanques de expansão produzido nas regiões Sul,
Sudeste e Centro-Oeste até o ano de 2008 e as demais regiões até 2010.
(SANTOS, 2006).
3
2. OBJETIVOS
Os objetivos do trabalho foram:
• Analisar a correlação entre o crescimento bacteriano em placa
qualitativo, Contagem de Células Somáticas (CCS) e a Contagem
Bacteriana Total (CBT) de leite proveniente de vacas com mastite
subclínica selecionadas pelo teste “California Mastitis Test” (CMT)
com resultado de 3 cruzes;
• Avaliação microbiológica de amostras de leite cru de vacas com
mastite subclínica identificando os principais microrganismos
causadores da enfermidade;
4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. A Mastite
Mastite é a inflamação da glândula mamária primariamente devido a
infecção por microrganismos, embora estes possam não estar presentes na
ocasião do exame, e é considerada uma doença preocupante do rebanho leiteiro,
capaz de proporcionar grandes prejuízos, não somente pela redução da
produção e descarte do leite e animais, mas também pelas alterações das
características microbiológicas e físico-químicas do leite (TRONCO, 1997) . Esta
doença continua sendo o principal problema para a indústria de laticínios, apesar
de pesquisas na área e esforços para o seu controle (SEARS et al., 1993).
A enfermidade reduz a produção e a qualidade do leite com imensas
perdas econômicas, estimadas em U$200 por vaca/ano nos Estados Unidos
(SMITH e HOGAN, 2001). De acordo com o Conselho Nacional de Mastite dos
EUA (NATIONAL MASTITIS COUNCIL, 1996), em rebanhos para os quais não
são adotadas medidas de controle, cerca de 50% das vacas encontram-se
infectadas, em média, em dois quartos cada. Em relação aos animais, três em
cada dez vacas leiteiras apresentam inflamação clinicamente aparente da
glândula mamária. Entre os animais afetados, 7% são descartados e 1% morre
5
em conseqüência desta doença. Mais de 25% de todas as perdas econômicas
relacionadas às doenças em bovinos leiteiros podem ser diretamente atribuídas à
mastite (CULLOR et al., 1993).
A mastite continua sendo a enfermidade mais cara para a indústria leiteira
mundial, segundo resultados de uma intensiva investigação em rebanhos leiteiros
durante as últimas décadas, quando os tratamentos com antibióticos em todas as
vacas no momento da secagem e todas as mastites clínicas observadas, têm tido
resultados modestamente satisfatórios contra microrganismos contagiosos
(Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae). Porém, a rotina de
tratamento de todas as vacas tem sido criticada, recomendando-se uma terapia
seletiva (com identificação de bactérias), reduzindo-se, assim, os custos de
tratamento e a eliminação indiscriminada de patógenos menores, que estariam
tornando as vacas mais susceptíveis a patógenos ambientais, como coliformes,
geralmente resistentes a todos os antimicrobianos (ERSKINE, 2000).
No Brasil, estima-se que, em função da alta prevalência de mastite nos
rebanhos, possa ocorrer perda de produção entre 12 e 15%, o que significa um
total de 2,8 bilhões de litros/ano em relação à produção anual de 21 bilhões de
litros (FONSECA e SANTOS, 2000). Nos levantamentos feitos em rebanhos
leiteiros de São Paulo e Minas Gerais, 72% das vacas apresentaram mastite
subclínica em pelo menos um quarto e a taxa de quartos afetados foi de 46%. A
porcentagem de animais com mastite clínica foi de 17,45% (COSTA et al., 1995).
Considerando que a mastite subclínica reduz de 3 a 46% a produção de leite no
quarto afetado, pode-se perceber que estes rebanhos estão perdendo, em média,
cerca de 12% da produção de leite em decorrência da mastite. Os prejuízos por
mastite subclínica em propriedades segundo COSTA et al. (1999), nestas
mesmas regiões, correspondem em média a US$332,20 por vaca/ano e
US$21.000,00 por propriedade/ano.
3.1.1 Classificação de Mastite
Para PHILPOT e NICKERSON (2002), praticamente todos os indivíduos
que trabalham com gado leiteiro estão bem familiarizados com a forma clínica da
mastite, devido à sua evidência explícita e à sua fácil identificação, contudo
poucas pessoas têm a consciência da existência e da importância da forma
subclínica da doença. Assim, é fundamental focar a atenção primariamente sobre
6
a mastite subclínica, pois: a) ela é de 15 a 40 vezes mais prevalente do que a
forma clínica; b) usualmente precede a mastite clínica; c) é de longa duração; d)
é de difícil diagnóstico; e) reduz a produção de leite de forma significativa; f)
altera negativamente a composição do leite e; g) constitui um reservatório de
patógenos causadores de mastite que podem disseminar-se para outras vacas
do rebanho.
Nas Infecções Intramamárias (IIMs), a extensão da resposta inflamatória
varia de acordo com a natureza do estímulo e a capacidade de reação do animal.
Reações brandas, sem alterações macroscópicas detectáveis, porém, com
alterações químicas e microbiológicas do leite evidenciam a mastite subclínica,
detectada por testes específicos como o “California Mastitis Test” (CMT) e
Contagem de Células Somáticas (CCS). A mastite clínica resulta em respostas
inflamatórias mais severas com mudanças no aspecto da secreção láctea,
incluindo as alterações verificadas na forma subclínica. Contudo, há visíveis
mudanças no tecido mamário e, alguns efeitos sistêmicos, como hipertermia,
prostação e tremores musculares, conforme menciona HILLERTON (1996).
Nas mastites crônicas, não há ocorrência dos sinais externos do processo
inflamatório e o leite encontra-se aparentemente normal. Os quadros crônicos
são caracterizados pelo aumento de contagem das células somáticas (CCS) no
leite, com presença de células de descamação dos tecidos do úbere e
principalmente pelo afluxo de leucócitos para o quarto mamário afetado. Esta
enfermidade é geralmente de longa duração e pode afetar a vaca durante toda
sua vida produtiva, caso não sejam tomadas medidas efetivas para curá-la
(SARAN, 1986).
A infecção intramamária pode ou não apresentar sinais clínicos durante o
curso da doença, onde casos de mastite clínica podem aparecer no curso de uma
mastite crônica, podendo ainda haver casos agudos de mastite freqüentemente
causados por bactérias ambientais tais como Escherichia coli (BARKEMA et al.,
1999).
Os quadros de mastite prolongada ou crônica levam a contínua mudança
na constituição dos tecidos da glândula e tecidos produtores de leite que são
substituídos por tecidos conjuntivos ou fibrosos tornando o animal
economicamente inviável. A enfermidade do úbere é a reação dos tecidos da
glândula mamária em resposta à agressão provocada com retorno dos tecidos do
7
úbere ao seu desempenho normal e, conseqüentemente, ocorre uma série de
mudanças nos referidos tecidos. Quando ocorre um dano leve desta área ele é
rapidamente recuperável. As lesões mais graves têm por conseqüência a
destruição do tecido produtor de leite no úbere (SARAN, 1986).
3.2 Fatores ligados ao hospedeiro
3.2.1 Estágio de lactação
As IIMs podem suceder-se em diferentes etapas da vida do animal. Parto,
lactogênese e período seco constituem eventos reprodutivos que influenciam na
susceptibilidade à mastite (ELBERS et al., 1998). Durante o período seco, a
glândula mamária passa por uma involução ativa, principalmente nas duas
semanas seguintes à secagem da vaca. De acordo com ANDERSON e CÔTÉ
(2003), estudos demonstraram que 35% de todas as novas infecções ocorrem
durante esse período. PHILPOT e NICKERSON (2002), mencionaram que nessa
fase a glândula continua a secretar leite com o máximo acúmulo ocorrendo dois a
três dias depois de suspensa a remoção do leite; a pressão originada na glândula
promove dilatação do canal da teta, predispondo à entrada de microrganismos
para o interior do órgão. As bactérias não são mais removidas pela ordenha, o
processo de fagocitose não é eficiente em remover os materiais estranhos e a
desinfecção da teta já não é realizada; fatores que favorecem a instalação de
IIMs. Conforme ANDERSON e CÔTÉ (2003), nesse período há outra fase crítica,
que corresponde as duas últimas semanas que antecedem ao parto, quando
ocorre a colostrogênese, processo que acomete alguns mecanismos de defesa;
no início da lactação também há susceptibilidade devido ao estresse sofrido no
parto (glicocorticóides contribuem para menor resposta das células de defesa).
Do ponto de vista microbiológico, BRADLEY e GREEN (2000)
mencionaram que enterobactérias, causadoras de infecções durante o período
seco, têm habilidade em se manterem quiescentes na glândula mamária até o
parto, subseqüentemente, causando mastite clínica durante a fase inicial da
lactação. Na lactação e no processo de ordenha em si há maior susceptibilidade
de difusão de mastite contagiosa, já no período seco e intervalos entre ordenhas
a susceptibilidade recai sobre mastites ambientais.
8
3.2.2 Idade, raça e genética
A conformação da glândula mamária e tetos constituem uma característica
moderada a altamente herdável; tetos planos e cilíndricos são mais susceptíveis
a infecção do que os tetos de formato cônico (mais resistentes). A seleção
genética visando incremento na produção de leite foi acompanhada por aumento
a susceptibilidade às IIMs (PHILPOT e NICKERSON, 2002). NICKERSON
(2001), em investigações sobre mastite em novilhas, verificou uma maior
prevalência das IIMs em animais da raça Jersey (67,7%), quando comparado à
raça Holandesa (35%).
Quanto à idade dos animais, LADEIRA (1998) cita que fêmeas mais velhas
(sete a nove anos) são mais susceptíveis às IIMs devido a lesões internas e
desgaste sofrido pelo esfíncter do teto e pela glândula em si. JONES e BAILEY Jr
(1998) comentaram que a transmissão entre animais pode ocorrer ainda na
puberdade, por meio de amamentação cruzada. WAAGE et al. (2001)
mencionaram que, em novilhas, a presença antes do parto de edema de úbere,
edema de teta, sangue no leite ou vazamento de leite pelos tetos, está associada
com aumento do risco de ocorrência de mastite clínica pós-parto.
3.2.3 Resistência Natural
Uma glândula mamária normal é protegida por uma variedade de
mecanismos de defesa naturais frente às infecções. Esses mecanismos podem
ser não imunológicos (inespecíficos) ou imunológicos (GIRAUDO, 1996). O
primeiro deles está constituído por uma barreira física que inclui o canal e o
esfíncter do teto que possuem propriedades defensivas como um mecanismo de
oclusão relativamente eficiente, a roseta de “Furstenberg” e ainda, proteínas
bactericidas. Um mecanismo adicional de defesa do teto citado por NICKERSON
(1985) e HILLERTON (1996) é o seu revestimento por uma camada de queratina
(composta por células epiteliais descamadas, ácidos graxos e proteínas
catiônicas). Os autores comentaram que há evidências de que a queratina tenha
função de adsorver as bactérias, prendendo-as e removendo-as juntamente com
parte da camada de queratina durante o processo de ordenha.
9
TIZARD (2002) define como “segunda linha de defesa” os mecanismos
químicos e celulares conhecidos de maneira coletiva como imunidade inata ou
natural. Uma capacidade chave da imunidade inata é a resposta defensiva
centralizada do órgão afetado desencadeando uma inflamação. A inflamação, em
resposta às lesões tissulares microbianas, induz aumento de fluxo sangüíneo e
acúmulo de células capazes de destruir invasores. Essas células são neutrófilos
e monócitos (macrófagos na glândula mamária) capazes de fixar, de ingerir e de
destruir substâncias estranhas mediante o processo de fagocitose. Os fagócitos
estimulados expressam proteínas aderentes chamadas “seletinas” e “integrinas”,
podendo migrar desde os tecidos em um mecanismo chamado “quimiotaxia”. A
união do fagócito com a bactéria requer um recobrimento protéico para promover
a ingestão; essas moléculas são as opsoninas, que, no caso da imunidade inata,
correspondem a um tipo de complemento. De acordo com SORDILLO et al.,
(1997) o principal papel dos macrófagos é a sua habilidade de estimular a
migração de polimorfonucleares para o leite através da liberação de citocinas e
leucotrienos.
No sistema imunológico inespecífico existe a participação ativa de
neutrófilos, monócitos, macrófagos e também de um tipo de linfócito chamado de
“célula assassina natural” (NK). Essas células NK atuam mediante mecanismos
citotóxicos ativados por interleucinas sobre células tumorais e, também, por
exemplo, sobre Staphylococcus aureus obtidas do tecido mamário e ativadas in
vitro por interleucinas-2 (SORDILLO et al., 1997).
PAAPE et al., (2000) descrevem as células presentes nas secreções
mamárias e suas características da seguinte maneira: as células que compõe o
leite normal consistem em linfócitos, neutrófilos e macrófagos, assim como
células epiteliais. Pela presença destas últimas, foi criado o termo geral “células
somáticas”; nos quartos mamários livres de infecções, os macrófagos são os
tipos de células predominantes (35-79%), seguido pelos neutrófilos (3-26%),
linfócitos (10-24%) e células epiteliais (2-15%); a porcentagem de neutrófilos
tende a aumentar durante os períodos médio e final da lactação, com diminuição
dos linfócitos; em úberes infectados, a porcentagem de neutrófilos pode
aproximar-se de 100%; a contagem de células somáticas (CCS) de úberes não
infectados é geralmente abaixo de 50.000 céls/ml, porém as vacas com infecções
intramamárias, do tipo subclínica, tendem a contagens maiores.
10
SURIYASATHAPORN et al., (2000) citaram que a presença desses
fagócitos no leite, como células somáticas, aumenta prontamente seguindo-se a
invasão bacteriana, quando agem reconhecendo, ingerindo e destruindo o
material estranho. Fisiologicamente as células somáticas também podem estar
elevadas durante a involução glandular e ainda em condições de estresse (pós-
parto), colostrogênese ou início da lactação. O papel dos neutrófilos é fagocitar e
depois eliminar o patógeno invasor. O número de partículas que um neutrófilo
pode fagocitar e a ativação de um arsenal bactericida varia entre indivíduos e
também com o estágio de lactação (DALEY et al., 1991).
Junto à imunidade inata operam também na glândula mamaria proteínas
bactericidas (fatores solúveis) como complementos do tipo lisozima, sistema
lactoperoxidase-tiocianato e lactoferrina. O complemento é um complexo de
proteínas presentes no soro sangüíneo e no leite, capaz de incrementar a
fagocitose. Sua concentração é alta no colostro e no leite provenientes de vacas
com mastite, porém baixa em leite normal (OLIVER E SORDILLO, 1989).
De acordo com TIZARD (2002), a imunidade adquirida ou específica
constitui um sistema de defesa que não somente reconhece e destrói os
antígenos invasores, mas também retém “memória” do episódio. Se o mesmo
microrganismo invadir pela segunda vez o sistema imunológico, a reação ocorre
com maior prontidão e eficácia. O sistema imunológico adquirido consiste em
duas porções principais que proporcionam resistência aos invasores: uma se
dirige contra os invasores extracelulares, que são destruídos pelas proteínas
chamadas “anticorpos” – denominada imunidade mediada por anticorpos ou
“imunidade humoral” – e a outra como imunidade mediada por células ou
imunidade celular.
Imunidade Humoral – os anticorpos ou imunoglobulinas (Ig) secretados
pelas células plasmáticas são originados desde os linfócitos B. Existem quatro
classes de Ig no bovino IgG, IgM, IgA e IgE, de três subclasses, IgG1, IgG2a e
IgG2b. A função é formar complexos antígeno-anticorpo, com intensificação da
fagocitose, neutralização do antígeno e ativação do sistema de complemento.
Esse último é composto por uma série de proteínas sangüíneas, com interação
de uma cascata enzimática que funciona integrando as respostas inflamatórias
em casos agudos (GIRAUDO, 1996).
11
Imunidade Celular – as células do sistema imune secretam uma grande
variedade de proteínas em resposta aos sinais antigênicos que regulam as
imunorreações, enviando sinais entre células chamadas “citoquinas”. Essas
podem ser: interleucinas (IL1 e IL2), interferons (IFN) e fatores de necrose tumoral
(TNF) que são produzidos no úbere em níveis muito baixos, porém,
desempenham um papel importante estimulando o recrutamento de células para
dentro do úbere após a invasão bacteriana. É também representada
basicamente pelos linfócitos T do tipo CD4 e CD8. As células T possuem, em sua
superfície, uma estrutura de reconhecimento capaz de distinguir determinantes
antigênicos (SORDILLO et al., 1997).
SANTOS (2001) mencionou que, atualmente, são conhecidos dois tipos de
vacinas contra mastite que comprovadamente apresentam efeito positivo (J5
contra mastite causada por coliformes e uma vacina baseada em antígeno
capsular de Staphylococcus aureus) e ambas têm sido eficazes na diminuição da
severidade dos casos clínicos e no aumento da taxa de cura espontânea.
3.3 Fatores ligados ao agente etiológico
A epidemiologia da mastite varia consideravelmente dependendo da
espécie, quantidade, patogenicidade e infectividade do agente envolvido e há
evidências de que os fatores de risco diferem conforme essas características.
Segundo HARMON (1994), mais de 80 diferentes microrganismos foram
identificados como agentes causadores de mastite bovina, sendo que as
espécies mais freqüentemente isoladas são: Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis e
Escherichia coli. Podem ser divididos em dois grupos, baseados na sua origem:
patógenos contagiosos e patógenos ambientais (PEELER et al., 2000).
As do tipo contagioso referem-se às causadas pelas bactérias:
Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, cujo habitat preferencial é o
interior da glândula mamária. Estão associadas às expressivas elevações da
CCS, com maior ocorrência de casos subclínicos, geralmente crônicos e de longa
duração. Os Staphylococcus freqüentemente causam mastite e são encontrados
colonizando a pele da glândula mamária, tetos e lesões nessas áreas, porém,
quartos mamários infectados são os principais reservatórios desses
microrganismos, sendo transmitidos por qualquer forma de contato. Segundo
12
HILLERTON (1996), os Streptococcus agalactiae são os microrganismos melhor
adaptados à glândula mamária e geralmente estão envolvidos em doenças
clínicas agudas e infecções subclínicas persistentes.
3.3.1 Staphylococcus coagulase positivo:
Os estafilococos apresentam-se na forma de cocos Gram-positivos,
isolados ou agrupados em cachos, pares e tétrades. São anaeróbios facultativos,
com maior crescimento sob condições aeróbias, não esporogênicos, produtores
usuais da catalase e imóveis. São bactérias mesófilas que apresentam
temperatura de crescimento na faixa de 7ºC a 47,8ºC (FRANCO e LANDGRAF,
1996). O gênero Staphylococcus é composto por cerca de 27 espécies, sendo
que algumas são freqüentemente associadas a uma ampla variedade de
infecções de caráter oportunista, em seres humanos e animais. Entre as espécies
que se destacam: Staphylococcus aures, S. epidermidis, S. saprophyticus, S.
haemolyticus. Tradicionalmente, os estafilococos são divididos em duas
categorias: coagulase positivos e coagulase negativos. Essa divisão é baseada
na capacidade de coagular o plasma sangüíneo, considerada importante
marcador de patogenicidade dos estafilococos. Entre os coagulase positivos, a
espécie de interesse é o S. aureus (TRABULSI et al., 1999).
O Staphylococcus aureus destaca-se como o microrganismo causador de
mastite contagiosa de maior importância, de maior ocorrência nos rebanhos
mundiais e de tratamento mais difícil devido à elevada resistência aos antibióticos.
Coerentemente, S. aureus é, também, o microrganismo patogênico mais
freqüentemente isolado no leite cru (ZECCONI e HAHN, 2000). Em
levantamentos epidemiológicos nacionais e internacionais, o S. aureus está
presente em cerca de 50% das infecções da glândula mamária dos bovinos
leiteiros (BRABES et al., 1999). Entre as características microbiológicas do S.
aureus, destacam-se as seguintes: são cocos Gram positivos, catalase e
coagulase positivos, β- hemolíticos, maltose e manitol positivos e formadores de
colônias pigmentadas (JAY, 1994). Podem apresentar mudanças nas
características bioquímicas, o que acarreta muitos problemas para o controle das
infecções porque afetam diretamente o sistema imunológico da vaca e sua
suscetibilidade às infecções (ZECCONI e HAHN, 2000). O S. aureus é
13
classificado como microrganismo mesófilo, porém, pode apresentar crescimento
em temperaturas compreendidas entre 7,0 e 47,8º C (JAY, 1994).
Quanto às mastites ambientais, os agentes partilham do mesmo
ecossistema do animal, como o solo, piso, cama, esterco e materiais orgânicos
encontrando um ambiente propício para propagação. Entre eles, sobressaem a
Escherichia coli, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp.,
Staphylococcus sp. coagulase negativo, Streptococcus uberis, Streptococcus
dysgalactiae, Nocardia sp e fungos. Conforme SMITH e HOGAN (2001), a
população bacteriana tende a estacionar seu crescimento em torno de sete a dez
dias, quando há um declínio por exaustão dos nutrientes na cama onde o animal
está instalado. Esses tipos de patógenos não sobrevivem por longos períodos de
tempo na pele dos tetos. Os mesmos autores ainda citaram que colonização por
um grande número de microrganismos reflete a exposição à alta contaminação
ambiental, pois o Streptococcus uberis tem sido isolado da cama, solo, fezes e
urina. Segundo SANTOS (2004b), este microrganismo apresenta características
que causam impactos importantes sobre a qualidade do leite, pois as vacas
apresentando mastite clínica causada por este agente podem ter elevada
contagem bacteriana no leite produzido (até 107 UFC/mL). Além da glândula
mamária de vacas infectadas, esta bactéria pode ser encontrada em diversos
locais do corpo da vaca, como, por exemplo, na superfície da pele, trato genital, e
no solo, esterco e ambiente da vaca. Desta forma, em rebanhos com elevado
número de vacas infectadas por Streptococcus uberis podem ocorrer elevadas
contagens bacterianas (CBT) do leite do tanque. A ocorrência de picos
(aumentos) diários da CBT do leite pode estar associada com elevado nível de
mastite causada por Streptococcus uberis.
As IIMs causadas por patógenos ambientais são mais freqüentes no
período seco em relação ao período lactacional, podendo alguns animais
desenvolver mastite crônica, agindo como reservatório de patógenos (BRADLEY
e GREEN, 2000). PEELER et al. (2000) citaram que agentes da espécie
Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes podem estar ligados a infecções
agudas nesse período e sua importância reside em levar danos e perda de tecido
secretório.
A fonte de água também pode contribuir para disseminação de mastite,
principalmente causada por coliformes, pela contaminação por matéria fecal.
14
Para LANGONI (2000), apresentam-se com maior freqüência na forma clínica,
não estando associados às altas CCS e sua transmissão ocorre principalmente
entre as ordenhas.
3.4 Fatores ligados ao meio ambiente
3.4.1 Ordenha
A quantidade de bactérias existentes sobre a pele dos tetos antes de
colocar as teteiras reflete, ao mesmo tempo, a qualidade do ambiente onde se
movimentam ou permanecem os animais e a efetividade das práticas de higiene
adotadas. As práticas de higiene aplicadas antes da colocação das teteiras têm
como finalidades: diminuir os riscos de penetração de bactérias patogênicas
presentes sobre o teto no interior do úbere; limitar a contaminação bacteriológica
e de sedimentos no leite; contribuir com a estimulação do animal (TAVERNA,
2004).
As rotinas propostas para higienizar os tetos antes da ordenha são
múltiplas e variam desde algumas muito simples, que consistem em não fazer
nada e colocar as teteiras diretamente, até outras mais complexas, que
combinam práticas distintas de lavagem com o uso de desinfetantes e secagem
final. As recomendações associadas a essa prática que limitam a possibilidade
de novas infecções são: as vacas devem ingressar na sala de ordenha com o
úbere limpo e seco. O manejo dos currais, água, corredores e o ingresso na sala
de ordenha constituem papel determinante; os tetos sujos devem ser lavados
com água e imersos numa solução anti-séptica (TAVERNA, 2004). Segundo o
autor, os riscos associados à ordenha e ao funcionamento da ordenhadeira estão
situados esquematicamente em três níveis: contato de bactérias patogênicas com
vacas e tetos sadios; redução das defesas naturais das vacas lesadas na
extremidade do úbere e do canal do teto devido a ordenhas traumatizantes;
penetração de bactérias dentro do canal do teto durante a ordenha através de um
mecanismo físico chamado “refluxo” induzido pela ordenhadeira.
Durante a ordenha, o contato de bactérias patogênicas com tetos sadios
pode ser favorecido pelas mãos do ordenhador, água utilizada, pés sujos ou mal
lavados e as teteiras. Para isso, recomenda-se o uso de roupas apropriadas para
ordenha, utilização de água potável, mãos limpas e unhas cortadas, desinfecção
15
prévia dos tetos (pré-dipping) e imersão das teteiras em solução desinfetante
após a ordenha (TAVERNA, 2004).
3.4.2 Manejo e Clima
As práticas de manejo estão associadas com a susceptibilidade à mastite.
A CCS pode auxiliar na descoberta dos fatores determinantes da enfermidade. A
alta CCS no pós-parto pode indicar que o animal foi exposto à má condição
ambiental (umidade, sujidades, insetos, etc.) antes do parto, ou ao inefetivo
tratamento de infecções no período seco. A alta CCS no decorrer da lactação
pode advir de imprópria prática e/ou equipamento de ordenha (JONES e BAILEY
Jr., 1998).
Para HOGAN e SMITH (2001), as instalações utilizadas assumem
importância. Animais mantidos em baias facilitam as práticas de manejo da
fazenda, porém podem contribuir para a susceptibilidade à mastite, uma vez que
os animais são mantidos sobre cama muitas vezes constituída por material
orgânico, excelente suprimento para os microrganismos ambientais. Sistemas
como “free-stall”, quando mal projetados, deficientes em ventilação e drenagem,
têm conseqüências danosas à saúde da glândula mamária; nessas instalações, a
higiene assume importância primordial.
Para NICKERSON (2001), atenção deve ser dispensada ao combate aos
insetos, uma vez que podem atuar traumatizando os tetos, bem como agindo
como vetores para agentes contaminantes, difundindo as infecções. Vacas
mantidas a pasto, geralmente, têm risco reduzido de contraírem mastite quando
comparadas a animais confinados, entretanto, algumas condições na pastagem,
por exemplo, áreas baixas e alagadiças e/ou sombreadas, forragem grosseira e
áreas de aglomeração de animais, favorecem o desenvolvimento de
microrganismos ambientais e, conseqüentemente, a probabilidade de
contaminações. Atenção deve ser dispensada aos episódios de
retroamamentação e amamentação cruzada em fêmeas jovens, hábitos que
contribuem para o futuro estabelecimento da mastite. PEELER et al. (2000) ainda
comentaram sobre a aquisição de animais que, eventualmente, podem ser
portadores de infecções. Essas fêmeas constituem um fator de risco frente ao
rebanho, pois podem agir como difusoras de patógenos e requerem um manejo
diferenciado.
16
O clima, segundo RADOSTITS et al. (1994), assume importância em
função das mudanças de temperatura e umidade que podem influenciar
indiretamente na tríade de fatores determinantes (hospedeiro, agente e/ou meio
ambiente) que afetam a susceptibilidade à mastite.
3.5 Qualidade e Inocuidade
Os alimentos de origem animal são hoje vistos como problemas
particulares, cada vez mais presentes entre as preocupações dos consumidores.
No atual contexto de globalização de mercados, descuidar da qualidade e da
inocuidade dos produtos lácteos é arriscar a perda dos mercados interno e de
exportação, limitando o crescimento do respectivo setor leiteiro. Inocuidade é a
característica ou propriedade dos alimentos de não causar dano à saúde do
consumidor.
Os conceitos básicos de prevenção e controle da contaminação alimentar
e das doenças transmitidas através dos alimentos sugerem, geralmente,
melhorar a qualidade higiênica dos alimentos crus, aplicando boas práticas de
produção e criação. O conceito de qualidade tem se alterado à medida que
avançam as comunicações e o conhecimento científico. A Organização
Internacional de Normatização (ISO) define qualidade como a “totalidade de
atributos e características de um produto ou serviço para satisfazer as
necessidades declaradas ou implícitas”. Durante os anos 60, a composição
nutritiva dos alimentos era a certificação de qualidade. Nos anos 70, a ausência
de resíduos químicos foi um assunto importante para definir qualidade. Durante
os anos 80, os níveis máximos de resíduos, drogas, aditivos e contaminantes
tomaram um lugar preponderante na certificação de qualidade. Nos anos 90, os
consumidores passaram a dar prioridade aos alimentos sem risco para saúde,
ricos em proteínas, vitaminas, minerais e ácidos graxos essenciais (NARDONE e
VALFRÉ, 1999).
O resultado é um conceito mais amplo de Qualidade Total, proposto por
VALFRÉ e MORETTI (1991), que pode ser aplicado aos produtos lácteos:
1. qualidade higiênica ou inocuidade;
2. qualidade composicional;
3. qualidade nutricional;
17
4. qualidade sensorial;
5. qualidade tecnológica (apropriado para processamento, transformação,
armazenagem e distribuição).
3.6 Qualidade microbiológica do leite
Em condições normais, o leite é estéril ao ser secretado nos alvéolos do
úbere (INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, 1991). No entanto, ao ser
ordenhado, o leite pode se contaminar por um pequeno e bem definido número
de microrganismos, provenientes dos canais lactíferos, da cisterna da glândula e
canal do teto. Em função do número e do tipo de microrganismos, alterações
indesejáveis são produzidas na aparência, sabor ou odor do leite ou de seus
derivados. Além disso, alguns microrganismos podem representar risco à saúde
do consumidor, devido à ação de bactérias patogênicas (Listeria, Salmonella,
Staphylococcus aureus, Brucella, Mycobacterium), especialmente quando o leite
é ingerido cru (FONSECA e SANTOS, 2000; BRITO 1999).
Esperava-se que, com o processo de coleta a granel do leite e
conseqüente melhoria nas condições de transporte e de refrigeração, os
problemas em decorrência da carga microbiana do leite fossem amenizados,
porém isto não ocorreu. Apesar da adoção do armazenamento e coleta a granel
diminuir a proliferação de bactérias mesófilas (aquelas que possuem crescimento
ótimo em temperatura média de 35ºC), este processo promove a seleção de
bactérias psicrotróficas (aquelas que possuem crescimento ótimo em temperatura
média de 7ºC). Esses microrganismos possuem alta capacidade de produção de
enzimas que diminuem o valor nutritivo e o rendimento industrial do leite e de
seus derivados (CASSOLI, 2005; FONSECA e SANTOS, 2000). Há diversos
estudos que relacionam a alta carga microbiana com problemas na coagulação e
acidificação, produção de gás, geleificação, sabor amargo, aumento de
viscosidade e alteração de cor. Estas alterações causam diminuição da vida de
prateleira e diminuem o rendimento industrial. Portanto, a qualidade do leite
encaminhado às indústrias é essencial para o processamento dos produtos,
sendo esta qualidade determinada pelas condições de saúde dos animais
ordenhados, e pela manutenção das características próprias do leite durante o
armazenamento e o transporte (PRATA, 2001; GIGANTE, 2004).
18
3.7 Legislação no Brasil
Considerando as evidências que o leite produzido e consumido no Brasil
nem sempre apresenta a qualidade desejada, o Ministério da Agricultura do Brasil
iniciou há cerca de 10 anos uma discussão nacional, envolvendo os setores
científicos e econômicos do setor leiteiro, buscando alternativas para melhorar a
qualidade do leite produzido no país. Essa discussão resultou na Portaria nº166
(BRASIL, 1998), que estabeleceu um grupo de trabalho para analisar e propor um
programa de medidas visando o aumento da competitividade e a modernização
do setor leiteiro no Brasil. Esse grupo desenvolveu uma versão do Programa
Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite (PNMQL), projeto que já vinha sendo
desenvolvido desde 1996, e o submeteu à consulta pública pela Portaria nº56
(BRASIL, 1999b). A versão definitiva das novas normas de produção leiteira foi
publicada na Instrução Normativa nº 51 (IN51), de 18 de setembro de 2002, que
determina novas normas na produção, identidade e qualidade de leites tipos A, B,
C, pasteurizado e cru refrigerado, além de regulamentar a coleta de leite cru
refrigerado e seu transporte a granel (BRASIL, 2002). Outro incentivo à
modernização da produção leiteira no Brasil ocorreu em 2003, pela Resolução n°
3088 (BRASIL, 2003), que aprovou financiamento de equipamentos de
resfriamento e coleta a granel para produtores de leite. A principal razão de todas
essas medidas foi a necessidade de adequação das normas publicadas no
RIISPOA (BRASIL, 1997) às atuais realidades de produção e consumo de leite no
Brasil.
Dentre as modificações preconizadas pela IN51, pode ser citada a
permissão de comercialização de leites pasteurizados tipos A e B com diferentes
percentagens de gordura (integral, padronizado, semi-desnatado e desnatado),
visando atender a um mercado consumidor cada vez mais crescente. Entretanto,
uma das principais alterações diz respeito ao leite tipo C; até então, o leite cru
destinado ao beneficiamento desse tipo de leite pasteurizado não possuía
parâmetros microbiológicos específicos. De acordo com as novas normas, esse
leite deve ser refrigerado já na propriedade e possuir uma contagem de aeróbios
mesófilos máxima de 1x106 UFC/mL, objetivo a ser atingido em diferentes prazos
de acordo com a localização geográfica da região produtora (Quadro 1).
Ainda, a denominação “leite tipo C” vigora até data determinada, variável
de acordo com a localização geográfica da região produtora (01/07/2005 nas
19
regiões Sul, Sudeste e Centro-oeste e 01/07/2007 nas regiões Norte e Nordeste),
quando será então classificado apenas como leite pasteurizado.
Quadro 1. Requisitos microbiológicos para leite cru refrigerado a serem atingidos
em diferentes regiões do Brasil.
Índice mensurado
Até 01/07/2005 (S, SE e CO)
Até 01/07/2007 (NE e N)
De 01/07/2005 até 01/07/2008 (S, SE e CO) De 01/07/2007 Até 01/07/2010
(NE e N)
De 01/07/2008 até 01/072011 (S, SE e CO) De 01/07/2010 Até 01/07/2012
(NE e N)
A partir de 01/07/2011 (S, SE e CO) A partir de 01/07/2012 (NE e N)
Contagem
Bacteriana Total (CBT)
1,0 x 106 UFC/mL
1,0 x 106 UFC/mL
7,5 x 105 UFC/mL
1,0 x 105 UFC/mL (individual)
3,0 x 105 UFC/mL (conjunto)
Contagem de
Células Somáticas (CCS)
1,0 x 106 céls/mL
1,0 x 106 céls/mL
7,5 x 105 céls/mL
4,0 x 105 céls/mL
Fonte: Instrução Normativa nº 51(BRASIL, 2002). Outra importante norma descrita na IN51 é a regulamentação de
conservação, coleta e transporte de leite cru refrigerado, independente do tipo,
que deve ser feito a granel. Nas propriedades, o leite deverá ser refrigerado e
atingir a temperatura de 4ºC (tanques de expansão) ou 7ºC (tanques de imersão),
num período não superior a 3 horas após o término da ordenha. Também é
prevista a permissão de tanques resfriadores comunitários, que visa atender
pequenos produtores. Caminhões-tanque coletam o leite refrigerado e o
encaminham aos laticínios para o processamento. Na recepção dos laticínios, o
leite desses tanques não deverá apresentar temperatura superior a 7ºC (para leite
B) ou 4ºC (para leite C). Outro importante objetivo a ser alcançado é a redução da
contagem de células somáticas (CCS), em prazos similares aos estabelecidos
para contagem de aeróbios mesófilos.
A Instrução Normativa 51/2002 trouxe diversas vantagens e desafios para
o setor leiteiro, entre os quais se destaca a necessidade de realização de análises
de composição (teores de gordura, proteína e sólidos totais) contagem de células
somáticas e de contagem bacteriana total (CBT) das amostras de leite dos
produtores em laboratórios credenciados pelo MAPA (SANTOS, 2005a). Para
isso, o MAPA criou a Rede Brasileira de Laboratórios de Análise da Qualidade do
20
Leite (RBQL), que é responsável pela análise de todo o leite cru produzido no
país e composta atualmente por sete laboratórios centralizados. Estes
laboratórios possuem equipamentos automatizados de última geração e de alto
rendimento analítico. Todas essas normas representam um importante passo do
PNMQL, que buscam a melhoria da qualidade do leite cru produzido no Brasil,
resultando num produto final beneficiado de melhor qualidade.
3.8 Células Somáticas
Segundo BREER et al. (1976) e LANGONI (2000), a determinação da CCS
(Contagem de Células Somáticas) através de microscopia ótica direta foi
introduzida em 1910, por Prescott e Breed. Estes últimos sugeriram o uso do
termo “células corporais”, pois pesquisas ao longo do tempo indicavam que as
células do leite eram células epiteliais descamadas, entretanto, depois de 1960 o
termo contagem de células “somáticas” (substituindo “corporais”) tornou-se
comum (HARMON, 2001).
As células somáticas são, normalmente, células de defesa (leucócitos ou
células brancas) do organismo que migram do sangue para o interior da glândula
mamária com o objetivo de combater agentes agressores, mas podem ser
também células secretoras descamadas. Durante a inflamação, o maior aumento
da CCS é devido ao fluxo de neutrófilos para a glândula (HARMON, 1994, 2001).
A porcentagem dos diferentes tipos de células somáticas do leite, oriundos de
glândulas sadias são: (1) macrófagos – 60%, (2) linfócitos – 25% e (3) neutrófilos
– 15%. Aproximadamente 99% de todas as células do leite proveniente de um
quarto infectado serão de glóbulos brancos do sangue, enquanto 1%
remanescente será de células epiteliais secretoras que se originam dos tecidos
mamários. Juntos, esses dois tipos de células formam a CCS do leite, que é
geralmente expressa em “por mililitro” (PHILPOT e NICKERSON, 2002). A CCS é
um indicador geral da saúde da glândula mamária amplamente utilizada como
indicador de mastite subclínica, sendo aceita também, como medida padrão para
determinar a qualidade do leite (HARMON, 2001). O uso de contagem de células
somáticas é um método efetivo para avaliar rebanhos e monitorar os níveis da
doença na propriedade (SEARS et al., 1993).
A CCS do tanque de expansão é utilizada como medida de qualidade. Isso
se deve ao fato de que o aumento na CCS está associado com a redução da
21
concentração de componentes do leite (caseína, principalmente), reduzindo o
rendimento industrial do mesmo. Assim, muitos laticínios utilizam um sistema de
bônus ou penalizações, para estimular a produção de leite com baixas contagens
de células somáticas. Legalmente, os países impõem limites máximos para a
CCS do leite do rebanho, sendo que nos Estados Unidos, em algumas regiões,
esse limite é de 750.000 células/mL, enquanto na União Européia, Nova Zelândia
e Austrália o valor é de 400.000 células/mL (EDMONDSON, 2002).
HARMON (2001) afirma que em animais saudáveis a CCS geralmente
está abaixo de 200.000 células/mL, mas pode ser menor do que 100.000
células/mL em vacas primíparas. Assim, elevação acima de 200.000 céls/mL é
considerada anormal e indicativo de inflamação do úbere, sendo que esse valor
chega a milhões de células/mL nos casos clínicos. SURIYASATHAPORN et al.
(2000) especula a relação entre a CCS e o risco subseqüente de mastite clínica.
De maneira complementar, os resultados da CCS de vacas individuais
podem ser utilizados para avaliar a sanidade da glândula mamária através da
identificação do número de animais com mastite subclínica (vacas com CCS
acima de 200.000 células/mL de leite). Em rebanhos com monitoramento mensal
individual de todos os animais, pode-se utilizar a CCS para verificar a eficácia do
programa de controle de mastite adotado, assim como identificar animais
infectados cronicamente que apresentam CCS altas por vários meses. Os dados
da CCS obtidos de vacas individuais devem ser organizados de forma a
possibilitar a identificação de variações sazonais e definir estratégias de controle
para os períodos mais críticos do ano. A CCS é também bastante útil na
identificação de algumas poucas vacas que individualmente contribuem
significativamente na CCS total do tanque. Estas vacas identificadas com altas
contagens de células podem assim ser selecionadas para cultura microbiológica
do leite, secagem antecipada, descarte de vacas com mastite crônica e linha de
ordenha (ordenha dos animais com CCS alta após a ordenha de todos os
animais sadios). Esta medida pode auxiliar na diminuição do aparecimento de
novas infecções, pois diminui o risco de transmissão da mastite contagiosa
durante a ordenha (SANTOS, 2005b).
22
3.8.1 Fatores que afetam a contagem de células somáticas
A CCS é um fenômeno biológico dinâmico que está sujeito a variações
significativas, uma vez que é travada uma batalha permanente entre as células
somáticas e os microrganismos da mastite de um quarto infectado (PHILPOT e
NICKERSON, 2002). O fator mais importante afetando a CCS é o grau de
infecção da glândula mamária, embora existam outros fatores menos
importantes, como a variação diurna, o estresse, os estágios de lactação, a idade
da vaca, o tamanho do rebanho, o nível de produção de leite e a presença de
outras doenças (HARMON, 1994; LANGONI, 2000). As concentrações das
células somáticas podem variar de dezenas de milhares para dezenas de milhões
por mililitro, dependendo dos microrganismos envolvidos e do grau de inflamação
existente (PHILPOT e NICKERSON, 2002).
O estágio de lactação afeta a CCS, sendo que imediatamente após o parto
a CCS é alta, mas é rapidamente reduzida para níveis normais dentro de 4-5
dias, se não houver IIM. No entanto, em vacas sem isolamento bacteriano
(sadias) não ocorre efeito da ordem de parição e do estágio de lactação,
conforme pode ser visualizado na Figura 1 (SANTOS, 2006).
Figura 1. Média geométrica de CCS de vacas sem isolamento bacteriano na primeira (1), segunda (2) e terceira (3) lactação, em diversos estágios de lactação.
Fonte: (SANTOS, 2006)
Outro fator a ser considerado é a estação do ano, pois a CCS é,
geralmente, menor durante o inverno e maior durante o verão, devido,
provavelmente, às melhores condições ambientais para o crescimento bacteriano
durante o verão (HARMON, 1998). O agente causal da mastite pode também
23
influenciar na CCS, porém só será identificado com isolamento bacteriano
(HARMON, 1994).
3.8.2 Efeitos das células somáticas na produção e composição do leite
Há um considerável volume de pesquisas indicando que a produção de
leite diminui na medida em que a CCS aumenta. Vacas de primeira lactação
perdem 91Kg de leite por lactação e vacas mais velhas perdem 182Kg de leite
por lactação cada vez que a CCS dobra a partir de 50.000 células (PHILPOT,
1998). Segundo COLDEBELLA (2003), as perdas de produção de leite
associadas ao aumento da CCS são absolutas, isto é, independem da produção
de leite, e variam apenas com a ordem de lactação (vacas primíparas ou
multíparas).
As alterações de composição do leite ocorrem em conseqüência à
inflamação, que causa diminuição na capacidade de síntese da glândula mamária
e aumento da permeabilidade vascular. O leite apresenta redução nos teores de
cálcio, lactose, caseína e gordura, além de aumentar os níveis de íons sódio,
cloro e de proteínas séricas (SHUSTER et al., 1991; OLIVEIRA et al., 1999).
3.9 Métodos de Detecção da Mastite
Em razão de a mastite ser uma inflamação da glândula mamária causada
por microrganismos infecciosos, a detecção da doença pode ser feita pelo
monitoramento do grau de inflamação, ou por vários testes ao pé da vaca ou
laboratoriais. Os testes mais simples e diretos são os testes ao pé da vaca, como
o exame físico e o teste da caneca, seguidos por testes laboratoriais mais
sofisticados que usam reagentes químicos e meios de cultura. Na mastite clínica,
a detecção da doença é feita simplesmente pela observação visual do leite ou
dos quartos anormais, devido à resposta inflamatória. Contudo, na infecção
subclínica, devem ser usadas medidas indiretas da inflamação (PHILPOT, 1998).
3.9.1 “California Mastitis Test” (CMT)
O CMT estima qualitativamente a presença de células somáticas do leite e
pode ser feito ao pé da vaca para detectar a mastite. Os valores do CMT estão
24
relacionados com o número de células somáticas no leite. Os números de células
somáticas no leite tendem a aumentar durante a ordenha e permanecem altos
por várias horas. Portanto, para que os resultados sejam confiáveis, o CMT deve
ser conduzido antes da ordenha, mas depois da estimulação da vaca e da
eliminação dos primeiros jatos de leite. O reagente do CMT é um detergente
aniônico (alquil lauril sulfonato de sódio) capaz de emulsionar os lipídeos de
membrana dos leucócitos presentes no leite, liberando o material nucléico das
células somáticas (DNA), que leva à formação de um composto gelificado
correspondente à quantidade de células presentes. A intensidade da reação está
classificada com 5 escores: negativo, traço (suspeito), positivo 1+, 2+, 3+
(BLOOD e RADOSTITIS, 1991). A “raquete” do CMT é colocada sob o úbere e
alguns jatos de leite de cada um dos quatro quartos são despejados nos
respectivos coletores. O excedente é descartado inclinando-se a raquete e uma
quantidade igual do reagente do CMT é acrescentada, misturada e a reação é
observada. O CMT é valioso para a detecção das infecções subclínicas que
podem, de outra forma, continuar não sendo detectadas até que um estágio mais
avançado ou clínico da doença seja atingido (PHILPOT, 1998).
3.9.2 Contagem Eletrônica de Células Somáticas
Os contadores eletrônicos automatizados de células e o registro
computadorizado dos dados tornaram possível a obtenção de relatórios
periódicos da CCS de todas as vacas leiteiras de um rebanho. A avaliação
desses registros é útil para monitorar o progresso e revelar deficiências nas
práticas de controle de mastite (PHILPOT, 1998).
Este método é realizado com auxílio de aparelhos como o “Somacount
150” (BENTLEY INSTRUMENTS, 1994). Este é um aparelho composto por cinco
estruturas que formam o sistema óptico de leitura, que são: o conjunto de fluidos
com o corante brometo de etídio e o carreamento, que é o detergente RBS; um
computador; um canhão de laser; um leitor, denominado “Flow cell”; e um tubo
foto multiplicador, que faz a conversão de impulsos luminosos para impulsos
elétricos.
O aparelho funciona com um computador que controla todas as funções.
Utiliza um sistema óptico para detecção e contagem das células inflamatórias do
25
leite. Nesse aparelho, o leite é aspirado e misturado a uma solução, que cora o
núcleo das células somáticas. A contagem eletrônica de células somáticas é feita
pelo exame de citometria de fluxo, no qual os impulsos luminosos (fluorescentes,
sob luz ultravioleta) emitidos pelas células, decorrentes da associação DNA-
corante (brometo de etídio), após sua conversão em impulsos elétricos no tubo
fotomultiplicador, são lidos pelo aparelho. As células fluorescentes, ao passarem
pelo fluxo, carreadas por uma pequena corrente do fluido (RBS), ao serem
bombardeadas por um feixe de laser, produzem uma explosão luminosa de curta
refração que atravessa uma série de filtros ópticos e lentes, sendo focadas em
um comprimento de luz apropriado. Esses pulsos de luz são convertidos em
pulsos elétricos, amplificados, eletronicamente filtrados e ordenados por
tamanho, para que especifiquem as células somáticas. O computador conta os
pulsos elétricos como células inflamatórias e os números encontrados são
expressos em mil células por mililitro de leite (céls/mL) (BENTLEY, 1994).
3.9.3 Cultura de Amostras do Leite
Quase sempre desejável é determinar os tipos de microrganismos
causadores da infecção num rebanho específico, para que sejam identificadas as
soluções para o problema da mastite. Isso se faz através da cultura
microbiológica das amostras do leite dos quartos individuais, ou de amostras
compostas de vacas individuais. A precisão da cultura laboratorial depende da
maneira com que as amostras de leite são coletadas, armazenadas e
manipuladas. As amostras devem ser coletadas em tubos estéreis e refrigeradas
até que sejam enviadas para o laboratório (PHILPOT, 1998).
3.9.4 Determinação da Qualidade microbiológica
Os métodos utilizados para a determinação da qualidade microbiológica
podem ser divididos em qualitativos e quantitativos.
Entre os qualitativos, destacam-se o teste da redutase, teste da
fermentação e o teste da acidez. Apesar da praticidade de realização, estes
testes são subjetivos e indiretos, sendo utilizados apenas para um diagnóstico
geral da qualidade do leite (FONSECA e SANTOS, 2000).
26
Dentre os testes quantitativos, destaca-se a contagem bacteriana total
(CBT), em que são estimados o número de unidades formadoras de colônias de
bactérias por mililitros de leite (UFC/mL) (BRASIL, 1999a). Para esta
determinação, existem vários métodos disponíveis, sendo a contagem bacteriana
em placa (CBP), o método de referência. Amostras de leite em várias diluições
são semeadas em um meio de cultura e incubadas por 48h a 32ºC. Após a
incubação, o número de colônias bacterianas é contado. A CBP determina o
conteúdo de bactérias aeróbias no leite (BRITO, 1999; HILLERTON, 2000). Este
procedimento pode subestimar a quantidade de bactérias presentes no leite, pois
apenas bactérias viáveis e que se multiplicam nas condições de cultivo, formam
colônias. Também, a característica de agregação pode subestimar a contagem,
sendo que uma colônia pode ter sido originada de várias bactérias (HILLERTON,
2000). Devido à utilização de um meio de cultura simples, ocorre competição
entre as espécies presentes, sobressaindo-se bactérias que encontram
condições mais favoráveis (PRATA, 2001). SUHREN e REICHMUTH (2000)
citam que a CBP não expressa a real qualidade bacteriológica do leite, apesar de
ser utilizado internacionalmente como método de referência.
A contagem de bactérias é provavelmente o método mais comumente
usado para determinar a qualidade do leite em todos os países de pecuária
leiteira desenvolvida. De acordo com a legislação européia – European Milk
Hygiene Directive 92/46, o parâmetro “contagem bacteriana total” (CBT) é
recomendado para avaliação da qualidade higiênica do leite cru.
O limite legal para a CBT previsto na IN-51, foi estabelecido em UFC. Para
a produção de leite tipo “A” o limite é de 10mil UFC/mL, 500 mil UFC/mL para o
leite tipo “B” e 1x106 UFC/mL para o leite cru refrigerado (BRASIL, 2002).
3.9.5 Determinação da contagem bacteriana do leite pelo método de
citometria de fluxo
A citometria de fluxo consiste na medição de características celulares,
quando estas se encontram suspensas em meio fluido (BARRIENTOS et al.,
2000). O leite e as células bacterianas em suspensão são injetados em um
capilar acoplado a um sistema óptico. O capilar recebe continuamente um feixe
de laser, que atinge cada bactéria que passa pelo capilar de fluxo. O sistema
27
óptico coleta informações referentes ao tamanho, número de células,
complexidade da célula (características de parede celular e número de organelas
presentes) (CASSOLI, 2005).
Nesta técnica são utilizados corantes fluorescentes específicos (brometo
de etídio), que penetra nas células bacterianas ligando-se ao DNA e ao RNA.
Estas células, quando excitadas pelo laser, passam a emitir radiação em
comprimento de onda de 620nm que são captadas pelo sistema óptico do
aparelho. É necessário utilizar enzimas proteolíticas e detergentes para a
degradação das proteínas, gordura e células somáticas do leite, ocorrendo a
penetração do corante na célula. O processo de sonificação irá destruir por
completo as células somáticas presentes no leite (BARRIENTOS et al., 2000).
A radiação emitida pelas células bacterianas é coletada pelo sistema
óptico, transferida para o sistema de filtros e transformada em impulso elétrico
pelo sistema eletrônico. Os impulsos por sua vez, são transformados em número
de bactérias e este, relacionado ao volume analisado. Os resultados emitidos por
estes equipamentos são expressos em número de bactérias por mL de leite e
representam a contagem individual de bactérias (CIB) (CASSOLI, 2005).
A grande vantagem deste equipamento é o baixo custo da análise e o
elevado rendimento analítico, sendo possível obter a CBT em cerca de 12
minutos e analisar 150 amostras por hora (BENTLEY INSTRUMENTS, 2004).
Para a determinação da CBT é necessária a utilização da refrigeração
associada a um conservante. Atualmente o conservante mais utilizado é o azidiol,
que possui como princípio ativo o cloranfenicol e a azida sódica, ambos
bacteriostáticos. A amostra para CBT poderá ser analisada em até sete dias após
a coleta, se mantida sob refrigeração a 7°C (Figura 2). Deve-se evitar o
aquecimento ou congelamento da mesma, bem como garantir que o azidiol seja
adicionado à amostra (CASSOLI, 2005).
28
Figura 2: Contagem bacteriana total em função da temperatura de
armazenamento e da idade das amostras (CASSOLI, 2005).
29
4. MATERIAL E MÉTODOS
Foram avaliadas 101 amostras de leite cru provenientes de vacas
primíparas e pluríparas, de diferentes graus de sangue, em diferentes estágios de
lactação, pertencentes a 15 propriedades rurais de exploração leiteira, em sua
maioria com ordenha do tipo mecânica (12), escolhidas ao acaso, localizadas nas
regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro. Estes animais não se
encontravam em período colostral nem em fase de secagem e não foram
submetidos a tratamento medicamentoso com antibióticos nos dias anteriores à
coleta de material.
Das 15 propriedades, 6 são do município de Santa Maria Madalena, 3 de
Campos dos Goytacazes, 3 de Bom Jesus do Itabapoana, 2 de Itaperuna e 1 em
São Fidélis.
30
4.1 Coleta das amostras:
4.1.1 CMT:
As amostras foram coletadas após a higienização dos tetos por lavagem
com água e sabão, secagem com papel toalha e desinfecção com álcool 70º. Os
três primeiros jatos de leite foram desprezados.
A seguir foi realizado o “California Mastitis Test” (CMT), analisando a
alteração na viscosidade da mistura de 2 mL de reagente com 2 mL de leite, a fim
de detectar a ocorrência de mastite subclínica com resultado três cruzes em pelo
menos um dos quartos (Figura 3).
Figura 3: “California Mastitis Test” com reação 3 cruzes (arquivo pessoal)
4.1.2 Análise microbiológica:
Para a análise microbiológica foram coletados cerca de 5 mL de leite do
teto acometido com resultado três cruzes (CMT), em tubos de plástico estéreis
tipo Falcon, previamente identificados. Os tubos foram acondicionados em caixa
isotérmica com gelo reciclável. Em seguida, as amostras foram levadas em
menor tempo possível, ao Setor de Doenças Infectocontagiosas, Seção de
Bacteriologia Veterinária do Laboratório de Sanidade Animal/CCTA para o
isolamento e identificação dos microrganismos.
31
4.1.3 CBT e CCS:
As amostras foram coletadas após a realização do CMT do leite
ordenhado de cada animal. Somente eram coletadas as amostras de leite dos
tetos que apresentavam resultado três cruzes ao CMT. Para a realização das
análises de CCS e CBT, as amostras de leite dos tetos acometidos (cerca de 50
mL para cada teste) eram coletadas em frascos apropriados de plástico.
Para análise da CCS, foi utilizado um conservante, Bronopol (2-Bromo-2-
Nitropropano-1,3-Diol), com a finalidade de inibir o crescimento bacteriano no
leite por até 7 dias. Cada pastilha possui 8 mg de bronopol e 0,3 mg de
natamicina, um agente antifúngico. Utilizou-se uma pastilha para cada 50 mL de
leite.
Para análise da CBT, foi utilizado o azidiol, que é bacteriostático. A
solução de azidiol (0,15% de cloranfenicol e 3,6% de azida sódica) foi preparada
pelo Laboratório de Qualidade do Leite da Embrapa Gado de Leite – Juiz de Fora
– MG. Foram utilizadas 2 a 3 gotas da solução para cada 50 mL de leite, segundo
orientação do próprio laboratório fornecedor.
Após a adição dos conservantes, os frascos eram acondicionados em
caixa isotérmica com gelo reciclável e posteriormente conduzidos ao laboratório
para análise da CCS.
As amostras para CBT foram identificadas, etiquetadas com códigos de
barras (Figura 4) e enviadas à Embrapa Gado de Leite, em Juiz de Fora – MG
para análise, mantidas em temperatura de 4 a 8ºC no máximo, em caixa
isotérmica, 5 a 7 dias após a sua obtenção.
Figura 4: Amostras identificadas com código de barras para CBT (arquivo
pessoal)
32
4.2 Procedimentos:
4.2.1 CMT: Os resultados do teste de CMT foram avaliados através dos movimentos
de rotação com a bandeja. A interpretação do teste é baseada na formação de
um gel. Quando os jatos de leite coletados na bandeja se misturam ao reagente,
são classificados em (-) não coagula, (+) ligeira coagulação, (++) coagula em
menor intensidade, (+++) coagula formando um gel (SCHALM e NOORLANDER,
1957). Os resultados do teste foram anotados em uma ficha individual para cada
animal e somente coletadas as reações com 3 cruzes (+++).
4.2.2 Contagem de Células Somáticas: As amostras coletadas para a contagem de células somáticas foram
aquecidas em banho-maria a uma temperatura de 42°C por 15 minutos com o
suporte de uma placa aquecedora e homogeneizadas por inversão. Em seguida,
analisadas pelo aparelho “Somacount 150” (BENTLEY INSTRUMENTS, 1994),
através de citometria de fluxo utilizando a metodologia prescrita pelo fabricante e
os resultados expressos em céls/mL.
Figura 5: Aparelho “Somacount 150” (arquivo pessoal)
33
4.2.3 Contagem Bacteriana Total: As amostras coletadas em frascos estéreis para a contagem bacteriana
total foram enviadas para Embrapa Gado de Leite, em Juiz de Fora – MG e
analisadas pelo aparelho “Bactocount 150” (BENTLEY INSTRUMENTS, 2004),
através de citometria de fluxo utilizando a metodologia prescrita pelo fabricante e
os resultados expressos em UFC/mL.
Figura 6: “Bactocount 150” (Bentley Instruments)
4.2.4 Análise microbiológica:
As amostras de leite foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 minutos assim
que chegavam ao Laboratório. Utilizou-se uma alça de platina para coletar o
material precipitado no fundo do tubo (pellet). Com este material realizou-se o
Gram para avaliar as características morfotintoriais dos microrganismos
presentes no leite antes de serem incubados e em seguida a Bacterioscopia.
Após este procedimento, o pellet foi semeado em placas de Petri, com o auxílio
de uma alça de platina, com meios de cultura específicos.
No Ágar Sangue (sangue desfibrinado de carneiro a 5,0%), utilizou-se uma
metodologia para avaliar o crescimento bacteriano em placa que será descrito no
tópico seguinte. Utilizou-se o Ágar MacConkey como meio seletivo para o
crescimento de bactérias Gram negativas. Em seguida, as placas foram
colocadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 48h e depois retiradas para
análise do crescimento de colônias e classificação.
34
Ocorrendo o crescimento de colônias, estas foram separadas quanto às
suas características morfológicas e novamente semeadas em Ágar Sangue
(sangue desfibrinado de carneiro a 5,0%). Em seguida, levadas à estufa
bacteriológica a 37ºC por 48h para obtenção de colônias puras. Esfregaços em
lâminas corados pelo método de Gram das colônias puras foram realizados para
verificar os aspectos morfotintoriais das bactérias e após realizou-se as provas
bioquímicas específicas para cada grupo.
As colônias de bactérias que se revelaram como cocos Gram-positivos em
forma de cachos foram submetidas aos seguintes testes: catalase, produção de
acetoína (prova de Voges Proskauer - VP), teste de fermentação de manitol em
anaerobiose e produção de coagulase pelo método de coagulação do plasma de
coelho (DIFCO, USA) para as bactérias suspeitas de serem Staphylococcus sp.
Para as bactérias suspeitas de Streptococcus sp foram realizados os testes de
catalase, esculina e o teste de CAMP para diferenciá-las.
Para as colônias de bactérias que se revelaram como cocos Gram-
negativos realizou-se: o teste IMVIC (Indol, Vermelho de Metila, Voges
Proskauer, Citrato de Simmons) e oxidase.
Figura 7: Isolamento microbiológico em ágar sangue (arquivo pessoal)
35
4.2.4.1 Análise microbiológica qualitativa:
Para a definição da análise microbiológica qualitativa, as amostras
provenientes do leite classificado com 3 cruzes no CMT foram centrifugadas a
5000 rpm durante 5 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi dispensado e o
“pellet” formado aproveitado. Utilizando uma alça de platina, previamente
esterilizada na flama do bico de Bunsen, o “pellet” foi coletado. O semeamento
com a alça foi realizado de acordo com a figura 8, onde uma parte foi semeada
na parte esquerda da placa de petri, contendo o ágar sangue de carneiro a 5%.
Em seguida, a alça foi flambada e uma linha diagonal da parte de baixo onde a
amostra foi previamente semeada foi realizada até a parte superior da placa de
petri. A alça foi novamente flambada e movimentos em forma de “zig-zag” foram
feitos até chegar o limite do meio da placa (Figura 8). A classificação qualitativa
foi de acordo com o esquema abaixo. Onde ocorreu o crescimento de colônias de
bactérias, classificou-se em uma, duas ou três cruzes:
Esquema Ilustrativo
36
Figura 8: Análise microbiológica qualitativa em ágar sangue classificada
como ECRTO=3 (arquivo pessoal).
4.3 Análise estatística:
As características estudadas foram: contagem de células somáticas
(CCS), contagem bacteriana total (CBT) e crescimento qualitativo em placa.
A CCS pode ser expressa na forma de escore linear de células somáticas
(ECS), que tem sido adotado em vários países. Como pode ser observado no
quadro 2, o uso do escore de células somáticas facilita a interpretação dos
resultados, uma vez que a cada aumento de 1 (um) escore linear, a CCS é
dobrada (SANTOS, 2006). O mesmo critério foi utilizado para os resultados de
CBT, sendo descrito como escore de contagem bacteriana total (ECBT).
Os resultados de crescimento qualitativo em placa foram expressos em
escore de crescimento (ECRTO), conforme o quadro 3.
37
Quadro 2 - Relação entre o escore de células
somáticas (ECS) e a contagem de células
somáticas (CCS)
ECS Variação CCS
(x1000céls/mL)
0 0 – 17
1 18 – 34
2 35 – 70
3 71 – 140
4 141 – 282
5 283 – 565
6 566 – 1130
7 1131 – 2262
8 2263 – 4525
9 > 4525
Fonte: National Mastitis Council, 1996
Quadro 3 - Escore do crescimento
qualitativo em placas de Petri (ECRTO)
dos microrganismos
ECRTO Crescimento microbiano
por zona
0 Ausência de crescimento
1 1 cruz
2 2 cruzes
3 3 cruzes
Foi realizada a análise de regressão linear simples para comparação entre
ECS e ECBT usando o procedimento PROC REG (SAS, 1998). Foram calculadas
as correlações simples entres as características (ECS, ECBT e ECRTO) mediante
o procedimento PROC CORR (SAS,1998).
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO:
5.1 Resultados da contagem de células somáticas:
Os resultados da Tabela 1 demonstram que, das 101 amostras analisadas
pelo “Somacount 150”, 72 (71,3%) encontravam-se em desacordo com a IN51 por
apresentarem valores acima de 1x106 céls/mL (ECS 7,8 e 9)(BRASIL, 2002),
sendo a média de 4763x103 céls/mL (ECS 7 à 9). Em um estudo realizado no sul
do país, CADEMARTORI (2001) encontrou médias de 1354x103 céls/mL de CCS
em quartos positivos no teste do CMT. LANGONI (2000) considera normais e
indicativos de úbere sadio valores menores do que 200 x103 céls/mL. Das 101
amostras, 9,9% (ECS 1 à 4) enquadraram-se na classificação de úbere sadio,
mesmo apresentando resultado 3 cruzes no CMT.
39
Tabela 1 - Contagem de Células Somáticas (CCS) em escore (ECS) das
amostras positivas para o California Mastitis Test (CMT), no período
de abril a dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro.
ECS n° de amostras %
1 01 1,0
2 02 1,98
3 05 4,95
4 02 1,98
5 07 6,93
6 12 11,88
7 21 20,8
8 21 20,8
9 30 29,7
Total 101 100
n= 101
5.2 Resultados do crescimento bacteriano em placa:
Observou-se (Tabela 2) que as amostras classificadas com o escore 3,
corresponderam a 32,67% das 101 amostras isoladas, com média de CBT de
970x103UFC/mL. Os demais escores encontrados foram: ECRTO 0 (20,8%);
ECRTO 1 (27,72%); ECRTO2 (18,81%). CADEMARTORI (2001) analisou 342
amostras positivas no teste do CMT e encontrou 46,2% das lactoculturas com
resultados negativos no isolamento bacteriano (ausência de crescimento), que
segundo o autor, pode ser explicado pela presença de agentes infecciosos que
não se desenvolvem nos meios de cultura rotineiramente empregados. Neste
trabalho, a ausência de crescimento correspondida com o escore zero atingiu
uma porcentagem de 20,8%, concordando com as observações do autor citado.
40
Tabela 2 - Crescimento bacteriano qualitativo em placa em escore (ECRTO) das
amostras positivas para o California Mastitis Test, no período de
abril a dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro.
ECRTO n° de amostras %
0 21 20,8
1 28 27,72
2 19 18,81
3 33 32,67
Total 101 100
n= 101
5.3 Resultados da contagem bacteriana total:
Considerando o limite de 106 UFC/mL de aeróbios mesófilos em leite cru
(BRASIL, 2002), 77 (76,33%) das amostras analisadas encontravam-se de acordo
com a IN51 (ECBT 0 à 6) e 24 amostras (23,77%) estavam fora dos padrões
exigidos pela legislação do país (ECBT 7 à 9), ou seja, acima de 106 UFC/mL
(Tabela 3).
41
Tabela 3 - Contagem bacteriana total das amostras positivas em escore (ECBT)
das amostras positivas para o California Mastitis Test, no período de
abril a dezembro de 2006, do leite de propriedades nas regiões Norte e
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro.
ECBT N° de amostras %
0 17 16,83
1 08 7,92
2 12 11,88
3 10 9,9
4 12 11,88
5 06 5,94
6 12 11,88
7 14 13,86
8 09 8,91
9 01 1,0
Total 101 100
n= 101
5.4 Resultados do isolamento bacteriano:
A tabela 4 apresenta os microrganismos isolados no leite dos quartos
mamários com mastite subclínica e positivas 3 cruzes no CMT. Das 101 amostras
obtidas, Staphylococcus aureus foram os microrganismos mais isolados (20,8%),
seguidos por Staphylococcus coagulase negativo (9,90%), Streptococcus
agalactiae (6,93%), Bacillus sp. (5,94%), Streptococcus sp. (4,95%),
Streptococcus dysgalactiae (4,95%), Corynebacterium bovis (3,96%),
Streptococcus uberis (1,0%) e Enterococcus faecalis (1,0%). Outros
microrganismos isolados, em associação, totalizaram 9 (8,91%). MOTTA et al.
(2001) isolaram Staphylococcus aureus de 128 amostras de leite cru (23,06%),
positivas no teste do CMT, num total de 555 amostras submetidas ao isolamento
microbiológico nas regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro. Num
outro estudo também realizado na mesma região citada, DONATELE et al. (2002)
observaram que das 379 amostras de leite CMT positivas, 180 (47,5%) foram de
42
Staphylococcus coagulase positivos. O S. aureus foi considerado por PARDO et
al. (1998), como o agente isolado com maior freqüência na etiologia de IIMs em
vacas primíparas no período pós-parto, correspondendo a 64% das amostras de
leite analisadas. Assim sendo, estes dados demonstram concordância com o
isolamento realizado nesta pesquisa, sendo o S. aureus o principal causador de
mastite subclínica bovina na região Norte do Estado do Rio de Janeiro.
Entretanto MAGALHÃES et al. (2005) analisando amostras de leite de
vacas pertencentes a rebanhos de várias regiões do Estado do Rio de Janeiro
entre os anos de 2000 e 2004 e, de um total de 404 microrganismos isolados, o
Staphylococcus coagulase negativo (15,6%) foi o de maior freqüência, seguido do
Bacillus sp. (15%), S. aureus (13,86%), Corynebacterium (7,92%) e
Streptococcus, incluindo as espécies Streptococcus uberis (3,46%),
Streptococcus agalactiae (1,5%) e Streptococcus dysgalactiae (0,74%). Num
estudo realizado em propriedades leiteiras localizadas no oeste de São Paulo e
norte do Paraná, VIANNA et al. (2002) encontraram 213 (13,52%) estafilococos
coagulase negativos, 97 (6,15%) de Corynebacterium sp. e 32 (2,03%) de
estafilococos coagulase positivos em 1575 amostras de leite cru de vacas.
Resultados semelhantes foram obtidos por FREITAS et al. (2005), que
observaram que os agentes mais prevalentes nos casos de mastite bovina no
Agreste do Estado de Pernambuco são o Staphylococcus coagulase negativa
(36%), Corynebacterium sp. (34,8%) e S. aureus (13,6%) das 572 amostras de
leite de vaca analisadas. Todavia, neste trabalho foi demonstrado uma freqüência
maior de Staphylococcus aureus (20,8%), que é coagulase positivo, discordando
das observações dos autores supracitados.
Das 101 amostras obtidas, não apresentaram crescimento bacteriano 27
(26,73%) amostras de leite, de acordo com a tabela 4. Resultados semelhantes
foram obtidos por DONATELE et al. (2002), onde das 379 amostras observadas,
60 (15,8%) também não apresentaram crescimento. Os resultados positivos no
CMT, mas negativos no exame microbiológico, podem indicar um processo
inflamatório de etiologia não bacteriana, pois segundo COSTA et al. (1995), o
CMT é um método auxiliar de boa correlação com o exame microbiológico, porém
o processo inflamatório pode não ser de origem infecciosa. Há também a
possibilidade de não ter ocorrido crescimento pela necessidade de se utilizar um
meio de cultura enriquecido com nutrientes e condições adequadas para o
43
crescimento de bactérias. Segundo SANTOS (2002a), os resultados falso-
negativos são mais prováveis de ocorrer em casos de mastite causada por
coliformes e existem relatos de que cerca de 20 a 30% das amostras de casos
clínicos não resultam em crescimento, havendo possibilidade de estar presentes
inibidores como resíduos de antibióticos e desinfetantes. Neste trabalho é
sugerido que algumas lactoculturas negativas podem ser provenientes de vacas
com processo infeccioso, tais como micoplasmose, brucelose ou mesmo
tuberculose e que não encontraram condições para o seu crescimento nos meios
de cultura de rotina utilizados no estudo (ágar sangue e ágar MacConkey), ou
então a presença de resíduos de antibióticos no leite.
44
Tabela 4 - Bactérias isoladas das amostras de leite positivas para o California
Mastitis Test (CMT), no período de Abril a dezembro de 2006, de
propriedades nas regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de
Janeiro.
Bactérias isoladas n°°°° de amostras %
Sem crescimento bacteriano 27 26,73
Staphylococcus aureus 21 20,8
Staphylococcus sp. coagulase negativo 10 9,90
Streptococcus agalactiae 07 6,93
Bacillus sp. 06 5,94
Streptococcus dysgalactiae 05 4,95
Streptococcus sp. 05 4,95
Staphylococcus aureus / Staphylococcus coagulase
negativo
04 3,96
Corynebacterium bovis 04 3,96
Corynebacterium bovis / Staphylococcus coagulase
negativo
03 2,97
Streptococcus uberis 01 1,0
Streptococcus viridans 01 1,0
Enterococcus faecalis 01 1,0
Actinomyces sp. / Staphylococcus chromogenes 01 1,0
Streptococcus uberis / Staphylococcus chromogenes 01 1,0
Streptococcus agalactiae / Staphylococcus coagulase
negativo
01 1,0
Bacillus sp. / Staphylococcus hyicus 01 1,0
Staphylococcus coagulase negativo / Enterococcus
faecalis
01 1,0
Streptococcus dysgalactiae / Enterococcus faecalis 01 1,0
Total 101 100
n= 101
45
Verificou-se na Tabela 5, que a bactéria Streptococcus dysgalactiae foi a
que apresentou maiores valores médios de CBT (1083x103UFC/mL) para as 101
amostras analisadas, seguida pelo Streptococcus agalactiae (903x103UFC/mL) e
o Staphylococcus aureus (843x103UFC/mL). O principal grupo de agentes
causadores de mastite associados com aumentos da CBT do leite é o
Streptococcus sp, sendo que dentre as espécies mais importantes destacam-se o
S. agalactiae e S. uberis (GONZÁLES, et al., 1986; JEFREY e WILSON, 1987
apud SANTOS, 2002b), ainda que outros agentes possam ter influência sobre a
CBT. Verificou-se então a concordância entre os dados apresentados neste
trabalho com os estudos citados, pois o S. agalactiae foi o segundo, na tabela 5,
em maior valor médio para CBT (903x103UFC/mL)..
HARMON (1994) afirma que as bactérias causadoras de mastite podem ser
classificadas em patógenos maiores ou menores. Os patógenos maiores
provocam grandes mudanças na composição do leite, incluindo grande aumento
na CCS, e são responsáveis pelo maior impacto econômico da doença. Eles
incluem Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e coliformes. Ao
contrário, os patógenos menores, como estafilococos coagulase-negativo e
Corynebacterium bovis, não estão associados com grandes mudanças na
composição e na produção de leite. Infecções causadas por esses
microrganismos apenas duplicam ou triplicam a CCS em relação aos quartos não
infectados. Esta afirmação foi demonstrada neste trabalho, pois se verifica na
tabela 5, que o Streptococcus agalactiae foi o que apresentou maiores valores
médios de CCS (5393x103céls/mL), das 101 amostras analisadas, seguido do
Staphylococcus aureus (3980x103céls/mL) e o Corynebacterium bovis com
médias inferiores correspondendo a 1721x103céls/mL.
46
Tabela 5 - Médias de CCS e CBT das principais bactérias isoladas das 101
amostras obtidas de vacas positivas no CMT no período de abril a
dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e Noroeste
do Estado do Rio de Janeiro.
Bactérias isoladas n°°°° amostras Média CCS
(x103cél/mL)
Média CBT
(x103UFC/mL)
Staphylococcus aureus 21 3980 843
Staphylococcus sp.
coagulase negativo
10 3585 311
Streptococcus agalactiae 07 5393 903
Bacillus sp. 06 1359 76
Streptococcus dysgalactiae 05 4911 1083
Streptococcus sp. 05 3704 685
Corynebacterium bovis 04 1721 62
Figura 9: Histograma com as médias de CCS e CBT das bactérias isoladas de
amostras de leite obtidas de vacas positivas no CMT no período de abril a
dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e Noroeste do Estado do
Rio de Janeiro.
Médias de CCS e CBT
0 2000 4000 6000
(x1000céls/mL)
(x1000UFC/mL)
CCS
CBT
Corynebacterium bovis
Streptococcus sp.
Streptococcusdysgalactiae
Bacillus sp.
Staphylococcus sp.coagulase negativo
Streptococcusagalactiae
Staphylococcus aureus
47
5.5 Correlação entre ECS, ECBT e crescimento qualitativo:
A correlação entre as características ECS e ECBT apresentou-se positiva
e de alta magnitude (0,69), o que significa que ao aumentar o ECS, também
aumenta o ECBT (Tabela 6). Observou-se um coeficiente de correlação baixo
entre ECRTO com ECS (0,13) e ECRTO com ECBT (0,12). A relação entre CCS
e a CBT de rebanhos leiteiros foi avaliada por RYSANEK e BABAK (2005)
obtendo índice de correlação alto (0,84), quando a CCS era maior que 400 x 103
céls/mL, o que concorda com as observações do estudo realizado.
Tabela 6 - Correlação entre ECS e os valores de ECBT e crescimento qualitativo
em placa das amostras de leite analisadas, no período de abril a
dezembro de 2006, de propriedades nas regiões Norte e Noroeste do
Estado do Rio de Janeiro.
Variável ECBT ECRTO
ECS 0,69** 0,13ns
ECBT - 0,12ns
**(p<0,01) significativo
ns= não significativo
ECS: Escore de Células Somáticas
ECBT: Escore de Unidades Formadoras de Colônias
ECRTO: Escore de crescimento qualitativo em placa
Na Figura 10 é apresentada a regressão linear entre os escores de Células
Somáticas e Contagem Bacteriana Total. A reta formada pela equação
y=5,27+0,48(x) indica que a cada incremento no ECBT, acarreta um aumento de
0,48 no ECS e estes resultados corroboram com os coeficientes de correlação
encontrados.
48
Figura 10: Regressão Linear entre ECS e ECBT
Regressão Linear
y = 5,27 + 0,48x
R2 = 0,69
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ECBT
ECS
ECS = Escore de Células Somáticas
ECBT = Escore de Contagem Bacteriana Total
49
6. CONCLUSÕES:
1. Nem sempre o CMT 3 + demonstra uma CCS elevada no leite individual. 2. A principal bactéria isolada foi o Staphylococcus aureus. 3. O Streptococcus dysgalactiae foi o que produziu maior média de CBT. 4. Existe uma correlação positiva entre ECS e ECBT nas amostras de leite
individual. 5. Animais com maiores médias de CCS e CBT apresentaram diferentes escores de
crescimento em placa e este critério não pode ser utilizado como parâmetro de avaliação microbiológica do leite.
50
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APÊNDICE
QUESTIONÁRIO QUESTIONÁRIO N° _______ PROPRIEDADE : ________________________________________________ NOME: ________________________________________________________ RESIDE NA PROPRIEDADE? SIM □ NÃO □ ESCOLARIDADE : ____________ AREA DA PROPRIEDADE: _______________ AREA DE PASTAGEM: __________________ NATURAL □ FORMADA □ N° ANIMAIS: _________ MACHOS = ______ FEMEAS = ________ ANIMAIS EM LACTAÇAO: ________ VACAS FALHADAS: _________ GRAU DE SANGUE PREDOMINANTE: _____________________________ INSEMINAÇAO ARTIFICIAL: SIM □ NÃO □ ALIMENTAÇAO: PASTAGEM □ CANA □ CAPINEIRA □ SILAGEM □ CONCENTRADOS □ SAL MINERAL? ____________________ POLPA CITRICA □ FARELO DE ALGODAO □ OUTROS:______________________________________________________________
VACINAÇAO
AFTOSA □ BRUCELOSE □ MANQUEIRA □ RAIVA □ PARATIFO □ VERMIFUGAÇAO: PRODUTO ___________________________________________ QUANDO ___________________________________________ CARRAPATO : PRODUTO ____________________________________________ BERNE QUANDO ___________________________________________
CONTROLE: FICHA □ CADERNO □ NÃO ANOTA □ DOENÇAS MAIS FREQUENTES: DIARREIA □ PNEUMONIA □ _________________ LEITE TIPO DE ORDENHA: MANUAL □ MECANICA □ CONTROLE DO FLUXO / MANUTENÇAO DA BOMBA: FREQUENCIA __________ N° DE ORDENHAS: 1 □ 2 □ 3 □ HIGIENE: PRÉ DIPPING □ PÓS DIPPING □ PRODUTOS UTILIZADOS : _________________________________________ SECAGEM DAS TETAS : SIM □ PANO□ PAPEL□ NÃO □ LINHA DE ORDENHA: SIM □ NÃO □ PERÍODO SECO Qual critério utilizado pra secagem? ___________________________ Tempo de descanso ____________ TERAPIA DA VACA SECA (ATB) : SIM □ NÃO □ MÉDIA DE PRODUÇAO EM LITROS: AGUAS ___________ SECA ______________ CMT _______________ CANECA TELADA ______________ TANQUE DE EXPANSAO □ IMERSAO □ CAPACIDADE: _____________ CAMINHAO: DIÁRIO □ CADA 2 DIAS □ PROBLEMAS COM LEITE ÁCIDO? SIM □ NÃO □ _________________________ MASTITE CLÍNICA TRATA? SIM □ NÃO □ ___________________________ SABE O QUE É MASTITE SUBCLINICA? SIM □ NÃO □ VACAS DE DESCARTE – QUAL CRITÉRIO? _________________________________
Perfil das propriedades (RESPOSTAS DO QUESTIONÁRIO) 1)Tamanho: Até 10 alqueires: 20% De 10 a 30 alqueires: 26,67% De 31 a 50 alqueires: 13,33% De 51 a 100 alqueires: 20% Mais de 100 alqueires: 6,67% Não souberam informar: 13,33% 2) Número de animais: Até 20 animais: 6,67% De 21 a 50 animais: 6,67% De 51 a 100 animais: 40% De 101 a 200 animais: 13,33% De 201 a 300 animais: 20% Mais de 300 animais: 6,67% Não soube informar: 6,67% 3) Grau de sangue: GIROLANDA: 40% 5/8 HOLANDÊS, ¾ GIR: 6,67% HOLANDÊS P.O. E 5/8 HOLANDÊS, ¾ GIR: 6,67% ½ sangue HOLANDÊS, ½ sangue GIR: 13,33% MESTIÇO + GIROLANDA: 6,67% MESTÇO JERSEY X HOLANDÊS: 6,67% PARDO SUÍÇO X GIROLANDO (tricross): 6,67% MESTIÇO (sem especificação): 13,33% 4) Inseminação Artificial: SIM: 66,67% NÃO: 33;33%
Perfil da exploração leiteira e produção
1)Tipo de ordenha: MANUAL: 20% MECÂNICA: 66,67% AMBAS: 13,33% 2) Manutenção da ordenhadeira (mecânica): NÃO FAZIAM: 20% FAZIAM: 80% Dos quais: MENSALMENTE: 8,33% A CADA 3 MESES: 8,33% A CADA 4 MESES: 8,33% A CADA 6 MESES: 16,67% NÃO SOUBERAM PRECISAR: 58,3% 3) Número de ordenhas: 1 ordenha: 20% 2 ordenhas: 66,67% 2 ordenhas para as melhores vacas, 1 para as demais: 6,67% 3 ordenhas para as melhores vacas, 2 para as demais: 6,67% 4) Pré e/ou pós-dipping: NÃO FAZIAM: 40% SÓ O PRÉ-DIPPING, COM IODO: 26,67% SÓ O PÓS, COM IODOPOVIDONA: 6,67% PRÉ E PÓS-DIPPING, COM IODO: 26,67% 5) Secagem dos tetos: NÃO FAZIAM: 60% COM PAPEL: 33,33% COM PANO: 6,67% 6) Linha de ordenha: NÃO: 26,67% SIM: 66,67% NÃO SOUBE RESPONDER: 6,67%
7) Vacas lactantes X falhadas: 0% falhadas: 46,67% 0 a 1%: 6,67% 1 a 5%: 6,67% 5 a 10%: 6,67% Mais que 10%: 6,67% Não souberam precisar: 20% 8) Controle: NÃO ANOTAM: 33,33% CADERNO: 40% FICHA INDIVIDUAL: 13,33% COMPUTADOR: 6,67% NÃO SOUBE DIZER: 6,67% 9) Critério para a secagem das vacas: TEMPO DE LACTAÇÃO/ IDADE DO BEZERRO: 53,33% POR PRODUÇÃO: 26,67% TEMPO DE LACTAÇÃO E PRODUÇÃO: 13,33% NÃO SOUBE PRECISAR: 6,7% 10) Período de descanso dos animais: 60 dias: 33,33% 60 a 90 dias: 26,67% 90 a 120 dias: 6,67% 120 a 240 dias: 13,33% NÃO SOUBE PRECISAR: 20% 11) Terapia da vaca seca: SIM: 60% NÃO: 26,67% NÃO SOUBE DIZER: 6,67% 12) Produção: águas X seca Menor produção na seca: 33,33%, com queda de 16,67% a 25% na produção. Produção igual na seca e nas águas: 46,67% Maior produção na seca: 13,33%, com aumento de 50 a 53,85% na produção. Não souberam precisar: 6,67%
13) Tanque: tipo/capacidade IMERSÃO: 6,67% EXPANSÃO: 93,33% Dos quais:
- até 1000L: 35,71% - de 1000 a 2000L: 35,71% - de 2000 a 3000L: 7,14% - de 3000 a 4000L: 7,14% - mais de 4000L: 7,14% - não soube informar: 7,14%
14) Freqüência da passagem do caminhão: DIÁRIO: 6,67% DE 2 EM 2 DIAS: 86,67% NÃO INFORMA: 6,67% 15) Problemas com leite ácido? SIM: 13,33% RARAMENTE: 6,67% NÃO: 73,33% NÃO INFORMA: 6,67% 16) Critérios para descarte de animais do plantel: IDADE: 53,33% PERDA DE TETOS: 13,33% MASTITE: 13,33% PRODUÇÃO: 13,33% REPRODUÇÃO: 20% NÃO INFORMA: 6,67%
