Quantos e qual o tipo de micróbios que existem em alguns miligramas de solo?

Coordenadora de estágio: Margarida Santana

Francisco PascoalAna CoelhoSara Medinas

DNAConstituído por duas

cadeias de nucleótidos;Cada nucleótido tem

uma pentose, uma base fosfato, e uma base azotada;

Todos os nucleótido são essencialmente iguais, variando apenas a base azotada.

A - Introdução

DNA

As duas cadeias formam uma dupla hélice e têm sentidos opostos, como está evidenciado na figura.

Os nucleótidos das cadeias ligam-se através das bases azotadas.

Adenina(A)-Timina(T)Guanina(G)- Citosina (C)

DNA

As ligações G-C são triplas (mais fortes)

As ligações A-T são duplas (mais fracas)

Bactérias

Legenda:1. DNA cromossómico;2. Plasmídeos;

16s rDNA

O genoma bacteriano é constituído por cromossoma e plasmídeo, o DNA codificante do RNA ribossomal (16s rDNA) está no cromossoma

Replicação do DNA é semi-conservativa

O PCR imita a replicação do DNA

O que é necessário para o PCR? DNTP (nucleótidos no meio de reacção); Iniciadores; Enzima (DNA polimerase termo estável,

isolada a partir de uma bactéria termofilica); Tampão com magnésio.

Após a primeira replicação cada molécula de DNA origina duas moléculas.

Consequentemente, a quantidade de moléculas formadas será 2ⁿ, sendo n o número de replicações.

Com este processo e a partir de pequenas quantidades de DNA, obtemos grandes quantidades – amplificação.

1

2Legenda:1. Iniciador2. DNTP

Nota: São necessários dois iniciadores, um “forward“ e um “reverse”.

Os iniciadores a utilizar dependem da parte que se quer amplificar.

No nosso caso, utilizámos o P341 F-GC e P518 R, que são primers universais bacterianos.

1. Desnaturação de DNA a alta temperatura (95ºC);2. Descida de temperatura para os iniciadores se unirem à

cadeia;3. Subida à temperatura optima de extensão da DNA

polimerase;

1,2 e 3, constituem um ciclo que é repetido 35 vezes.

DGGE

No final do PCR obtemos um único fragmento, mas que corresponde a uma enorme quantidade de DNA de diferentes microrganismos. Para os podermos separar usamos o DGGE

Como funciona? Temos um gel com um gradiente de concentração de ureia, (maior concentração em baixo do gel.) A ureia vai desnaturar o DNA. Como temos diferentes sequencias de DNA, umas com mais G-C do que outros, estas vão oferecer maior resistência à desnaturação do que as ricas em A-T.

As moléculas mais ricas em G-C migram mais, só desnaturando na zona do gel com mais ureia.

Micro pipetas

Para pipetar pequenos volumes, as micro pipetas são um utensílio fundamental, que tivemos de aprender a utilizar correctamente.

B – Material e métodos

Verificação do DNA Em 1 está colocado um gel de agarose, ligado a uma fonte de alimentação. No gel colocámos as amostras de DNA recolhido.O DNA migra do pólo negativo para o positivo, separando-se de acordo com o seu tamanho.

1

Como vamos ver as bandas de DNA? Usamos Brometo de Etidio, que se intercala no DNA e é visível sob UV.

Corrida do gel

Para evitar contaminações as reacções de PCR são preparadas numa câmara previamente tratada com UV.

Após a preparação das soluções, fizemos o PCR no termociclador.

Preparação dos géis para o DGGE

1.Placa de agitação2.Agitadores magnéticos3.Gradientador: dois tubos que levam soluções com diferente concentração de ureia.4. Bomba peristáltica.

2

1

4

3

6Em 6 temos placas de vidro, onde é depositado o gel, que deriva do gradientador.

Tina de eletroforece

Aqui é colocado o gel

C- Resultados

2

1

1. Marcador;2. Amostra B (sem

manganésio);3. Amostra M (com

manganésio);

Por comparação com o marcador, podemos inferir que a amostra B tem menos concentração do que a amostra M.

3

Após o PCR vêm-se bandas da região amplificada, correspondente a um fragmento de cerca de 200 Pb.

De novo, percebe-se que há mais concentração de amostra B do que de M.

200pb

MarcadorBSem manganésio

Migração dos fragmentos em DGGE

M Com

magnésio

D- Discussão

• É difícil visualizar as bandas da amostra B, muito provavelmente devido à quantidade de DNA presente.

•A banda assinalada na foto anterior não existe em B e poderá corresponder a um organismo que se adapta melhor a solos ricos em manganésio

Também se conclui que temos poucos microrganismos, ou seja, pouca diversidade; o gel ao lado é exemplo dos muitos microrganismos esperados em solos “saudáveis”