Controle da Expressão Gênica_Eucariotos

Controle da

Expressão Gênica

- Eucariotos -

Princípios de Bioquimica – Lehninger- Quarta Edição

Biologia Molecular da Célula – Bruce Alberts et al. – Quinta Edição

Conteúdo genômico x diferenciação celular

Células eucariotas

Regulação da expressão gênica em eucariotos

• Em procariotos, os genes são normalmente controlados

na forma de operons.

• Em eucariotos, genes são controlados individualmente e

operons não são conhecidos.

• O controle da expressão gênica é muito mais complexa:

– Existência de um núcleo e assim transcrição e

tradução não são acopladas.

– A RNA polimerase II é muito maior e complexa do

que sua contraparte procariótica.

– Os mRNA são processados durante a transcrição

(capacete 5’, caula poliA, introns).

Expressão gênica em eucariotos

Possíveis pontos de controle

• Inciação da transcrição

• Processamento de RNA

• Transporte de mRNA para o

citoplasma

• Degradação do mRNA

• Iniciação da tradução

• Modificação pós-traducional e

degradação de proteínas

Regulação Transcricional

Estado basal de Transcrição

• As RNA polimerases eucarióticas possuem baixa afinidade

pelos regiões promotoras.

• A iniciação da transcrição é dependente da ação de mútliplas

proteínas reguladoras.

• Ocorre uma predominância da regulação positiva: o

armazenamento do DNA dentro da cromatina torna a maioria

dos promotores inacessíveis.

• Maior eficiência da regulação positiva.

Estado basal de Transcrição

• Em eucariotos promotores estão geralmente

inativos e os genes silenciados:

– O acesso aos promotores é restrito pela

estrutura da cromatina.

– Predominância dos mecanismos reguladores

positivos.

– Presença de proteínas reguladoras complexas.

Como “ligar” um gene eucariótico?

• Remodelagem da cromatina

• Proteínas regulatórias

• Recrutamento de fatores de transcrição ao

complexo de iniciação.

Remodelagem da cromatina

Essencial para tornar o DNA mais acessível aos fatores de

transcrição

A Estrutura do Cromossomo Eucariótico

Duas

cromátides

(10 espiras

cada)

Uma espira

(30 rosetas)

Uma roseta

(6 alças)

Uma alça

~75Kb

Fibra de

30nm

Forma da

cromatina em

“colar de

contas”

Remodelagem da cromatina

• O DNA interfásico é ainda bem condensado.

• A inacessibilidade da cromatina pode ser

demonstrada por ensaios de sensibilidade

da a nucleases. – Genes inativos são resistentes a DNAse.

– Genes ativos são mais sensíveis ao tratamento com

DNAse.

Sensibilidade da cromatina à DNAse

Em eritrócitos de galinha o gene da

ovoalbumina é totalmente insensível

ao tratamento com DNAse I : está

inativo

O gene da beta-globina adulta é mais

sensível a digestão com DNAse I

enquanto o gene da beta-globina

embriônica é menos sensível.

Em eritrócitos de galinha o gene da

ovoalbumina é totalmente insensível

ao tratamento com DNAse I : está

inativo

Sensibilidade da cromatina à DNAse

O papel da cromatina na expressão

Gênica Eucariótica

• As regiões heterocromáticas altamente condensadas têm menos genes e menores frequências de recombinação do que as regiões eucromáticas menos condensadas.

• Entretanto a cromatina eucromática pode ser alterada e além disso, genes ativos nessas regiões podem ser se tornar inativos por diferentes mecanismos.

A cromatina

• A estrutura da cromatina está diretamente relacionada com o controle da expressão gênica.

• O primeiro nível de organização da cromatina é o nucleossomo.

• Os nucleossomos são capazes de bloquear o acesso da RNA polimerase II ao promotor.

Organização do Nucleossomo

• O cerne do nucleossomo é formado por 8

proteinas histonas (histonas nucleossomais)

– duas H2A,

– duas H2B,

– duas H3

– duas H4

Porção N-terminal da cadeia polipeptídica

Octâmero de histonas

Papel da histona H1 (histona não-nucleossomal)

Tratamento da cromatina com DNAse

DNA ligante Histonas

Cromatina na forma

de contas em colar Nuclease digere o

DNA ligante

Unidade repetida

de 200pb

Perfil de eletroforese

Tratamento da cromatina com DNAse

DNA ligante Histonas

Cromatina na forma

de contas em colar Nuclease digere o

DNA ligante

Unidade repetida

de 200pb

A Remodelagem da Cromatina

• A remodelagem da cromatina ocorre

através de três mecanismos:

– Reposicionamento dos nucleossomos

– Modificações pós-traducionais das histonas

– Metilação do DNA

Reposicionamento dos Nucleossomos

• A organização da cromatina não permite

que os fatores de transcrição e a RNA

polimerase acesse os sítios de ligação no

DNA


Complexo SWI/SNF:

– 11 subunidades

• Inclui atividades de ligação ao DNA e ATPase

• Comum em eucariotos (leveduras a humanos)

– Remodelador global da cromatina permitindo que regiões

do DNA sejam mais acessíveis às proteínas da transcrição.

Movem ou deslocam os nucleossomos hidrolisando ATP.

• Em leveduras, o

complexo protéico

SWI-SNF

reposiciona os

nucleossomos de

maneira a expor as

sequências

promotoras e

acentuadoras no

DNA

Complexo SWI-SNF


Modificações nas Histonas

• As histonas do nucleossomo sofrem modificações

pós-traducionais:

– Acetilação

– Fosforilação nos resíduos de Serina e Treonina

– Metilação nos resíduos de Lisina (irreversível)

– Ubiquitinação

Acetilação da Histonas

• Acetilação dos resíduos de lisina remove cargas positivas global das histonas.

• Isto provoca uma redução da afinidade das histonas pelo DNA.

• Assim, a RNA Polimerase II e fatores de transcrição têm acesso mais fácil a região promotora.

• Acetilação das histonas está associada a genes ativamente expressos.

Diminuição das cargas positivas das histonas por

modificação de Lys (Acetilação e metilação)

X

Ativação do gene

Menor interação DNA-histona

irreversível

Acetilação de histonas

Vídeo

Acetilação/Desacetilção de

Histonas

Metilação de histonas

Metilação do DNA

• Metilação do DNA é a

adição de um grupo

CH3 nas bases do

DNA

• O padrão de metilação

mais conhecido é nas

regiões ricas em

Citosina e Guanina

• Estas regiões são

conhecidas como

“ilhas CpG”

Metilação da Citosina

• O nível de metilação do DNA geralmente

está correlacionado ao estado

transcricional de um gene: genes ativos

são menos metilados

Como a metilação afeta a

transcrição?

Características das Proteínas Regulatórias

• As proteínas regulatórias precisam desempenhar pelo menos duas funções:

– Ligar ao DNA

– Ativar ou Reprimir a Transcrição

Proteínas Regulatórias

Interações nos sulcos maior e

menor do DNA

Aceptores de

LH

Doadores de

LH

Interações

hidrofóbicas

Ligação de uma proteína regulatória ao sulco

maior do DNA

Domínios de ligação ao DNA

• A maioria dos domínios de ligação ao DNA são

carregados de aminoácidos positivos, de modo que são

atraídos para o arbabouço de fosfato do DNA.

• Os domínios de ligação se ajustam ao sulco maior do

DNA.

• Os domínios de ligação ao DNA das proteínas

regulatórias possuem estruturas conservadas de

leveduras aos humanos que são classificadas como:

– Hélice-volta-hélice

– Dedo de zinco (zinc finger)

– Hélice-alça-hélice

– Ziper de leucina

Interação com o DNA

Heterodimerização de proteínas

Ziper de leucina

Iniciação da transcrição


• Provavelmente, o mais comum nível de

regulação.

• Iniciação pode envolver a ação de mais de 100

proteínas diferentes.

• A maioria dos fatores atuam para ativar a

expressão.

• São poucos os repressores da iniciação da

transcrição.

• RNA polimerase II transcreve os mRNAs

• Controle da expressão gênica em eucariotos

requer a ação de fatores de transcrição:

– Fatores de transcrição gerais são necessários

para a iniciação da transcrição

– Fatores de transcrição específicos que

aumentam a transcrição gênica em certos tipos

de células ou em resposta à sinais específicos


Fatores Gerais de Transcrição

Fatores Gerais de Transcrição

• O início da transcrição ocorre através do reconhecimento dos promotores pelos fatores gerais de transcrição (FGT)

• A região promotora eucariótica típica se localiza na posição -30 (TATA box)

• FGT posicionam a RNA pol II no local correto para iniciar a transcrição

• O complexo de pré-iniciação é formado por 6 FGTs mais RNA pol. II (Complexo Basal de Transcrição)

Fatores Específicos de Transcrição

• Fatores Específicos de Transcrição são proteínas que reconhecem sequências de DNA que ocorrem acima do sítio de iniciação da transcrição

• Cada FET reconhece sequências cis específicas próximas ao promotor

• Um ou mais FET podem regular a expressão de um mesmo gene

1) Promotor (core): TATA

2) “Proximal promoter regions” (Upstream Promoter

Elements):

- CAAT ou CCAAT box

- GC box (consenso GGGCGG)

Elementos regulatórios cis

Promotores eucarióticos

Acentuadores e Silenciadores

Existem Fatores Específicos de Transcrição que

reconhecem sequências de DNA localizadas a

considerável distância tanto acima quando abaixo do

sítio de início da transcrição.

Acentuadores

• Acentuadores são sequências no DNA nos quais

fatores de transcrição específicos (ativadores) se ligam

para aumentar a taxa de transcrição.

• Quando estas proteínas se ligam ao DNA ocorre a

formação de alças aproximando as sequências

acentuadoras ao RNA pol II

Acentuadores e Ativadores

• O complexo acentuador/ativador interage a distância com a RNA polimerase no promotor resultando em uma transcrição mais eficiente e aumentada.

Acentuadores e Ativadores

• O complexo acentuador/ativador interage a distância com a RNA polimerase no promotor resultando em uma transcrição mais eficiente e aumentada.

Proteínas

HMG

Co-ativadores e Mediadores

• Co-ativadores e mediadores são

também necessários para a ativação dos

fatores de transcrição.

• Co-activadores e mediadores se ligam aos

fatores de transcrição e se associam a

outras partes do complexo de ativação da

transcrição

Mediadores

• O complexo protéico dos mediadores e os fatores de transcrição interagem com a RNA polimerase II para aumentar a transcrição

Silenciadores

• Silenciadores são sequências no DNA nos quais

fatores de transcrição específicos (repressores) se

ligam para diminuir a taxa de transcrição

Mecanismos de ação dos repressores transcricionais eucarióticos

Silenciadores (Silencers) e Repressores

Alguns exemplos de regulação

da transcrição em eucariotos

Regulação da transcrição dos genes do

metabolismo da galactose em leveduras

• As enzimas requeridas para a importação e metabolismo

da galactose são codificadas por seis genes dispersos em 3

cromossomos.

• Todos os genes GAL possuem promotores semelhantes e

são regulados coordenadamente por um conjunto de

proteínas.

• Os promotores para os genes GAL contém as sequências

TATA, Inr e UAS (enhancer)

• Ativador de transcrição que se liga a UAS: Gal4p

• Outras proteínas acessórias: Gal80p, Gal3p

Regulação da transcrição dos genes do metabolismo da galactose em leveduras

Ausência de

galactose

Complexo Gal80p

e Gal4p é inativo

na ativação

Regulação da transcrição dos genes do metabolismo da galactose em leveduras

Ausência de

galactose

Presença de

galactose e

Gal3p

Complexo Gal80p

e Gal4p é inativo

na ativação

Gal3p se liga a

Gal80p

• Hormônios Esteróides: estrógeno, progesterona, cortisol...

• Hidrofóbicos transportados na corrente sanguínea via proteínas

de transporte até o local de ação difundem-se pela membrana

núcleo celular ligação a proteínas regulatórias Sequências

regulatórias específicas do DNA (elementos responsivos ao

hormônio, HREs) expressão de proteínas específicas.

Regulação da transcrição pelos hormônios esteróides

Regulação da transcrição pelos hormônios esteróides

(Pro-Ala-Thr-Asn-Glu)

A regulação pode resultar da fosforilação de

fatores de transcrição nucleares

Compreende a ativação de uma proteína quinase no núcleo

que fosforila proteínas específicas de ligação ao DNA.

Se ligam aos receptores na superfície celular desencadeando

uma via de sinalização que pode levar à fosforilação de uma

proteína reguladora afetando sua atividade.

Hormônios não-esteróides

Regulação da expressão gênica da insulina

O receptor da insulina é uma proteína tirosina quinase-específica

Resumindo...

Cromatina (DNA + histonas)


Complexo de remodelamento da cromatina

Remodelamento da cromatina


Complexo de remodelamento da cromatina (SWI/SNF)


Enzimas de modificação de histonas

Modificação covalente de histonas






Outras proteínas ativadoras

Proteínas ativadoras adicionais ligadas à região de regulação gênica








Mediador

Fatores gerais de transcrição

RNA polimerase

Montagem do complexo de pré-iniciação no promotor








Mediador

Fatores gerais de transcrição

RNA polimerase

Montagem do complexo de pré-iniciação no promotor

Rearranjo das proteínas

no complexo de pré-

iniciação

Início da transcrição

Regulação Pós-Transcricional

• Introns são removidos dos pre-mRNA para

produzir o mRNA maduro para ser traduzido

• Processamento Alternativo reconhece

diferentes sítios de corte para remoção dos

introns

• Cada mRNA maduro terá diferentes exons o

que resulta em diferentes cadeias polipetídicas

originados de uma mesmo gene

• O dogma “Um gene, uma proteína” não é

verdadeiro

Processamento Alternativo

Processamento Alternativo

(diferentes maneiras de “emendar” um mRNA)

Controles negativo e positivo do

processamento alternativo do mRNA

Transporte de mRNAs para o citoplasma

Transporte de mRNAs para o citoplasma

A medida que a molécula de mRNA é processada ela perde determinadas proteínas

e adquire outras.

Proteínas perdidas: snRNA (RNAs

nucleares pequenos)

Complexos de ligação ao capacete

Complexos de Junção de exons

Proteínas de ligação à cauda poli-A

Proteínas ribonucleares nucleares heterogêneas (hnRNPs)

Proteínas adquiridas:

Introns excisados, RNAs quebrados e mRNAs que sofreram splicing anormal

são degradados no exossomo nuclear.

Somente os mRNA eucarióticos maduros são seletivamente exportados do núcleo.

Transporte de mRNAs para o citosol

Receptores de exportação nuclear

Uma das formas de controle traducional é evitar que estes mRNA defeituosos sejam

traduzidos nos ribossomos.

Entretanto alguns mRNA processados de forma incorreta são

enviados para o citoplasma e mRNAs podem quebrar

durante o tranporte.

NMD – Nonsense-mediated mRNA decay (Degradação do mRNA mediada por ausência de sentido)

(Behm-Ansmant, et al, 2007)

Células eucarióticas: mecanismos de controle de qualidade

que reconhecem e degradam mRNAs com danos.

Poderoso sistema de vigilância que elimina os mRNA defectivos antes que eles sejam traduzidos em proteínas.

• NMD acelera deadenilação, decapeamento e a

degradação 5’- 3’.


Degradação do mRNA

• A quantidade de proteína produzida de um

determinado gene pode ser influenciada

pela meia-vida do mRNA

• O mRNA maduro possuem diferentes

tempos de vida dependendo da sua

estabilidade na célula.

• Tamanho da cauda Poli(A).

Estabilidade de mRNA: Meia-vida

- enzimas de decapeamento – Dcp1 e Dcp2

- exonuclease 5’-3’ - Xrn1p

Sítios onde ocorrrem a destruição final da maioria dos mRNA

P-bodies (Corpos de Processamento)

Estruturas citosólicas compostas de grandes complexos de

mRNA e enzimas que degradam o mRNA.

Inibição da Tradução

Um dos mecanismos mais

importantes para a

regulação da tradução em

eucariotos envolve a

ligação de repressores da

tradução em sítios

específícos da região 3’

UTR

O posicionamento destas

proteínas impedem

diretamente o início da

tradução


IRES (Internal Ribosome Entry Site): presentes na extremidade 5’ do mRNA

Regulação da tradução dos mRNA de transferrina e ferritina:

metabolismo do ferro


Reciclagem de eIF-2 (Eucaryotic initiation factor)

O eIF2 se liga ao tRNA iniciador (Met – tRNA)

Controle da Expressão Gênica_Eucariotos

Documents

Transcript of Controle da Expressão Gênica_Eucariotos