Controle epigenético da expressão gênica em plantas Alteração da expressão gênica sem...
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Controle epigenético da expressão gênica em plantas
Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA
Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação
Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose
Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose
Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA
Mudanças no posicionamento do nucleossomaMudanças no empacotamento dos nucleossomas
Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de padrões específicos de metilação.
DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp
Modificações covalentes do nucleossomaMetilação: mecanismo mais connhecido
1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas
2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela):Configuração da cromatina permissível à metilação
3) “Targeting factor” reconhece a sequência a ser metilada,e traz consigo os fatores para a metilação:DNMT1: citosina-5-metil transferaseHDAC: desacetilase da histonaMeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado
4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonasresultando em sua condensação
Metilação e repressão transcricional
Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gametaExs: mamiferos, fungos e plantas
Bom nível de expressão quando transmitido pelo óvulo ::cor sólida da
semente
Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red):
Baixo nível de expressão quando transmitido pelo pólem ::cor variegada:
Mecanismo epigenético 1: Imprinting
Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene Rmas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas
2x x 2x
Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e ligadas ao sexo
Transgênicos e Mutantes hipometilados
Grande desenvolvimento do endospermaperiférico e chalazal, mas sem celularização
Fenocópia 4x x 2x
Fenocópia 2x x 4x Fenocópia 2x x 6x
Maternalização = redução da metilação
Reduzido endospermaperiférico e chalazal
Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente
paternal
Mecanismo do imprinting (ratos)Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot.
DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2
Bloqueia o estimulador de Igf2
Estimuladores
Endoderme Mesoderma
Específico para mesoderme
?
Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada napresenca de outro; herdável através da meiose
Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B’: pigmentacao fraca
B-I: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo B’B’: transcrição 10-20 vezes menor
Alelo Pl; forte pigmentação das anteras; Pl’: cor variegada
PI e P’: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P’
Mecanismo epigenético 2: Paramutação
DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado
Mecanismo da paramutação;
Mecanismo 1
Interação dos cromossomas
Mecanismo 2
formação da heterocromatina
Promotor 1
Promotor 2
RNAaberrante
Sinal difusivel: RNA
enzimas modificadoras das histonas fatores remodeladores da cromatina
Transferência direta de elementos da cromatina
Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação
Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica
Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e de outros pigmentos
ambos genes PAI tornam-se então metilados
Arabidopsis: o caso dos genes PAI: sintese triptofano:
2 genes, em 2 cromos.
PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase
Introdução de novos genes PAI não metilados tornam-se metilados
Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAIEstratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI
metilacoes
Planta transgênicautilizado na
seleção genética
10 mutante isolado
20 mutante isolado
metilaçãoredução nafluorescência
Nivel de metilação = reostatoNivel de metilação = reostato
controle do nível de controle do nível de expressão gênicaexpressão gênica
intermediário fluorescenteReação catalizada pela enzima PAI
TriptofanoTriptofano……….
Única sequência PAI que pode ser expressa no
cromossoma 1 foi mutada
Met1 e CMT3: codificam paraduas diferentes
metil-transferases deDNA
[ ] XX
Mecanismo epigenético 3: Silenciamento
Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco
Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências
Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento
Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1):
Adição da segunda cópia de A1: transcrição silenciada: herdável geneticamente
Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo,somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro.
Variegação: Silenciamento da segunda cópia
Introdução gene A1 do milho: cópia simples:Flor torna-se pigmentada
Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação
PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição
ddm1: afeta o reconhecimento da metilação
met1: afeta a metilação
mom1: TGS independente da metilação
Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão
Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo
Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase
Co-supressão não herdável geneticamente: atividade endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene
Silenciamento de viróides: enxerto de planta contaminada por um vírus em outra planta contaminada com
outro vírus:.
Silenciamento de outro vírus:Transmissão do sinal por toda a
planta:
Efeito a nível pós-transcripcional
Silenciamento não-herdável
Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias
Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente
Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina,
Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC
AutopoliploideAutopoliploide
Duplicação gênica
Duplicação gênica
HíbridoF1
AlopoliplóideAlopoliplóide
Diferencas no número de cormossomas ou organização
Inicio da formação de um poliplóide: “choque”:
podem romper o pareamento e distribuição
: duplicação dos cromossomas
- silenciamento genes duplicados; - reduzir “infidelidade” cromossomal
translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos
Eventos epigenéticos na poliploidização (70% angiosperma; 95% pteridófitas)
Modelo explicativo do silenciamento em poliplóidesModelo explicativo do silenciamento em poliplóides
Causas potencias da origem da variabilidade em poliplóides
Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticasSeleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas
ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina;
Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação
Sem fenótipo visível; autofecundação:
reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais
Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes
1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica
Plantas antisenso para MET1;redução em 30% no nível de metilação
Hipermetilaçãodo gene SUPERMAN
Hipermetilaçãodo gene SUPERMAN
e do gene AG
progenia anormal::desestabilização da programação epigenética
Paradoxo?
Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos no controle do florescimento (repressores epigeneticos)
Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina
Repressores epigenéticos
Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente,
35S:TFL135S:TFL1
4 sépalasnova influorescência
35S:EMF1 + DL35S:EMF1 + DL
duas folhas caulinaresflor terminal (2 silíquas)
novo broto terminal
35S:EMF1 + DC35S:EMF1 + DC
flores e brotosoriginados na mesma
regiao
Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênicae dos processos de desenvolvimento
Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas
2) florescem sob DC, flor terminal,
3) proteínas de reserva da semente são expressas antes
PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em plantas
Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora
PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi
PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces)
Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou ambientais::flexibilidade
Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento
Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos)
Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons
2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA)
DICER
Pode ser transmitido entrecélulas e a longas distâncias
PGTS(Silenciamento pós-transc.
Comprimento médio de 25 nucleotídeos
Tamanho médio de 70 nucleotídeos
Tamanho médio de 70 nucleotídeos
Dupla fita
Fita simples
Fita simples
Perfeitamente complementar ao RNA alvo
Parcialmente complementar ao RNA alvo
Parcialmente complementar ao RNA alvo
Direciona a clivagem endonucleolítica
Mecanismo de ação desconhecido
Inibe a tradução do mRNA
RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado
RNA dupla fita pareado, mas com alças
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Não conservado entre as espécies
Frequentemente conservado entre as espécies e filos
Altamente conservado entre as espécies e filosAltamente conservado entre as espécies e filos
Cromossomal ou citoplásmico
Cromossomal (IGR)
Cromossomal (IGR)
RNA curto de interferência (siRNA)
RNA curto temporal (stRNA)
Micro RNA (miRNA)
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Mecanismos pelos quaisos microRNAs promovem
o silenciamento
RNAse tipo III
Complexo deendonucleases
Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P)
Metilação da histona
Recrutamento: criação de um sítio de nucleação da heterocromatina
Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina:Silenciamento do locus mat2P
Dicer
Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod
61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais
Dif. Merist. Axilar e da folha
Separação de orgãos
Identidade floral
Desen. floral
Desen. floral
Desen. floral
Desen. floral
TRV: tobacco rattle virus
TRV-00: vírus sem insertoTRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFPTRV-35S: 347 nt do promotor da GFP
Luz UV
Luz UV
Nuclear Run of: taxa de transcrição
Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP
PTGS
PGS
Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico
HC-Pro: proteína viral quesuprime o silenciamento
SilGUS: locus de silenciamentode GUS
Silenciamentosistêmico
Supressão do silenciamento sistêmico
RNAi: poderosa ferramenta
atFAD2: Desaturase de A. thaliana
AttP1/AttP2: clonagem por Recombinação utilizando o sistema
Gateway
Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2
Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway
Gene orientaçãoSenso substitui ccdB
Gene orientaçãoanti-senso substitui ccdB
Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante
RNAi