CONTRIBUIÇÃO DOS MICROSSATÉLITES DE DNA NA … · Seminário apresentado junto à Disciplina...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS CONTRIBUIÇÃO DOS MICROSSATÉLITES DE DNA NA CARACTERIZAÇÃO RACIAL Bruna Paula Alves da Silva Orientador: Prof. Dr. José Robson Bezerra Sereno GOIÂNIA 2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
CONTRIBUIÇÃO DOS MICROSSATÉLITES DE DNA NA
CARACTERIZAÇÃO RACIAL
Bruna Paula Alves da Silva
Orientador: Prof. Dr. José Robson Bezerra Sereno
GOIÂNIA
2011
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BRUNA PAULA ALVES DA SILVA
CONTRIBUIÇÃO DOS MICROSSATÉLITES DE DNA NA
CARACTERIZAÇÃO RACIAL
Seminário apresentado junto à Disciplina
Seminários Aplicados do Programa de
Pós-Graduação em Ciência Animal da
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Nível: Mestrado
Área de Concentração:
Produção Animal
Linha de Pesquisa:
Fatores genéticos e ambientais que
influenciam o desempenho dos animais
Orientador:
Prof. Dr. José Robson Bezerra Sereno - EMBRAPA CERRADOS
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG
Dra. Raquel Soares Juliano - EMBRAPA PANTANAL
GOIÂNIA
2011
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................ iv
LISTA DE TABELAS........................................................................ v
LISTA DE QUADROS...................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................. vii
1 INTRODUÇÃO................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................ 3
2.1 Marcadores moleculares.................................................................. 3
2.1.1 Marcadores microssatélites.............................................................. 4
2.1.1.1 Aplicações dos marcadores microssatélites.................................... 6
2.1.1.2 Vantagens e desvantagens da utilização de marcadores
microssatélites..................................................................................
6
2.1.2 Técnicas utilizadas para a genotipagem de marcadores
moleculares......................................................................................
7
2.1.2.1 Reação em cadeia da polimerase.................................................... 7
2.1.2.1.1 Vantagens e desvantagens de utilização da PCR........................... 10
2.1.2.2 Eletroforese....................................................................................... 11
2.1.3 Seqüenciamento de DNA................................................................. 13
2.1.3.1 Seqüenciamento manual de DNA.................................................... 13
2.1.3.2 Seqüenciamento automático de DNA............................................... 13
2.2 Caracterização genética por marcadores microssatélites................ 15
2.3 Diversidade genética........................................................................ 27
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................. 29
REFERÊNCIAS................................................................................ 30
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 A: genótipo homozigoto, B: genótipo heterozigoto, ambos para uma
região genômica que compreende um microssatélite de elementos
(CA)/(GT). C: gel de eletroforese com diferentes genótipos
homozigotos, com banda única e heterozigotos, com duas bandas,
em indivíduos diplóides......................................................................
5
Figura 2 Slippage.............................................................................................. 9
Figura 3 Esquema dos quatro primeiros ciclos de uma reação de PCR.......... 10
Figura 4 Padrão de bandas observado para os alelos do microssatélite
TGLA122. Raias 1 e 20, DNA ladder 10pb. Raia 2, marcador de
DNA de tamanho padrão. Raias 3,4,..., 19, DNA dos animais
estudados. Os números ao lado esquerdo da figura indicam o
tamanho dos fragmentos de DNA em pares de bases......................
15
Figura 5 Dendrograma construído utilizando o método de UPGMA a partir
dos 15 locus analisados. EA: Eqüino Árabe. JB: Jumento
Brasileiro. JP: Jumento Pêga. JN: Jumento Nordestino....................
26
Figura 6 Agrupamento individual dos 215 indivíduos das três raças asininas
e da raça eqüina Árabe, pelo método estatístico Bayesiano
utilizando o programa STRUCTURE. EA: Eqüino Árabe, JB:
Jumento Brasileiro, JN: Jumento Nordestino e JP: Jumento Pêga....
27
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Probabilidade de paternidade (PP) nas famílias em que não
ocorreu exclusão de paternidade...................................................
18
Tabela 2 Polimorfismo de 15 loci de microssatélites em 87 amostras de
DNA de galinhas caipiras de ovos azuis........................................
20
Tabela 3 Número de alelos (NA), heterozigosidades observada (Ho) e
esperada (He) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), em
função dos loci analisados.............................................................
22
Tabela 4 Locus em desequilíbrio Hardy-Weinberg....................................... 23
Tabela 5 Número de indivíduos (N), riqueza alélica (AR), média do
número de alelos por locus considerando-se o número amostral
(i.e), heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade
esperada (He), coeficiente de endogamia (FIS).............................
25
Tabela 6 Estimativa aos pares de diferenciação genética e distância
genética entre as três raças de asininos e a raça eqüina Árabe.
As estimativas de FST encontram-se acima na diagonal e abaixo
se encontra a identidade genética de Nei’s. Todas as
estimativas de FST foram significativas (p<0,01)............................
26
vi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Probabilidade de Exclusão (PE) para cada microssatélite e
Probabilidade de Exclusão Combinada (PEC) para todos os
marcadores.......................................................................................
16
Quadro 2 Famílias excluídas nos testes de paternidade e marcadores
microssatélites responsáveis pela exclusão....................................
17
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
DNA - Ácido desoxirribonucléico
EHW - Equilíbrio de Hardy-Weinberg
FAO - Food and Agriculture Organization
He - Heterozigosidade Esperada
Ho - Heterozigosidade Observada
ISAG - Sociedade Internacional de Genética Animal
MoDAD - Meansurement of Domestic Animal Diversity
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PE - Probabilidade de Exclusão
PEC - Probabilidade de Exclusão Combinada
PP - Probabilidade de Paternidade
1 INTRODUÇÃO
O conhecimento da estrutura genética de raças, espécies e populações
se faz importante para a caracterização racial e consequentemente para
preservação de animais que estejam sendo extintos. O estudo genético utilizando-
se marcadores microssatélites possibilita definir a diversidade genética entre
animais e raças, proporcionando maior eficiência dos programas de
acasalamentos por meio do estudo da genealogia dos animais, otimizando o
sistema de criação destes e auxiliando os criadores na escolha de métodos mais
adequados ao sistema de produção em que estes animais estão inseridos.
Com vistas a implementar programas de conservação se faz
necessária a utilização de técnicas que auxiliem a análise de parentescos e a
identificação genética de indivíduos para direcionar os acasalamentos visando a
manutenção da diversidade genética (EGITO et al., 2005).
Os marcadores moleculares têm sido bastante utilizados para
identificar genes de interesse econômico, mapeamento genético, estudos
evolucionários, identificação de paternidade, introgressão de genes úteis,
diagnóstico precoce de doenças, caracterização assistida por marcadores e
caracterização genética de populações locais (AMARANTE & WOMACK, 2004).
O avanço da biologia molecular, a descoberta de marcadores
moleculares do tipo microssatélites de DNA e o uso da Reação em Cadeia da
Polimerase, possibilitou a identificação de polimorfismos em vários sítios
genômicos nos animais, revolucionando o monitoramento genético de populações
(SILVA, 2007).
Os marcadores microssatélites são neutros e altamente polimórficos,
sendo utilizados para estimação de distâncias genéticas, estruturação
populacional, identificação racial, realização de testes de paternidade, estudos de
caracterização genética e possibilitam o estabelecimento das relações
filogenéticas entre diversas raças (KUMAR, 2000; MAUDET et al., 2002).
A reação em cadeia da polimerase possibilita a realização de testes
altamente sensíveis, dependendo da habilidade de extrair DNA em quantidade
suficiente e com qualidade adequada à técnica que vai ser utilizada, considerando
2
que o DNA é a base para se produzir conhecimentos genéticos (COELHO et al.,
2004).
As estratégias de conservação animal se baseiam na caracterização
das raças e populações para verificar a diversidade genética existente entre
estas. Durante muito tempo a caracterização dos recursos genéticos animais
baseou-se em características morfológicas e produtivas, sendo estas insuficientes
para distinguir raças e influenciadas pelo ambiente. As estratégias de
conservação devem se embasar na combinação de dados fenotípicos e
genotípicos (EGITO et al., 1999).
A caracterização genética se faz importante aos programas de
conservação animal, considerando que esta avalia as distâncias entre
populações, facilitando na escolha dos animais a serem utilizados na conservação
animal, in situ e ex situ, utilizando estimativa de índices de similaridade entre os
indivíduos analisados, além de auxiliar programas de acasalamentos que
favoreçam a variabilidade genética entre e dentro das populações (EGITO et al.,
2001).
Objetivou-se descrever a importância dos microssatélites de DNA para
a caracterização racial de diferentes espécies, visando manter a diversidade
genética dentro das raças.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Marcadores moleculares
Os marcadores moleculares ou marcadores genéticos podem ser
entendidos como sendo técnicas que permitem determinar pontos de referência
nos cromossomos, capazes de diferenciar indivíduos. Dessa forma, os
marcadores de DNA podem ser definidos como características de DNA que são
herdadas geneticamente e diferenciam indivíduos (MILACH, 1998).
Para realizar a caracterização genética de populações os marcadores
moleculares têm sido muito utilizados, quantificando a diversidade genética,
principalmente de animais domésticos. Estes são loci que possuem
características capazes de serem identificadas, sendo que estas características
possibilitam a diferenciação dos indivíduos (MENEZES et al., 2006).
Os marcadores podem ser classificados de acordo com a metodologia
para identificá-los, sendo elas a hibridização ou amplificação de DNA. Os
marcadores moleculares RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e os
locus VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) ou minissatélites são
identificados por hibridização, enquanto os marcadores do tipo RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions),
STS (Sequence Tagged Sites), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
e microssatélites são identificados por amplificação e foram desenvolvidos após a
descoberta da PCR, que por sua vez, permitiu a amplificação de DNA in vitro
(MILACH, 1998).
Vários tipos de marcadores moleculares detectam o polimorfismo
genético diretamente do DNA, entre estes, destacam-se a classe conhecida como
microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats), ou ainda STR (Short
Tandem Repeats), por serem bastante polimórficos, ou seja, possuem grande
habilidade para detectar diferenças entre indivíduos (FALEIRO, 2007).
4
2.1.1 Marcadores microssatélites
Para a confecção de mapas genéticos, as análises que mais se
destacam são as obtidas por marcadores microssatélites, que são sequências
repetidas de DNA, apresentando loci discretos e alelos co-dominantes. Os
microssatélites são sequências de um a seis nucleotídeos de comprimento, que
se repete em tandem, ocorrendo consecutivamente uma após a outra. Possuem
maior capacidade de ganhar alelos que perder, sendo que um lócus de um
microssatélite tem aproximadamente quatro a dez alelos, além de serem
facilmente amplificados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR), podendo ser analisados depois de passar pela eletroforese (STRACHAN
& READ, 2002; MENEZES et al., 2006).
Para obtenção de marcadores microssatélites, existem diversos
protocolos como: derivados de EST (Expressed Sequence Tag), ou seja,
etiquetas de sequências expressas; por meio de bibliotecas genômicas
enriquecidas; transferibilidade, entre outros (ZAHA et al., 2003).
Os microssatélites apresentam freqüentemente uma heterozigosidade
esperada acima de 0,7 e são altamente polimórficos, o que possibilita uma
discriminação bastante precisa de indivíduos próximos, além disso, são também
abundantes e dispersos de forma uniforme no genoma, proporcionando facilidade
para que suas informações sejam compartilhadas em laboratórios (BRONDANI et
al., 1998).
A Food Agriculture Organization (FAO) e a International Society of
Animal Genetics (ISAG) estabeleceram, em 1995, um grupo de consultores com o
objetivo de elaborar uma série de recomendações técnicas e diretrizes para
avaliação da diversidade genética de raças de animais domésticos. Por meio do
projeto chamado Meansurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD) foi
selecionada uma lista de loci de microssatélites que podem ser utilizados para
estudos da diversidade genética e caracterização de raças de ovinos, caprinos,
suínos, bovinos e aves. Esta lista foi ampliada em 2004, quando foram incluídos
novos marcadores microssatélites (FAO, 2004).
5
Os marcadores microssatélites que apresentam homologia em diversas
espécies devem ser preferíveis, em razão de facilitarem os estudos em
laboratórios, possibilitando reduzir custos e economizar tempo (FAO, 2004).
O polimorfismo encontrado nos marcadores diz respeito ao número de
vezes que o núcleo de bases se repete (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Na Figura 1 estão ilustrados a base genética e o polimorfismo em marcadores
microssatélites.
FIGURA 1 - A: genótipo homozigoto, B: genótipo heterozigoto, ambos para uma região genômica que compreende um microssatélite de elementos (CA)/(GT). C: gel de eletroforese com diferentes genótipos homozigotos, com banda única e heterozigotos, com duas bandas, em indivíduos diplóides
Fonte: FERREIRA & GRATTAPAGLIA (1998)
6
2.1.1.1 Aplicações dos marcadores microssatélites
As maiores aplicações dos marcadores de DNA têm sido utilizadas
para a sexagem de embriões, testes de paternidade, registro genealógico e
utilização com vistas a detectar doenças genéticas ou características funcionais
em determinadas raças (GARCIA, 2006). Os microssatélites são muito utilizados
na investigação da estrutura populacional de diversas espécies de animais
domésticos, considerando os métodos de agrupamento, os quais possibilitam a
inferência de estrutura de populações e a designação de indivíduos a populações
(FABUEL et al., 2004; MARTÍNEZ et al., 2006).
A utilização de marcadores moleculares possibilita quantificar a
diversidade genética de populações, além da realização de testes de paternidade,
que podem ser feitos em vegetais, humanos e animais. Os marcadores mais
utilizados para a realização dos exames de paternidade são os do tipo RFLP,
microssatélites e minissatélites (CURI & LOPES, 2001).
2.1.1.2 Vantagens e desvantagens da utilização de marcadores microssatélites
Os marcadores moleculares possibilitam avaliação precoce dos
animais para características determinadas, pois esta tecnologia utiliza amostras
de DNA, podendo ser realizadas análises logo após o nascimento ou ainda na
fase embrionária, inclusive em programas de transferência de embriões e
produção in vitro, otimizando a seleção genética (GARCIA, 2001; GARCIA &
PORTO-NETO, 2006).
Outro benefício se refere à possibilidade de se selecionar
características que apresentam dificuldades técnicas para serem mensuradas
como, precocidade sexual e de terminação de carcaça ou características que
demonstram alto custo de análises, como maciez da carne e resistência a
doenças e ainda características como a longevidade (GARCIA, 2006).
A principal desvantagem da utilização de marcadores microssatélites
de DNA em escala comercial é o alto custo, necessitando de estudos que
7
apresentem formas de aumentar a rapidez e diminuir os custos com a
genotipagem de animais (CURI & LOPES, 2001).
Outra desvantagem são os erros de identificação de paternidade, que
prejudicam os programas de melhoramento genético por reduzirem o ganho
genético anual da população, por isso devem ser minimizados. Quando se
investiga biologicamente a paternidade é realizada uma análise da herança
genética do filho, apurando a parte genética herdada da mãe e transmitida pelo
pai. Se estes possuírem características hereditárias transmitidas ao filho, não
pode ser excluído da paternidade. Qualquer característica constante do
nascimento ao longo da existência e que é geneticamente determinada, não
sofrendo influência do meio, como doenças ou qualquer outra condição
submetida, pode servir como parâmetro para identificar a paternidade. Os
polimorfismos de DNA baseiam-se na variabilidade da composição das bases dos
ácidos nucléicos, proporcionando o estudo a partir do código genético (CURI &
LOPES, 2001).
2.1.2 Técnicas utilizadas para a genotipagem de marcadores moleculares
2.1.2.1 Reação em cadeia da polimerase
A PCR (Polimerase Chain Reaction) transformou a genética molecular,
uma vez que, permitiu a rápida clonagem e a análise do DNA. Esta técnica
representa um método in vitro rápido e versátil, utilizado para amplificação
seletiva de sequências-alvo de DNA específicas a partir de DNA total previamente
extraído. Para que a amplificação seja seletiva precisa-se de alguma informação
prévia, utilizada para desenhar dois oligonucleotídeos iniciadores, denominados
primers, específicos para a seqüência-alvo e apresentam em média 15 a 25
nucleotídeos de extensão. Depois que os primers são adicionados ao DNA-molde
desnaturado, estes se ligam especificamente às sequências de DNA
complementares ao seu sítio-alvo, flanqueando e delimitando a região a ser
analisada (STRACHAN & READ, 2002).
8
A síntese de novas fitas de DNA inicia-se em presença de uma DNA-
polimerase termoestável apropriada e dos quatro desoxirribonucleosídeos
trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP). As novas fitas são complementares a
cada uma das fitas de DNA do segmento alvo de DNA, formando um fragmento
de DNA com seqüência idêntica à do DNA analisado e previamente selecionado
pelo par de primers. A PCR é uma reação em cadeia, pois as fitas de DNA
sintetizadas atuam como moldes para mais sínteses de DNA nos ciclos
subseqüentes. Considerando que o ciclo de duplicação molecular é repetido
várias vezes, após 25 ciclos de síntese de DNA, além do DNA que iniciou a
reação os produtos da PCR incluem cerca de 10 cópias da sequência-alvo
específica. Em menos de 24 horas os resultados podem ser obtidos (STRACHAN
& READ, 2002).
A PCR é utilizada para aumentar pequenas quantidades de DNA (LITT
& LUTY, 1989). Depois de obtidos os microssatélites, os fragmentos são
amplificados via PCR com iniciadores, primers, específicos de 20 a 30 bases, que
complementam as sequências que flanqueiam a região a ser amplificada e são
utilizados para delimitar tal região (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
O polimorfismo é causado pelo deslizamento (slippage) da DNA
polimerase que ocorre durante o processo de replicação. O slippage é um
mecanismo interno que ocasiona elevada taxa de mutação (ELLEGREN, 2004).
Acredita-se que durante a replicação de uma região repetitiva, as fitas
de DNA separam-se e se associam novamente de forma incorreta, gerando
cópias de trechos de DNA, alelos, com diferentes tamanhos ou números de
repetições no próximo ciclo de replicação (Figura 2), seja por meio da inserção ou
da deleção de uma unidade de repetição (BARBOSA, 2010).
9
FIGURA 2 - Slippage Fonte: http://www.virtuallaboratory.net/Biofundamentals/lectureNotes/AllGraphics/slippage.jpg
Os reagentes necessários para que ocorra uma reação da PCR são:
DNA molde, primers, DNA polimerase, MgCl2, solução tampão e dNTPs. Os
primers possuem hidroxila livre (OH-) na extremidade, onde serão adicionados
novos dNTPs pela enzima DNA polimerase. A DNA polimerase termoestável que
tem sido mais utilizada é a Taq DNA polimerase. O reagente MgCl2 doa íons
Mg2+, cofatores indispensáveis para a atividade da Taq DNA polimerase. A
solução tampão é usada para manter o pH e as condições iônicas ideais para a
reação e os dNTPs são desoxinucleosídeos trifosfatados, monômeros utilizados
na síntese das fitas complementares às fitas-molde da molécula de DNA inicial. A
PCR ocorre em um equipamento denominado termociclador (BARBOSA, 2010).
A PCR tem como objetivo principal amplificar regiões específicas de
DNA (Figura 3), com o intuito que se tenha um grande número de cópias,
10
considerando que apenas uma cópia de uma seqüência não é suficiente para ser
analisada (BARBOSA, 2010).
FIGURA 3 - Esquema dos quatro primeiros ciclos de uma reação de PCR Fonte: http://www.geocities.com/avinash_abhyankar/molecular/pcr_basics_files/image003.gif
2.1.2.1.1 Vantagens e desvantagens de utilização da PCR
A clonagem de DNA por meio da PCR realiza-se em poucas horas,
utilizando para isso um equipamento simples, que varia a temperatura no
processo. As etapas consistem em desnaturação, síntese e pareamento,
considerando que uma reação de PCR consiste de trinta ciclos, com cada ciclo
durando cerca de três a cinco minutos em um termociclador automatizado.
Necessita-se também algum tempo para a construção e a síntese dos
oligonucleotídeos, que são utilizados como primers, no entanto, existem
programas comerciais que projetam primers e sintetiza comercialmente os
oligonucleotídeos desejados de forma rápida. Dessa forma a PCR apresenta
velocidade e facilidade de utilização (STRACHAN & READ, 2002).
A PCR demonstra sensibilidade, pois é capaz de amplificar sequências
a partir de quantidades mínimas do DNA-alvo, até mesmo do DNA de uma única
11
célula. Este fato torna essa técnica muito útil na análise forense, onde a
quantidade de material biológico é muito pequena (DUARTE et al., 2001).
Por meio da PCR, que por sua vez, apresenta robustez e possibilidade
de análise de amostras degradadas, pode-se amplificar sequências específicas a
partir de amostras em que o DNA está degradado ou em um meio onde é difícil o
isolamento do DNA. Lembrando que apenas um fragmento do DNA é isolado e
amplificado pela PCR, se torna possível a análise com sucesso de amostras
antigas e já decompostas, restos mortais, entre outros (DUARTE et al., 2001).
Uma limitação da técnica de PCR se diz respeito à contaminação. Se o
DNA contaminante estiver em níveis comparáveis aos do DNA-alvo, sua
amplificação pode confundir a interpretação dos resultados referentes à tipagem,
causando erros na conclusão. Para evitar estas possibilidades pode-se utilizar um
controle negativo, em que se realiza a mesma reação de PCR, mas não se coloca
amostras e outra forma seria a separação física das áreas do laboratório
destinadas ao trabalho com PCR e com produto que já foi amplificado (DUARTE
et al., 2001; BOROVIK et al., 2011).
2.1.2.2 Eletroforese
A eletroforese compreende uma técnica de genotipagem que possibilita
separar moléculas em função da sua massa, forma e compactação. Esta técnica
é sensível, rápida e precisa. A molécula, o DNA, migra nos suportes, que podem
ser géis de agarose ou acrilamida, em razão da ação de uma corrente elétrica,
com diferentes velocidades que dependem do tamanho e forma. As moléculas de
DNA migram para o pólo positivo quando submetidas a um campo elétrico,
porque são carregadas negativamente e o atrito com o gel, suporte, reage como
força oposta à migração. Dessa forma, quanto maior a molécula, maior o atrito e
mais lenta a migração (VIEIRA, 2011).
Na presença de compostos intercalantes, como o brometo de etídio, o
DNA pode ser visualizado, pois esta molécula emite fluorescência por exposição à
luz ultravioleta (UV) em presença desse composto e as moléculas de um mesmo
tamanho podem ser visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma
12
faixa fluorescente, enquanto se existirem mais de um tamanho de molécula na
amostra, estas serão separadas na migração, sendo visíveis bandas em
diferentes localizações do gel (ZAHA et al., 2003).
As duas substâncias mais utilizadas para eletroforese, géis de agarose
e géis de acrilamida, formam tramas de poros de tamanhos variáveis, o que
possibilita a separação dos fragmentos, sendo sua eficiência dependente da
concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.
Em qualquer uma das escolhas, estas substâncias são dissolvidas numa solução-
tampão eletrolítica, a mesma que deve recobrir o gel na cuba de eletroforese e
possibilitar a passagem de corrente elétrica, chamado Tampão de Corrida.
Geralmente, utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA). A
escolha do tipo de gel a ser utilizado depende do tamanho do fragmento e da
diferença de tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja visualizar (KOCH &
ANDRADE, 2008).
Antes da aplicação das amostras no gel, elas são misturadas a outra
solução, tampão da amostra, para aumentar a viscosidade da amostra e impedir
que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a voltagem seja
aplicada no sistema, além de possibilitar a visualização da corrida em razão do
tampão possuir um corante. Geralmente utiliza-se uma mistura do corante Azul de
Bromofenol, Xileno-Cianol e Glicose, dissolvidos no tampão de corrida, de acordo
com cada reação (VIEIRA, 2011).
No gel são utilizadas concentrações de 0,5 a 4% de agarose, sendo
que quanto maior a concentração maior a capacidade de distinguir fragmentos de
tamanhos próximos. Para acrilamida as concentrações variam de 4 a 25% no gel,
apresentando definição maior que a agarose. A eletroforese convencional possui
a desvantagem de identificar os fragmentos quanto ao tamanho e não quanto à
seqüência, contudo, apresenta baixo nível de dificuldade de realização e
versatilidade (VIEIRA, 2011).
13
2.1.3 Seqüenciamento de DNA
2.1.3.1 Seqüenciamento manual de DNA
O DNA pode ser seqüenciado de forma manual produzindo-se
fragmentos pela interrupção controlada da replicação enzimática. Considerando
que a DNA polimerase é utilizada para copiar uma determinada seqüência de um
DNA unifilamentar, como em uma reação de PCR comum, tem-se como diferença
destas reações que, além dos quatro desoxirribonucleosídeos (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP marcados com radioatividade), a mistura de incubação contém um
análogo 2’, 3’-didesoxi de um deles. A incorporação desse análogo bloqueia o
posterior crescimento da nova cadeia porque ele não tem a hidroxila 3’ terminal
necessária para formar a ligação fosfodiéster seguinte. Assim, são produzidos
fragmentos de vários comprimentos, nos quais o análogo didesoxi está na ponta
3’. A mesma amostra é submetida a esta reação em quatro eppendorfs diferentes
e em cada eppendorf existe um dos quatro nucleotídeos modificados diferentes
(STRYER, 1996).
O resultado final em cada reação são fragmentos de diferentes
tamanhos, em razão da parada da reação a cada vez que o nucleotídeo
amplificado é incorporado. Estes conjuntos de fragmentos, um para cada análogo
didesoxi são então submetidos à eletroforese e a seqüência de bases do novo
DNA é lida na auto-radiografia (STRYER, 1996).
2.1.3.2 Seqüenciamento automático de DNA
Os seqüenciadores de DNA realizam automaticamente a análise das
fitas de DNA previamente amplificadas, cujos didesoxirribonucleotídeos (dNTPs)
incorporados na PCR foram marcados previamente com compostos
fluorescentes, com cores diferentes para cada dNTP. O produto da PCR é
aplicado em um gel no interior de um capilar e dessa forma, a migração do DNA
ocorre até passar pelo detector do equipamento. O gel é rastreado por um feixe
14
de laser, excitando os marcadores, que emitem luz em um comprimento de onda
específico, de acordo com o corante utilizado. A luz é detectada e o padrão do
espectro analisado com o auxílio de programas que permitem gerar as
sequências de DNA. Usando detectores de fluorescência controlados por
computador, os sistemas automáticos podem identificar aproximadamente 10 mil
bases por dia, enquanto os métodos manuais identificam 50 mil bases por ano
(VOET et al., 2002).
Os sistemas automatizados de genotipagem de locus microssatélites
são os mais utilizados, por proporcionarem análises de fragmentos produzidos por
PCR por meio de primers marcados com fluorescência. Os sistemas multiplex
possibilitam a genotipagem em grande escala, com seus sistemas de
genotipagem multiloco, semi-automatizados, detectando e analisando
simultaneamente em analisadores automáticos vários fragmentos microssatélites,
o que fornece grande precisão na detecção alélica, diminuindo os custos, o tempo
de análise e os erros que ocorrem quando se realiza uma análise manual e visual
(RANGEL et al., 2005).
Diversos STRs são amplificados utilizando-se vários pares de primers,
que compõem o kit comercial chamado PCR multiplex. O produto da reação de
amplificação dos STRs pode ser detectado por seus tamanhos, por meio da
migração em gel de eletroforese de alta resolução, localizado dentro de um
capilar. Quando se utiliza a tecnologia de coloração fluorescente com detecção
por laser é possível avaliar STRs de mesmo tamanho, simplesmente marcando
cada um com uma coloração diferente. Cada kit PCR multiplex utiliza diferentes
colorações e amplifica diferentes STRs, como por exemplo os kits comerciais,
Profiler Plus™ que analisam simultaneamente dez marcadores, kit Power Plex®
para dezesseis STRs e o Identifiler™ para dezesseis marcadores (KASHYAP et
al., 2004).
Uma PCR multiplex pode ser operada para quatro ou cinco
marcadores, sendo que duas reações podem ser suficientes para realização de
testes de paternidade (CURI & LOPES, 2001).
15
2.2 Caracterização genética por marcadores microssatélites
A caracterização genética de populações proporciona o estudo da
variabilidade genética. A variabilidade genética total de uma espécie resulta do
conjunto representado pela contribuição da variabilidade intra e inter-populacional.
Estes parâmetros são importantes para a conservação dos recursos genéticos,
evitando a extinção de animais ameaçados (SILVA, 2007).
Em experimento realizado com 40 famílias (touro/vaca/bezerro) de
animais da raça Gir, sendo estes puros de origem e registrados na Associação
Brasileira dos Criadores de Zebu, realizou-se testes de paternidade por meio de
amostras de sangue, utilizando-se microssatélites de DNA. Os primers utilizados
são recomendados pela ISAG e alguns microssatélites analisados nesse estudo
geralmente não são utilizados para esse propósito. As regiões microssatélites
foram amplificadas pela PCR e os produtos resultantes separados por
eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. Os fragmentos de DNA foram
detectados utilizando-se coloração por nitrato de prata. Visualizaram-se os
fragmentos amplificados sob luz branca e estes foram fotografados em filme
polaróide 667 (Figura 4) (CURI & LOPES, 2001).
FIGURA 4 - Padrão de bandas observado para os alelos do microssatélite TGLA122. Raias 1 e 20, DNA ladder 10pb. Raia 2, marcador de DNA de tamanho padrão. Raias 3,4,..., 19, DNA dos animais estudados. Os números ao lado esquerdo da figura indicam o tamanho dos fragmentos de DNA em pares de bases
Fonte: CURI & LOPES (2001)
16
Foi determinada a constituição genotípica dos indivíduos para cada
marcador, utilizando-se a análise do tamanho do fragmento em pares de bases
(pb). Calcularam-se as frequências alélicas e a probabilidade de exclusão (PE)
para cada marcador microssatélite, além da probabilidade de exclusão combinada
(PEC) para o conjunto de microssatélites que foram utilizados. As famílias em que
não ocorreu exclusão de paternidade foram submetidas ao cálculo de
probabilidade de paternidade (PP). A PEC demonstra a probabilidade de ocorrer
exclusão de paternidade em pelo menos um sistema genético utilizado e tanto a
PEC quanto a PE estão apresentadas no Quadro 1 (CURI & LOPES, 2001).
QUADRO 1 - Probabilidade de Exclusão (PE) para cada microssatélite e Probabilidade de Exclusão Combinada (PEC) para todos os marcadores
Microssatélites PE
TGLA 122* 0,4323
TGLA 126* 0,3035
ETH 3* 0,2769
SPS 115* 0,3114
ETH 225* 0,1878
BM 1824* 0,2599
ETH 10* 0,3403
BMS 2533 0,6289
POTCHA 0,2705
PEC = 0,9789
*microssatélites recomendados pelo ISAG para a realização de testes de paternidade em bovinos
Fonte: Adaptado de CURI & LOPES (2001)
A tabela acima mostra que os microssatélites BMS2533 e TGLA122
apresentaram alto polimorfismo e PE adequadas e o valor obtido para PEC,
0,9789 se aproximou do ideal, 0,99, resultado que poderia ser obtido aumentado-
se um marcador microssatélite ao teste de paternidade. Os marcadores ETH10,
SPS115, TGLA126, ETH3, POTCHA, BM1824 e ETH225 apresentaram PE baixa,
sendo o ETH3, ETH225 e BM1824, recomendados pelo ISAG para testes de
paternidade em bovinos. Em contraste, o microssatélite BMS 2533, que por sua
17
vez, não é utilizado para essa finalidade, demonstrou alta PE, o que mostra a
importância de se caracterizar diferentes populações ou linhagens dentro da raça
em estudo, pois diferentes populações não apresentam obrigatoriamente o
mesmo número de alelos e mesmas frequências alélicas (CURI & LOPES, 2001).
Os resultados de PE obtidos para os microssatélites BM1824 e
ETH225 demonstraram que microssatélites adequados para testes de
paternidade em raças bovinas européias, podem não ser apropriados para raças
zebuínas. Os marcadores microssatélites que excluíram a possibilidade de
paternidade nas famílias (Touro (T), Vaca (V) e Bezerro (B)) estão apresentados
no Quadro 2 (CURI & LOPES, 2001).
QUADRO 2 - Famílias excluídas nos testes de paternidade e marcadores microssatélites responsáveis pela exclusão
Família TGLA122
TGLA126
BM1824
BMS2533
SPS115
ETH3
ETH10
ETH225
POTCHA
TB/V5/ B5
x x
TA/V18/B18
x x x
TA/V19/B19
x x x
TA/V20/20
x x x x x
TC/V23/B23
x x
TC/V24/B24
x x
TA/V25/B25
x x x
TA/V26/B26
x x
TA/V33/B33
x x x x x
TA/V34/B34
x x x
TA/V37/B37
x x x x
Fonte: Adaptado de CURI & LOPES (2001)
O cálculo da probabilidade de paternidade foi realizado para todas as
famílias que não foram excluídas da paternidade, sendo estas apresentadas na
Tabela 1 (CURI & LOPES, 2001).
18
TABELA 1 - Probabilidade de paternidade (PP) nas famílias em que não ocorreu exclusão de paternidade
TA TB TC TD
V/B PP V/B PP V/B PP V/B PP
V1/B1 0,9521 V2/B2 0,9801 V21/B21 0,9998 V22/B22 0,9999
V4/B4 0,8691 V3/B3 0,8714 V28/B28 0,9964
V9/B9 0,8691 V6/B6 0,9228 V29/B29 0,9972
V11/B11 0,9521 V7/B7 0,9529 V30/B30 0,9972
V12/B12 0,9521 V8/B8 0,9396 V31/B31 0,9998
V14/B14 0,9521 V10/B10 0,9574
V17/B17 0,8691 V13/B13 0,8994
V32/B32 0,9521 V15/B15 0,9844
V35/B35 0,9521 V16/B16 0,9905
V36/B36 0,9521 V27/B27 0,9741
V39/B39 0,9521 V28/B28
V40/B40
0,9964
0,8994
Média = 0,9295 0,9474 0,9981 0,9999
Média geral = 0,9512
Fonte: Adaptado de CURI & LOPES (2001)
A probabilidade de paternidade variou entre 0,8691 e 0,9999, com
média de 0,9512, sendo que somente oito famílias atingiram a probabilidade
recomendada de 0,99, fato que pode ter sido causado pelo baixo poder
informativo de alguns microssatélites utilizados (CURI & LOPES, 2001).
Em estudo que avaliou a variabilidade genética de galinhas caipiras
brasileiras de ovos azuis foram utilizadas 87 amostras de sangue e 15
marcadores microssatélites. Após a extração do DNA total foi feita a análise dos
loci microssatélites e a amplificação dos fragmentos de DNA foi realizada pela
PCR. Utilizaram-se iniciadores marcados com fluoróforos para quinze loci de
microssatélites: LEI0234, LEI0248, LEI0221, LEI0214, LEI0192, LEI0217,
LEI0254, LEI0194, LEI0212, MCW0371, ADL0278, MCW0183, MCW0216,
MCW0330 e MCW0081, sendo os cinco últimos recomendados pela FAO. Os
produtos amplificados foram submetidos à genotipagem em seqüenciador
automático e as seqüencias analisadas com programa Gene Mapper ID Software
19
v.3.2 e a análise estatística realizada utilizando o programa Arlequin v.3.5. Foram
calculados para todos os lócus de microssatélite as frequências alélicas,
genotípicas e estimativas de heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho) e
desvios do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (FONTEQUE, 2011).
O mesmo autor demonstrou que a amplificação das amostras de DNA
de 87 galinhas nos 15 loci de microssatélite gerou um total de 168 alelos, com
amplicons variando entre 83 e 490 pares de base, estes fatos demonstraram que
os quinze loci de microssatélites utilizados foram eficientes na amplificação e
genotipagem do DNA, apresentando alto polimorfismo e um número médio de
11,2 alelos. O número máximo de 28 alelos foi identificado para o marcador
LEI0212, o que pode significar que este locus encontra-se em uma região de
elevada taxa de mutação ou de seleção positiva a mutação. Foram produzidos
288 genótipos com a combinação de alelos dos 15 loci.
As heterozigosidades esperada e observada são medidas de
variabilidade genética eficientes. A He representa a probabilidade que dois alelos
escolhidos ao acaso em uma população sejam diferentes, enquanto a Ho
representa a proporção de indivíduos heterozigotos observados nas amostras da
população. A heterozigosidade de um marcador diz respeito à probabilidade de
um indivíduo ser heterozigoto no locus marcador, sendo este parâmetro
dependente do número de alelos e da freqüência destes na população e
apresentando polimorfismo informativo quando possui heterozigosidade maior
que 70% (NEI, 1973; BELKHIR, 1999).
A heterozigosidade média observada é considerada elevada quando
apresenta valores superiores a 0,7 e reduzida quando apresenta valores inferiores
a 0,5. Em relação à heterozigosidade média esperada os valores superiores a 0,5
indicam que os marcadores possuem elevada diversidade genética (MENEZES,
2005).
A heterozigosidade média esperada foi 0,76 e a observada foi 0,49
para a população estudada, conforme demonstrado na Tabela 2. Os quinze loci
apresentaram desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) para a população
(FONTEQUE, 2011).
Os desvios de EHW podem ocorrer em razão de fatores como
acasalamentos direcionados, antepassados comuns, subdivisões dentro da
20
população, seleção natural e artificial, fluxo de genes a partir de população
externa ou migração (MENEZES, 2005).
TABELA 2 - Polimorfismo de 15 loci de microssatélites em 87 amostras de DNA de galinhas caipiras de ovos azuis
Locus NA1 Ho2 He3 T4(pb) Valor de P5 s.d.
LEI0248 12 0.70115 0.76447 210-258 0.00000 0.00000
LEI0221 14 0.81609 0.86944 125-233 0.00000 0.00000
LEI0214 13 0.29885 0.80845 127-279 0.00000 0.00000
LEI0192 19 0.66667 0.89104 230-378 0.00000 0.00000
MCW0371 17 0.26437 0.84905 98-229 0.00000 0.00000
LEI0217 19 0.55172 0.83702 174-330 0.00000 0.00000
LEI0254 02 0.08046 0.34981 83-87 0.00000 0.00000
LEI0194 08 0.17241 0.77138 125-181 0.00000 0.00000
LEI0212 28 0.45977 0.87403 310-490 0.00000 0.00000
ADL278 05 0.56322 0.58328 102-114 0.00894 0.00011
LEI0234 12 0.63218 0.82526 208-304 0.00000 0.00000
MCW0183 07 0.62069 0.75809 292-396 0.00000 0.00000
MCW0216 05 0.35632 0.73145 124-142 0.00000 0.00000
MCW0330 02 0.54023 0.73483 265-285 0.00000 0.00000
MCW0081 05 0.65517 0.69796 109-130 0.00000 0.00000
Média 11,20 0,49195 0,75637
s.d. 7,38 0,21266 0,13819
1Número de alelos por locus.
2Freqüência de heterozigosidade observada.
3Freqüência de
heterozigosidade esperada. 4Tamanho do alelo em pares de base.
5Locus em desequilíbrio
(P<0,05)
Fonte: FONTEQUE (2011)
As populações de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis são
pequenas, geralmente endogâmicas e submetidas ao ambiente comum de
criação de aves caipiras, sendo selecionadas de forma natural e artificial, fatos
que podem justificar a população estar em desvio do EHW. Os resultados
encontrados para heterozigosidades médias e número médio de alelos
demonstram que existe elevada variabilidade genética em galinhas caipiras
brasileiras de ovos azuis (FONTEQUE, 2011).
21
Em um experimento que verificou a utilização de 27 microssatélites
para caracterização genética de raças caprinas brasileiras, coletou-se 332
amostras casualizadas de pêlos de caprinos das raças Moxotó, Canindé, Serrana
Azul, Marota, Repartida e Graúna. Foi extraído o DNA das amostras de dez pêlos
selecionados por animal. Os 27 microssatélites foram analisados com as
sequências direta e reversa dos iniciadores, amplificados mediante a técnica de
reação em cadeia de polimerase (PCR), submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida em seqüenciador automático, os resultados das análises de
fragmentos e a tipificação alélica foram obtidos por meio dos programas
informáticos Genescan Analysis v.3.7 e Genotyper 2.5 (MENEZES et al., 2006).
As frequências alélicas foram calculadas com base na contagem direta
dos alelos encontrados e estas frequências juntamente com as heterozigosidades
foram calculadas por meio do programa Genetix versão 4.01. Os resultados
encontrados de polimorfismo dos loci analisados estão apresentados na Tabela 3.
(MENEZES et al., 2006).
O Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC) é um indicador da
qualidade do marcador em estudos genéticos, sendo útil para a segregação,
identificação de populações e controle de paternidade. Os marcadores que
apresentam valores de PIC superiores a 0,5 são considerados muito informativos,
outros com valores variando entre 0,25 e 0,50 são considerados mediamente
informativos e com valores inferiores a 0,25 são classificados como pouco
informativos (BOTSTEIN et al., 1980).
Os marcadores que apresentaram elevado grau de heterozigosidade
média observada, sendo esta com valores superiores a 70% foram TGLA122,
MM12, CSSM60, BM6526, HSC E BM8125, enquanto os marcadores MAF209,
BM6506, SPS115, ETH225, INRA63, HAUT27, ETH10 e INRA23 demonstraram
nível reduzido de heterozigosidade, com valores inferiores a 50%. A
heterozigosidade média esperada foi superior a 50% para a maioria dos loci
(85%). O PIC apresentou valores superiores a 50% em mais de 75% dos loci
analisados (MENEZES et al., 2006).
22
TABELA 3 - Número de alelos (NA), heterozigosidades observada (Ho) e esperada (He) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), em função dos loci analisados
LOCI NA Ho He PIC
CSSM66 23 0,680 0,819 0,908
OarFCB304 16 0,669 0,795 0,777
MM12 14 0,733 0,752 0,724
BM6526 14 0,716 0,744 0,724
INRA6 13 0,638 0,847 0,830
HSC 11 0,731 0,789 0,761
BM1329 11 0,678 0,741 0,698
OarFCB11 11 0,659 0,687 0,643
MAF65 11 0,508 0,717 0,675
CSRM60 10 0,720 0,755 0,718
BM6506 10 0,371 0,406 0,391
BM1818 10 0,671 0,761 0,737
TGLA122 10 0,754 0,829 0,807
CSRD247 09 0,666 0,748 0,717
HAUT27 09 0,461 0,479 0,436
SRCRSP8 09 0,675 0,776 0,742
INRA23 09 0,495 0,666 0,612
INRA5 08 0,623 0,709 0,667
OarFCB48 08 0,598 0,632 0,572
ILSTS011 07 0,524 0,786 0,752
McM527 07 0,631 0,699 0,651
BM8125 06 0,713 0,769 0,733
INRA63 06 0,454 0,572 0,480
SPS115 05 0,412 0,503 0,398
ETH10 05 0,493 0,650 0,576
ETH225 04 0,416 0,483 0,383
MAF209 03 0,037 0,043 0,042
Fonte: MENEZES et al. (2006)
23
O equilíbrio de Hardy-Weinberg dos loci está apresentado na Tabela 4
para cada raça caprina analisada (MENEZES et al., 2006).
TABELA 4 - Locus em desequilíbrio Hardy-Weinberg
Locus S. Azul Moxotó Marota Canindé Repartida Graúna
CSRD247 ─ ─ ─ ─ 0,099 ─
ETH225 ─ ─ ─ ─ 0,000 0,053
HAUT27 ─ ─ ─ ─ 0,024 ─
ILSTS011 ─ 0,000 ─ 0,000 ─ ─
INRA63 0,079 ─ ─ 0,006 0,094 ─
INRA5 0,014 ─ 0,087 ─ ─ ─
SPS115 0,072 0,000 ─ 0,002 0,005 ─
BM6526 0,000 0,080 ─ ─ ─ ─
CSRM60 ─ ─ 0,039 0,071 ─ ─
CSSM66 ─ ─ ─ ─ 0,001 0,002
ETH10 ─ ─ ─ ─ 0,019 0,067
INRA6 0,000 0,062 ─ 0,065 ─ 0,000
MM12 ─ 0,025 ─ ─ ─ ─
HSC ─ 0,013 0,047 ─ 0,086 ─
McM527 ─ 0,026 ─ ─ ─ ─
SRCRSP8 ─ 0,022 0,093 0,075 ─ 0,012
OarFCB48 0,056 ─ 0,043 ─ ─ ─
OarFCB11 ─ 0,032 0,085 ─ ─ ─
INRA23 0,016 ─ 0,000 0,000 ─ 0,000
MAF209 0,000 0,000 0,000 ─ 0,051 0,000
MAF65 0,000 0,000 0,003 ─ ─ 0,017
Fonte: Adaptado de MENEZES et al. (2006)
A raça Moxotó apresentou onze locus em desequilíbrio, a Serrana Azul,
Marota e Repartida apresentaram nove, a Graúna oito e a Canindé sete locus em
desequilíbrio Hardy-Weinberg. Dessa forma, verifica-se que foram poucos
microssatélites que demonstraram desequilíbrio, considerando que 70% dos
marcadores apresentaram estar em EHW. Os desequilíbrios podem acontecer em
24
populações ameaçadas de extinção como as deste estudo em razão de fatores
como antepassados comuns e seleção natural (MENEZES et al., 2006).
Com vistas a avaliar a diversidade genética de raças asininas criadas
no Brasil foram analisados 215 indivíduos das raças Jumento Brasileiro, Jumento
Nordestino e Jumento Pêga, além da raça eqüina Árabe utilizada como outgroup.
O DNA foi obtido por meio de amostras sangüíneas. Foram utilizados 15 loci
microssatélites, sendo eles, ASB02, AHT04, ASB17, ASB23, COR07, COR58,
COR82, HMS03, HMS07, HMS45, HTG07, LEX73, TKY312, TKY344,
UCDEQ425, amplificados pela PCR. Os loci TKY312 e TKY344 não são
recomendados pela FAO e ISAG para o estudo da diversidade de asininos no
MoDAD. Para amplificação dos fragmentos utilizou-se sistemas multiplex e
seqüenciador automático de DNA. Os programas GeneScan 2.0 e Genotyper 2.1
foram utilizados para a genotipagem dos alelos observados (ALMEIDA, 2009).
No estudo citado foram calculadas He, Ho, PIC e a probabilidade de
exclusão média e verificado o EHW. Gerou-se um dendrograma a partir da
distância genética (DA) pelos algoritmos de agrupamento Neighbor-Joining (NJ),
utilizando o programa SplitsTree4 (HUSON & BRYANT, 2006) e baseando-se nos
genótipos dos 15 locus microssatélites, os indivíduos foram agrupados em
determinadas populações pela metodologia Bayesiana no programa
STRUCTURE (PRITCHARD et al., 2000). Os testes foram baseados no modelo
de miscigenação (ALMEIDA, 2009).
Os locus genotipados foram polimórficos para todas as raças, exceto a
raça Pêga que apresentou um alelo para o locus ASB17. O número médio de
alelos por locus foi 6,07 e o número total de alelos para todos os locus analisados
foi 91. As heterozigosidades esperadas para cada locus foram maiores que as
heterozigosidades observadas, variando de 0,08 (ASB17) a 0,787 (AHT04),
enquanto a heterozigosidade observada variou de 0,038 (ASB17) a 0,757
(HTG07). Os locus que apresentaram equilíbrio de Hardy-Weinberg foram HMS3,
HTG07, COR82, HMS07, UCDEQ425, HMS45, TKY312, AHT04, ASB23. O locus
HGT07 apresentou a menor estimativa de endogamia (0,1018) e a maior
estimativa foi para o locus ASB17 (0,3616) (ALMEIDA, 2009).
Entre todas as raças foram observados valores significativos de
diferenciação genética. Os índices estimados de diversidade para cada raça
25
demonstraram um número médio de seis alelos. As raças locais apresentaram
maior diversidade que a raça eqüina Árabe, com as maiores médias de riqueza
alélica (acima de 8,5), conforme a Tabela 5. A avaliação do desempenho forense
dos 15 marcadores indicou que para a maioria dos locus demonstrou um padrão
consistente de poder de exclusão de paternidade, com 99,85% de probabilidade
de excluir um provável parental em testes onde o provável pai e/ou mãe e a cria
são conhecidos (ALMEIDA, 2009).
TABELA 5 - Número de indivíduos (N), riqueza alélica (AR), média do número de alelos por locus considerando-se o número amostral (i.e), heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), coeficiente de endogamia (FIS)
Raça N AR He (s.d.) Ho (s.d.) FIS
Jumento Brasileiro 74 9,067 0,4986 (0,0508) 0,5201 (0,0159) -0,044
Jumento Nordestino 65 8,838 0,5668 (0,0534) 0,4953 (0,0174) 0,127
Jumento Pêga 48 8,773 0,4657 (0,0600) 0,4611 (0,0199) 0,01
Eqüino Árabe (outgroup) 28 7,822 0,6721 (0,0472) 0,5681 (0,0280) 0,159
Fonte: ALMEIDA (2009)
A raça Nordestina apresentou o maior número de alelos e o maior
coeficiente de endogamia, fato que pode ser justificado pela diminuição de 75%
de sua população na década de 80. O FIS desta raça demonstra que se faz
necessário manter a máxima variabilidade existente nesta população por meio de
alternativas como a troca de reprodutores entre as propriedades, criação de
núcleos de conservação animal, coleta de germoplasma e criopreservação
(ALMEIDA, 2009).
As maiores distâncias genéticas foram observadas entre as raças
Brasileira e Nordestina, enquanto as menores distâncias foram observadas entre
as raças Pêga e Nordestina (Tabela 6) (ALMEIDA, 2009).
26
TABELA 6 - Estimativa aos pares de diferenciação genética e distância genética entre as três raças de asininos e a raça eqüina Árabe. As estimativas de FST encontram-se acima na diagonal e abaixo se encontra a identidade genética de Nei’s. Todas as estimativas de FST foram significativas (p<0,01)
Raça Eqüino Árabe J. Brasileiro J. Nordestino J. Pêga
Eqüino Árabe ─ 0.3184 0.2867 0.3348
J. Brasileiro 0.3919 ─ 0.1451 0.1322
J. Nordestino 0.3582 0.8028 ─ 0.0656
J. Pêga 0.3739 0.8497 0.9169 ─
Fonte: ALMEIDA (2009)
Construiu-se um dendrograma a partir da reconstrução filogenética
pelo método de agrupamento UPGMA com base na matriz de distância genética
(Figura 5) (ALMEIDA, 2009).
FIGURA 5 - Dendrograma construído utilizando o método de UPGMA a partir dos 15 locus analisados. EA: Eqüino Árabe. JB: Jumento Brasileiro. JP: Jumento Pêga. JN: Jumento Nordestino
Fonte: ALMEIDA (2009)
Conforme está apresentado na Figura 6, o agrupamento com K=2
diferenciou as espécies asininas e eqüina, enquanto K=5 discriminou todas as
populações, demonstrando uma sub-estruturação na população de jumentos
Nordestinos, onde cada um dos 215 animais está representado por uma linha
vertical dividida em segmentos classificados de acordo com a cor e tamanho
27
correspondente à proporção relativa do genoma do animal correspondendo a um
agrupamento particular (ALMEIDA, 2009).
FIGURA 6 - Agrupamento individual dos 215 indivíduos das três raças asininas e da raça eqüina Árabe, pelo método estatístico Bayesiano utilizando o programa STRUCTURE. EA: Eqüino Árabe, JB: Jumento Brasileiro, JN: Jumento Nordestino e JP: Jumento Pêga
Fonte: ALMEIDA (2009)
2.3 Diversidade genética
A importância de se verificar a diversidade ou variabilidade genética
intra e inter-raciais se fundamenta no fato de que para realizar a conservação de
recursos genéticos animais deve-se manter a variabilidade genética intra-racial
para evitar a erosão genética e inter-racial para evitar a extinção das raças
(GAMA, 2004).
28
A utilização de marcadores moleculares para a caracterização genética
tem sido uma ferramenta eficaz para quantificação da diversidade genética de
animais domésticos (MENEZES et al., 2006).
A diversidade das espécies domésticas reflete-se na quantidade de
raças existentes e na variação dentro de cada raça (EGITO et al., 2002). O
método mais utilizado para realizar a quantificação da diversidade genética é a
análise de genótipos de indivíduos que não sejam aparentados entre si, que
sejam por sua vez, selecionados da população que esteja sendo investigada
(GROENEN et al., 2003).
Os níveis determinantes da diversidade gênica de uma espécie são a
heterozigosidade, que representa a variação genética dentro do indivíduo,
diferenças genéticas entre indivíduos dentro de uma população e diferenças
genéticas entre populações (OLLIVIER & FOULLEY, 2005).
29
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A caracterização genética de raças é fundamental para que se possa
conhecer a estrutura genética de raças e espécies, com vistas a auxiliar na
investigação da diversidade genética entre populações e dentro delas, para que
se utilize a conservação animal de forma precisa e eficiente com animais que
realmente apresentam diversidade genética e que são fundamentais ao processo,
diminuindo custos e esforços que não sejam necessários.
Os marcadores microssatélites tem apresentado resultados adequados
e satisfatórios para a caracterização racial, facilitando o estudo genético animal e
proporcionando dados necessários sobre a genealogia, testes de paternidade,
mapeamento genético e o estudo de árvores filogenéticas, fundamentais aos
programas de seleção e conservação de recursos genéticos animais.
30
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