CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA EM MICROSSATÉLITES PARA O...
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CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA EM MICROSSATÉLITES PARA O APAPÁ ( Pellona castelnaeana, PRISTIGASTERIDAE) Hernández-Ruz EJ 1 ; Ximenes AM 2 ; Rodrigues LRR 2 ; Machado V 3 ; Izeni Pires Farias 3 ¹Laboratório de Zoologia, Faculdade de Ciências Biológicas, Campus Universitário de Altamira, Universidade Federal do Pará,. Rua José Porfírio, nº 2515, Bairro d e São Sebastião CEP: 68372 -040 Altamira – PA. ²Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA), Laboratório de Genética e Biodiversidade, Campus Tapajós, Instituto de Ciências da Educação. CEP: 68040260 Santarém-PA. ³Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Evolução e Genética Animal, Mini Campus ICB, Av. Gen. Rod rigo Octávio Jordão Ramos, 3000 – Coroado, Cep 69.077-000, Manaus, AM, Brasil. RESUMO Para avaliar a estrutura genética de populações de apapá na bacia Amazônica, desenvolvemos uma biblioteca genômica parcial enriquecida em microssatélites para P. castelnaeana a partir do método de hibridização seletiva, com sonda biotinilada do tipo (CT) 8 , conjugadas a contas magnéticas revestidas por estreptavidina. Após a hibridização, os insertos enriquecidos em sequências microssatélites foram amplificados via PCR, ligados ao vetor pGEM-T Easy Vector e transformados em bactérias eletrocompetentes Escherichia coli TOP10 por eletroporaçã o. As bactérias transformada s foram plaqueadas em meio sólido 2XYT-ágar contendo ampicilina + X-gal, e após crescimento, as colônias com o inserto (brancas) foram transferidas e crescidas em placas de 96 poços em meio liquido com Tartoff-Hobbs Broth/Ampicilina. A placa foi glicerolizada e acondicionadas a -20ºC. Sequenciam os 95 clones positivos. O programa GRAMENESSRTOOL foi utilizado para rastrear os microssatélites dos clones sequenciados. Obtivemos um total de 24 microssatélites de motivo de repetição dinucleotídeos. Esses microssatélites foram editados e alinhados no software Bioedit, os clones redundantes removidos e os iniciadores desenhados pelo programa Primer 3. Dos 15 iniciadores avaliados três não foi possível otimizar e 12 foram otimizados. Os 12 otimizados se apresentam como polimórficos e serão utilizados para posterior genotipagem de populações naturais dessa espécie. PALAVRAS-CHAVE : Dinucleotídeo; Pellona flavipinnis ; Genotipagem. ABSTRACT To assess the genetic structure of populations of Amazon pellona in the basin of Amazon, we developed a partial genomic library enriched for microsatellites P. castelnaeana from the method of selective hybridization with biotinylated probe type (CT) 8 , conjugated to streptavidin coated magnetic beads. After hybridization, the inserts enriched in microsatellite sequences were amplified by polymerase chain reaction, linked to the vector pGEM-T Easy Vector and transformed into Escherichia coli TOP10 electro competent bacteria by electroporation. The transformed bacteria were plated on solid medium containing agar-2XYT ampicillin + X-gal, and after growth, the colonies with the uncertain (white) were transferred and grown in 96-well plates in a liquid medium with Tartoff- Hobbs Broth / ampicillin. The plate was glycerolized and placed at -20° C. Sequenced 95 positive clones. GRAMENEssrtool program was used to track the microsatellite clones sequenced. We obtained a total of 24 microsatellite dinucleotide repeat motif. These microsatellites were edited and aligned in BioEdit software, removed redundant clones and primers designed by Primer 3 program. Of the 15 primers evaluated three was not possible to optimize and 12 were optimized. The optimized
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CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICAENRIQUECIDA EM MICROSSATÉLITES PARA O APAPÁ ( Pellona castelnaeana,
PRISTIGASTERIDAE)
Hernández-Ruz EJ1; Ximenes AM 2; Rodrigues LRR2; Machado V3; Izeni Pires Farias3
¹Laboratório de Zoologia, Faculdade de Ciências Biológicas, Campus Universitário de Altamira, Universidade Federal doPará,. Rua José Porfírio, nº 2515, Bairro de São Sebastião CEP: 68372-040 Altamira – PA.
²Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA), Laboratório de Genética e Biodiversidade, Campus Tapajós, Instituto deCiências da Educação. CEP: 68040260 Santarém-PA.
³Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Evolução e GenéticaAnimal, Mini Campus ICB, Av. Gen. Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000 – Coroado, Cep 69.077-000, Manaus, AM,
Brasil.
RESUMOPara avaliar a estrutura genética de populações de apapá na bacia Amazônica, desenvolvemos umabiblioteca genômica parcial enriquecida em microssatélites para P. castelnaeana a partir do método dehibridização seletiva, com sonda biotinilada do tipo (CT)8, conjugadas a contas magnéticas revestidas porestreptavidina. Após a hibridização, os insertos enriquecidos em sequências microssatélites foramamplificados via PCR, ligados ao vetor pGEM-T Easy Vector e transformados em bactériaseletrocompetentes Escherichia coli TOP10 por eletroporação. As bactérias transformadas foram plaqueadasem meio sólido 2XYT-ágar contendo ampicilina + X-gal, e após crescimento, as colônias com o inserto
(brancas) foram transferidas e crescidas em placas de 96 poços em meio liquido com Tartoff-HobbsBroth/Ampicilina. A placa foi glicerolizada e acondicionadas a -20ºC. Sequenciamos 95 clones positivos. Oprograma GRAMENESSRTOOL foi utilizado para rastrear os microssatélites dos clones sequenciados.Obtivemos um total de 24 microssatélites de motivo de repetição dinucleotídeos. Esses microssatélitesforam editados e alinhados no software Bioedit, os clones redundantes removidos e os iniciadoresdesenhados pelo programa Primer 3. Dos 15 iniciadores avaliados três não foi possível otimizar e 12 foramotimizados. Os 12 otimizados se apresentam como polimórficos e serão utilizados para posteriorgenotipagem de populações naturais dessa espécie.
PALAVRAS-CHAVE: Dinucleotídeo; Pellona flavipinnis; Genotipagem.
ABSTRACT To assess the genetic structure of populations of Amazon pellona in the basin of Amazon, wedeveloped a partial genomic library enriched for microsatellites P. castelnaeana from the method of selective hybridization with biotinylated probe type (CT)8, conjugated to streptavidin coated magneticbeads. After hybridization, the inserts enriched in microsatellite sequences were amplified bypolymerase chain reaction, linked to the vector pGEM-T Easy Vector and transformed into Escherichia coli TOP10 electro competent bacteria by electroporation. The transformed bacteria wereplated on solid medium containing agar-2XYT ampicillin + X-gal, and after growth, the colonies withthe uncertain (white) were transferred and grown in 96-well plates in a liquid medium with Tartoff-Hobbs Broth / ampicillin. The plate was glycerolized and placed at -20° C. Sequenced 95 positiveclones. GRAMENEssrtool program was used to track the microsatellite clones sequenced. Weobtained a total of 24 microsatellite dinucleotide repeat motif. These microsatellites were edited andaligned in BioEdit software, removed redundant clones and primers designed by Primer 3 program. Of
the 15 primers evaluated three was not possible to optimize and 12 were optimized. The optimized
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microsatellites present as polymorphic and be used for subsequent genotyping of natural populationsof this species.
KEY-WORDS: Dinucleotide; Pellona flavipinnis; Genotyping
INTRODUÇÃO
Pellona flavipinnis e Pellona castelnaeana, regionalmente conhecidas como apapá branco e
apapá amarelo, respectivamente, são espécies importantes na pesca de subsistência na Amazônia,
sendo uma das poucas espécies da família Pristigasteridae exploradas comercialmente na Amazônia
brasileira (BATISTA; PETRERE, 2003). Considerando que os peixes são a principal fonte de proteína
na alimentação das populações amazônicas (FERREIRA et al., 1998) e que segundo Giugliano et al.
(1978), este representa cerca de 70% da proteína animal consumida, (o consumo tem incrementado de
300 a 800g por dia) com uma média per capita de 150,6 g por dia. O pescado além de ser uma das
principais fontes de proteínas animais e também uma importante fonte de renda em especial para aspopulações que vivem próximas a corpos d’água (ARAÚJO-LIMA; RUFFINO, 2003). Estudos que
avaliam aspectos da biologia de espécies populares e de baixo valor no mercado são importantes uma
vez que subsidiam planos de manejo e conservação desse recurso para avaliar as variabilidades
genéticas entre outras variáveis. Portanto, nosso objetivo foi avaliar a estrutura genética da população
de Pellona na região do meio e baixo rio Amazonas.
MATERIAL E MÉTODOS
As sequências microssatélites da espécie Pellona castelnaeana foram isoladas com auxílio deoligonucleotídeos marcados com biotina, que se ligam a partículas magnéticas revestidas de
estreptavidina. O complexo formado (oligonucleotídeo-partícula magnética) hibridiza-se nas fitas
simples em regiões do DNA genômico fragmentado que apresentam sequências nucleotídicas
complementares. O produto final é uma biblioteca enriquecida de microssatélites de sequências
definidas pelo oligonucleotídeo/sonda biotina-marcado. A metodologia usada neste trabalho, uma
modificação dos protocolos de Gautschi et al. (2000) e Guillemaund et al. (2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO95 clones positivos foram sequenciados através do método didesoxiterminal usando o
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), de acordo com as instruções
do fabricante, em associação com o analisador automático de DNA ABI 3130 (Applied Biosystem).
Ambos os filamentos do DNA de cada clone foram sequenciados com uso dos iniciadores universal e
reverso constituintes do kit. As sequências foram editadas e alinhadas com auxílio do programa
Bioedit (HALL, 1999). O programa GRAMENEssrtool foi utilizado para rastrear os microssatélites
dos clones sequenciados.
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Obtivemos um total de 24 microssatélites de motivo de repetição dinucleotídeos. Os clones
redundantes removidos e os iniciadores desenhados pelo programa Primer 3. Dos 15 iniciadores
avaliados, foi possível otimizar apenas 12, que por sua vez apresentaram, polimorfismo
transespecífico. As temperaturas de anelamento variaram entre 60 e 61 ºC e as concentrações de MgCl2
entre de 1,5 e 4 mM. Esses iniciadores serão utilizados para posterior genotipagem de populações
naturais de Pellona.
CONCLUSÕES
O método utilizado foi adequado para a construção de uma biblioteca genômica enriquecida
em microssatélites para Pellona.
A efetividade dos marcadores desenhados será avaliada mediante genotipagem.
LITERATURA CITADA
AÚJO-LIMA, C.; RUFFINO, M. Migratory Fishes of the Brazilian Amazon. pp 232 -302 In:CAROLSFELD J, HARVEY B, ROSS C, BAER, A (eds). Migratory fishes of South America.World Fisheries Trust, Victoria, BC, Canadá, 2003. 380 p.
BATISTA, V. S.; PETRERE Jr., M. Characterization of the commercial fish production landed atManaus, Amazonas state, Brazil . Acta amazonica, v. 33, n.1, p. 53-66, 2003.
FERREIRA, E. J. G., ZUANON, J. A. S., SANTOS, G.M., Peixes Comerciais do Médio Amazonas:
Região de Santarém. Edição IBAMA, Brasília, 1998, 211 p.
GIULIANO, R., SHRIMPTON, R.; ARKCOLL.,D.B.,GIUGLIANO, L.G.,PETRERE JR.,Diagnóstico e realidade nutricional do Estado do amazonas. Acta Amazônica, v 8, (Supl. II), p. 1-54.1978.
GAUTSCHI, B., WIDMER, A., KOELLA, J., Isolation and characterization of microsatellite loci inthe dice snake ( Natrix tessellata). Molecular Ecology, v. 9, p. 2192-2193, 2000.
GUILLEMAUND, T., STREIFF, R., SERRÃO-SANTOS, R., et al., Microsatellite characterization inthe rainbow Wrasse Coris julis (Pisces: Labridae). Molecular Ecology v 9, p. 631, 2000.
HALL, T. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program forWindows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series v. 41, p. 95 – 98, 1999.
