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Consumo de tecidos edíveis de porco com elevadas concentrações denandrolona: consequências em actividades profissionais específicas

Consumption of suine edible tissues with height levels of nandrolone: con-sequences for specific professional activities

Jorge Barbosa *, Alexandre José Galo

Laboratório Nacional de Investigação VeterináriaEstrada de Benfica, 701, 1549-011 Lisboa

Resumo: O consumo de determinadas substâncias por viaalimentar, pode ocasionar a excreção, na urina, de quantidadesapreciáveis dessas substâncias e/ou os seus metabolitos. Aquantidade excretada pode ser suficientemente elevada paraocasionar um resultado positivo numa análise para drogas deabuso ou num controlo de dopagem. Esta forma de ingestão decompostos proibidos, cuja comprovação é difícil, pode conduzira um quadro sancionatório para os trabalhadores e atletasenvolvidos num caso positivo. Recentemente, o elevado núme-ro de casos de dopagem envolvendo a 17βOH-nortestosterona(nandrolona), suscitou a hipótese da ingestão de produtosalimentares com este composto. Uma dessas hipóteses envolveo consumo de tecidos edíveis de porco contendo elevadasconcentrações de nandrolona. Neste trabalho, e no intuito decaracterizar a situação no nosso país, apresentam-se os resulta-dos relativos à 17α e 17βOH-nortestosterona obtidos em 44 de201 amostras de fígado de suíno, colhidas ao abrigo do PlanoNacional de Pesquisa de Resíduos (PNPR) e analisadas porcromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, nomodo de monitorização selectiva de iões (GC/MS-SIM).

Summary: The consumption of drugs in foodstuffs, can lead toexcretion of detectable amounts of drugs and/or metabolites inurine. The amount ingested and the extent of excretion may beenough to produce positive results in workplace drug testing orin doping control. This unknown ingestion of banned drugs, thatare very difficult to prove, can produce severe sanctions toworkers and athletes involved in a positive case. Anunexplained number of positive cases with 17βOH-nortes-tosterone (nandrolone) in sport activities has created consi-derable concern and discussions related to the ingestion offoodstuffs with that compound, namely boar edible tissues. Tocharacterise the situation in our country, in this study it wasmeasured the concentrations of 17α and 17βOH-nortest-osterone by gas chromatography/mass spectrometry in selectiveion monitoring mode (GC/MS-SIM) in 44 from 201 analysedsuine liver samples collected for the National Plan of ResiduesControl.

Introdução

A abordagem mais comum relativamente à seguran-

ça e qualidade alimentar está relacionada com os riscospara a Saúde Pública. A ingestão de xenobióticos porvia alimentar capazes de provocar patologias das maisdiversas, onde se incluem intoxicações agudas oucrónicas que eventualmente podem ser fatais, constituia principal preocupação dos consumidores e a priori-dade máxima das medidas profiláticas implementadase projectadas pelas autoridades. No entanto, ao redordeste núcleo central, gravitam outros problemas derelativa menor relevância, mas não menos importantes.

É do conhecimento geral que os trabalhadores dealgumas actividades profissionais estão sujeitos aocontrolo do consumo de estupefacientes. A actividadefarmacológica destes compostos é capaz de influenci-ar, negativamente, o desempenho do trabalhador, pon-do em causa a segurança de terceiros e/ou de patrimó-nio de elevado valor. O pessoal operacional ligado aostransportes aéreos, marítimos ou terrestres, as forçasmilitares e militarizadas e de segurança privada, sãoexemplos de actividades profissionais sujeitas a estetipo de controlo pelas razões anteriormente indicados.

No desporto, na defesa da saúde dos atletas e porrazões éticas, proíbe-se o consumo de certas classes decompostos que pela actividade farmacológica aumen-tam o desempenho desportivo. A administração destassubstâncias aos atletas tem o nome de dopagem.

Para controlo destas situações, as empresas e asorganizações desportivas dispõem de sistemas labo-ratoriais capazes de detectar o consumo dos compostosproibidos pela sua detecção em amostras biológicas.Em resultado de casos positivos, os indivíduos envol-vidos podem sofrer sanções de acordo com oenquadramento legal apropriado.

Mas a introdução no organismo dos compostosconsiderados proibidos poderá ser motivada, não porum acto voluntário, mas sim por outras vias nemsempre sob controlo do indivíduo. Entre estas vias,inclui-se a alimentar. Existem alimentos cujos consti-tuintes, estranhos ou não, podem provocar positi-vidade nos testes anteriormente referidos.

* Correspondente: email jorge.barbosa@lniv.min-agricultura.pt;tel: 21 711 5241; fax: 21 711 5384

R E V I S TA P O RT U G U E S ADE

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Testes para drogas de abuso

Desde há alguns anos que é conhecida a possibilida-de da positividade em testes de drogas de abuso pelaingestão de sementes de papoila (poppy seeds)(Meadway et al., 1996), utilizadas na fabricação dealguns tipos de pão e bolos. Ao conterem quantidadesvariáveis de opiáceos, de acordo com a sua origemgeográfica, o seu consumo pode positivar as análisesrealizadas para a detecção daqueles compostos naurina (Perders e Ros, 1996).

Igualmente, misturas de várias plantas originárias devários países da América do Sul destinadas à prepara-ção de chás e muitas vezes apelidados de medicinais,podem conter folhas de coca, sem que exista qualquermenção deste conteúdo no respectivo rótulo. O consu-mo destas bebidas poderá originar o aparecimento deconcentrações de metabolitos da cocaína na urina doconsumidor, em quantidade suficientemente elevadaspara positivar uma análise para cocaína (Jackson et al.,1991).

Uma situação deste tipo, que normalmente passarádespercebida ao comum dos cidadãos, trará gravesproblemas a um profissional abrangido por regulamen-tação específica em termos de controlo de drogas deabuso.

Controlo da dopagem

Compostos proibidos em produção animalNo desporto, este problema está colocado com uma

maior relevância dada a intensa mediatização que umcaso de dopagem normalmente envolve. Um casopositivo pode acarretar sanções de vária ordem para oatleta podendo envolver multas, proibição de exercerqualquer actividade desportiva e mesmo penas deprisão efectiva, dependendo das disposições legais decada país e ainda do quadro sancionatório das Federa-ções Nacionais e Internacionais das respectivas moda-lidades.

Observando os compostos proibidos aos atletas queconstam da lista do Comité Olímpico Internacional eos compostos interditos em produção animal, queconstam da Directiva 96/22/CE de Maio de 1996,verifica-se que existem, pelo menos, dois grupos coin-cidentes, nomeadamente os esteroides anabolizantes eos beta-agonistas. Esta coincidência é facilmente ex-plicável uma vez que os efeitos farmacológicos preten-didos, em ambos os casos, são os mesmos, isto é, odesenvolvimento artificial das massas musculares. Noprimeiro caso, visando uma melhoria do desempenhodesportivo e no segundo um aumento na rentabilidadeda produção.

Os produtos alimentares que contenham aquelescompostos em resultado de uma administração fraudu-lenta por parte do produtor, ao serem consumidos poratletas, podem resultar em análises positivas no contro-

lo da dopagem. Vários investigadores de áreas distin-tas têm abordado esta problemática (Kicman et al.,1994; Debruyckere et al., 1992; Debruyckere et al.,1993; Hemmersbach et al., 1995), tendo a grandemaioria dos trabalhos desenvolvidos concluído queeste facto pode ocorrer, com um grau de probabilidademaior ou menor, dependendo das circunstâncias envol-vidas.

Compostos endógenos: 17βββββOH-nortestosteronaA ingestão de compostos proibidos aos atletas por

via alimentar não se limita à possibilidade da utiliza-ção fraudulenta de promotores de crescimento. Narealidade o porco produz, de forma endógena, umcomposto que é interdito aos atletas. Referimo-nos à17βOH-nortestosterona, também conhecida por 19-nortestosterona ou nandrolona, e que é responsável,nos últimos tempos, por um elevado número de casospositivos de dopagem envolvendo atletas de elevadoprestigio internacional, alguns dos quais portugueses.

A nandrolona, quando administrada ao homem, ori-gina por via metabólica, entre outros, a 19-noran-drosterona (19-NA) e a 19-noretiocolanolona (19-NE)que são excretados na urina. Estes metabolitos sãoutilizados como marcadores biológicos nos testes dedopagem, para comprovar a administração daquelecomposto (figura 1).

Recentemente, vários investigadores verificaramque o homem também produz aqueles metabolitosendogenamente, em concentrações residuais (0,02 a0,60 ng/ml) (Dehennin et al., 1999; Le Bizec et al.,1999) por via do metabolismo da testosterona (figura2). Por este motivo, as organizações desportivas inter-nacionais introduziram um patamar de concentraçãoacima do qual se considera uma análise como positiva(> 2 ng/ml de 19-NA).

O porco macho adulto não castrado produz 17βOH-nortestosterona em grandes quantidades. Após o abatepara consumo, este composto fica depositado em di-versos tecidos edíveis tais como o músculo e o fígado,conforme foi observado por van Ginkel et al. (1989).

Figura 1 - Principais etabolitos detectados na urina após administraçãode 19-nortesterona ao homem

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Neste trabalho, os autores referem a detecção de con-centrações que variam entre 1,1 a 13 ng/g para omúsculo e 23 a 200 ng/g para o fígado.

Parece, portanto, provável que um atleta ao consu-mir uma quantidade mediana de tecidos edíveis prove-nientes de um desses animais horas antes de uma provadesportiva, poderá constituir um factor a ter em contanum teste de dopagem positivo para nandrolona. Aquantidade ingerida deste composto por esta via pode-rá, por si só, ser suficientemente elevada para quesejam excretados, na urina, concentrações dosmetabolitos capazes de ultrapassar o limite estabeleci-do, ou ser determinante para um efeito cumulativorelativamente à quantidade que o homem produzendogenamente.

Este cenário foi recentemente comprovado por in-vestigadores da Universidade de Nantes (Le Bizec etal., 2000), que verificaram concentrações de 19-NA e19-NE superiores a 2 ng/ml (3,1 a 7,5 ng/ml) na urinade indivíduos que consumiram uma quantidade decerca de 300 g de tecidos edíveis de porco nãocastrado.

O Plano Nacional de Pesquisa de Resíduos (PNPR)tem como objectivos primordiais o controlo da utiliza-ção ilegal de promotores de crescimento e a verifica-ção do uso indevido de medicamentos veterinários emprodução animal. As análises laboratoriais das amos-tras aleatoriamente colhidas resultantes da aplicaçãodaquele Plano são efectuadas no Laboratório Nacional

de Investigação Veterinária. Tendo em conta os eleva-dos teores de 17βOH-nortestosterona em tecidosedíveis de suínos destinados ao consumo humanoobservados noutros países comunitários, e sabendoque existe a possibilidade deste consumo poder ocasio-nar casos positivos de dopagem, importava caracteri-zar a situação existente em Portugal relativamente aosníveis de nandrolona em amostras provenientes desuínos.

Material e métodos

Os reagentes e solventes utilizados são de grauanalítico ou de qualidade superior adquiridos à Merck.A β-glucoronidase/sulfatase e o padrão de 17βOH-nortestosterona (17βOHNT) foram adquiridos àSigma. O N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida(MSTFA) da Macherey-Nagel e o trimetiliodosilano(TMSIodo) da Aldrich. A 17αOH-nortestosterona(17αOHNT) e a 17βOH-nortestosterona deuterada(17βOHNT_d3) utilizada como padrão interno (IS)foram gentilmente cedidas pelo RIVM, LaboratórioComunitário de Referência, Bilthoven, Holanda.

O sistema de cromatografia gasosa acoplado aespectrometria de massa (GC-MS) é da marca Agilentmodelo 6890, com injector automático da mesmamarca do modelo 7683. O cromatógrafo estava equipa-do com uma coluna capilar de sílica fundida de 30 m

Figura 2 - Via Metabólica de 19-norandosterona e da 19-noretiocolanolona no homem

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de comprimento e 0,2 mm de d.i, com fase estacionáriade 5% de fenilmetilsilicone de 0,25 µm de espessurade filme. Utilizou-se hélio como gás de arraste com umfluxo de 2 ml/min. A injecção foi feita no modosplitless, com um volume de injecção de 2 µl. O fornoinicia a temperatura programada a uma temperatura de170 ºC, sobe até 230 ºC com um incremento de 3 ºC/min, sofre novo incremento até aos 310 ºC a 10 ºC/min, mantendo-se nesta temperatura durante 5 min. Aaquisição de dados utilizada foi a monitorização selec-tiva de iões (SIM).

Para purificação dos extractos, utilizou-se um siste-ma de HPLC da Merck-Hitachi, com injector automá-tico, bomba isocrática, detector UV/Vis e colector defracções. A coluna RP-18 ADS, com 150x40 mm, 25µm de tamanho de partícula, com pré-coluna da mesmafase apolar. A fase móvel utilizada é constituída poruma mistura de metanol/água (70:30, v:v), sendo ofluxo de 0,9 ml/min. As amostras analisadas foram asresultantes da aplicação do PNPR.

Foram preparadas soluções mãe com uma concentra-ção de 1 mg/ml de 17αOHNT e 17βOHNT. Estassoluções foram então diluídas, a fim de se prepararemsoluções de trabalho com concentração de 10 e 1 µg/ml, que foram armazenadas a 4 ºC e protegidas da luz.Para o IS (17βOHNT_d3), preparou-se uma soluçãomãe a 10 µg/ml. Esta solução foi diluída de forma aobter uma solução à concentração de 1 µg/ml. Foramconstruídas curvas de calibração, pela adição a amos-tras de fígado de bovino previamente testadas e consi-deradas desprovidas dos compostos a analisar, dequantidades das soluções de trabalho atrás indicadas,de forma a se obterem concentrações de 2, 5, 10, 50 e100 µg/ml. Estas amostras sofreram o mesmo procedi-mento que as amostras a analisar.

O método de análise utilizado é o descrito por vanRossum et al. (2000).

Preparação da amostraA 5 g de homogeneizado de fígado de suíno, adicio-

nar tampão de acetato de sódio (pH=5,2) contendoglucosidase, e 50 µl de β-glucoronidase/sulfatase. Adi-cionaram-se 50 µl de solução do IS a 1 µg/ml. Incubardurante 12 horas a 37 ºC.

Processo de extracçãoApós arrefecer, adicionar 20 ml de éter terbutilmetil

(TBME), agitar, centrifugar e retirar a fase orgânica.Repetir a extracção com mais 20 ml de TBME, e juntaras duas fases orgânicas obtidas. Levar à secura emrotavapor. O resíduo seco obtido é dissolvido em 4 mlde solução metanol/água (80:20, v:v).

Desengordurar por partição com três porções de 5 mlde éter de petróleo. Evaporar a fase metanol:água atécerca de 0,5 ml. Extrair com 5 ml de TBME poragitação. Centrifugar, retirar a fase orgânica e levar àsecura em rotavapor.

PurificaçãoO extracto é dissolvido em 120 µl de fase móvel,

injectando-se 100 µl no sistema de HPLC.Recolhe-se a fracção de fase móvel eluída que

contem os analitos a analisar. Esta fracção é levada àsecura em rotavapor.

Figura 3 - Espectro de massa da 17βOHNT após trimetilsililação

Figura 4 - Cromatogramas dos iões m/z 418, 420, 403, 287 obtidos apartir de uma amostra de fígado contendo 17αOHNT (1) e 17βOHNT(2).O pico a 22.11 (m/z 421) corresponde ao IS (17βOHNT_d3)

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DerivatizaçãoO resíduo seco, isento de água, é dissolvido em 50 µl

de solução de MSTFA:TMSIodo:Ditioeritritol(1000:2:2, v:v:p). Incubar a 65 ºC durante 20 min.Transferir a solução para vial de injector automático.Analisar por GC-MS.

Resultados

Na figura 3 está representado o espectro de massa da17βOHNT após trimetilsililação. Os iões selecciona-dos para confirmar a presença de 17αOHNT e de17βOHNT nas amostras analisadas, foram o m/z 418(M+), 420, 403 e 287 (figura 4). Os critérios utilizadospara a confirmação, foram a coincidência dos temposde retenção relativa ao IS dos iões seleccionados e asua abundância relativa quando comparada com umpadrão do composto analisado nas mesmas condições.

Para a avaliação quantitativa e após se ter confirma-do a presença de 17αOHNT e de 17βOHNT nas

amostras pela aplicação dos critérios de confirmação,utilizaram-se as razões entre as abundâncias dos iõesmoleculares dos compostos (m/z=418) e do IS (m/z=421), por leitura, dos valores obtidos, contra curvasde calibração elaboradas da mesma forma a partir deamostras contaminadas.

Das 201 amostras de fígado analisadas, 44 demons-traram uma concentração de 17βOHNT superior a 10ng/g. Conforme pode ser constatado no quadro 1, estasamostras demonstram uma grande variabilidade emtermos de concentração de 17βOHNT (média de 60,2ng/g ±56,1, N=44). Esta variabilidade é, seguramente,resultado de vários factores endógenos e exógenos taiscomo idade, aporte enzimático, condições ambientais ealimentação, entre outras.

Igualmente, e mais determinante, é o facto de não serprática corrente no nosso país a castração dos animaisaté à idade do abate. Uma vez que nos boletins queacompanham as amostras não consta este tipo deinformações, e sendo estas amostras colhidas de forma

Quadro 1 - Concentração de 17αOH-nortestosterona (17αOHNT) e 17βOH-nortestosterona (17βOHNT) em fígado de suíno (amostras colhidas noPNPR – 2000/2001)

AMOSTRA Nº CONC. 17OHαNT CONC. 17OHβNT RELAÇÃO[ ng/g ] [ ng/g ] 17αOHNT/17βOHNT

1 1.7 26.5 15.62 1.9 32.4 17.13 2.1 52.3 24.94 1.2 32.4 27.05 1.6 29.5 18.46 < 1.0 19.77 3.2 79.5 24.88 4.8 123.5 25.79 1.3 23.7 18.210 < 1.0 13.811 2.9 58 20.012 1.3 18.2 14.013 1.9 35.8 18.814 3.8 67.5 17.815 5.3 86.4 16.316 < 1.0 10.717 7.1 142.8 20.118 5.4 98.7 18.319 2.7 43.5 16.120 1.7 26.8 15.821 2.5 48.9 19.622 6.8 197.6 29.123 5.4 154.7 28.624 < 1.0 20.625 1.2 25.7 21.426 3.1 32.1 10.427 6.4 202.4 31.628 2.9 26.7 9.229 3.1 34.6 11.230 < 1.0 14.932 2.9 37.5 12.933 7.6 168.4 22.234 1.2 27.8 23.235 3.1 89.5 28.936 1.3 20.5 15.838 6.4 199.7 31.239 < 1.0 10.540 1.3 21.4 16.542 1.6 34.5 21.643 < 1.0 14.844 2.1 65.3 31.1

Média 3.2 (*) 60.2 20.4Desvio Padrão 2.0 (*) 56.1 6.2(*) para as amostras com valores superiores a 1 ng/g

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aleatória, presume-se que as concentrações mais eleva-das que foram detectadas sejam provenientes de ani-mais adultos do sexo masculino não castrados.

Discussão

Os resultados obtidos para as amostras colhidas nonosso país ao abrigo do PNPR são comparáveis aosmencionados por van Ginkel et al. (1989). Uma vezque foi demonstrado (Le Bizec et al., 2000) que aingestão destes produtos pode ser factor primordial ouacessório num teste positivo de dopagem pornandrolona, e comprovando-se a existência no mercadonacional de produtos edíveis de suíno com elevadasconcentrações de 17βOHNT, presumivelmente de ma-chos não castrados, então esta hipótese terá de serigualmente equacionada no nosso país.

Os exemplos relatados, com especial destaque para anandrolona, podem provocar gravíssimos problemasaos indivíduos envolvidos, desde que a sua actividadeprofissional esteja abrangida por restrições específicas,nomeadamente a proibição da administração de deter-minados compostos. Parece, portanto, indispensável,que a segurança alimentar seja igualmente equacionadana vertente da protecção dos interesses dos consumido-res.

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