CLAUDIA DE CAMARGO TOZATO - UEL€¦ · T757a Tozato, Claudia de Camargo. Análise filogenética de...

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

CLAUDIA DE CAMARGO TOZATO

ANÁLISE FILOGENÉTICA DE PAPILOMAVÍRUS BOVINO (BPV)

IDENTIFICADOS A PARTIR DE LESÕES EPITELIAIS DA

GLÂNDULA MAMÁRIA DE VACAS LEITEIRAS

Londrina/PR

2011

ii

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL



IDENTIFICADOS A PARTIR DE LESÕES EPITELIAIS DA GLÂNDULA

MAMÁRIA DE VACAS LEITEIRAS

Dissertação apresentada ao programa de Pós-

Graduação (nível mestrado) em Ciência Animal

(área de concentração: Sanidade Animal) da

Universidade Estadual de Londrina, como requisito

para a obtenção do título de mestre.

Orientadora: Profª. Drª. Alice Fernandes Alfieri

Londrina/PR

2011

iii

Catalogação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central

da Universidade Estadual de Londrina.

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

T757a Tozato, Claudia de Camargo.

Análise filogenética de papilomavírus bovino (BPV) identificados a partir de lesões

epiteliais da glândula mamária de vacas leiteiras / Claudia de Camargo

Tozato. – Londrina, 2011.

xx, 97 f. : il.

Orientador: Alice Fernandes Alfieri.

Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Universidade Estadual de Londrina,

Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal,

2011.

Inclui bibliografia.

1. Bovino de leite – Doenças – Teses. 2. Virus do papiloma – Bovino – Teses. 3.

Virus do papiloma – Filogenia – Teses. 4. Bovino – Infecções – Teses. 5.

Histopatologia veterinária – Teses. I. Alfieri, Alice Fernandes. II. Universidade

Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação

em Ciência Animal. III. Título.

CDU 619:636.2

iv



IDENTIFICADOS A PARTIR DE LESÕES EPITELIAIS DA GLÂNDULA

MAMÁRIA DE VACAS LEITEIRAS

Dissertação apresentada para a obtenção do título de

Mestre em Ciência Animal (Área de Concentração:

Sanidade Animal) da Universidade Estadual de

Londrina.

COMISSÃO EXAMINADORA

________________________________________

Profª. Drª. Alice Fernandes Alfieri

Universidade Estadual de Londrina

________________________________________

Profª. Drª. Giovana W. Di Santis

Universidade Estadual de Londrina

________________________________________

Profª. Drª. Sheila Rezler Wosiacki

Universidade Estadual de Maringá/ Campus

Umuarama/ PR

Londrina, 25 de fevereiro de 2011.

v

Londrina, 25 de fevereiro de 2011.

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Virologia Animal, Departamento de

Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual

de Londrina como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal pelo

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, área de concentração em Sanidade

Animal, sob orientação da Profª. Drª. Alice Fernandes Alfieri.

A dissertação é parte integrante do projeto de pesquisa n° 578637/2008-1

intitulado “Doenças endêmicas negligenciáveis na pecuária bovina leiteira: Profilaxia da

papilomatose mamária por meio de vacinas VLPs (virus-like particles) produzidas a

partir da ORF L1 do BPV-6”, financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico - CNPq e Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

- MAPA, por intermédio da Secretaria de Defesa Agropecuária – DAS, Edital CNPq /

MAPA / SDA - 064/2008.

Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto

às agências e órgãos de fomento à pesquisa abaixo relacionados:

- CAPES: Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior.

- CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.

- Fundação Araucária: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Paraná.

- FINEP: Financiadora de Estudos e Projetos / MCT

vi

Dedico este trabalho à toda minha família e aos

meus cachorros Zumbi e Tica-Tica e gatos Mercy,

Nina, Tatu e Mimi, companheiros de todas as

horas...

vii

AGRADECIMENTOS

À Profª. Drª. Alice Fernandes Alfieri e ao Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri, ambos da

Universidade Estadual de Londrina, pela oportunidade, orientação, dedicação e

confiança em meu trabalho.

À Profª. Drª. Giovana W. Di Santis, da Universidade Estadual de Londrina, pela leitura

dos manuscritos e auxílio nas técnicas histopatológicas.

Ao Prof. Dr. Marco Antônio Bacellar Barreiros, da Universidade Federal do Paraná,

Campus Palotina, pelas oportunidades.

À médica veterinária Marlise Pompeus Claus, da Universidade Estadual de Londrina,

pelo auxílio nas coletas de papilomas e nas análises laboratoriais.

À médica veterinária Michele Lunardi, da Universidade Estadual de Londrina, pelo

auxílio nas análises laboratoriais e sugestões do manuscrito.

Aos médicos veterinários Eudes e Rodrigo A.A. Otonel, da Universidade Estadual de

Londrina, pelo auxílio nas coletas de papilomas nas fazendas de Londrina, Ivaiporã e de

Faxinal, PR.

Ao Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) de Ibiporã, PR, pela disponibilização de

papilomas e às amigas Cidinha e Mariana e ao técnico Davi, pelo auxílio nas coletas.

À médica veterinária Madlaine, da Universidade Estadual de Londrina, pelo auxílio nas

coletas de papilomas no estado de Santa Catarina.

À Associação Cultural e Educacional de Garça, pela disponibilização de amostras da

fazenda escola da FAEF em Garça, SP.

viii

Aos médicos veterinários Danilo e Claudia e ao estagiário Reginaldo, da Universidade

Estadual de Londrina, pelo auxílio no laboratório de anatomia patológica da UEL.

Aos médicos veterinários Elis (Régis), Taís, Raquel, Juliane, Michele, Aline, Juliana,

Otonel e, especialmente, Noemi, todos da Universidade Estadual de Londrina, pela

amizade e pela presença em todos os momentos deste trabalho.

Aos meus pais, Elizeu Tozato e Luiza Cristina Tozato, à minha irmã, Carolina Tozato, e

ao meu sobrinho Leonardo Tozato pela confiança, carinho e suporte.

À minha irmã, Heloísa Tozato e meu cunhado Guilherme Borges, ambos da

Universidade de São Paulo, pelo carinho, suporte e estímulo em todos os momentos

deste trabalho.

ix

“Encontramos a felicidade nos momentos bem

vividos de nossa jornada. Não no destino”..

Dan Millman

x

ABSTRACT

TOZATO, C.C. PHYLOGENETIC ANALYSIS OF BOVINE

PAPILLOMAVIRUSES (BPVs) OF TEAT PAPILLOMAS IN BRAZILIAN

DAIRY CATTLE HERDS. 97f. 2011. Dissertation. (Master’s Degree in Animal

Science) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.

The bovine teat papillomatosis is an infectious disease caused by BPV (bovine

papillomavirus) that affects animals of all ages, and has been reported as a health

problem in dairy cattle that determine economic losses. Despite the large number of

herds affected by teat papillomatosis, studies aiming the identification of BPVs that

infect the mammary gland are sporadic. The objective of this study was to identify the

BPV types related to the teat papillomatosis in Brazilian dairy cattle herds. Using the

PCR assay with the generic primers FAP59/FAP64, 40 samples of teat papilloma of 13

dairy herds from three Brazilian states (Paraná, São Paulo, and Santa Catarina) were

analyzed. Twelve animals had multiple lesions and more than one sample was of teat

papilloma was evaluated. The amplified products were sequenced and submitted to

phylogenetic analysis. Histopathology was performed on 29 samples and the AgNOR

histochemical staining was performed in two samples. A product of approximately 480

bp was amplified in all 40 samples. Direct sequencing of amplicons and analysis of the

sequences identified five types of BPV completely characterized (-6, -7, -8, -9, and -10);

one putative type (BAPV9); and two new putative new types, denominated BPV/BR-

UEL6 and -7. BPV-6 was the prevalent viral type identified (45% - 18/40), followed by

BPV-10 (32.5% - 13/40). It was the first identification of BPV-7, -9, -10, and the

putative new type BAPV9 in the American continent, suggesting a possible wide world

distribution of these viral types. The identification of BAPV9 from a teat papilloma

lesion demonstrate the pathogenic potential of this viral type. More than one viral type

was identified in 61.5% (8 / 13) of the herds evaluated. Of the animals with multiple

lesions, 58.3% (7 / 12) had mixed infection characterized by the presence of more than

one viral type. All animals with single infection, with various lesions caused by one

type of BPV, were determined by BPV-6 (5 / 12). Histopathologic analysis showed viral

cytopathic effects in keratinocytes and AgNOR staining technique enabled the

visualization of NORs, demonstrating the intense proliferation of the epidermal

epithelium. All papillomas were classified as true papillomas. This study demonstrates

the diversity of BPV types that affect the mammary gland of dairy cow.

Keywords: cattle, teat papillomatosis, bovine papillomavirus, phylogenetic analysis,

histopathology.

xi

RESUMO

TOZATO, C.C. ANÁLISE FILOGENÉTICA DE PAPILOMAVÍRUS BOVINO

(BPV) IDENTIFICADOS A PARTIR DE LESÕES EPITELIAIS DA

GLÂNDULA MAMÁRIA DE VACAS LEITEIRAS. 97f. 2011. Dissertação.

(Mestrado em Ciência Animal, Área de Concentração: Sanidade Animal) –

Universidade Estadual de Londrina, Londrina.

A papilomatose mamária é uma doença infecto-contagiosa determinada pelo BPV

(bovine papillomavirus) que acomente animais de todas as idades, e tem sido relatada

como problema sanitário em gado de aptidão leiteira por determinar prejuízos

econômicos para o setor. Apesar do grande número de rebanhos afetados pela

papilomatose mamária, estudos que avaliam a diversidade de BPVs que infectam a

glândula mamária são esporádicos. O objetivo do trabalho foi identificar os tipos de

BPV relacionados com o desenvolvimento de papilomatose mamária em rebanhos

leiteiros. Utilizando a técnica da PCR, com os primers genéricos FAP59/FAP64, foram

analisadas 40 amostras de papilomas de teto de 13 rebanhos leiteiros provenientes de

três estados brasileiros (Paraná, São Paulo e Santa Catarina). Doze animais que

apresentavam múltiplas lesões e tiveram mais de uma amostra de papiloma avaliada. Os

produtos amplificados foram sequenciados para a realização de análises filogenéticas.

Foi realizado o exame histopatológico de 29 amostras e, adicionalmente, foi realizada a

coloração histoquímica AgNOR. Todas as 40 amostras geraram um produto de

aproximadamente 480 pb. O sequenciamento direto dos amplicons e análises das

sequências identificaram cinco tipos de BPV já caracterizados (-6, -7, -8, -9 e -10), um

provável novo tipo (BAPV9) e dois novos prováveis tipos nunca descritos

anteriormente, denominados BPV/BR-UEL6 e -7. O BPV-6 foi o tipo viral identificado

com maior freqüência (45% - 18/40), seguido pelo BPV-10 (32,5% - 13/40). Foi a

primeira identificação no continente Americano dos tipos de BPV -7, -9 e -10 e do

suposto novo tipo BAPV9, recentemente descritos na Europa (BPV-10) e Ásia ( BPV-

7, -9 e -10 e BAPV9), sugerindo a provável distribuição universal desses tipos virais. A

identificação do BAPV9 a partir de lesões de teto demonstra o potencial patogênico

desse tipo viral. Mais de um tipo viral foi identificado em 61,5% (8/13) dos rebanhos

avaliados. Dos animais com múltiplas lesões, 58,3% (7/12) apresentavam infecção

mista caracterizada pela presença de mais de um tipo viral. Todos os animais que

apresentavam infecção simples, isto é, com várias lesões causadas por um tipo de BPV

foram determinadas pelo BPV-6 (5/12). A análise histopatológica mostrou

queratinócitos sob efeito citopático viral e a coloração pela técnica de AgNOR

possibilitou a visualização das NORs, demonstrando a intensa proliferação celular do

epitélio. Todos os papilomas foram classificados histologicamente como epiteliais. O

presente estudo demonstra a diversidade de tipos virais que acometem este sítio

anatômico.

Palavras-chave: bovino, papilomatose mamária, papilomavírus bovino, análise

filogenética, histopatologia.

xii

LISTA DE FIGURAS

Revisão de Literatura

Figura 1. Desenho esquemático do genoma do papilomavírus bovino tipo 1. Fonte:

Alfieri et al., 2007...........................................................................................27

Figura 2. Organização genômica linear do BPV-9 e BPV-10...........................................28

Artigo “Teat papillomatosis associated with recent characterized BPV types (BPV-7,

-9 and -10) in Brazilian cattle herds”

Figura 1. Histopathological evaluation of teat papillomas. (A) Lesion harboring BPV-10

characterized by mild to moderate acanthosis, granular cell layer hyperplasia

and discrete hyperkeratosis. HE staining, 100x. (B) Papillary projections

compounded of orthokeratosis and acantholytic epidermis sustained by scanty

connective-vascular tissue (arrow) in BPV-7-induced lesion. The upper cell

layer hypergranulosis resulted in marked basophilic aspect (empty arrow). HE

staining, 100x. (C) BPV-9 papilloma featuring hypergranulosis and

koilocytosis (centre) in a moderately acantholytic and orthokeratotic

epidermis. HE staining, 400x. (D) High-power field showing basal cell layer

proliferation, mitotic figures (arrows) and empty stromal blood vessels from

BPV-6 cutaneous lesions. HE staining, 400x……………......…………...…47

Artigo “Phylogenetic analyses of bovine papillomavirus (BPV) of teat papillomas in

Brazilian dairy cattle herds”

Figura 1. Neighbour-joining phylogenetic tree reconstructed with FAP sequences of

previously described BPV types, and putative new BPV types. A

representative of each BPV type identified in the study was identified as C2

(BPV-6), E1 (BPV-7), U2 (BPV-8), H3 (BPV-9), F3 (BPV-10), I1 (BAPV9)

and the new putative types desidnated as BPV/BR-UEL6 and -7. The tree is

divided into the previously determined genera Deltapapillomavirus,

Epsilonpapillomavirus, Xipapillomavirus, an unassigned PV genus (BPV-7)

and a probable new genus. The numbers in internal nodes represent the

xiii

bootstrap support values determined for 1000 replicates. The BPV/BRUEL-6

and 7 indicated by shading…………………………………………….…….70

Figura 2. Neighbour-joining phylogenetic tree reconstructed with FAP sequences of

previously described BPV types, and putative new BPV types except BAA3.

A representative of each BPV type identified in the study was identified as C2

(BPV-6), E1 (BPV-7), U2 (BPV-8), H3 (BPV-9), F3 (BPV-10), I1 (BAPV9)

and the new putative types desidnated as BPV/BR-UEL6 and -7. The tree is

divided into the previously determined genera Deltapapillomavirus,

Epsilonpapillomavirus, Xipapillomavirus, and an unassigned PV genus

(BPV-7). The numbers in internal nodes represent the bootstrap support

values determined for 1000 replicates. The BPV/BRUEL-6 and 7 indicated by

shading………………………………………………………………........…71

Figura 3. Photomicrograph of the lesion F2 (BPV-10) stained with AgNOR technique.

Arrows indicate nucleolar organizer regions, demonstrating the high cell

proliferation in keratinocytes (AgNOR staining, 10X objective)…………...72

Figura 4. Photomicrograph of four bovine teat papillomas that had different macroscopic

classifications. A) Lesion C2 (BPV-6/filiform): papilloma filiform, with a

close few papillary projections of similar length. The papillary projections

directed in a similar way. B) Lesion F1 (BPV-10/caulyflower): papilloma

cauliflower, has large numbers of close long papillae, of similar length. The

papillary projections directed similarly. C) Lesion L1 (BPV-6/frond) presents

many papillary projections, with variable length, spaced and directed

asymmetrically. D) Lesion V2 (BPV/BR-UEL7/flat-and-round): papilloma

flat-and-round displays moderate epidermal hyperplasia, flat, extending the

papillary ridges to the dermis (HE stain, objective 4X)……………………..73

Anexo B

Figura 1. Foto documentação de aspectos macroscópicos de papilomatose mamária.

Novilha com papilomatose mamária. A) Múltiplos papilomas no teto e pele

com aspecto de “couve-flor” e “plano”. B) Teto acometido em região de

esfíncter com mastite purulenta causada por infecção secundária. C) Teto

xiv

acometido pela papilomatose, apresentando-se deformado e totalmente

descaracterizado. D) Animal após remoção/coleta de papilomas de

teto...................................................................................................................92

Anexo C

Figura 1. Foto documentação de alterações citopáticas induzidas pelo papilomavírus

bovino em tecido epitelial de glândula mamária. Fotomicrografia de papiloma

da lesão K1, classificado como BPV tipo BAPV9. Primeira descrição

histopatológica da neoplasia determinada por esse tipo viral, que foi

identificado a partir de swabs provenientes de pele de teto saudável de

animais do Japão. Hiperplasia da epiderme, coilocitose moderada e

hiperqueratose. Papiloma exclusivamente de epiderme, sem proliferação

fibroblática, classificado como papiloma verdadeiro (coloração HE; objetiva

de 10X)............................................................................................................93

Figura 2. Fotomicrografia da lesão V2 classificada macroscopicamente como flat-and-

round, induzida por um suposto novo tipo identificado no trabalho (BPV/BR-

UEL7). A) Hiperlasia da epiderme plana, com prolongamento de cristas

papilares para derme (objetiva de 4X). B) Grânulos cerato-hialínicos

grosseiros em grande quantidade. (coloração HE; objetiva de

10X)................................................................................................................94

Figura 3. Fotomicrografia da lesão S1 (BPV-10), demonstrando pela seta intensa

coilocitose nos queratinócitos da camada espinhosa da epiderme (coloração

HE; objetiva de 40X)......................................................................................94

Figura 4. Fotomicrografia da lesão S1 (BPV-10), demonstrando pela seta inclusões

intranucleares nos queratinócitos da camada espinhosa da epiderme

(coloração HE; objetiva de 40X)....................................................................95

Figura 5. Fotomicrografia da lesão U2 (BPV-8). A seta indica região de dermatite

perivascular linfoplasmocitária com predomínio de linfócitos em derme

xv

adjacente, sugerindo provavelmente um estádio inicial de regressão do

papiloma (coloração HE; objetiva de 10X).....................................................96

xvi

LISTA DE TABELAS

Artigo “Teat papillomatosis associated with recent characterized BPV types (BPV-7,

-9 and -10) in Brazilian cattle herds”

Tabela 1. Lesion characteristics and type classification of the viral strains identified…48

Artigo “Phylogenetic analyses of bovine papillomavirus (BPV) of teat papillomas in

Brazilian dairy cattle herds”

Tabela 1. BPV identification and macroscopic characteristics of teat lesions from three

different Brazilian states………………………………….............................74

Tabela 2. Distribution of BPV viral types in herds, animals and

lesions…………,.................................................................................…...….75

Tabela 3. The highest similarity percentage of Brazilian putative new bovine

papillomavirus types with BPV-1 to -10 and putative new BPV

types…………………....................................................................................76

Tabela 4. The highest similarity percentage of Brazilian putative new bovine

papillomavirus types with BPV-1 to -10 and putative new BPV types except

BAA3……………………………………………………………………......76

Anexo A

Tabela 1. Alterações histopatológicas e tipo viral de papilomas de teto...........................91

xvii

LISTA DE QUADROS

Revisão de Literatura

Quadro 1. Funções das proteínas codificadas pelo papilomavírus bovino tipo 1..............29

Quadro 2. Primers utilizados na reação em cadeia da polimerase para a identificação e

análise filogenética do papilomavírus bovino associado a lesões cutâneas....29

xviii

SUMÁRIO

1. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................01

Introdução........................................................................................................02

Papilomavírus..................................................................................................03

Classificação viral...........................................................................................03

Estrutura e organização genômica dos papilomavírus...................................05

Controle da transcrição...................................................................................07

Expressão das proteínas virais........................................................................07

Ciclo replicativo..............................................................................................08

Patologia dos papilomavírus bovino (BPV)....................................................09

Tumores do trato digestório e bexiga..............................................................10

Papilomatose cutânea bovina..........................................................................11

Papilomatose mamária....................................................................................14

Resposta imune ao BPV..................................................................................17

Imunoprofilaxia para o BPV............................................................................18

Considerações finais........................................................................................19

Referências......................................................................................................21

2. OBJETIVOS............................................................................................30

3. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO.........................................................32

3.1 Teat papillomatosis associated with recent characterized BPV types (BPV-

7, -9 and -10) in Brazilian cattle herds.……………………………….…33

Abstract………………………………………………………………..........34

Introduction………………………………………...……...………………..35

Material and Methods………………………………………………….… .36

Papilloma specimens…………………………………...........36

DNA extraction……………………………………………..37

PCR assay………………………………………………... ...37

Sequence analysis……………………………………..……...38

Histopathology…………………………………………………..……39

Results……………………………………………...……….................39

xix

Discussion………………………………..…………………………40

Acknowledgements………………………………………………….42

References…………………………………………………………...43

3.2 Phylogenetic analyses of bovine papillomavirus (BPV) of teat papillomas

in Brazilian dairy cattle herds……………………………………………..…49

Abstract………………………………………….……………………….......50

Introduction………………………………………….……...………………..51

Material and Methods…………………………………...………….54

Papilloma specimens…………………………………...……..54

DNA extraction…………………………………..…….……..54

PCR assay……………………………………………..……...55

Sequence analysis……………………………………..……...56

Phylogenetic analysis………………………………...… ..…..57

Histopathology…………………………………………………… …58

Results……………………..………………………………..................58

PCR and sequence analysis…………………………..…....…58

Phylogenetic analyses…………………………………....…...59

Histology………………………………………..……………..…..….60

Discussion…………………………………..……………..…..……60

Acknowledgements………………………..……………..….…..….65

References……………………………..…………………..……..….66

4. CONCLUSÕES.....................……………......………………..…......77

5. APÊNDICES........................................................................................79

A) Lista de Reagentes............................................................................80

B) Soluções e Tampões..........................................................................82

C) Protocolo de Técnicas.......................................................................85

6. ANEXOS.....................................................................................................90

A) Tabela 1. Alterações histopatológicas dos papilomas de teto induzidas

pelos tipos de papilomavírus bovino identif....................................................91

B) Foto documentação de aspectos macroscópicos de papilomatose

mamária...........................................................................................................92

Figura 1. Novilha com papilomatose mamária. A) Múltiplos

papilomas no teto e pele com aspecto de “couve-flor” e “plano”. B) Teto

xx

acometido em região de esfíncter com mastite purulenta causada por infecção

secundária. C) Teto acometido pela papilomatose, apresentando-se deformado

e totalmente descaracterizado. D) Animal após remoção/coleta de papilomas

de teto...............................................................................................................92

C) Foto documentação de alterações citopáticas induzidas pelo papilomavírus

bovino em tecido epitelial de glândula

mamária...........................................................................................................93

Figura 1. Fotomicrografia de papiloma da lesão K1, classificado

como BPV tipo BAPV9. Primeira descrição histopatológica da neoplasia

determinada por esse tipo viral, que foi identificado a partir de swabs

provenientes de pele de teto saudável de animais do Japão. Hiperplasia da

epiderme, coilocitose moderada e hiperqueratose. Papiloma exclusivamente

de epiderme, sem proliferação fibroblática, classificado como papiloma

verdadeiro (coloração HE; objetiva de

10X).................................................................................................................93

Figura 2. Fotomicrografia da lesão V2 classificada macroscopicamente

como flat-and-round, induzida por um suposto novo tipo identificado no

trabalho (BPV/BR-UEL7). A) Hiperlasia da epiderme plana, com

prolongamento de cristas papilares para derme (objetiva de 4X). B) Grânulos

cerato-hialínicos grosseiros em grande quantidade. (coloração HE; objetiva de

10X).................................................................................................................94

Figura 3. Fotomicrografia da lesão S1 (BPV-10), demonstrando pela

seta intensa coilocitose nos queratinócitos da camada espinhosa da epiderme

(coloração HE; objetiva de 40X).....................................................................94

Figura 4. Fotomicrografia da lesão S1 (BPV-10), demonstrando pela

seta inclusões intranucleares nos queratinócitos da camada espinhosa da

epiderme (coloração HE; objetiva de

40X).................................................................................................................95

Figura 5. Fotomicrografia da lesão U2 (BPV-8). A seta indica região de

dermatite perivascular linfoplasmocitária com predomínio de linfócitos em

derme adjacente, sugerindo provavelmente um estágio inicial de regressão do

papiloma (coloração HE; objetiva de 10X)....................................................96

1. REVISÃO DE LITERATURA

2

REVISÃO DE LITERATURA

Introdução

O rebanho bovino brasileiro cresce, em média, 1,5% ao ano e chegou a mais de

200 milhões de cabeças em 2010 conferindo ao país os títulos de segundo maior

rebanho de bovinos do mundo - atrás apenas da Índia -, de segundo maior produtor de

carne bovina - depois dos Estados Unidos, e de maior exportador mundial do produto

(FAO).

Além da carne, o Brasil também se destaca pela produção anual do leite bovino,

a qual registrou recordes de exportação entre 2000 e 2008 e em 2009 foi de,

aproximadamente, 30 bilhões de litros, com alta de 5,6% em relação ao ano anterior

(IBGE, 2010). De acordo com o Ministério de Desenvolvimento, Indústria e Comércio

Exterior (MDIC), esse crescimento anual da produção de leite no Brasil – que em média

atingiu 1,95% ao ano - corresponde ao aumento da demanda no mercado internacional,

principalmente da China, e a menor oferta dos países produtores de leite. Para Rocha

(2007), este cenário torna o Brasil também um forte candidato a grande exportador

mundial de leite e de produtos lácteos.

Entretanto, do ponto de vista sanitário, os rebanhos bovinos leiteiros brasileiros

apresentam-se susceptíveis a várias doenças de caráter infecto-parasitário que podem

comprometer consideravelmente a saúde animal, a produção leiteira e a rentabilidade da

atividade. Entre as enfermidades tem-se as doenças agudas, que evoluem com sinais

clínicos e que são visíveis em uma observação, e as infecções endêmicas com evolução

subclínica ou crônica e que são “invisíveis”, o que resulta na tendência de se

perpetuarem no rebanho. Como o controle dessas doenças apresenta alto custo

financeiro devido o gasto dispendioso com os tratamentos – quando há, pois no caso de

certas infecções virais ele não existe - e descarte do animal, resta a alternativa de

condutas como o diagnóstico laboratorial e a profilaxia (ALFIERI, 2008).

Um exemplo de infecção viral que causa grandes prejuízos aos rebanhos bovinos

é a papilomatose cutânea, causada pelo papilomavírus bovino (bovine papillomavirus -

BPV) que está amplamente distribuído em rebanhos de todo o mundo e é considerado

endêmico em todo o território brasileiro (ALFIERI et al., 2007). Entre seus efeitos

destacam-se as infecções secundárias, a dificuldade de amamentação do bezerro, a

3

depreciação do couro e o descarte precoce de animais e ainda, no caso de rebanhos de

aptidão leiteira, a papilomatose mamária ocasiona dificuldade de ordenha, retenção de

leite e predisposição a mastite.

Mas se por um lado a papilomatose cutânea caracteriza-se como uma virose que

causa prejuízos ao rebanho, por outro ela ainda constitui-se uma doença negligenciada

do ponto de vista científico e profissional. Exemplo disso são os resultados

contraditórios e deficientes dos vários tratamentos sugeridos, cuja grande maioria não

apresenta comprovação de eficiência (SILVA et al., 2004).

De acordo com este cenário, desenvolver métodos baseados em evidências

científicas para o controle e profilaxia de uma doença negligenciada como a

papilomatose, pode trazer reflexos diretos na produção leiteira da grande maioria dos

rebanhos nacionais.

Papilomavírus

O papilomavírus constitui um grupo de vírus DNA altamente diverso com

potencial para a indução de lesões hiperproliferativas benignas e malignas, tanto na pele

quanto em mucosas de seus hospedeiros naturais. Muito provavelmente, os PVs

ocorram na maioria das espécies de mamíferos, aves e répteis (de VILLIERS et al.,

2004).

Classificação viral

A caracterização do genoma dos papilomavírus (PVs) foi sempre o critério

utilizado para sua nomenclatura e taxonomia, uma vez que eles não apresentam cultura

celular nem marcadores sorológicos. Tradicionalmente, os isolados de PVs que tinham

DNA significativamente diferentes de outros isolados eram chamados de “tipos”, e

todos os PVs eram agrupados com os poliomavírus na família Papovaviridae.

Entretanto, com os estudos moleculares realizados nos últimos 25 anos os PVs

foram diferenciados dos poliomavírus. O resultado de comparações filogenéticas de

grande número de PVs resultou em sua nova classificação, reconhecida pelo “Comitê

Internacional de Taxonomia Viral” (BERNARD, 2007). Atualmente eles são

4

classificados taxonomicamente na família Papillomaviridae, que apresenta várias

divisões.

Os papilomavírus são identificados pela abreviatura PV, juntamente com uma ou

duas letras indicando a espécie hospedeira. Os tipos de PVs seguem a ordem numérica

de descrição. Nos últimos 20 anos o Reference Center for Papillomaviruses at the

German Cancer Research Center tem sido responsável pelo processo de registro dos

HPVs (CHAN et al., 1995; DOOBAR, 2005; BERNARD, 2005; BERNARD, 2007).

Nesta família, como a sequência de nucleotídeos mais conservada é a ORF L1,

ela é responsável pela identificação de novos tipos virais do genoma do PV. Assim,

seguindo a taxonomia atual, o maior ramo taxonômico da família Papillomaviridae é

formado pelo “gênero”, que compartilha menos de 60% de identidade na análise de

nucleotídeos da ORF L1 e entre 23% e 43% de identidade de nucleotídeos na análise do

genoma completo. O sub-ramo taxonômico é formado por “espécies” que compartilham

no gênero entre 60 e 70% de identidade de nucleotídeos. Um novo “tipo” é reconhecido

quando tiver seu genoma completo clonado e o sequenciamento da L1 demonstrar

diferença de identidade de nucleotídeos superior a 10%, quando comparado a todos os

outros PV já descritos naquela espécie. Diferenças entre 2% e 10% definem um

“subtipo” e inferiores a 2% caracterizam uma “variante” viral. Quando somente uma

parte do gene L1 é amplificada e avaliada, sugerindo essas diferenças, o isolado é

denominado de suposto novo tipo (de VILLIERS et al., 2004; BERNARD 2005). Esse

critério, originalmente estabelecido para o HPV, tem sido extrapolado para outros PVs

identificados em outras espécies animais como a bovina, uma vez que não existe

padronização na taxonomia dos PV isolados em animais (de VILLIERS et al, 2004).

Estudos demonstram que o genoma dos PVs evolui lentamente. A árvore

filogenética de todos os PVs de origem humana e animal apresenta uma história

evolutiva tão antiga quanto a dos seus respectivos hospedeiros naturais, isto é, mais de

100 milhões de anos nos casos de PVs de vertebrados e milhares de centenas de anos

para os human papilomavirus (HPVs). No nível taxonômico de gênero existe uma

correlação limitada entre classificação taxonômica, biologia molecular e propriedades

patogênicas, porém, no ramo taxômico que formam uma espécie, os tipos de PV

possuem similaridade genômica e propriedades biológicas semelhantes (BERNARD,

2007).

De acordo com as características clínicas, anatomopatológicas e moleculares, os

BPVs -1 a -6 foram distribuídos em subgrupos na antiga classificação. O subgrupo A

5

(BPV-1,-2 e -5) era constituído por vírus que induzem proliferação fibroblástica e

subgrupo B (BPV-3,-4 e -6) compreendem os vírus epiteliotrópicos (CAMPO, 1995).

Esta distribuição foi baseada na premissa de que cada tipo de BPV tenha especificidade

por algum tecido, apresente determinado aspecto macroscópico e tenha localização

anatômica específica no corpo do animal afetado. Os estudos moleculares recentes,

envolvendo a identificação do BPV presente em lesões cutâneas, sugerem que talvez

esse critério de classificação de acordo com aspecto e localização do papiloma não deva

ser totalmente seguido. A diversidade dos PVs em seres humanos já está comprovada e

alguns tipos virais já foram descritos em outros locais além do primariamente

identificado (DOORBAR, 2005; CLAUS et al., 2008c).

Atualmente, a família Papillomaviridae, com base na biologia e homologia

genômica, é formada por 18 gêneros (Alphapapillomavirus a Sigmapapillomavirus) (de

VILLIERS et al., 2004). Os tipos de BPV identificados até o momento são classificados

em quatro gêneros que incluem o Deltapapillomavirus (BPV-1 e -2), Xipapillomavirus

(BPV-3, -4, -6, -9, -10 e -11), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 e -8) e um tipo ainda não

nominado (BPV-7) (de VILLIERS et al., 2004; OGAWA et al., 2004; TOMITA et al.,

2007; HATAMA et al., 2008).

Estrutura e organização genômica dos papilomavírus

Um aspecto importante que caracteriza os PVs é a dificuldade de propagação in

vitro em culturas de monocamada celular, uma vez que in vivo esses vírus se replicam,

naturalmente, no núcleo das células do epitélio e requerem o aparato de diferenciação

celular para a replicação (CAMPO, 2002).

Os PVs são considerados vírus altamente espécie-específicos. O único caso

singular de infecção entre espécies é a infecção de equídeos por papilomavírus bovino

tipos -1 e -2. Após infecção acidental da derme, principalmente os equídeos podem

desenvolver tumores dermais benignos conhecidos como sarcóide equino (CAMPO,

2002).

Em humanos, os estudos de vírus oncogênicos tem proporcionado importantes

descrições de processos celulares como o armazenamento e expressão da informação

genética, o controle de ciclo celular, a tradução de sinal, a regulação da resposta imune e

carcinogênese. A identificação dos tipos virais envolvidos na patologia de tumores

possibilita novas oportunidades de tratamento clínico e o desenvolvimento de

6

estratégias de vacinação. Acredita-se que a ação de imunoprofilaxia com abordagens

específicas antivirais, reduza a incidência desses tumores (NASIR e CAMPO, 2008).

Os estudos com o BPV em bovinos tem possibilitado a compreensão da história

natural do vírus, a ligação direta entre a infecção viral e neoplasia, a correlação entre

vírus-hospedeiro-ambiente, o esclarecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos

na resposta à infecção e o desenvolvimento de vacinas antipapilomavírus (NASIR e

CAMPO, 2008).

Os PVs são pequenos vírus oncogênicos, não envelopados, com 55-60nm de

diâmetro e com genoma constituído por DNA fita dupla. O capsídeo viral é composto

por 72 pentâmeros (capsômeros), sendo que 60 capsômeros se ligam de forma

hexavalente e 12 de forma pentavalente, arranjados em superfície de triangulação T=7,

composto pela proteína principal (L1) do capsídeo e a proteína secundária interna do

capsídeo (L2). O DNA genômico viral consiste numa molécula fita dupla circular com

7.3 a 8 kpb. Nos vírions e nas células hospedeiras o genoma está conjugado à

nucleossomos, apresentando aspecto empacotado como cromossomos. A massa

molecular do ácido nucléico é de 5.0x106 daltons e representa 12% da massa do vírion.

A partícula viral é resistente às condições do meio ambiente e a solventes lipídicos

como o éter e clorofórmio (GARCEA e CHEN, 2007; ALFIERI et al., 2007).

O genoma do PV possui sequências conservadas, localizadas em uma das fitas

do DNA, indicando que somente uma fita é utilizada como molde para a transcrição das

proteínas. Não são observadas diferenças na organização entre os gêneros de

papilomavírus. A fita codificante contém cerca de 10 sequências abertas de leitura (open

reading frames - ORFs), que são classificadas conforme a fase de expressão temporal,

sendo que o segmento E (early) contém oito ORFs iniciais, e o segmento L (late)

contém duas ORFs tardias. Além das sequências conservadas existe no genoma viral a

região LCR (long control region - LCR) que controla os processos de transcrição e

replicação viral. O desenho esquemático do genoma do BPV-1 está representado na

figura 1 (ALFIERI et al., 2007).

O segmento E representa 45% do genoma viral e codifica proteínas necessárias

para as fases de transcrição e de replicação viral. Nesse segmento, estão as ORFs que

codificam as proteínas regulatórias e as proteínas oncogênicas dos PVs. As proteínas

“E” são expressas em células recém infectadas, em infecções não produtivas, assim

como em células transformadas. O segmento L representa 40% do genoma viral e

codifica as proteínas do capsídeo (L1 e L2), que são produzidas nas fases tardias da

7

replicação viral e são encontradas somente em células com infecções produtivas. As

ORFs dos PVs estão sobrepostas compactando vários genes em uma pequena extensão

do genoma. Entre os segmentos E e L está o segmento LCR que representa 15% do

genoma viral que não codifica proteínas, mas é constituído por elementos reguladores

da replicação e da transcrição e por promotores que são responsáveis pelos fatores

celulares, além de conter o ponto de origem (ori) da replicação viral (HOWLEY e

LOWY, 2001; ALFIERI et al., 2007).

Controle da transcrição

A LCR do BPV contém 12 locais que interagem com a proteína E2. Essa

proteína é fundamental no ciclo viral do BPV, sendo que é um fator de replicação do

DNA viral e o maior regulador de transcrição viral, que se liga à região LCR ativando

ou reprimindo a transcrição dos genes virais. Além disso, vários outros fatores de

transcrição celular interagem com a LCR, tanto promovendo quanto inibindo a

transcrição dos genes virais. Essas interações resultam em um circuito sincronizado

onde elementos de controle, viral e celular, contribuem para regular a expressão dos

genes virais Quando essa harmonia é desestabilizada, a transcrição dos genes e

expressão das proteínas víricas aumentam, e o resultado é a transformação celular para o

estado neoplásico (NASIR e CAMPO, 2008).

Expressão das proteínas virais

Os genes E1 e E2 estão envolvidos na regulação da transcrição e na replicação

do vírus. Os genes E5, E6 e E7 apresentam regulação negativa dos genes E1 e E2. Na

ausência de E1 e E2 os produtos de E6 e E7 são oncogenes potentes. No BPV-5, o gene

E5 é o principal gene encontrado em células transformadas. Esse gene é altamente

conservado entre os PVs indutores de fibropapilomas nos seus hospedeiros naturais,

além de ter a capacidade de induzir tumores fibroblásticos em hamsters. Provavelmente,

o gene E5 seja o principal responsável pela proliferação de fibroblastos em

fibropapilomas (HOWLEY e LOWY, 2001).

Alguns tipos de BPVs não possuem todos os oncogenes virais em seu genoma.

No BPV-7, descrito em 2007, o gene E5 não foi identificado. A ORF E6 está ausente

nos BPVs-3, -4 e -6, assim como em outros PVs (JACKSON et al.,1991; TERAI et al.,

8

2002). Uma hipótese relevante seria a de que um rearranjo genômico, ocorrido em

ancestrais virais, pode ter contribuído para a evolução de alguns tipos de PVs sem

alguns oncogenes virais. Esses genes também estão envolvidos na adaptação do genoma

dos PVs a vários hospedeiros e tecidos (GARCEA e CHEN, 2007). Em contraste, as

ORFs E1, E2, L2 e L1 são bem conservadas em todos tipos de PVs e seus produtos são

proteínas essenciais para o ciclo de replicação viral (de VILLERS et al., 2004).

As proteínas estruturais L1 e L2 são expressas nos núcleos de queratinócitos

diferenciados. Durante a morfogênese do virion, a proteína L2 se liga ao DNA viral,

auxiliando a montagem do vírus. As proteínas L1 e, possivelmente, L2 mediam a

ligação do vírus com o receptor de membrana celular na infecção. As duas proteínas

codificam epítopos neutralizantes e tem sido empregas com sucesso no

desenvolvimento de vacinas (NASIR e CAMPO, 2008).

O estado físico do genoma do PV pode se apresentar sob duas formas, conforme

o tipo de lesão associada à infecção. Nas lesões benignas, o genoma está presente em

múltiplas cópias, não integrado ao genoma celular, isto é, na forma epissomal. Nas

lesões malignas, o genoma do PV pode se integrar ao genoma da célula hospedeira

formando uma ligação estável. O vírus integrado é incapaz de completar o ciclo

replicativo, visto que os genes essenciais para o término da replicação estão

interrompidos. Quando o fenômeno da integração acontece, o genoma circular do PV é

rompido, geralmente entres os genes E1 e E2. Com a inativação do gene E2, que

codifica uma proteína reguladora que reprime a transcrição excessiva das proteínas E6 e

E7, há aumento dos produtos desses genes (CULLEN et al., 1991).

Ciclo replicativo

Os PVs que induzem uma variedade de lesões hiperproliferativas em tecidos

epiteliais. Apesar das diferenças de potencial oncogênico desses vários tipos de PVs, é

provável que eles compartilhem mecanismos comuns durante o ciclo de vida produtiva

(HOWLEY e LOWY, 2001).

O ciclo de vida produtiva do BPV está intimamente ligado ao programa de

diferenciação do tecido epitelial do hospedeiro (HOWLEY e LOWY, 2001). O receptor

celular de adsorção viral ainda é desconhecido, embora o heparan sulfate pareça

facilitar o acesso do vírus em alguns tipos de células. Os alvos da infecção inicial são as

células epiteliais basais, que são expostas como resultado de microlesões do epitélio

9

estratificado. Após a ligação e entrada do vírus na célula, os virions migram para o

núcleo (LEE e LAIMINS, 2007). A replicação do genoma ocorre na fase S do ciclo

celular por meio da ação das proteínas virais E1 e E2, juntamente com proteínas de

replicação celular. Após a replicação do genoma viral e divisão celular uma das células

filhas migra para longe da camada basal e inicia o programa de diferenciação.

Queratinócitos não infectados interrompem o ciclo celular replicativo, após deixar a

camada basal, e o núcleo é degradado em muitas dessas células em diferenciação. Em

contrapartida, as células infectadas pelo BPV se diferenciam, mas permanecem com o

ciclo celular ativo. Isto permite que células suprabasais, altamente diferenciadas, voltem

a entrar na fase S e mantenham o alto nível de replicação viral. A capacidade das células

diferenciadas de manter a progressão do ciclo celular é mediada, principalmente, pela

ação da proteína viral E7. A amplificação do genoma viral dependente da diferenciação

em células suprabasais e coincide com a ativação dos promotores virais tardios. As

transcrições tardias codificam as proteínas virais do capsídeo (L1 e L2). A progênie dos

virions é montada em células altamente diferenciadas e, em seguida, liberada para o

meio extracelular (LEE e LAIMINS, 2007).

Estudo tem demonstrado que vários tipos de HPV podem ser, aparentemente,

não patogênicos e comportarem-se como agentes comensais da pele saudável de seres

humanos (FOURSLUND et al., 1999; ANTONSSON et al., 2000). O mesmo ocorre em

várias espécies de animais, incluindo a bovina, onde tanto BPVs já caracterizados

quanto aqueles ainda descritos como supostos novos tipos virais tem sido isolados a

partir de swabs de pele saudável (ANTONSSON e HANSSON, 2002; OGAWA et al.,

2004; ANTONSSON e MC MILLAN, 2006).

Patologia do papilomavírus bovino (BPV)

Os PVs são altamente espécie-específicos e estão relacionados com lesões no

epitélio cutâneo e mucoso de várias espécies de mamíferos, aves e répteis (DOOBAR,

2005). As infecções entre diferentes espécies hospedeiras são raras, mas não há infecção

produtiva na segunda espécie. O sarcóide, que é o tumor de pele mais comumente

relatado em equinos e muares, está associado à infecção desses animais pelo BPV-1 e

BPV-2 (NASIR e CAMPO, 2008).

Os BPVs-1 e -2 pertencem ao gênero Deltapapillomavirus e são, usualmente,

denominados fibropapilomavírus. Com frequência, causam infecção no epitélio e na

10

derme induzindo a formação de fibropapilomas. Os BPVs-3, -4, -6, -9, -10 e -11

pertencem ao gênero Xipapillomavirus, são vírus exclusivamente epiteliotrópicos e

induzem a formação papilomas verdadeiros. Os BPVs-5 e -8 são membros do gênero

Episilonpapillomavirus e parecem apresentar patologia dupla, causando fibropapilomas

e papilomas epiteliais e seu genoma compartilha homologia tanto com o gênero

Deltapapillomavirus quanto com o gênero Xipapillomavirus. Com base em análises

filogenéticas foi proposto que o BPV-7 pertença a um novo gênero de BPV. Com base

em análises parciais do gene L1, supostos novos tipos de BPVs têm sido descritos e

aguardam a caracterização genômica completa para a definição taxonômica (BLOCH et

al, 1996; OGAWA et al., 2004; CLAUS et al. 2008a; OGAWA et al., 2007; TOMITA

et al., 2007; NASIR e CAMPO, 2008).

A replicação viral ocorre nos queratinócitos, durante o processo de diferenciação

do epitélio escamoso. Nos fibroblastos, onde o genoma do BPV está presente na forma

epissomal não há replicação viral. Papilomas e fibropapilomas podem ocorrer em

diferentes sítios anatômicos de bovino onde diferentes genotipos de BPV são

encontrados. Os BPVs também podem ser encontrados em células polimorfonucleares

do sangue periférico, no entanto, não existe evidência da replicação viral nessas células.

Essa observação é importante pela implicação na patogênese da infecção, pois sugere

que a corrente sanguínea pode carrear o vírus para diferentes tecidos

(BORZACCHIELLO e ROPERTO, 2008).

Tumores do trato digestório e bexiga

Evidências epidemiológicas demonstram que algumas lesões benignas podem

sofrer transformação maligna em resposta a fatores genéticos ou ambientais

(HOPKINS, 1986). Nesse contexto, a hematúria enzoótica bovina (HE) e o tumor de

trato digestório superior em bovinos são enfermidades relacionadas à associação entre

infecção pelo BPV e a ingestão da planta samambaia (CAMPO et al., 1992).

A hematúria enzoótica bovina apresenta caráter enzoótico em determinadas

regiões geográficas que reúnem condições ideais para o crescimento da samambaia. A

samambaia é uma pteridófita do gênero Pteridium, espécie P. aquinilum, de distribuição

cosmopolita em todas as regiões tropicais. A samambaia apresenta em sua composição

diversas substâncias mutagênicas, carcinogênicas e imunossupressivas. A

11

carcinogenicidade da planta tem sido atribuída a quercetina, ptaquilosídeos e ao ácido

shiquímico (ALFIERI et al., 2007).

A infecção pelo BPV-2 e a intoxicação crônica pela samambaia foram

associadas com lesões vesicais e a sinais cílincos de hematúria enzoótica em bovinos

adultos. Vários estudos indicam que a progressão maligna das lesões do aparelho

urinário depende de uma inter-relação entre a infecção pelo BPV-2 e os compostos

tóxicos presentes na samambaia (CAMPO, 1995; WOSIACKI et al., 2005).

O diagnóstico do BPV-2 por meio de técnicas convencionais é de difícil

realização, particularmente pela não adaptação do vírus em sistemas de replicação in

vitro em culturas celulares. Os avanços nos métodos de diagnóstico molecular tornaram

possível o diagnóstico da infecção pelo PV partir da identificação do DNA viral por

meio de técnicas de hibridação molecular ou pela reação em cadeia pela polimerase

(PCR) (WOSIACKI et al., 2005).

Em bovinos, a infecção pelo BPV-4 pode resultar em papilomas no trato

digestório superior que podem progredir para o câncer quando associada aos compostos

tóxicos presentes na samambaia (CAMPO, 2002; BORZACCHIELLO et al., 2003).

Papilomatose cutânea bovina

Na espécie bovina, o BPV está amplamente distribuído em rebanhos bovinos de

todo mundo, sendo que no Brasil, independentemente do nível de tecnificação da

exploração pecuária, a infecção pode ser encontrada tanto em rebanhos bovinos de corte

quanto, principalmente, em rebanhos com aptidão leiteira em praticamente todo o país.

A maior prevalência da infecção pelo BPV observada nos rebanhos leiteiros, resultando

principalmente no quadro da papilomatose cutânea, pode ser justificada pelo emprego

de práticas de manejo mais intensivas, comuns a esse tipo de exploração (CLAUS et al.,

2007).

Em rebanhos com papilomatose cutânea, na dependência da extensão das lesões,

pode-se observar o comprometimento do desenvolvimento corporal dos animais,

predisposição a infecções secundárias, queda na produção de leite e redução do valor de

mercado do animal, entre outras consequências que podem acarretar prejuízos

econômicos à exploração pecuária de corte e, principalmente, leiteira (CAMPO, 2002).

Normalmente, ocorre a regressão espontânea dos papilomas como resultado da resposta

imune celular, mas alguns animais são incapazes de combater a infecção e podem

12

sucumbir frente a infecção cutânea generalizada ou ao envolvimento da mucosa. Estas

formas de papilomatose são problemáticas e de grande importância econômica


As lesões cutâneas podem apresentar aspectos variados e são classificadas

macroscopicamente em filiformes, na forma típica pedunculada e nas formas atípicas,

planas. Os papilomas do tipo pedunculado apresentam aspecto verrucoso, sugerindo a

forma de “couve-flor”. A base de inserção pode ser ampla ou estreita, com coloração

variando do cinza ao preto e desprovida de pêlos. As lesões, dependendo do número,

podem formar uma grande massa e comprometer extensas áreas da pele. Os papilomas

planos são achatados, com base ampla, de coloração esbranquiçada e com presença de

pêlos. Podem se apresentar de forma agrupada ou isolada e são de difícil remoção

(GUPTA et al., 1989; SMITH et al., 1995).

Alguns tipos de BPVs, ainda não identificados, infectam o epitélio vulvo-

vaginal e os olhos (HATAMA et al., 2008). Existem algumas formas de apresentação

clínica que são relacionadas com o tipo de BPV destacando-se: BPV-1 com

fibropapilomas em teto e pênis; BPV-2 com verrugas cutâneas, fibropapilomas do trato

digestório e tumores de bexiga; BPV-3 com papilomas cutâneos; BPV-4 com papilomas

epiteliais do trato digestório superior; BPV-5 com fibropapilomas de morfologia

macroscópica em formato de grão de arroz no úbere; BPV-6 com papilomas de

morfologia macroscópica classificada como “frond” presentes nos tetos; BPV-8 com

papilomas cutâneos; BPVs-9 e -10 associados com papilomas de teto e úbere


Embora se tenha correlacionado os genotipos virais com o aspecto morfológico

macroscópico das lesões, estudos atuais demonstram resultados que não correspondem a

essa correlação (CLAUS et al., 2008a; MAEDA et al., 2007). Fibropapilomas que

ocorrem no prepúcio e pênis podem sangrar e, frequentemente, apresentar áreas de

necrose. Os fibropapilomas podem se espalhar ao longo do períneo e como os animais

infectados apresentam a tendência de lamberem as lesões, as mesmas podem se

disseminar para o focinho e a boca. Os fibropapilomas podem ainda causar perda de

função reprodutiva e, com isso, promover o descarte precoce dos animais. As lesões

cutâneas induzidas pelo BPV-2 são geralmente encontradas na testa, pescoço, tórax e

costas. Surtos de papilomatose cutânea têm sido descritos em animais confinados


13

O exame histopatológico é uma das formas indiretas de diagnóstico do

papilomavírus. Embora permita a identificação de neoplasias intra-epiteliais, essa

técnica não possibilita a identificação do tipo viral associado à lesão. Achados

histológicos dos papilomas incluem: i) presença de vesículas intracitoplasmáticas

(degeneração hidrópica) em células do estrato espinhoso, ii) aumento na quantidade de

granulações basofílicas, intracitoplasmáticas e intranucleares no estrato granuloso; e iii)

inclusões eosinofílicas intranucleares (HEAD et al., 2002).

A observação microscópica dos papilomas cutâneos revela a presença de

hiperqueratose e hiperplasia celular da camada espinhosa (acantose). Essas células

mostram aumento de tamanho e no número dos desmossomos e tonofibrilas. Outras

células epiteliais podem apresentar alterações degenerativas como a perda das

tonofibrilas, separação dos desmossomos, atipia nuclear focal e vacuolização do

citoplasma. Nas camadas superiores do epitélio essas mudanças são mais pronunciadas.

Na camada granular a degeneração nuclear é evidente, com marginação e condensação

da cromatina (LANCASTER e OLSON, 1982). Em contraste com essas alterações

celulares estão os fibromas induzidos pelos fibropapilomavírus. Estes fibromas

apresentam extensiva proliferação fibroblástica, com as células arranjadas em círculo e

com padrões irregulares. Os fibropapilomas exibem uma combinação desses efeitos,

sendo que a primeira reação da pele é a estimulação dos fibroblastos na derme,

acompanhada por resposta inflamatória com congestão, edema e infiltração leucocitária.

Em torno de uma semana após a infecção a reação inflamatória diminui, porém a

estimulação fibroblástica prossegue, seguida pela invasão da camada papilar da derme

por fibroblastos (JELÍNEK e TACHEZY, 2005). Nos papilomas pedunculados, as

cristas interpapilares penetram profundamente no interior da derme, ao contrário dos

papilomas planos onde o tecido da derme sofre pouco ou nenhuma fibroplasia. A

literatura ressalta a importância da análise do tipo de lesão, uma vez que estudos

demonstram que mesmo com os achados macroscópicos e histológicos compatíveis com

a presença do vírus, somente técnicas de diagnóstico etiológico podem comprovar a

presença viral (GUPTA et al., 1989; SANTIN e BRITO, 2004; MCGAVIN e

ZACHARI, 2007).

14

Papilomatose mamária

A papilomatose mamária é uma forma de manifestação clínica da papilomatose

cutânea na ocorrência neste sítio anatômico. As lesões causadas pelos BPVs em tetos,

assim como na papilomatose cutânea, são denominadas verrugas, papilomatose

mamária ou figueira. Atualmente, foram encontrados oito tipos de BPVs induzindo

lesões em tetos e úberes de bovinos, além de outros tipos virais ainda não

caracterizados. Desde a década de 80, vários estudos que visavam a identificação de

tipos virais associados aos papilomas do aparelho mamário bovino identificaram o

BPV-6 como tipo mais prevalente neste sítio anatômico e, a partir desses estudos, a

papilomatose mamária bovina tem sido associada principalmente ao BPV-6

(LINDHOLM et al., 1984; JARRET et al., 1984; MAEDA et al. 2007).

Lindholm et al. (1984) em estudo realizado com lesões epiteliais de teto animais

provenientes de abatedouro identificaram o BPV-6 em 92% das lesões avaliadas. Maeda

et al. (2007) investigaram um surto de papilomatose mamária em bovinos de leite no

Japão em que 80% do rebanho de 700 animais foi comprometido e encontraram o BPV-

6 em, aproximadamente, 86% (12/14) das lesões analisadas. Ogawa et al. (2004)

utilizando dois pares de primers genéricos, desenvolvidos para identificação de HPVs

cutâneos e mucosos, avaliaram lesões e swabs cutâneos de tetos de bovino de leite de 5

properiedades e identificaram o BPV-6 somente em um swab de pele de teto saudável.

No Brasil, um estudo de identificação de tipos de BPV em lesões cutâneas, o BPV-6 foi

o tipo viral mais prevalente em papilomas de tetos de bovinos de corte (3/3) em 3

rebanhos distintos (CLAUS et al, 2007). Outro estudo no Brasil identificou o BPV-6

associado em co-infecção ao BPV-1 em lesão de teto de bovino de corte (CLAUS et al.,

2008b). Atualmente não há estudos no Brasil com objetivo de identificar os tipos virais

envolvidos na papilomatose mamária. Entretanto, em todo o mundo, já foram

identificados vários tipos de BPVs (BPV-1, -3, -5, -7, -8, -9, -10), além de tipos virais

ainda não totalmente caracterizados (supostos novos tipos), a partir de papilomas de

aparelho mamário bovino (CAMPO et al., 1981; JARRET et al., 1984; LINDHOLM et

al., 1984; CAMPO, 2002; OGAWA et al., 2004; MAEDA et al., 2007; CLAUS et al.,

2007; NASIR e CAMPO, 2008).

A papilomatose mamária é uma doença infecto-contagiosa que compromete

animais de todas as idades, incluindo animais adultos. Porém os animais jovens, com até

os dois anos de idade, são os mais comprometidos. As lesões têm caráter auto-limitante

15

e tipicamente regridem entre 1-14 meses. Ocasionalmente, alguns tumores podem

persistir e progredir para carcinoma de células escamosas (SUNBERG, 1987; CAMPO,

1987). Segundo Campo (2002), fibropapilomas e papilomas de tetos e úberes podem ser

um grande problema econômico em bovinos uma vez que o papiloma pode atingir a

região do períneo e a parte inferior do corpo. Em alguns animais nos quais a regressão

espontânea dos papilomas não ocorre, a infecção pode generalizar pelo aparelho

mamário, inviabilizando a ordenha.

Existe grande variação nos aspectos relacionados à morfologia das lesões e à sua

progressão. Também são desconhecidas algumas características específicas da infecção

destacando-se entre elas: a correlação do tipo viral com o aspecto morfológico

macroscópico da lesão; e a persistência e possível progressão com generalização de

alguns casos. Macroscopicamente, a lesão se inicia com a proliferação de uma pequena

massa abaulada na pele do teto que, com o tempo, aumenta de diâmetro, torna-se áspera

e pedunculada até que o papiloma é formado (BORZACCHIELLO e ROPERTO, 2008)

Papilomas localizados no úbere e nos tetos de vacas em lactação dificultam a

amamentação dos bezerros e a ordenha tanto manual quanto, principalmente, mecânica.

Dentre os problemas mais frequentes ocasionados pelos papilomas destacam-se: i)

dificuldade do encaixe perfeito das teteiras da ordenhadeira mecânica ocasionada pela

irregularidade do tecido epitelial do teto ou distorção do ducto causando vazão do ar e

dificuldade na sucção do leite que comprometem a saúde do teto; ii) condenação de

novilhas ao abate antes mesmo da primeira lactação devido às extensões das lesões; iii)

predisposição à mastite devido à presença de leite residual ocasionada pela sensação

dolorosa que inibe a descida do leite; iv) presença de verrugas ao redor do canal do teto

que também podem predispor à mastite; v) predisposição aumentada para o

desenvolvimento de infecções bacterianas secundárias ocasionadas por lacerações das

verrugas presentes nos tetos (BLOWEY e EDMONDSON, 1995; BORZACCHIELLO

e ROPERTO, 2008).

A característica auto-limite da doença ocasiona negligência por parte dos

criadores no que tange ao controle da infecção. Com frequência, a papilomatose entra

no rebanho por meio da compra de animais infectados, aparentemente com poucos

papilomas, e de baixo valor no mercado, disseminando o vírus no rebanho. O fato dos

criadores ignorarem a presença de alguns animais infectados, mantendo-os juntamente

com animais sadios também predispõe a disseminação da infecção por meio de

16

equipamentos de ordenha, fômites, mãos dos ordenhadores, entre outras formas diretas e

indretas de transmissão do BPV.

Na criação de bovinos são reconhecidos vários fatores predisponentes que,

atuando de forma isolada ou preferencialmente em associação, reconhecidamente

ocasionam distúrbios hormonais que culminam com o desenvolvimento de

imunodepressão dos animais. Falhas na resposta imune são um dos principais fatores

responsáveis pela manutenção e, principalmente, disseminação da infecção intra-

rebanho. Dentre as várias condições que ocasionam o desencadeamento de

imunodepressão destacam-se aquelas relacionadas ao manejo, nutrição e sanidade.

Falhas no manejo dos animais ocasionam condições inapropriadas de bem-estar animal

gerando situações de estresse prolongado e constante, tais como temperaturas extremas

como calor ou frio excessivos, superlotação, locais inapropriados de criação. Nutrição

inadequada, tanto nos aspectos quantitativos quanto qualitativos dos alimentos, diminui

o potencial de resposta imune dos animais. Infestações por endo e ectoparasitas

ocasionam distúrbios relacionados aos aspectos nutricionais e de bem-estar animal

contribuindo, consideravelmente, com a redução no potencial de resposta imune dos

animais. Ainda é possível citar alguns vírus responsáveis por efeitos imunosupressivos

em bovinos como herpesvírus bovino (BoHV-1), vírus da diarréia viral bovina (BVDV)

e vírus da leucemia bovina (BLV).

A eficiência de diferentes protocolos de tratamentos para papilomatose bovina já

foi testada, como a utilização da autovacina, auto-hemoterapia, diaminazina,

clorobutanol. Entretanto a eficiência dos resultados dos tratamentos é contraditória e

deficiente, levando à necessidade da repetição contínua dos mesmos. Por tratar-se de

uma enfermidade autolimitante e que pode variar com cada animal, a avaliação dos

tratamentos é relativa. Embora a porcentagem de “cura” demonstrada pelos tratamentos

seja bastante variada, a autovacina é o tratamento terapêutico que merece destaque. As

variadas taxas de sucesso obtidas com sua utilização podem ser decorrentes de alguns

aspectos relacionados à sua produção e características biológicas do BPV (SILVA et al.,

2004).

Várias medidas, específicas e inespecíficas, podem ser implementadas com o

objetivo de controle da papilomatose bovina. Todas elas devem ser direcionadas para a

redução da circulação viral no rebanho ou para a não geração de situações que

proporcionem a manutenção e a disseminação do vírus intra-rebanho. Entre as medidas

destacam-se: isolamento dos animais infectados; tratamento dos animais; remoção

17

cirúrgica dos papilomas; emprego de auto-vacinas; anti-sepsia das mãos de

ordenhadores; desinfecção de equipamentos e fômites; cuidados especiais em processos

que causem ferimentos na pele tais como colocação de brincos e tatuagens; alteração da

ordem de ordenha com os animais infectados sendo manejados por último; criação em

ambientes adequados que proporcione bem-estar animal; nutrição adequada em termos

quantitativos e qualitativos; controle de endoparasitas; controle de carrapatos e moscas.

Resposta imune ao BPV

A imunidade para as infecções pelo BPV é considerada tipo-específica e o status

imunológico dos animais infectados é considerado fator crucial para a definição da

resolução clínica. Enquanto a imunidade humoral tem a habilidade de prevenir novas

infecções, a imunidade celular, provavelmente envolvendo linfócitos T, é responsável

pela regressão espontânea e imunomediada das lesões já estabelecidas (NICHOLLS e

STANLEY, 2000). As lesões benignas produzidas na infecção cutânea e mucosa pelo

PV apresentam tendência de regressão espontânea. No entanto, algumas infecções com

curso clínico prolongado e que determinam lesões extensas podem, ocasionalmente,

progredir para o câncer. Infecções pelo BPV, ocasionando lesões benignas podem ser

encontradas tanto em animais imunodeprimidos quanto em imunocompetentes. Casos

de papilomatose persistente geralmente são observados em animais imunodeprimidos

(ALFIERI et al., 2007).

O PV deve ser capaz de superar as resposta imune do hospedeiro

para se replicar, no entanto, apesar da superação do vírus, eventualmente, o

hospedeiro produz resposta imune eficaz e as células infectadas são eliminadas.

A resposta imune de bovinos para o BPV é surpreendentemente pobre. Os animais

podem apresentar tumores sólidos, produzindo ativamente vírus em grande quantidade,

porém não respondem facilmente aos antígenos BPV durante o curso da infecção e

anticorpos anti-BPV raramente são detectados. O fracasso do sistema imunológico para

reconhecer tanto a adsorção do vírus quanto a progênie viral é devido ao fato de que o

ciclo replicativo viral é restrito ao epitélio e, portanto, o vírus não entra em contato com

o sistema imune. Essa interpretação é apoiada pelo fato de que os animais a campo que

apresentam tumores ulcerados com hemorragia têm altos títulos de anticorpos anti-BPV.

Adicionalmente, a resposta humoral pode ser obtida após a inoculação intramuscular de

vírus purificado ou de proteínas virais, confirmando que só quando o papiloma está

18

lesionado, ou após a imunização, os antígenos virais entram em contato com as células

do sistema imunológico. Podem ser observadas respostas T e B fracas frente às

proteínas do capsídeo (L1 e L2) ou à proteínas transformantes (E7) em estádios finais da

infecção que parecem estar associadas com a rejeição do papiloma (NASIR e CAMPO,

2008).

Durante a rejeição dos papilomas, grandes massas de linfócitos ativados se

acumulam na derme subjacente. Provavelmente, a resposta imune ineficiente frente ao

BPV seja a principal razão para a persistência da infecção, uma vez que mesmo em

animais imunocompetentes, os papilomas persistem por muitos meses antes que ocorra

a regressão (NASIR e CAMPO, 2008).

Recentemente, estudos demonstraram que além do “escape imunológico” em

razão do ciclo viral confinado ao epitélio, os PVs podem desenvolver formas de evasão

do sistema imune do hospedeiro como a interrupção da expressão do MHC I pela

proteína E5 (O’BRIEN e CAMPO, 2002).

Imunoprofilaxia para o BPV

A expressão dos genes L1 e L2 em células eucarióticas, ou somente do gene L1,

resulta na auto-montagem (empacotamento) das proteínas em partículas semelhantes ao

vírus (VLP – virus-like particles), as quais são estruturalmente e antigenicamente

similares aos virions naturais (KIRNBAUER et al., 1996). O aproveitamento desta

propriedade biológica das proteínas estruturais dos PVs vem sendo empregado com

sucesso na elaboração de diversas vacinas profiláticas para diferentes espécies

hospedeiras, sendo que VLPs produzidas a partir destes genes tem se mostrado

altamente imunogênicas, conferindo proteção quando do desafio com tipo viral

(KIRNBAUER et al., 1996). Estudos demonstraram que a vacina elaborada com a

proteína L1 do BPV-2 promoveu proteção contra a infecção e que o uso da proteína L2

induziu mais rapidamente a regressão de lesões pré-formadas (JARRETT., et al 1991).

Em contrapartida, a vacina com a proteína L2 do BPV-4, proporcionou proteção total

contra o agente. Curiosamente os epítopos da L2 do BPV-4 são homólogos e têm reação

cruzada com epítopos identificados na proteína L2 de vários HPVs, levando a predizer

que vacinas baseadas nas proteínas L2 do HPV poderiam induzir reação imune cruzada

entre diferentes genotipos de HPVs (NASIR e CAMPO, 2008).

19

Vacinas terapêuticas (curativas), designadas para induzir a regressão das lesões

pré-malignas, têm sido desenvolvidas com base na proteína L2 do BPV-2, ou na

proteína E7 do BPV-4. Em ambos os casos, a regressão é acompanhada por infiltração

de linfócitos e macrófagos, que é indicativo de uma resposta imune mediada por células,

semelhante ao observado na regressão natural dos papilomas (NASIR e CAMPO,

2008).

Considerações finais

Enquanto numerosos tipos HPVs já foram definidos, até o início da década de 80

somente seis tipos de BPVs (BPV-1 a -6) haviam sido identificados a partir de casos de

papilomatose cutânea e de câncer em bovinos (PFISTER et al., 1979; CAMPO et al.,

1980, 1981; CAMPO e COGGINS, 1982; CHEN et al., 1982; JARRETT et al., 1984).

Entretanto, estudos realizados a partir do início da década atual, com o objetivo de

investigar a diversidade do BPV, tem indicado a existência de numerosos tipos de BPV,

a exemplo do que ocorre nos seres humanos (ANTONSSON e HANSSON, 2002;

OGAWA et al., 2004).

O principal impedimento para a caracterização de novos PVs é a ausência de um

sistema convencional de cultivo celular para a propagação viral in vitro. Os métodos

recentes para a identificação de novos PVs são baseados em reações de PCR

empregando primers genéricos (degenerados). Estes primers são desenhados a partir de

sequências conservadas do gene que codifica a proteína L1 de tipos de PVs

anteriormente caracterizados. Essa estratégia tem sido utilizada com sucesso na

detecção de um amplo espectro de tipos virais já conhecidos e de novos tipos de HPV,

uma vez que a ORF L1 é a mais conservada no genoma dos PVs. Uma destas

metodologias, envolvendo a utilização do par de primers FAP (FAP59 e FAP64), foi

originalmente desenvolvida para a amplificação de HPVs cutâneos. Porém, essa

estratégia tem também possibilitado a detecção de novos tipos virais tanto em bovinos

quanto em outras espécies animais (FORSLUND et al., 1999; ANTONSSON e

HANSSON, 2002; OGAWA et al., 2004; ANTOSSON e McMILLAN, 2006;

LITERÁK et al., 2006; CLAUS et al., 2008a; CLAUS et al., 2008b; CLAUS et al.,

2008c).

20

Recentemente, a partir da análise de papilomas cutâneos de bovinos no estado do

Paraná, utilizando a técnica de PCR com o par de primers FAP59/FAP64, foram

identificados os tipos de BPV já descritos anteriormente (BPV-1, 2, 6 e 8) e quatro

prováveis novos tipos de BPV que ainda não haviam sido descritos em todo o mundo

(CLAUS et al., 2007; 2008a; 2008b, 2008c).

No Brasil, o estudo mais abrangente envolvendo a epidemiologia molecular da

papilomatose cutânea, observada em diversos rebanhos bovinos do estado do Paraná, foi

realizado por meio do emprego da técnica da PCR com primers genéricos. O BPV-6 foi

o tipo viral mais prevalente em papilomas provenientes de tetos e/ou úberes (CLAUS et

al., 2007). Curiosamente, achado similar foi encontrado em estudo realizado no Japão,

que teve como objetivo a identificação dos tipos de BPV mais prevalentes em um surto

de papilomatose mamária envolvendo 560 novilhas (MAEDA et al., 2007).

Dentre os 11 tipos de BPVs até então caracterizados, tem-se o relato da

ocorrência de oito tipos virais em lesões cutâneas dos tetos e úberes de animais

acometidos por papilomatose cutânea (NASIR e CAMPO, 2008). Porém, a realização

de investigações epidemiológicas em diversas regiões geográficas, as quais venham

elucidar quais os tipos mais prevalentes em lesões da glândula mamária de bovinos,

ainda podem ser consideradas escassas em todo o mundo.

A imunidade para as infecções pelo BPV é considerada tipo-específica e o status

imunológico dos animais infectados é considerado fator crucial para definir a resolução

clínica. Enquanto a imunidade humoral tem a habilidade de prevenir novas infecções, a

imunidade celular é responsável pela regressão espontânea e imunomediada das lesões

já estabelecidas (NICHOLLS e STANLEY, 2000).

Em bovinos, vacinas preventivas também tem sido desenvolvidas contra os

BPVs tipos 2 e 4, sendo que estes dois tipos virais foram, respectivamente,

selecionados como representativos para os papilomavírus cutâneos e mucosos, e

também porque ambos os tipos estão relacionados com a determinação de câncer em

bovinos (CAMPO et al., 1993).

O desenvolvimento de vacinas e estratégias imuno-profiláticas contra a

papilomatose mamária, requer previamente a identificação dos tipos de BPV mais

prevalentes na neste sítio anatômico. O controle e profilaxia de uma doença

negligenciada como a papilomatose pode trazer reflexos diretos na produção leiteira da

grande maioria dos rebanhos nacionais.

.

21

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27

Ilustrações

Figura 1. Desenho esquemático do genoma do papilomavírus bovino tipo 1. Fonte:

Alfieri et al. (2007). Modificado de Frazer (2004).

28

Figura 2. Organização genômica linear do BPV-9 e BPV-10. As caixas

representam as early (E) e late (L) ORFs. A longa região de controle (LCR)

abrangendo os nucleotídeos 7158–323 no BPV-9 e 7006–101 no BPV-1 está

representada expandida abaixo do genoma. , Sinal de poliadenilação; , sítio

de ligação de E2; , sítios de ligação de E1; , protomotores virais. Modificado

de Hatama et al. (2008). Disponível no GenBank (NC_ 18089739).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18089739

29

Quadro 1. Funções das proteínas codificadas pelo papilomavírus bovino tipo 1

Fonte: Alfieri et al. (2007)

Quadro 2. Primers utilizados na reação em cadeia da polimerase para a identificação e análise

filogenética do papilomavírus bovino associado a lesões cutâneas.

Primera Sequência

b nt HPV-8

FAP59 5’TAA CWG TIG GIC AYC CWT ATT 3’ 5981-6001

FAP64 5’CCW ATA TCW VHC ATI TCI CCA TC 3’ 6458-6436

a Fourslund et al. (1999)

b Nucleotídeos degenerados: W=T, C; I=Inosina; Y=C, T; V=A, C, G; H=A, T, C.

2. OBJETIVOS

32

OBJETIVOS

Objetivo Geral:

Identificar os tipos de BPV relacionados com o desenvolvimento de

papilomatose mamária em rebanhos bovinos leiteiros brasileiros.

Objetivos Específicos:

Detectar a presença dos BPVs envolvidos nas lesões cutâneas do aparelho

mamário de bovinos leiteiros pertencentes às regiões brasileiras alvo do estudo

empregando os primers genéricos (FAP) desenhados a partir da ORF L1;

Sequenciar os amplicons-FAP e realizar as análises filogenéticas por meio da

comparação das sequências obtidas com as disponíveis em bases públicas de dados;

Verificar as diferentes alterações histopatológicas e correlacionar o tipo de lesão

ao genótipo do BPV.

33

3. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO

34

3.1 TEAT PAPILLOMATOSIS ASSOCIATED WITH RECENT

CHARACTERIZED BPV TYPES (BPV-7, -9 AND -10) IN BRAZILIAN

CATTLE HERDS*

* Artigo editado de acordo com as normas de publicação do periódico Veterinary Microbiology,

disponível em: http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/503320/authorinstructions

35

TEAT PAPILLOMATOSIS ASSOCIATED WITH RECENT

CHARACTERIZED BPV TYPES (BPV-7, -9 AND -10) IN BRAZILIAN

CATTLE HERDS

Abstract

Teat papillomatosis has been reported in dairy herds worldwide as a cattle health

problem responsible for economic losses. Despite the high number of cattle herds

affected by cutaneous papillomatosis, studies evaluating BPV diversity remain sporadic.

The aim of the current report was to genotype the BPV types associated with teat

papillomas obtained from Brazilian cattle herds. Fifteen teat papilloma lesions

underwent papillomavirus DNA detection via the FAP PCR assay and were processed

for histopathological evaluation. BPV-6, -7, -9, and -10 were identified in ten (66.7%),

two (13.3%), one (6.7%), and two (13.3%) papilloma specimens, respectively. All

specimens analyzed were classified as true papillomas. This finding demonstrates the

great diversity in BPV types that occurs in benign teat lesions. This study represents the

first report of the identification of the recently characterized BPV types 7, 9, and 10

associated with cases of teat papillomatosis in cattle from the South American

continent.

Keywords: Bovine papillomavirus; cutaneous papillomatosis; papilloma; warts;

histopathology.

36

1. Introduction

Papillomaviruses are able to induce cutaneous warts in the skin and mucosal

epithelia of most higher vertebrate species examined. Some specific viral types have the

potential to cause malignant progression in papillomatous lesions of animals and

humans (Antonsson, Hansson, 2002, de Villiers et al., 2004). In cattle, bovine

papillomaviruses (BPV) are known as the etiological agents of distressing diseases such

as cutaneous and teat papillomatosis, papillomatosis and cancers of the upper

gastrointestinal tract and urinary bladder (Campo, 2002, Borzacchiello et al., 2003a,

2003b, Wosiacki et al., 2006).

Teat papillomatosis has been reported in dairy herds worldwide as a cattle health

problem responsible for economic losses, as milking can become difficult in markedly

affected individuals. Ulceration and rupture of established cutaneous lesions may

predispose dairy cattle to mastitis and distortion of the milk ducts. Additionally, the

maintenance of affected heifers with alteration in mammary gland shape and/or even of

herds with a high number of affected animals may prevent economic profits in the dairy

industry (Campo, 2002, Borzacchiello, Roperto, 2008).

Currently, the genomes of ten BPVs (BPV-1 to -10) have been fully

characterized. They are classified in four genera based on their biological properties and

genome relatedness. These genera are Deltapapillomavirus (BPV-1 and -2),

Xipapillomavirus (BPV-3, -4, -6, -9, and -10), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 and -8),

and a yet unnamed PV genus (BPV-7) (Hatama et al., 2008). Moreover, the occurrence

of numerous additional viral types has been proposed based on partial nucleotide

sequence analysis of the major capsid protein L1, obtained both from benign cutaneous

lesions and swab samples of healthy skin from cattle (Antonsson, Hansson, 2002,

37

Ogawa et al., 2004, Maeda et al., 2007, Claus et al., 2008, 2009a). Papilloma lesions

found in teats and udders can be caused by diverse BPV types. Although these warts can

be caused by several viral types, BPV-6 has often been identified in this anatomical

location. However, the association of BPV-1, -3, -5, -7, -8, -9, -10, and other types still

to be characterized, have indeed been confirmed in mammary glands of cattle (Campo

et al., 1981, Jarrett et al., 1984, Ogawa et al., 2004, Maeda et al., 2007, Claus et al.,

2007, 2008).

Despite the high number of cattle herds affected by cutaneous papillomatosis in

several geographical regions in Brazil, studies evaluating BPV diversity associated with

different clinical outcomes remain sporadic (Santos et al., 1998, Freitas et al., 2003,

Wosiacki et al., 2005, 2006, Claus et al., 2007, 2009a, 2009b).

The aim of the current report was to genotype the BPV types associated with

papilloma lesions obtained from cattle herds with teat papillomatosis. To our

knowledge, this study represents the first attempt to investigate the BPV diversity

related to cases of teat papillomatosis in cattle from Brazil.

2. Material and Methods

2.1. Papilloma specimens

Fifteen teat papilloma lesions were individually collected from dairy cows

belonging to two different cattle herds from the northern region of Parana state in

southern Brazil. The teat papillomas were macroscopically classified as “frond,

“caulyflower, “filiform” and “flat-and-round”.

38

Fragments from each papilloma specimen were ground in phosphate-buffered

saline solution (PBS pH 7.2), and suspensions (10–20%, w/v) were centrifuged for 15

min at 3000 g at 4°C. Aliquots (250 l) from supernatant were treated with lysis

buffer [10 mM Tris; 1 mM EDTA; 0.5% Nonidet P40; 1% SDS; and 0.2 mg/ml

proteinase K (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA)]. After homogenization,

the samples were incubated at 56°C for 30 min.

2.2. DNA extraction

For DNA extraction, a combination of phenol/chloroform/isoamyl alcohol and

silica/guanidine isothiocyanate methods was performed according to Alfieri et al.

(2006). Briefly, fractions from each sample were treated with an equal volume of

phenol/ chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), homogenized, and heated at 56°C for 15

min (Sambrook et al., 1989). After centrifugation at 10,000 g for 10 min, the aqueous

phase was processed according to the silica/guanidine isothiocyanate method (Boom et

al., 1990). DNA was eluted in 50 µl of ultrapure (MilliQ®) sterile water and kept at

20°C until use. Aliquots of ultrapure sterile water were included as a negative control

in the DNA extraction procedures.

2.3. PCR assay

The PCR assay was carried out using the primer pair FAP59 (forward: 5’-

TAACWGTIGGICAYCCWTATT- 3’) and FAP64 (reverse: 5’-

CCWATATCWVHCATITCICCATC- 3’) according to Forslund et al. (1999), with

slight modifications (Claus et al., 2007). The reaction was performed using 5 µl of the

39

extracted DNA and 45 µl of PCR mix consisting of 1 µl (20 pmol) of each primer, 200

µM of each dNTP (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA), 2.5 units of

Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Life Technologies, BR), 1 PCR buffer (20

mM Tris– HCl pH 8.4 and 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2 and ultrapure sterile water,

resulting in a final volume of 50 µl. Amplification was performed in a thermocycler

(PTC 200, MJ Research Co., USA) with the following cycling profile: an initial step of

10 min at 94°C, followed by 40 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 50°C, 1 min at 72°C,

and a final extension step of 10 min at 72°C. Aliquots of 5 µl from the PCR products

were analyzed by electrophoresis in a 2% agarose gel in TBE buffer, pH 8.4 (89 mM

Tris; 89 mM boric acid; 2 mM EDTA) at constant voltage (90 V) for approximately 45

min, stained with ethidium bromide (0.5 µg/ml), and visualized under UV light.

2.4. Sequence analysis

Initially, all PCR products were purified using Illustra GFX PCR DNA and the

Gel Band Purification kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Direct sequencing was

then performed using the DYEnamic ET dye terminator cycle sequencing kit (GE

Healthcare, Little Chalfont, UK) with FAP59 and FAP64 primers, in a MegaBACE

1000/Automated 96 Capillary DNA Sequencer (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)

according to the manufacturer’s instructions. The obtained sequences were examined

with the PHRED software for quality analysis of chromatogram readings. The

sequences were accepted if the base quality was equal to or higher than 20. Consensus

sequences were determined using CAP3 software, and the sequence identity was

verified with all sequences deposited in the GenBank using the BLAST software. The

guidelines from the Papillomavirus Nomenclature Committee 1995 (14th International

40

Papillomavirus Conference, Quebec City, Quebec, Canada) were followed to identify

PV types (de Villiers et al., 2004).

2.5. Histopathology

Teat papilloma specimens were fixed in 10% neutral buffered formalin solution,

embedded in paraffin and routinely processed for histopathological evaluation. Sections

(5 m) were stained with hematoxylin and eosin (HE).

3. Results

Fifteen DNA samples extracted from teat papilloma lesions underwent PV DNA

detection via the FAP PCR assay, resulting in amplicons of approximately 480 bp in

length. The negative control for PCR amplification yielded no amplified product.

From the 15 teat cutaneous lesions that were amplified by FAP PCR assay,

BPV-6, -7, -9, and -10 were identified in ten (66.7%), two (13.3%), one (6.7%), and two

(13.3%) papilloma specimens, respectively. BPV-6 was the most frequent viral type

detected in evaluated samples, and this BPV type was present in both investigated

herds. Two (F and H) out of five cows with more than one teat papilloma lesion

evaluated presented double infection by different BPV types (BPV-7 and -10, and BPV-

6 and -9, respectively). The different strains identified in this study were designated as

BPV6/BR-UEL, BPV7/BR-UEL, BPV9/BR-UEL and BPV10/BR-UEL (GenBank

accession numbers: HM245430, HM245431, HM245433 and HM245432, respectively)

(Table 1).

41

In our analysis, we did not observe any association between the macroscopic

characteristics and the viral type harbored in the cutaneous teat lesions. BPV-6 was

detected in teat warts grossly presenting frond, cauliflower, filiform and flat-and-round

aspects, and BPV-7 could be identified in both filiform and cauliflower lesions.

The histopathological features of teat cutaneous lesions showed keratinocytes

with viral cytopathic effect. Epidermal papillary projections composed of variable

acanthosis, parakeratotic or orthokeratotic hyperkeratosis, enlarged keratohyaline

granules, dyskeratosis, the presence of koilocytes and rare intranuclear eosinophilic

inclusion bodies were observed in the evaluated histological samples. All 15 specimens

analyzed were classified as true papillomas (Figure 1).

The gross characteristics of cutaneous lesions as well as the type classification

and GenBank accession numbers for the obtained amplicons are indicated in Table 1.

4. Discussion

This study involved the analysis of lesions exclusively present in the mammary

gland of dairy cows of two Brazilian herds. We detected BPV types 7, 9, and 10, in

addition to BPV type 6, as causative agents of warts in the dairy cow teat. This finding

demonstrates the great diversity in BPV types that cause this condition. Although BPV-

6 is the viral type that is classically associated with teat papilloma worldwide, our

findings of diverse BPV types are in agreement with the results obtained by other

studies investigating viral diversity in Japanese cattle herds affected by teat

papillomatosis. Such investigations have confirmed the high BPV diversity that occurs

both in benign teat lesions and healthy teat skin, in a commensal form (Campo, 2002,

Ogawa et al., 2004, Maeda et al., 2007).

42

Even though high viral diversity (BPV-6, -7, -9, and -10) was observed in our

study, BPV-6 was the viral type present in most affected individuals.

To the authors’ knowledge, this study represents the first report of the

identification of the recent characterized BPV types 7, 9 and 10 associated with cases of

teat papillomatosis in cattle from the South American continent. The identification of

these BPV types in a geographical region not related to the locations where they were

first isolated, Japan (BPV-7 and -9) and Sweden (BPV-10), supports the hypothesis that

these viral types are widespread and affect herds worldwide (Ogawa et al., 2007,

Hatama et al., 2008).

Previous studies involving the identification of BPV types 9 and 10 have

documented that these viral types are easily isolated from naturally occurring teat

papilloma lesions but not from healthy teat skin, highlighting the need for further

investigations to confirm their specific association with the etiology of teat

papillomatosis (Ogawa et al., 2004, Maeda et al., 2007, Hatama et al., 2008). More

recently, the tumorigenic potential of BPV-9 was tested through experimental infection

of the teat skin of heifers, resulting in the development of papillomatosis (Hatama et al.,

2009). Conversely, BPV-7 has been detected mainly from swab samples of healthy teat

skin, and has been identified in only a few teat lesions from dairy cattle in Japan

(Ogawa et al., 2004).

The current taxonomic classification system for the Papillomaviridae family has

recently proposed the introduction of the taxonomic terms “species” and “genus” for

this viral family, establishing the relationship between phylogenetic assemblages and

biological and pathological properties shared by viruses grouped together (de Villiers et

al., 2004). The three Xipapillomavirus representatives (BPV-6, -9, and -10) identified in

our study were determined to be true papillomas in teat skin. This histological feature is

43

in agreement with the biological properties described for this specific genus (de Villiers

et al., 2004). Regarding the histological characteristics of BPV-7-induced cutaneous

lesions, this viral type gave rise to true epithelial papilloma at the same specific site of

the body. The histological characteristics of cutaneous lesions caused by BPV-7 were

missing in the work that established its phylogenetic position and characterized its

genome. Therefore, we now suggest that future isolates that are to be grouped with

BPV-7 in its yet unnamed genus should also be able to induce true papillomas in the

skin epithelia of cattle.

The limited number of recent studies seeking to identify BPV types associated

with lesions of the mammary gland of cattle have reported a considerable diversity of

the viral types involved, demonstrating that the viral type that has been classically

associated with this anatomical site (BPV-6) is not the only causative agent of these

lesions in affected herds. Therefore, the necessity for epidemiological investigations in

different geographical areas is clear, as such studies would facilitate the elaboration of

future immunogens while identifying the most prevalent type detected in each region. It

is noteworthy that there are no commercially available alternatives for the effective

treatment of or prevention against teat papillomatosis.

5. Acknowledgements

We thank Brazilian Institutes CNPq, CAPES, FINEP, and Fundação Araucaria

(FAP/PR) for financial support. Alfieri, A.A. and Alfieri, A.F. are recipient of CNPq

fellowship.

44

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48

Figure 1. Histopathological evaluation of teat papillomas. (A) Lesion harboring BPV-10

exhibit papillary projection of epidemis, by mild to moderate acanthosis, granular cell layer

hyperplasia and discrete hyperkeratosis. HE staining, 100x. (B) Papillary projections compounded

of orthokeratosis and acantholytic epidermis sustained by scanty connective-vascular tissue

(arrow) in BPV-7-induced lesion. The upper cell layer hypergranulosis resulted in marked

basophilic aspect (empty arrow). HE staining, 100x. (C) BPV-9 papilloma featuring

hypergranulosis and koilocytosis (centre) in a moderately acantholytic and orthokeratotic

epidermis. HE staining, 400x. (D) High-power field showing basal cell layer proliferation, mitotic

figures (arrows) and empty stromal blood vessels from BPV-6 cutaneous lesions. HE staining,

400x.

49

Table 1. Lesion characteristics and type classification of the viral strains identified.

Herd Animal Lesion Macroscopic characteristics

of true papillomas

Nucleotide sequence

BPV classification GenBank accession number*

1 A A1 Frond 6 HM245430

B B1 Cauliflower 6 -

B2 Frond 6 -

C C1 Cauliflower 6 -

C2 Filiform 6 -

D D1 Cauliflower 6 -

D2 Cauliflower 6 -

E E1 Filiform 7 HM245431

F F1 Cauliflower 7 -

F2 Cauliflower 10 HM245432

F3 Cauliflower 10 -

2 G G1 Filiform 6 -

H H1 Cauliflower 6 -

H2 Flat-and-round 6 -

H3 Flat-and-round 9 HM245433

*A single representative of each BPV type had its sequence submitted to GenBank database.

50

3.2. PHYLOGENETIC ANALYSES OF BOVINE PAPILLOMAVIRUS (BPV)

OF TEAT PAPILLOMAS IN BRAZILIAN DAIRY CATTLE HERDS

Artigo editado de acordo com as normas de publicação do periódico Veterinary Microbiology,

disponível em: http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/503320/authorinstructions

51

PHYLOGENETIC ANALYSES OF BOVINE PAPILLOMAVIRUS (BPV) OF

TEAT PAPILLOMAS IN BRAZILIAN DAIRY CATTLE HERDS

Abstract

Teat papillomatosis is an infectious disease that has been reported in dairy herds

worldwide as a cattle health problem responsible for economic losses. Despite the high

number of cattle herds affected by cutaneous papillomatosis, studies evaluating BPV

diversity affecting the mammary gland remain sporadic. The aim of this study is

identify the prevalence of BPV types involved in teat papilloma. Were collected 40 teat

papillomas of 25 dairy cows, in 13 dairy cattle herds of tree Brazilian state (Paraná, São

Paulo e Santa Catarina). The use of FAP59/64 primers pair assay amplified a fragment

of approximately 480 pb in all sample analyzed. Twenty nine teat papillomas specimens

processed for histopathological evaluation and two papillomas specimens were

submitted to the histochemical technique (Argyrophil Nucleolar Organizer Regions)

aiming visualization of NORs. The sequence analysis of the amplicons identified eight

different BPVs types: BPV-6, -7, -8, -9, -10, a previously described putative type

BAPV9 and two putative new types never described in the world (BPV/BR-UEL6 e -

7). BPV-6 was the main viral type identified in teat lesions analyzed (45% - 18/40),

followed by BPV-10 (32.5% - 13/40). More than one BPV type were identified in

61.5% (8/13) of the herds evaluated in this study. Multiple lesions were identified in

48% (12/25) of the animals and of these, 58.3% (7/12) presented mixed infection and

consequently 41,6% (5/12) presented single infection. All affected animals that

presented single infection had the BPV-6 identified as causative teat papilloma agent.

The histological features revealed benign proliferation and viral citopathic effects in the

epidermis. All papillomas analysed were classified as true papilloma. The AgNOR

stained showed de intense proliferation of spinous layer of epidermis. The BPV-6 was

the prevalent BPV type causative teat papillomatosis identified, followed by BPV-10.

This study demonstrated the great diversity of BPV that associated with this anatomical

site.

Key-words: Bovine papillomavirus; teat papillomatosis; papilloma; histopathology.

52

1. Introduction

Papillomaviruses (PVs) are a group of non-enveloped, double-stranded and

circular DNA viruses that are strictly species and tissue specific and occur in a broad

range of distantly related animals (Antonsson, Hansson, 2002).

In cattle, BPV is widespread and induces papillomas and fibropapillomas in both

mucosal and cutaneous epithelia. BPV can induce the vulvo-vaginal, penis, and eye

epithelium lesions, skin and teat warts, papillomatosis and cancer of the upper

gastrointestinal tract and urinary bladder (Borzacchiello, Roperto, 2008). The bovine

cutaneous papillomatosis determines economic losses due to secondary infections,

depreciation of leather and may interfere in the bulls’ function (Campo, 2002).

Teat papillomatosis is an infectious disease that affects two years animals, but

can also affect adults. The lesions are characterized as self-limiting and most of them

underwent spontaneous regression, however, occasionally, some tumors may persist and

induce severe and generalized infection affecting various body sites (Sundeberg et al.,

1987, Borzacchiello, Roperto, 2008). In dairy cows, teat papillomatosis can difficult

both manual and mechanical milking. The most common problems caused by

papillomas are: i) the difficulty of perfect coupling of liners caused by the irregularity of

the teat epithelial tissue or duct distortion causing air leaking and difficulty in sucking,

that endanger the teat health; ii) predisposition to mastitis due to the presence of residual

milk caused by the painful sensation that inhibits milk “let-down”; iii) the presence of

warts around the teat canal which may also predispose to mastitis; iv) an increased

predisposition to the development of secondary bacterial infections caused by teat warts

damage, and v) slaughter of heifers before the first lactation due to the lesion severity.

53

Therefore, is subject of the severity of the lesions and the number of affected animals,

the milk production can be unviable and the entire herd be slaughtered (Campo, 2002,

Blowey, Edmondson, 1995).

The BPVs are classified in four genera based on their biological properties and

genome relatedness. These genera are Deltapapillomavirus (BPV-1 and -2),

Xipapillomavirus (BPV-3, -4, -6, -9, -10 and -11), Epsilonpapillomavirus (BPV-5 and -

8), and a yet unnamed PV genus (BPV-7) (Hatama et al., 2008; Hatama et al.,

unpublished)

The L1 gene is the most conserved in genome and the sequence identity of this

gene has been used in the identification of new PVs types (de Villiers et al., 2004). The

partial amplification of L1 ORF by generic primers FAP59/FAP64 followed by

sequencing has allowed the identification of PV types in human and other animal hosts

(Forslund et al., 1999, Antonsson, Hansson, 2002, Ogawa et al., 2004, Claus et al.,

2008). Currently had been complete sequenced 11 BPV types (BPV-1 to -11) and had

been partially described 15 putative new types, based on the highly conserved region

analyses (Antonsson, Hansson, 2002, Ogawa et al., 2004, Claus et al., 2008, Hatama et

al., 2008, Hatama et al., unpublished). The complete characterization of genome

sequences of some putative BPV types lead the identification of four most recently

described BPV types (BPV-7, -8, -9, -10) (Ogawa et al., 2007, Tomita et al., 2007,

Hatama et al., 2008).

The diagnosis of bovine papillomatosis is usually made from the presenting

clinical signs, because the structure of papillomas and fibropapillomas on the skin or

mucosal membranes is easily observed and identified. The diagnosis can be confirmed

by biopsy and histopathological examination. However these diagnostic methods do

not allow the identification of the causative BPV types (Alfieri et al., 2007).

54

A variety of treatments for cutaneous papillomatosis has been suggested but

currently there is no effective science-based treatment to bovine papillomatosis (Santin,

Brito, 2004). Immunity to BPV infection is considered type-specific and immune status

of infected animals is considered critical to define the clinical resolution. While humoral

immunity confers the ability to prevent new infections, cellular immunity, probably

involving T lymphocytes, is responsible for immune-mediated and spontaneous

regression of established lesions (Nicholls, Stanley, 2000). In cattle, preventive vaccines

have been developed against the BPV types 2 and 4. These two viral types were selected

as representative for the cutaneous and mucosal papillomaviruses, and also because both

types are related to determination of cancer in bovines (Campo et al., 1993).

Until now, eight BPV types were described as causative agents for udder and

teat papillomas (BPV-1, -3, -5, -6, -7, -8, -9, -10). Other BPV putative new types have

been reported from bovine teat papillomas and healthy skin swabs (Ogawa et al., 2004,

Maeda et al., 2007, Claus et al., 2007, Claus et al., 2008). Several studies aiming for

identification of BPVs in teat papillomatosis had identified BPV-6 as being the

prevalent type in this anatomical site (Lindholm et al., 1984, Jarret et al., 1984, Campo,

2002, Maeda et al., 2007).

As regards a viral infectious disease, the teat papillomatosis causes great losses

due spreading and lack of effective treatment. At present there are few epidemiological

studies that define the type of BPV teat lesions. The development of type-specific

vaccines can be an alternative to control of this disease.

The aim of this study was to identify the prevalence of BPV types involved in

teat papillomas collected from Brazilian dairy cattle herds of tree Brazilian states.

55

2. Materials and Methods

2.1. Papilloma specimens

Forty teat lesions were collected from 25 animals (16 cows and nine heifers) of

13 dairy cattle herds in three Brazilian states (Paraná, São Paulo and Santa Catarina).

The samples from Santa Catarina state were collected in an abattoir receiving animals

from the state. Twelve animals had multiples lesions and had over a sample. All dairy

cattle herds included in this study were small or medium milking producer and the total

number of animals among herds varied between 19 and 190 animals. The teat

papillomas collected had size ranging from 0.5 to 3 cm. The teat papillomas were

macroscopically classified as “frond, “caulyflower, “filiform” and “flat-and-round”.

2.2. DNA extraction

Fragments from each papilloma specimen were ground in phosphate-buffered

saline solution (PBS pH 7.2), and suspensions (10-20% w/v) were centrifuged for 15

min at 3000 g at 4 °C. Aliquots (250 μL) from supernatant were treated with lysis buffer

[10mM Tris; 1mM EDTA; 0.5% Nonidet P40; 1% SDS; and 0.2 mg/ml proteinase K

(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA)]. After homogenization, samples were

incubated at 56°C for 30 min.

For DNA extraction, a combination of phenol/chloroform/isoamyl alcohol and

silica/guanidine isothiocyanate methods was carried out according to Alfieri et al.

(2006). Fractions from each sample were treated with an equal volume of

phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), homogenized and heated at 56 °C for 15

56

min (Sambrook, Russell, 2001). After centrifugation at 10,000 g for 10 min, the

aqueous phase was processed according to silica/guanidine isothiocyanate method

(Boom et al., 1990). DNA was eluted in 50 μL of ultrapure sterile water and kept at -20

°C until use. Aliquots of ultrapure sterile water were included as negative control in the

DNA extraction procedures.

2.3. PCR assay

The PCR assay was carried out using the primer pair FAP59 (forward: 5’-

TAACWGTIGGICAYCCWTATT-3’) and FAP64 (reverse: 5’-

CCWATATCWVHCATITCICCATC-3’) according to Forslund et al. (1999), with

slight modifications (Claus et al., 2007). Reaction was performed using 5 µL of the

extracted DNA and 45 µL of PCR-mix consisting of 1 µL (20 pmol) of each primer;

200 mM of each dNTP (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); 2.5 units

of Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Life Technologies, São Paulo, SP, BR);

1x PCR buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.4 and 50 mM KCl); 1.5 mM of MgCl2 and

ultrapure sterile water to a final volume of 50 μL. Amplification was performed in a

thermocycler (PTC 200, MJ Research Co., Water Town, Ma, USA) with the following

cycling profile: an initial step of 10 min at 94ºC, followed by 40 cycles of 1 min/94ºC, 1

min/50ºC, 1 min/72ºC, and a final extension step of 10 min/72ºC. Aliquots of 5 μL from

the PCR products were analyzed by electrophoresis in 2% agarose gel in TBE buffer pH

8.4 (89 mM Tris; 89 mM boric acid; 2 mM EDTA) at constant voltage (90V) for

aproximately 45 min. The agarose gel was stained with ethidium bromide (0.5 mg/mL),

and visualized under UV ligth.

57

2.4. Sequence analysis

Initially, all PCR products were purified using PureLink Quick Gel Extraction

Kit (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) and quantified using Quant-iT

TM dsDNA BR Assay kit (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) in the

Qubit TM Fluorometer (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, OR). The direct

sequencing was performed by using the DYEnamic ET dye terminator cycle sequencing

kit (DYEnamic ET dye terminator cycle sequencing kit (Amersham Biosciences,

Piscataway, NJ, USA) with FAP59 and FAP64 primers, in a MegaBACE

1000/Automated 96 Capillary DNA Sequencer (GE Healthcare, Little Chalfont, UK),

according to the manufacturer’s instructions. The obtained sequences were examined

with the PHRED software (http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph) for quality

analysis of chromatogram readings. The sequences were accepted if base quality was

equal to or higher than 20. Consensus sequences were determined by CAP3 software

(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/cgi-bin/phph/cap3.pl) and the sequence identity

was verified with all sequences deposited in the GenBank using the BLAST software

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). The guidelines from the Papillomavirus

Nomenclature Committee 1995 (14th

International Papillomavirus Conference, Quebec

City, Quebec, Canada) were followed to identify putative new PV types. A new PV

isolate is defined as such if its complete genome has been cloned and the L1 nucleotide

sequence is more than 10% dissimilar from the closest known PV type. Differences

between 2% and 10% identity define a subtype and less than 2% a variant. Since

FAP59/FAP64 products represent only part of the L1 gene, the sequences obtained were

denominated putative new PV types instead of new PV types (Antonsson and Hansson,

2002; de Villiers et al., 2004; Ogawa et al., 2004).

http://maps.google.com.br/maps?hl=pt-BR&biw=1260&bih=615&q=Piscataway,&wrapid=tlif129743810342191&um=1&ie=UTF-8&hq=&hnear=Piscataway,+NJ,+USA&gl=br&ei=gEdVTd6vIdLAgQfc4vzpDA&sa=X&oi=geocode_result&ct=title&resnum=1&ved=0CCAQ8gEwAA

http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph

http://asparagin.cenargen.embrapa.br/cgi-bin/phph/cap3.pl

58

2.5. Phylogenetic analysis

Two phylogenetic analysis were performed, with and without the BPV putative

BAA3 because of the minor sequence length.

The alignment and degree of similarity among sequences, at both nucleotide and

amino acid levels, were obtained using BIOEDIT version 5.0.9 software (Hall, 1999).

Phylogenetic trees were obtained by the Neighbour-joining method with the Kimura

two parameter distance estimate (Kimura, 1980), using MEGA version 3.1 program

(Kumar et al., 2004). Statistical analysis of phylogenetic trees were determined by

bootstrap method on 1000 replicates. The completely sequenced and putative viral types

of BPVs were included in the phylogenetic analysis. The putative BPV types included

in the study are denominated BAA1 to -4 and BAPV-4, -5, -7, -8, -9, and -10, BPV/BR-

UEL2, -to -5 described by Antonsson, Hansson (2002), Ogawa et al. (2004), and Claus

et al. (2008), respectively. The GenBank accession numbers of BPV and putative new

BPV types sequences reported in this paper are: AF4885375 (BAA1); AF4885376

(BAA2); AF4885377 (BAA3); AF4885378 (BAA4); AY300819 (BAPV3); AY426550

(BAPV4); AY426551 (BAPV5); AY426553 (BAPV7); AY426554 (BAPV8);

AY426555 (BAPV9); AY426556 (BAPV10); XO2346 (BPV-1); M20219 (BPV-2);

AF486184 (BPV-3); XO5817 (BPV-4); AJ620206 (BPV-5); AJ620208 (BPV-6);

DQ217793 (BPV-7); DQ098913 (BPV-8); AB331650 (BPV-9); AB331651 (BPV- 10),

AB543507 (BPV-11).

59

2.6. Histopathology

Twenty nine teat papillomas specimens were fixed in 10% neutral buffered

formalin solution, embedded in paraffin and routinely processed for histopathological

evaluation. Sections (5 m) were stained with hematoxylin and eosin (HE).

Two papillomas (F2 and F3) specimens were submitted to the AgNOR

(Argyrophil Nucleolar Organizer Regions) histochemical technique that allows

visualization of NORs, based on the technique described by Crocker, Skilbek (1987)

with modifications.

3. Results

3.1 PCR and sequence analysis

The FAP59/64 primer pair assay amplified a fragment of approximately 480 bp

in all teat papillomas included in this study. The sequence analysis of the amplicons

identified five different BPV types: BPV-6, -7, -8, -9, and -10; the putative previously

described BPV type BAPV9 and two putative new type never described in the world.

BPV-6 was the main viral type identified in the teat lesions analyzed (45% -18/40),

followed by BPV-10 (32.5% -13/40), other BPV types and BAPV9 (17.5%- 7/40), and

putative new BPV types (5%- 2/40) (Table 1).

Multiple lesions were identified in twelve animals (48%- 12/25) and 58,3%

(7/12) had mixed infection, characterized by infections with more than one type of

BPV. The animals that had single infection were exclusively caused by BPV-6 (5/12),

and 75% (9/12) had papillomas harboring BPV-6 sequences, associated or not with

60

other BPV types. The distribution of BPV viral types in herds, animals and lesions are

showed in table 2.

More than one BPV type were identified in 61.5% (8/13) of the herds evaluated

in this study. Whereas of the five herds that had only one type identified, three of them

had only a sample collected, the number of herds infected by multiples BPV types is

noteworthy prevalent.

Association between the macroscopic characteristics and the viral type detected

in the cutaneous teat lesions was not found. BPV-6 was detected in teat warts presenting

frond, cauliflower, filiform and flat-and-round gross aspects; BPV-7 in both filiform

and cauliflower; BPV-9 in flat-and-round and cauliflower, BPV-10 in cauliflower, flat-

and-round and frond macroscopic classified lesions.

3.2. Phylogenetic analyses

A representative of each BPV type and the two Brazilian putative new BPV types

identified in this study were grouped with BPV types and putative BPV types,

representing three previously defined PV genera (Deltapapillomavirus,

Epsilonpapillomavirus and Xipapillomavirus) (de Villiers et al., 2004). The Brazilian

putative new BPV BPV/BR-UEL7 was gouped with BPV types and putative types

(BAA1, BAPV-3, -9, -10, BPV/BR-UEL-2 e -3) grouped in Xipapillomavirus genus

whereas BPV/BR-UEL6 did not group in any genus (Figure 1). In a second analysis,

considering in a small length alignment with the BPV putative BAA3, the BPV/BR-

UEL6 clustered with this BPV putative type (Figure 2).

In table 3 and 4, the two lesion characteristics are indicated as well as the highest

similarity percentage of Brazilian putative new BPV types with BPV types 1 to 10.

61

3.3. Histology

The histological features of 29 teat papillomas revealed benign exophytic papillary

proliferation of epidermis, acanthosis, orthokeratotic or parakeratotic hyperkeratosis;

enlarge keratohyaline granules; koilocitose; dyskeratosis; rare intranuclear eosinophilic

inclusion bodies and mitotic figures in basal layer. In the samples collected in a abattoir,

that contained the underlying derma, was identified the presence of perivascular

inflammatory infiltrate. The histochemical AgNOR stained showed the intense cellular

proliferation activity in the zone of basal layer of epidermis (Figure 3). All 29

specimens analyzed were classified as true papillomas. The histological features of

macroscopic classification of papillomas are shown in figure 4.

The new BPV putative type BPV/BR-UEL7 described in this study showed in

histopathology epidermal papillary hyperplasia, acanthosis, large keratohyalin granules

in moderate amount, intense koilocytosis and was classified as true papilloma. The

histopathology of the other putative new type (BPV/BR-UEL6) described in this study

was not undertaken.

1.

2. 4. Discussion

3.

The bovine teat papillomatosis is a contagious infectious viral disease spread

worldwide. Most animals eventually undergo self-cure and by the second or third

lactation the warts are gone. Despite this, teat papillomatosis may persist in some cows,

can lead to mastitis, causing distortion of the milk canals, prevent the suckling of calves

and make milking impossible. Among the economic problems caused by teat

papillomatosis is the culled of heavily affected animals and so occasionally are whole

62

herds. In this study, eight heifers were severe affected and probably would be culled

whether papillomas not recede. Despite the high frequency of infection, there are few

studies involving teat papillomatosis and the determination of viral types is still

sporadic. Whereas, the elucidation of the epidemiology and pathology of the disease is

critical for the development of control strategies. This is the largest study to determine

the prevalence of different types of BPV involved in teat papillomatosis in different

Brazilian geographic regions.

The identification of teat papillomas harboring the BPV types -6, -7, -8, -9, -10 and

BAPV9 demonstrates the high BPV viral diversity that affects cattle in this anatomical

site. Furthermore, the strategy of using the primer pair FAP59/64 enabled the

identification of two putative new BPV types, not before described.

In this study the most prevalent BPV type identified in teat papillomas was the

BPV-6 followed by BPV-10. The BPV-6 is the viral type classically associated with

teat papillomatosis lesions and several studies in different countries have identified the

BPV-6 as the prevalent viral type involved in teat warts (Lindholm et al., 1984, Jarret et

al., 1984, Maeda et al., 2006, Claus et al., 2007). In Japan, in an outbreak of teat

papillomatosis, the BPV-6 was identified in 64% of the lesions analyzed, in addition to

BPV-9 and BPV-10. In another study in Japan, including five farms, the BPV-6 was

identify only in swabs of healthy skin of dairy cattle, suggesting that the animal may

harbor the virus commensally, or may harbor a latent or subclinical infection. In the

same study, the BPV-10 was the prevalent viral type identified in teat lesions (7 / 15)

and was not frequently identified from swabs of healthy skin. The BPV-6 was identified

in all investigations that were related to teat papillomatosis, despite this, the prevalence

of particular BPV types highly pathogenic for the mammary gland may differ by

geographic region.

63

Despite the frequent description of multiple human papillomavirus (HPV) infections

in human’s warts, studies with the aim to evaluate the occurrence of mixed BPV

infections and identifying BPV types associated with different skin warts from

individual animals are still sporadic. Claus et al. (2009) demonstrates the high frequency

of multiple infections in different bovine anatomical sites in a study performed in

Brazil. In addition, the present study demonstrates the high frequency which the animal

may harbor mixed BPVs infections in one anatomical site.

In addition to BPV types completely sequenced, there are several types identified

through analysis of partial L1 segments. This is the first description of the putative BPV

type BAPV9 outside of Japan, whitch was identified from swabs of teat healthy skin. In

our study, the BAPV9 was identified from a teat papilloma, suggesting that, despite of

this BPV type having been identified only in swabs of healthy skin, such putative

pathogen may have potential to induce proliferative lesions.

Currently, more than 200 human papillomavirus were described, showing the high

diversity of this viral family. In cattle 11 types of BPV were completely sequenced, but

this small number probably reflects the lack of determination of BPV types in

infections. The use of the generic primer pair FAP59/64, originally developed to

identify epithelial human papillomaviruses, followed by sequencing and phylogenetic

analysis has allowed the identification of BPV types completed sequenced and

characterized putative new types from partial analysis of the L1 gene (Forslund et al.,

1999, Antosson, Hansson, 2002, Ogawa et al., 2004, Claus et al., 2008). Many new

BPV types have been identified using this strategy and in our study two new putative

BPVs were described.

In current studies with HPVs, the way that specific HPV genotypes are associated

with distinct clinical and histological morphologies, and the marked preference of each

64

HPV genotype for specific tissues and sites have been considered as important aspects

of the nature of this group of heterogeneous viruses (Egawa et al., 1998). In order to

correlate microscopic findings with the viral type identified in teat lesions, the

prevalence of type BPV-6 and -10 in bovine teat papillomas is notable. However, the

viral cytopathic effects displayed in histopathology were similar and there was no

correlation with viral types, once samples that had the same BPV type identified

determined histopathological alterations in different intensities. According to Hatama et

al., (1990), the histopathological alterations may vary in effect and intensity with the

stage of lesion development.

The microscopic features of lesions showed characteristics of viral cytopathic

alterations set at different intensity among the samples. Benign exophytic papillary

proliferation of epidermis, parakeratotic or orthokeratotic hyperkeratosis, ancantosis;

basophilic and enlarged keratohyaline granules; koilocitose and acidophilic intranuclear

inclusions. All teat papilloma samples had only involvement of the epidermic tissue and

were classified as true papillomas.

The lesions that were from the abattoir of Santa Catarina state contained the adjacent

derma, which allowed the identification of lymphoplasmacytic perivascular dermatitis

in the histopathology. This finding probably indicates the early stages of papilloma

regression. This finding does not mean that the other lesions did not have this alteration

because that did not contain the adjacent part of the dermis.

The intense cellular proliferation activity in basal cell layer of epidermis was

showed by the technique of AgNOR that is considered a good marker of cellular

proliferation and used to evaluate progress of the malignant transformation (Carneiro et

al., 2000).

65

In 2004, there was a reclassification of the family Papillomaviridae and currently

the BPVs are classified into three different genera according to the sequence homology

and biological features (de Villiers et al., 2004). BPV-1 and -2, grouped in

Deltapapillomavirus genus, are etiologic agents of infection in epithelium and dermis

by inducing the formation of fibropapillomas. BPV-3, -4, -6, -9 -10, and -11, belong to

the Xipapillomavirus genus and are exclusively epitheliotropic viruses that infect only

the epithelium and induce true papillomas formation. BPV-5 and -8 are members of the

genus Epsilonpapillomavirus and seem to have dual pathology, inducing

fibropapillomas and epithelial papillomas, and its genome shares homology with both

Deltapapillomavirus and Xipapillomavirus. Based on phylogenetic analysis, it was

proposed that BPV-7 belongs to a new genus of BPV. All completely described BPVs

identified in this study belong to the Xipapillomavirus (BPV-6, -9 e -10),

Epsilonpapillomavirus (BPV-8), and a not classified genera (BPV-7). In the

histopathological evaluation all samples were classified as true papillomas, reinforcing

that the current taxonomic classification of genus share genomic homology and

pathologial characteristics.

The causative viral type infecting lesions did not showed correlation with the

respectively macroscopic morphology. This result corroborates with other authors and

suggests that the viral type involved in the pathology should not be the only factor that

plays a role in determination of the lesion gross aspect.

The BPV-6 is the viral type classically associated with teat papillomas and was the

prevalent viral type identified in lesions in this study. It is unclear the reason for the

predilection for this anatomical site. This study demonstrated the great diversity of BPV

of bovine teat papillomatosis in three states of Brazil and the great diversity of viruses

in the same herd and in animals, since animals with multiple lesions was found to be

66

harbor different viral types. No data is available about the prevalence of different types

of BPV involved in mammary papillomatosis in dairy cattle in Brazil. This is the first

epidemiological study that identifies BPV types in teat papillomatosis of dairy cows in

different geographic regions, and correlates with the histopathological finds of the

lesion. The molecular epidemiology of BPV knowledge is important because the

immunity developed is type-specific. Vaccination strategies should be developed in

order to prevent the infection and spread of disease.

5. Acknowledgements

We thank Brazilian Institutes CNPq, CAPES, FINEP, and Fundação Araucaria

(FAP/PR) for financial support. Alfieri, A.A. and Alfieri, A.F. are recipient of CNPq

fellowship.

67

6. References

Alfieri, A.A., Parazzi, M.E., Takiuchi, E., Médici, K.C., Alfieri, A.F., 2006. Frequency

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71

F3BPV 10

H3

BPV 9

BAA1

BPV/BR-UEL7

BPV 3

C2 BPV 6

I 1 BAPV9

BAPV3 BAPV10

BPV/BR UEL3

BPV 11

BPV 4

BPV/BR UEL2

BPV/BR-UEL6

BAA3

BAA2

E1

BPV 7

BAPV5

BAPV7

BAPV8

BAA4 BPV 2

BPV/BR UEL4BPV 1

BPV 5

BPV/BR UEL5BAPV4

U2BPV 8

Figure 1. Neighbour-joining phylogenetic tree reconstructed with FAP sequences of

previously described bovine papillomavirus types, and putative new BPV types. A

representative of each BPV type identified in the study was identified as C2 (BPV-6),

E1 (BPV-7), U2 (BPV-8), H3 (BPV-9), F3 (BPV-10), I1 (BAPV9) and the new putative

types designated as BPV/BR-UEL6 and -7. The tree is divided into the previously

determined genera Deltapapillomavirus, Epsilonpapillomavirus, Xipapillomavirus, an

unassigned PV genus (BPV-7) and a probable new genus. The numbers in internal

nodes represent the bootstrap support values determined for 1000 replicates. The

BPV/BRUEL-6 and 7 indicated by shading.

72

I 1BAPV9

BPV/BR-UEL7

BPV 3

H3

BPV 9

C2BPV 6

BAPV3

BAPV10

BPV/BR UEL3

BPV 4

BPV 11 BPV/BR UEL2

F3

BPV 10

BAPV8

BAA1

BPV/BR-UEL6

BAA4

BAA2

E1

BPV 7

BAPV5

BAPV7

BPV 2

BPV/BR UEL4

BPV 1

BPV 5

BPV/BR UEL5

BAPV4

U2

BPV 8

Figure 2. Neighbour-joining phylogenetic tree reconstructed with FAP sequences of

previously described bovine papillomavirus types, and putative new BPV types, except

BAA3. A representative of each BPV type identified in the study was identified as C2

(BPV-6), E1 (BPV-7), U2 (BPV-8), H3 (BPV-9), F3 (BPV-10), I1 (BAPV9) and the

new putative types designated as BPV/BR-UEL6 and -7. The tree is divided into the

previously determined genera Deltapapillomavirus, Epsilonpapillomavirus,

Xipapillomavirus, and an unassigned PV genus (BPV-7). The numbers in internal nodes

represent the bootstrap support values determined for 1000 replicates. The

BPV/BRUEL-6 and 7 indicated by shading.

73

Figure 3: Photomicrograph of the lesion F2 (bovine papillomavirus type 10) stained

with AgNOR technique. Arrows indicate nucleolar organizer regions, demonstrating

the high cell proliferation in keratinocytes (AgNOR staining, 10X objective).

74

Figure 4: Photomicrograph of four bovine teat papillomas that had different

macroscopic classifications. A) Lesion C2 (BPV-6/filiform): teat papilloma with a close

few papillary projections of similar length. The papillary projections directed in a

similar way. B) Lesion F1 (BPV-10/caulyflower): teat papilloma has large numbers of

close long papillae, of similar length. The papillary projections directed similarly. C)

Lesion L1 (BPV-6/frond) presents many papillary projections, with variable length,

spaced and directed asymmetrically. D) Lesion V2 (BPV/BR-UEL7/flat-and-round):

teat papilloma displays moderate epidermal hyperplasia, flat, extending the papillary

ridges to the dermis (HE stain, objective 4X).

75

Table 1. Bovine papillomavirus identification and macroscopic characteristics of teat

lesions collected in three Brazilian states.

State Herd Animal Lesion Macroscopic characteristics of

true papillomas BPV type

PR 1 A A1 Frond 6

B B1 Cauliflower 6

B2 Frond 6

C C1 Cauliflower 6

C2 Filiform 6

D D1 Cauliflower 6

D1 Couliflower 6

E E1 Filiform 7

F F1 Cauliflower 7

F2 Cauliflower 10

F3 Cauliflower 10

2 G G1 Filiform 6

H * H1 Cauliflower 6

H2 Flat-and-round 6

H3 Flat-and-round 9

3 I I1 Frond BAPV9

J J1 Frond BPV/BR-UEL-6

4 K K1 Frond BAPV9

K2 Frond 6

5 L* L1 Frond 6

L2 Frond 6

L3 Frond 6

6 M M1 Flat-and-round 6

M2 Flat-and-round 10

N* N1 Frond 10

O* O1 Frond 10

P* P1 Frond 6

P2 Frond 6

76

State Herd Animal Lesion Macroscopic characteristics of

true papillomas BPV type

SP 7 Q Q1 Flat-and-round 10

R R1 Flat-and-round 10

8 S S1 Frond 10

SC 9 T* T1 Cauliflower 10

10 U* U1 Cauliflower 10

U2 Cauliflower 8

11 V* V1 Cauliflower 10

V2 Flat-and-round BPV/BR-UEL-7

W* W1 Flat-and-round 9

12 X X1 Cauliflower 6

X2 Cauliflower 10

13 Y Y1 Cauliflower 10

GenBank database accession number: A1 (HM245430); E1 (HM245431); F2 (HM245432); H3

(HM245433)

* Heifers

PR=Paraná, SC=Santa Catarina, SP=São Paulo

Table 2. Distribution of bovine papillomavirus types in herds, animals and teat lesions.

BPV type Herd (n=13) Animal (n=25) Lesion (n=40)

BPV-6 6 12 18

BPV-7 1 2 2

BPV-8 1 1 1

BPV-9 2 2 2

BPV-10 9 12 13

BAPV9 2 2 2

BPV/BR-UEL-6 1 1 1

BPV/BR-UEL-7 1 1 1

77

Table 3. The highest similarity percentage of Brazilian putative new bovine papillomavirus types with

BPV-1 to -10 and putative new BPV types.

Lesion BPV strain Nucleotide sequence data Length

(pb)

Closest

related type

Similarity Closest related

putative type

Similarity

J1 BPV/BR-UEL6 168 BPV-10 0,607 BAA3 0,744

V2 BPV/BR-UEL7 165 BPV-9 0,704 BAPV3 0,68

Table 4. The highest similarity percentage of Brazilian putative new bovine papillomavirus types with

BPV-1 to -10 and putative new BPV types except BAA3.

Lesion BPV strain Nucleotide sequence data

Length

(pb)

Closest

related type

Similarity Closest related

putative type

Similarity

J1 BPV/BR-UEL6 320 BPV-11 0,659

BAPV3 0,678

V2 BPV/BR-UEL7 317 BPV-9 0,753

BAPV9 0,755

78

4. CONCLUSÕES

79

CONCLUSÕES

A PCR, realizada com os primers genéricos FAP59/FAP64, foi eficaz na

amplificação de um produto com aproximadamente 480 pb do gene L1 do BPV

em todos os papilomas de tetos bovinos;

O estudo dos tipos de BPVs provenientes de lesões de teto de gado leiteiro,

realizado a partir das seqüencias de nucleotídeos dos produtos amplificados pela

PCR, proporcionaram a identificação dos tipos de papilomavírus bovino BPV-6,

-7, -8, -9 e 10, do BAPV9 (provável novo tipo) e dois prováveis novos tipos

nunca descritos;

O tipo viral prevalente identificado em lesões de teto no estudo foi o BPV-6,

seguido do BPV-10;

A identificação pela primeira vez no continente Americano dos tipos virais

BPV-7, -9 e -10 recentemente descrito na Europa (BPV-10) e Japão (BPV-7, -9

e -10), sugere a distribuição mundial desses tipos virais;

A primeira identificação do suposto novo tipo viral BAPV9 em lesões de teto

demonstra o potencial patogênico desse vírus, que foi somente descrito

anteriormente em swab de pele de teto saudável de bovinos no Japão;

As formas de infecção pelo BPV foram identificadas como infecções simples

(apenas um tipo viral no mesmo animal) e mistas (mais de um tipo viral no

mesmo animal) nos rebanhos bovinos da regiões estudadas;

A histopatologia permitiu a identificação dos efeitos citopáticos virais clássicos

associados à formação de papilomas verdadeiros.

Não houve relação do tipo de alteração histopatológica com o tipo de BPV

identificado.

80

5. APÊNDICES

81

APÊNDICE A

Lista de Reagentes

1. 100 mM dNTP Set, 4 x 250 mL; 25mmol each (100 mM dATP Solution, 100

mM dCTP Solution, 100 mM dGTP Solution, 100 mM dTTP Solution) (Invitrogen Life

Technologies®)

2. 10 x PCR-Buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.4, 500 mM KCl) (Invitrogen Life

Technologies®)

3. 123 bp DNA Ladder (Invitrogen Life Technologies®)

4. 2-Mercapto-ethanol (C2H6O5) P.M. 78,13 (Fluka®)

5. Acetona, P.A. (CH3COCH3) P.M. 58,08 (Dinâmica®)

6. Ácido acético glacial, P.A. (CH3COOH) P.M. 60,05 (Nuclear®)

7. Ácido bórico (H3BO3) P.M. 61,83

8. Ácido clorídrico (HCl) P.M. 36,46 (Reagen®)

9. Ácido etilenodiaminotetraácido Sal di-sódico – EDTA, P.A.

(C10H14N2O8Na22H2O) P.M. 372,24 (Reagen®)

10. Agarose (Gibco BRL®)

11. Ágar - Himedia Laboratories, India

12. Álcool etílico absoluto (C2H2OH) P.M. 46,07 (Nuclear®)

13. Álcool isoamílico ((CH3)2CHCH2CH2OH) P.M. 88,15 (Synth®)

14. Ampicilina trihidratada - USB, Cleveland, Ohio

15. Azul de bromofenol (Sigma®)

16. Cloreto de Potássio, P.A. (KCl) P.M. 74,56 (Reagen®)

17. Cloreto de Sódio, P.A. (NaCl) P.M. 58,45 (Reagen®)

18. Clorofórmio, P.A. (CHCl3) P.M. 119,38 (Dinâmica®)

82

19. Dodecil Sulfato de Sódio – Lauril Sulfato de Sódio – SDS (C12H25NaO4S)

P.M. 288,38 (Synth®)

20. Ethidium bromide (C21H20N3Br) P.M. 394,3 (Sigma®)

21. Extrato de Levedura - USB, Cleveland Ohio

22. Gibco BRL – Concert™ Rapid Plasmid purification System - Invitrogen Life

Technologies®

23. Glicina, P.A. (Nuclear®)

24. Guanidine isothiocyanate P.M. 118,16 (Gibco BRL®)

25. Hidróxido de sódio, P.A. (NaOH) P.M. 40,00 (Dinâmica®)

26. Hidroximetil amino metano – TRIS 99% P.M. 121,14 (Inlab®)

27. Lambda DNA - (Invitrogen Life Technologies®)

28. Metanol, P.A. (CH3OH) P.M. 32,04 (Allkimia®)

29. Platinum Taq DNA Polymerase recombinant 500 units (Invitrogen Life

Technologies®)

30. PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen Life Technologies®)

31. Silicon dioxide (SiO2) P.M. 60,08 (Sigma®)

83

APÊNDICE B

Soluções e Tampões

• Hidratação da sílica

- 60 g de sílica (SIGMA®)

- Adicionar 500 mL de água MilliQ autoclavada

- Agitar lentamente e manter em repouso durante 24 horas

- Por sucção, desprezar 430 mL do sobrenadante

- Ressuspender a sílica em 500 mL de água bidestilada

- Manter em repouso durante 5 horas para sedimentar

- Desprezar 440 mL do sobrenadante

- Adicionar 600 μL de HCl (32% w/v) para ajustar o pH (pH=2,0)

- Aliquotar e autoclavar

• Solução L6

- 120 g de tiocianato de guanidina (GUSCN)

- 100 mL de TRIS-HCl 0,1 M pH 6,4

- 22 mL de EDTA 0,2 M pH 8,0

- 2,6 mL de Triton x 100

• Solução L2

- 120 g de tiocianato de guanidina (GUSCN)

- 100 mL de TRIS-HCl 0,1 M pH 6,4

84

• Tampão de Amostra

- Azul de bromofenol 0,25%

- Sacarose – sucrose (C12H22O11) 45%

Tampão de corrida: TBE (TRIS – Ácido bórico – EDTA) 10 x [ ]

- 0,89 M TRIS

- 0,89 M ácido bórico

- 0,02 M EDTA dissodium

- Água bidestilada qsp. 1 L

pH = 8,4

• Tampão fosfato salina (PBS)

-137 mM cloreto de sódio (NaCl)

- 3 mM cloreto de potássio (KCl)

- 8 mM sódio fosfato dibásico anidro (Na2HPO4)

- 15 mM potássio fosfato monobásico (K2H2PO4)

- Água MilliQ autoclavada q.s.p. 1 L

pH = 7,2

• Fenol / clorofórmio – álcool isoamílico (24:24:1)

- 24 mL fenol saturado

- 24 mL clorofórmio

- 1 mL álcool isoamílico

85

Tampão de Amostra

- Azul de bromofenol 0,25%

- Sacarose – sucrose (C12H22O11) 45%

Triton X -100 a 0.5% (Técnica de AgNOR)

- Acrescentar 0,5 mL de Triton X -100 em 99,5 mL de PBS

Solução A – Solução Colóide (Técnica de AgNOR)

- Aquecer 50 mL de água deionizada a 60°C

- Dissolver 1 g de gelatina

- Quando solução à temperatura ambiente, adicionar 0,5 mL de ácido fórmico

Solução B – Solução de Prata (Técnica de AgNOR)

- Dissolver 50 g de nitrato de prata em 100 mL de água destilada

86

APÊNDICE C

Protocolo de Técnicas

• Macerado de Papilomas de teto

- Triturar o papiloma

- Macerar o papiloma com pistilo em um gral

- Adicionar PBS 1x

- Homogeneizar em vórtex

- Centrifugar a 4.000 x g durante15 min

- Recolher 250 μL do sobrenadante em eppendorf para extração de DNA

• Lise Celular

- 250 μL do sobrenadante do macerado

- 250 μL de PBS 1x

- 1% de SDS (50 μL)

- 0,2 mg/mL de proteinase K (10 μL)

- Homogeneizar em vórtex 10/s

- Incubar em banho-maria à 56oC/30 min

• Extração do DNA pela técnica fenol / clorofórmio – álcool isoamílico /

sílica / tiocianato de guanidina

- Adicionar 500 μL de fenol clorofórmio álcool isoamílico após a lise celular


- Incubar em banho-maria à 56oC/15 min

87


- Centrifugar a 10.000 x g/12 min

- Recolher a fase aquosa em outro eppendorf

- Adicionar 25 μL de sílica hidratada

- Adicionar 1.000 μL de solução L6


- Agitar durante 30 min em temperatura ambiente

- Centrifugar a 10.000 x g 30/s

- Desprezar o sobrenadante em solução contendo NaOH 10 M

- Adicionar 500 μL de solução L2



- Desprezar o sobrenadante em solução contendo NaOH 10M

- Adicionar 500 μL de solução L2



- Desprezar o sobrenadante em solução contendo NaOH 10M

- Adicionar 1.000 μL de etanol 70% gelado



- Desprezar o sobrenadante

- Adicionar 1.000 μL de etanol 70% gelado


88



- Adicionar 1.000 μL de acetona PA gelada


- Centrifugar a 10.000 x g /2 min


- Secar o pellet em banho-maria a 56oC/15 min

- Adicionar 100μL de água miliQ autoclavada


- Descansar em banho-maria à 56oC/15 min


- Centrifugar a 10.000 x g /2 min

- Recolher o sobrenadante

- Estocar a –20ºC

• Gel de agarose a 2%

- 1 g de agarose

- 50 mL TEB buffer (Tris 89 mM; ácido bórico 89 mM; EDTA 2 mM) pH 8,4

- 30 µL de brometo de etídeo (0,5 μg/mL)

Purificação de produto de PCR excisado do gel

-Pesar o fragmento excisado do gel em microtubo de 1,5 mL

89

-Adicionar 10 μL do Capture buffer type 2 para cada 10 mg de Del

-Incubar o tubo a 60°C / 15 min, homogeneizando a cada 3 min

-Spin

-Transferir 600 μL da amostra com o Capture buffer type 2 em um microtubo

coletor com coluna

-Incubar a temperatura ambiente por 1 min

-Centrifugar a 13 000 G / 2 min

-Descartar o filtrado e recolocar a coluna no mesmo microtubo

-Adicionar 500 μL do Wash buufer type 1 na coluna com microtubo coletor


-Descartar o filtrado e transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL

-Adicionar 30 μL do Elution buffer type 6

-Incubar a temperature ambiente por 1 min


-Estocar o DNA purificado em -20°C

Quantificação de produto de PCR

-Preparar a solução Quant-iTTM

Working Solution diluindo o reagente Quant-

iTTM

no Quant-iTTM

Buffer, 1:200. São necessários 200 μL desta solução por

amostra e para os padrões 0 e 100.

-Homogeneizar em vortex

-No microbuto das amostras adicionar 198 μL da solução Quant-iTTM

Working

Solution 2 a 2 μL do DNA purificado.

90

-No microtubo do padrão 0 adicionar 190 μL da solução Quant-iTTM

Working

Solution a 10 μL do padrão 0

-No microtubo do padrão 100 adicionar 190 μL da solução Quant-iTTM

Working

Solution a 10 μL do padrão 100

-Homogeneizar os microtubos em vórtex por 2 – 3 s

-Incubar os microtubos em temperatura ambiente por 2 min

-Realizar a leitura utilizando QubitTM

fluorometer (Invitrogen Life

TechnologiesTM

)

-Multiplicar pelo fator de diluição para determinar a concentração correta da

amostra

AgNOR

- Desparafinizar a lâmina à temperatura de 80°C

- Reidratar a partir de xilol a álcool 70° GL

- Colocar em água destilada por 10 min

- Colocar em imersão na solução de Triton X 100 a 0.5% por 15 min

- Lavar em água corrente por 20 min

- Colocar a lâmina invertida no laminário

- Preparar solução de A+B na proporção de 1A:2B

- Adicionar para cada lâmina, 3 mL da solução A+B

- Incubar em estufa a 37°C por 25 min

- Lavar em água corrente por 20 min

- Secar e mont

91

ANEXOS

92

ANEXO A

Tabela 1. Alterações histopatológicas dos papilomas de teto induzidas pelos tipos de papilomavírus

bovino identificados.

Lesão Tipo macroscópico Tipo de BPV Alterações histopatológicas

Grânulos de

C-H volumosos

Quantidade de

grânulos de C-H

Coilocitose Inclusão

Intranuclear

Dermatite

perivascular

em derme

adjacente

B1 Couve-flor 6 - - + - -

B2 Frond 6 ++ + + - -

C1 Couve-flor 6 ++ ++ + - -

C2 Filiforme 6 - - + - -

D1 Couve-flor 6 ++ + + - -

E1 Filiforme 7 + + + + -

F1 Couve-flor 7 ++ ++ +++ - -

F2 Couve-flor 10 ++ - ++ - -

F3 Couve-flor 10 + - + - -

G1 Filiforme 6 + - + - -

H3 Plano 9 - - + - -

K1 Frond BAPV9 + - ++ - -

K2 Frond 6 ++ ++ + - -

L1 Frond 6 ++ ++ + - -

L2 Frond 6 ++ ++ + - -

M1 Plano 6 +++ +++ + - -

M2 Plano 10 + + + + -

N1 Frond 10 ++ ++ +++ - -

O1 Frond 10 + + - - -

P1 Frond 6 - - + - -

Q1 Plano 10 + + +++ - -

Q2 Plano 10 ++ + - - -

S1 Frond 10 ++ + + + -

T1 Couve-flor 10 + + ++ - +

U1 Couve-flor 10 ++ ++ + - +

U2 Couve-flor 8 ++ ++ + - +

V1 Couve-flor 10 ++ ++ + - +

V2 Plano

BPV/BR-

UEL7

++ ++ +++ + +

W1 Plano 9 + + ++ - +

C-H: cerato hialina

As lesões T1 – W1 foram coletadas em abatedouuro e tiveram parte da derme adjacente

presente na histopatologia.

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ANEXO B

Foto documentação de aspectos macroscópicos de papilomatose mamária

Figura 1. Novilha com papilomatose mamária. A) Múltiplos papilomas no teto e pele com aspecto de

“couve-flor” e “plano”. B) Teto acometido em região de esfíncter com mastite purulenta causada por

infecção secundária. C) Teto acometido pela papilomatose, apresentando-se deformado e totalmente

descaracterizado. D) Animal após remoção/coleta de papilomas de teto.

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ANEXO C

Foto documentação de alterações citopáticas induzidas pelo papilomavírus bovino

em tecido epitelial de glândula mamária.

Figura 1. Fotomicrografia de papiloma da lesão K1, classificado como BPV tipo BAPV9. Primeira

descrição histopatológica da neoplasia determinada por esse tipo viral, que foi identificado a partir de

swabs provenientes de pele de teto saudável de animais do Japão. Hiperplasia da epiderme, coilocitose

moderada e hiperqueratose. Papiloma exclusivamente de epiderme, sem proliferação fibroblática,

classificado como papiloma verdadeiro (coloração HE; objetiva de 10X).

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Figura 2. Fotomicrografia da lesão V2 classificada macroscopicamente como flat-and-round, induzida

por um suposto novo tipo identificado no trabalho (BPV/BR-UEL7). A) Hiperlasia da epiderme plana,

com prolongamento de cristas papilares para derme (objetiva de 4X). B) Grânulos cerato-hialínicos

grosseiros em grande quantidade. (coloração HE; objetiva de 10X).

Figura 3. Fotomicrografia da lesão S1 (BPV-10), demonstrando pela seta intensa coilocitose nos

queratinócitos da camada espinhosa da epiderme (coloração HE; objetiva de 40X).

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Figura 4. Fotomicrografia da lesão S1 (BPV-10), demonstrando pela seta inclusões intranucleares nos

queratinócitos da camada espinhosa da epiderme (coloração HE; objetiva de 40X).

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Figura 5. Fotomicrografia da lesão U2 (BPV-8). A seta indica região de dermatite perivascular

linfoplasmocitária com predomínio de linfócitos em derme adjacente, sugerindo provavelmente um

estágio inicial de regressão do papiloma (coloração HE; objetiva de 10X).

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