clae

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Disponvel em www.farmabio.k6.com.br

High Performance Liquid High Performance Liquid ChromatographyChromatography

CLAECromatografia a Lquida de Alta

Eficincia

HPLCHPLC

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ContedoContedo

Parte I: FUNDAMENTOS DE HPLC

1. Introduo2. Histrico3. reas de aplicao / vantagens4. Modos de separao / tipos de HPLC5. Caractersticas cromatograma /

eficincia coluna

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Contedo Contedo (cont.)(cont.)

Parte II: INSTRUMENTAO / FUNCIONAMENTO HPLC

1. Colunas2. Bombas / fase mvel3. Injeo da amostra4. Detectores5. Tratamento dados6. Dicas de manuteno

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Contedo Contedo (cont.)(cont.)

Parte III: APLICAES

1. Desenvolvimento de metodologias2. Validao de metodologias2. Aplicaes

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Parte I

FUNDAMENTOS

HPLC

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IntroduoIntroduo

CROMATOGRAFIA = mtodo fsico de separao no qual os constituintes de uma amostra a serem separados so distribudos entre 2 fases:

estacionriaestacionria: geralmente de grande rea, slida ou lquida

mvel: um fluido insolvel que percola atravs da primeira

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FASE MVEL

injeo separao eluio

Fase estacionria

DETECTOR

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FASE MVEL:

Lquido HPLC

Gs GC

Gs em condies supercrticas SFC (Cromatografia a fluido supercrtico)

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FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

LCCromatografia a

Lquido

SFCCromatografia a

Fluido Supercrtico

GCCromatografia a

Gs

LCPlanar

LCColuna

CromatografiaPapel

CCDCromatografia

Camada Delgada

ColunaEmpacotada

Coluna "Open Tubular" Capilar

dc < 350 um

Coluna Capilarempacotadadc = 8 mm

CROMATOGRAFIA

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HistricoHistrico

1903 - TSWETT, botnico russo: separao e isolamento de pigmentos de plantas em colunas de slica gel (cromatografia = color writing)

1931 - LEDERER & KUHN: trabalhos utilizando cromatografia na separao de carotenides

1938 - ISMAILOV & SHRAIBER: CCD 1941 - MARTIN & SYNGE: cromatografia partio 1944 - CONSDEN, GORDON & MARTIN: cromatografia papel 1949 - SPEEDING & TOMPKINS: cromatografia troca inica 1952 - MARTIN & JAMES: GC 1957 - GOLAY: colunas capilares para GC 1959 - PORATH & FLODIN: cromatografia excluso tamanho 1965-1969 - HALASZ; HORVATH; KIRKLAND; PRETORIUS;

SCOTT; SNYDER; etc: HPLC moderna*

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Cromatografia Lquida Cromatografia Lquida ClssicaClssica

Fluxo por gravidade

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HPLC Moderna*HPLC Moderna*

Partculas da fase estacionria extremamente pequenas (dimetro < 10 m) bombas para operaes a altas presses (at 500 atm) e baixas vazes (0,01 a 2-3 mL / min) ........High Pressure LC

Solventes especiais e ultra-puros

Detectores seletivos e super-sensveis, com tamanho de clula de deteco < 10 L

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DetectorSistema de Tratamentode Dados

Bomba HPLC

Injetor

Precoluna

Coluna Analitica

Filtro em linha Scavenger

Reservatrios para os solventes

HPLC Moderna*HPLC Moderna*

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reas aplicao / vantagensreas aplicao / vantagens

HPLC x GCHPLC x GC

AnalitosTcnicaPr-requisito Interao

GC Volteis e termicamente

estveis (nas consies de

operao)

Fase estacionria

HPLC Solveis na fase mvel Fase estacionria e

fase mvel

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Substncias no analisveis por GC:

compostos inicos sais inorgnicos e orgnicos aminocidos puros compostos polares de alto PM polmeros compostos termicamente instveis corantes salinos

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Aplicaes HPLCAplicaes HPLCSubstncias qumicasSubstncias qumicas

Protenas cidos nucleicos Aminocidos Corantes Polissacardeos Pigmentos plantas Metablitos plantas Produtos

farmacuticos

Compostos inicos ons metlicos Ctions e nions Lipdeos polares Complexos metais

pesados Explosivos Polmeros

sintticos

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Aplicaes HPLCAplicaes HPLCreasreas

PESQUISA QUMICA/BIOQUMICA (Universidade e Indstria) Anlise de misturas complexas Purificao de compostos qumicos Desenvolvimento de processos de sntese de compostos

qumicos Isolamento de produtos naturais com caractersticas biolgicas

benficas

CONTROLE QUALIDADE Garantia pureza de materiais brutos Teste in process para controle e otimizao de processos de

produo Ensaios quantitativos de produtos finais (garantia

especificaes) Avaliao estabilidade de produto e monitorizao degradao

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Aplicaes HPLCAplicaes HPLCreas reas

CONTROLE AMBIENTAL Anlise de poluentes do ar e gua

Monitorizao materiais perigosos - Sade ocupacional

Monitorizao nveis agrotxicos no ambiente

AGNCIAS REGULAMENTAO (Federais e

Estaduais)

Vigilncia de medicamentos / alimentos

Identificao narcticos confiscados

Conformidade - reclamaes etiquetas

FONTE: BIDLINGMEYER, 1993.

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Vantagens da HPLCVantagens da HPLC

Sensvel a diversas amostras, incluindo orgnicas, biomolculas e ons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC

Alta resoluo

resolve (separa) centenas de componentes em amostras complexas

Deteco de alta sensibilidade

detecta nos limites de pg - ng

Anlises rpidas e precisas

anlises de 1 - 60 min

Anlises automatizadas

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Modos de SeparaoModos de Separao

Cromatografia de adsoro (slido-

lquido)

Cromatografia de partio (lquido-

lquido)

Cromatografia de troca inica

Cromatografia por excluso de tamanho

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Cromatografia de adsoro (slido- Cromatografia de adsoro (slido- lquido)lquido)

ADSORO = tendncia de acmulo de uma substncia sobre a superfcie de outra, quando 2 fases imiscveis so colocadas em contato

FASE MVEL

FASE ESTACIONRIA (slida)

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AdsoroAdsoro

QUMICA = formao de ligaes qumicas

FSICA = envolve interaes como pontes de hidrognio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, etc

* temperatura : adsoro fsica adsoro qumica

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Slida Apresenta na superfcie cargas inicas

ou polares.

Exemplos: Slica gel Alumina Florisil Carvo Carbonato de clcio

Fase EstacionriaFase Estacionria

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Hexano Isooctano Cloreto de butila Clorofrmio Diclorometano Tetraidrofurano Acetonitrila Iso e n-propanol Metanol gua

Fase MvelFase Mvel

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Cromatografia de partio Cromatografia de partio (lquido- lquido)(lquido- lquido)

PARTIO = distribuio de uma substncia entre 2 fases heterogneas fluidas, imiscveis entre si. Por exemplo: um gs e um lquido, ou 2 lquidos imiscveis

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FASE ESTACIONRIA

Fina camada de lquido que cobre as partculas de um suporte slido

Este lquido pode ser:

polar: polietilenoglicol, ODPN (, -oxidipropionitrila)

apolar: hexano

FASE MVEL

Sempre de polaridade contrria

Baixa estabilidade

Cromatografia de partio Cromatografia de partio clssicaclssica

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FASE ESTACIONRIA Lquido quimicamente ligado ao suporte

slido.

FASE MVEL Sempre de polaridade contrria Alta estabilidade

Cromatografia de partio com Cromatografia de partio com fases quimicamente ligadasfases quimicamente ligadas

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Hidrocarbonetos aromticos, leos, esterides, plsticos, polmeros, alcalides (C18)

cidos urinrios, cidos carboxlicos, sulfonamidas, hormnios tireide, azocorantes (C8)

AplicaesAplicaes

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Classificao baseada na Natureza da Fase Mvel

NPC

Fase mvel Apolar hexano, isooctano

Fase estacionria Polar slica, alumina

RPC

Fase mvel Polar metanol, gua

Fase estacionria Apolar C8, C18

Cromatografia Fase Normal (NPC)Cromatografia Fase Normal (NPC) x x

Cromatografia Fase Reversa (RPC)Cromatografia Fase Reversa (RPC)

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GERALMENTE:

NPC Cromatografia Adsoro

RPC Cromatografia Partio

Portanto..........

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Cromatografia de troca inicaCromatografia de troca inica

FASE ESTACIONRIA = grupos inicos quimicamente ligados a um suporte (slica ou polmeros de alto PM).

FASE MVEL = solues tampes (controle pH). Por exemplo: cido ctrico, fosfato amnia, acetato sdio, borato sdio.

APLICAES = compostos inicos, aminocidos, protenas/peptdeos, etc

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Cromatografia por excluso de Cromatografia por excluso de tamanhotamanho

A separao baseada no tamanho da molcula e no em fenmenos de interaes fsicas ou qumicas

FASE ESTACIONRIA = partculas com dimetro mdio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas molculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros mdios, ou seja, so permeadas seletivamente. As molculas grandes so excludas excluso tamanho.

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Cromatografia por excluso de Cromatografia por excluso de tamanhotamanho

FLUXO

Poro

Gel

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Controle qualidade de polmeros de alto

PM (assegurar propriedades fsicas)

Separao polmeros de baixo PM

(poliestireno, ftalatos)

AplicaesAplicaes

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Escolha do sistema Escolha do sistema cromatogrficocromatogrfico

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Amostra

PM < 1.000

PM > 1.000

Insolvel gua

Solvel gua

InicaNo-inicaSolvel metanol

Solvel hexano

Amostra aquosa

Amostra no-aquosa

Cromatografiatroca inica

RPC"ion-pair"RPC

NPC(fase ligada)

NPC(slica)

Polmeros insolveis gua

Biopolmeros solveis gua

Condies no-desnaturantes

Condies desnaturantes

(separao analtica)

RPC

PreparativaPreparativaInformao tamanho

Cromatografiatroca inica

Cromatografiafiltrao gel

Cromatografiapermeao gel

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Caractersticas cromatograma / Caractersticas cromatograma / eficincia colunaeficincia coluna

Tempo de reteno (tr)

Largura do pico (wb)

Fator de Capacidade (k)

Seletividade ()

Resoluo (Rs)

Rendimento da coluna / nmero de pratos tericos

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Parte II

INSTRUMENTAO /

FUNCIONAMENTO HPLC

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DetectorSistema de Tratamentode Dados

Bomba HPLC

Injetor

Precoluna

Coluna Analitica

Filtro em linha Scavenger

Reservatrios para os solventes

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1. Colunas1. Colunas

Sistema separao (adsoro, partio, etc)

Comprimento (10-25 cm)

cromatografia rpida 3 cm

Dimetro interno*

Tipo de suporte (slica gel ou polmeros)

Grupos quimicamente ligados (amino, ciano,

C8, C18, sulfonato)

Tamanho da partcula (3-20 m)

Tamanho do poro (60-300 )

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2. Bombas / Fase Mvel2. Bombas / Fase Mvel

Velocidade fluxo

0,1-3,0 mL/mim para colunas analticas

> 5,0 mL/min para colunas preparativas

Presso operao

500-2000 psi para colunas analticas

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Eluio Isocrtica / Eluio Isocrtica / GradienteGradiente

ISOCRTICA = a composio da fase

mvel no muda durante a corrida.

GRADIENTE = a composio da fase

mvel varia de acordo com a polaridade

dos analitos. Bomba binria/quaternria.

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Eluio Eluio GradienteGradiente

Passo Solvente A Solvente B Tempo

1 30 % 70 % 3 min

2 50 % 50% 2 min

3 50 % 50 % 3 min

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Injeo da AmostraInjeo da Amostra

INJETOR MANUAL

Amostra da seringa

Da bomba

Para coluna

Descarte

Loop Loop

Da bomba

Para coluna

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Injeo da AmostraInjeo da Amostra

AUTOSAMPLER

SolventeCorpodaSeringa

Amostragemda Seringa

Vlvula deinjeo

Frasco de lavagem

Vials na bandeja

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DetectoresDetectores

Equipamento com uma pequena clula de fluxo conectado na sada da coluna e que monitora a concentrao dos analitos.

Detectores mais comuns: UV/Vis (absorvncia) Fluorescncia ndice de Refrao Outros: Eletroqumico, Condutividade,

Infravermelho, etc.

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Detectores UV/Vis e Rede de Diodos Detectores UV/Vis e Rede de Diodos (DAD)(DAD)

PRINCPIO: quando vrios grupos funcionais so expostos radiao, sofrem excitao eletrnica a qual resulta na absoro de energia em comprimentos de onda especficos para os grupos.

Comprimento onda: 210-380 nm UV

Comprimento onda: 380-800 nm Visvel

90% compostos orgnicos absorvem luz em algum lugar da regio UV-Vis

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DetectoresDetectores

SENSIBILIDADE Fluorescncia: 1.000 vezes mais sensvel

que UV-Vis

UV-Vis: 1.000 vezes mais sensvel que IR

ESPECIFICIDADE Aumenta com a sensibilidade

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Tratamento dos DadosTratamento dos Dados

Integradores

Software / Computador

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Analgsicos Comprimidos

Coluna: Pecosphere 3x3 C18(3-m, 33 x 4.6 mm i.d.)

Fase Mvel: 15% ACN em HAc a 0.1%

Fluxo: 2 mL/min

Deteco: UV a 240 nm

Identificao Picos

1.Acetaminofeno2. Cafena3. Salicilamida4. cido Acetilsaliclico

1

LC Application Note LCPH-1.

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Teofilina

Coluna: Pecosphere 3x3 C18(3-m, 33 x 4.6 mm i.d.)

Fase Mvel: 11% ACN em gua

Fluxo: 3 mL/min

Deteco: UV a 273 nm

Identificao Picos:

1. Teobromina2. Teofilina3. -OH-etilteofillina4. Cafena

LC Application Note LCCL-7.

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Prednisona Comprimidos

Coluna: Pecosphere 3 C18(3-m, 83 x 4.6 mm

i.d.)

Fase Mvel: 50% metanol em gua

Fluxo: 2.0 mL/min

Deteco: UV a 254 nm

Identificao Picos

1. Acetanilida2. Prednisona

Application Note LCPH-14.

2.5 mgDeltasone Tablet

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