desenvolvimento e validação de método por clae para análise da ...
PRÓXIMA AULA TEÓRICA (Eletroforese Capilar): 12-03-13, às ... · Questões 1-Descreva os...
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Cromatografia Líquida
Prof. Rafael SousaDepartamento de Química - [email protected]
Notas de aula: www.ufjf.br/baccan
Analítica V Aula 11: 05-03-13
PRÓXIMA AULA TEÓRICA (Eletroforese Capilar):12-03-13, às 08:15h, como Prof. Marcone
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL)em Inglês
Interação diferenciada dos componentes da amostra entre
FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL
sólido
oulíquido
líquidoCrom. líquida (CL)
Uma das diferenças entre a CG e a CL são as configurações experimentais:
Sólido
líquido sobre um sólido
FASEESTACIONÁRIA
CONFIGURAÇÃOEXPERIMENTAL
PLANAR
COLUNA
Ex de interação analito - FE
Equilíbrio FE – FM (partição na crom. Líquido-líquido)
� Diferente para as substâncias diferentesPolaridade
Tamanho
Cromatografia planar
Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido
FM (capilaridade) � separação
� Fácil realização� Análises quali e quantitativas
� Baixo custo� Baixas
- Resolução e- Repetibilidade- Reprodutibilidade
Cromatografia em coluna
Convencional (Clássica)
Solvente
Fase estacionária
Suporte inerte
Líquida de alta eficiência - CLAE (HPLC)
- Colunas verticais (FM - gravidade)- Análises quali e quantitativas- Baixo custo- Baixa frequência- Desempenho regular
- Colunas e FM – altas pressões- Análises quali e quantitativas- Desempenho analítico satisfatório- Rapidez analítica, automação- Custo elevado ...
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
- Amplamente utilizada- Dentre as modalidade mais importantes da cromatografia- Vem se desenvolvendo desde a década de 70
NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA
� Necessidade de calibração
RESULTADO : Amostras x Padrões(cromatograma)
Subdivisões da CLAE
Tipo de FE e o MECANISMO de separação
Cromatografia líquido-sólido: CLS� FE é um sólido ���� mecanismo de adsorção
Cromatografia líquida de fase ligada: CLFL�FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido
���� mecanismo de partição
Cromatografia líquido-líquido: CLL� FE é um líquido que recobre um sólido
���� mecanismo de partição
Cromatografia por exclusão: CE
� FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controladaAplicação importante: análise de polímeros (GPC)
Cromatografia de troca iônica: CTI
� FE sólida contém grupos NR3+ (para troca
aniônica) ou grupos SO3- (para troca catiônica)
Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)
Mesmo mecanismo estudado da Prática 10 !
Cromatografia por afinidade: CA
� FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivacom proteínas e anticorpos
Cromatografia quiral: CQ
� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirseletivamente com compostos quirais
Separação e Sinal analítico
FM
FM
FM
FM
FM
FM + componente separado
Cromatograma
Tempo de retenção
Sin
al
Entendendo o cromatograma
Diferentes espécies � SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr(tr= tempo de retenção � medida em função do tempo)
saca
rin
aaspartame
be
nza
lde
ído
Informações
quali e
quantitativas
Tempo de retenção
Resposta do detector
Muita interaçãoPouca interação
Análise quantitativa
Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picoscromatográficos com áreas diferentes
���� Necessidade de calibração:
�Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações
� Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES
Resposta do detector
Concentração do padrão, no tr específico
Equação de reta
Configuração instrumentalComponentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta
eficiência:
� Cada componente: função no processo analítico
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector
Processador-Registrador
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
frasco de plástico
ouvidro
+
Solvente(s) orgânico(s)
CiclohexanoTetracloreto de carbonoToluenoEtanolAcetato de etilaMetanolAcetonitrilaÁgua
(VERIFICAR TABELAS)
eliminação departículas maiores
que 5 µm
retirada de gasesDissolvidos
Ultrasomou
Borbulhamento gases inertes
USO(preparação diária)
CUIDADOS
Ordem crescentede polaridade
Água
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
� Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível
� BOMBAS DE ALTA PRESSÃO
Composição constanteeluição ISOCRÁTICA
Composição variávelEluição por GRADIENTE ou
Eluição por programação de solvente
Bomba de seringa
Bomba pneumática
Amostras complexasCompostos de polaridade
muito diferente
Bomba recíproca
Proporção doSolvente mais polar
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
Ex: Bomba recíproca (uma das mais usadas)
Desvantagens:
Vazão pulsada � amortecedorCavitação (bolhas) devido à compressão
Vantagem:
Mudança da fase móvel
Para coluna
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna
ALÇA TROCÁVEL ���� Volumes de 2 a 1000 µL
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
Coluna ���� tubo de aço inoxidável ���� separação
Capacidade: dimensões
Фi= 1 – 20 mm
L= 3 – 25 cm(limitado pela P trabalho)
FEPartículas com Ф na faixa de µmUso de partículas pequenas���� melhor separação (aumenta N)
+
FM
DUAS COMBINAÇÕES
Fase reversa
Fase normal
FE apolar (baixa polaridade)FM polar
FE polarFM apolar (baixa polaridade)
EFICIÊNCIA DA COLUNA
� REPRESENTADADA POR “N”“Número de pratos teóricos”
N = 16 tr
W
2
���� Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação
� Não implica em rapidez ! Esta é dada pela Altura do prato (H): H= L / N,
em que valores pequenos referem-se a colunas “rápidas”
- Determina a resolução do cromatograma- Relacionada ao no de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FM
Sin
al d
o d
etec
tor
Tempo de retenção
Detecção dos componentes ���� conforme saem da coluna
Deve-se obter UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA
���� Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE)
a) Detectores que respondem à concentração���� SINAL proporcional à CONCENTRAÇÃO
Ex: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência
MAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEIS
b) Detectores que respondem à massa ���� SINAL proporcional a um FLUXO DE MASSA por unidade de tempo
Ex: Detectores eletroquímicos e de condutividade elétrica
Sistema de bombeamento
Reservatóriode FM
Válvula deamostragem
Colunacromatográfica
Detector Registrador
MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADIENTE
Considerações práticas
� Várias configurações instrumentais podem ser empregadas
determinação de vários tipos de substâncias(mesmo em amostras complexas)
sistema à alta pressão: checar vazamentos
As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamno resultado
para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrõesinternos
(substância com características físico-químicas semelhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida)
Questões
1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquidade alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles.
2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes emanalgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveisdiferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% água; Y: 60% MeOH/ 40%água; Z: 40% MeOH/ 60% água). Considerando essas informações, responda qualé o composto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essamesma separação.
X Y Z
Referências
Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.Principles of Instrumental Analysis5th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998
Harris, D. C.Análise Química Quantitativa7a ed., LTC – Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008
Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S.Fundamentos de Cromatografia1a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006