Citologia bacteriana
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MicrobiologMicrobiologiaia
Profa Renata O. R. CalixtoDisciplina: Microbiologia e Imunologia
O que é? Ciência que estuda dos micro-organismos
Bactérias Arqueobactérias
Algas Fungos Protozoárioshttp://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Halobacteria.jpg
http://www.febico.com/pt/page/O-que-Microalgas/FL-1-Microalgae.html#
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm
http://pt.wikipedia.org/wiki/Flagelado
Grande diversidade
http://outrasverdadesinconvenientes.blogspot.com.br/2012_08_01_archive.html
Vírus
Visualizar células intactas com aumentos
relativamente pequenos
Visualizar estruturas celulares internas e detalhes da superfície celular com grandes aumentos
Microscópio Óptico Microscópio eletrônico
De que maneira podem ser visualizados????
Tipos de Tipos de microscopiamicroscopia
• Exemplos:• Microscopia ótica:
Campo claro Campo escuro Contraste de fase
Contraste Interferencial Diferencial
546nm: clorofila
Fluorescência
Tipos de Tipos de microscopiamicroscopia
• Exemplos:• Microscopia eletrônica:
Transmissão
Varredura AFM de perfringolisina : Clostridium perfringens
Força Atômica
Citologia Citologia Bacteriana: Bacteriana:
Citologia Microbiana
Procariótica Eucariótica
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5a/Average_prokaryote_cell-_en.svg http://www.vestibulandoweb.com.br/biologia/teoria/celula-eucarionte.asp
Citologia Microbiana
Citologia Microbiana
Estrutura celular em células procarióticas
Forma e Arranjo:
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bacterial_morphology_diagram_pt.svg
Célula Procariótica Estruturas principais:
Membrana citoplasmática Parede celular Ribossomos Inclusões Nucleóides
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/c7x4prokaryote.jpg
Membrana Citoplasmática Estrutura fina e fluida Barreira de permeabilidade Garante integridade celular Altamente seletiva Capacidade de concentrar metabólitos Excretar dejetos
membrana plasmátic
a
membrana plasmátic
a
citoplasmacitoplasma
meio extracelular
meio extracelular
Composição da Membrana CitoplasmáticaEstrutura lipoprotéica e fluida Lipídeos: fosfolipídeos e glicolipídeos Proteínas com propriedades variadas:
receptores, sinalizadores, transportadores, cadeia respiratórias síntese de componentes
Carboidratos (ligados a proteínas ou lipídeos)
citoplasma
ME
Lipídeos
Proteínas
Funções Permeabilidade seletiva e
transporte de solutos Transporte de elétrons e
fosforilação oxidativa Excreção de exoenzimas
hidrolíticas Sustentação de enzimas e
moléculas transportadoras Sustentação dos receptores
e outras proteínas do sistema de transdução quimiotática e sensorial
Características dos lipídeos de membrana
Moléculas anfipáticas – porções hidrofóbicas ficam voltadas para o interior da bicamada e porções hidrofílicas ficam expostas para o citoplasma e para o exterior da célula.
Porção hidrofílica (Cabeça polar)
Porção hidrofóbica
lipossoma
bicamada lipídica
meio aquoso
Composição lipídica da membrana
Fosfolipídeos:
Mais abundantes (classe principal)
Possuem um grupamento fosfatado ligado ao glicerol (cabeça polar): porção hidrofílica
Possuem dois ác. graxos ligados ao glicerol:
porção hidrofóbicaGrupamento
fosfato
Ácidos graxos
glicerol
Composição lipídica da membrana
Glicolipídeos:
Não possuem fosfato
Possuem mono, oligo ou polissacarídeos ligados ao glicerol (cabeça polar), expostos no meio
Possuem dois ác. Graxos
ligados ao glicerol
(porção hidrofóbica) Ácidos graxos
glicerol
polissacarídeos
oligo
mono
Composição lipídica da membrana
Esteróis:
A maioria das bactérias não possui (exceção: Micoplasmas)
Função de dar maior rigidez à membrana
Lipídeos análogos em algumas bactérias: hopanóides
cabeça polaranel esteróide
ác graxo
Esterol
Cabeçapolar
porçãohidrofílica
hopanóide
colesterol
Composição lipídica da membrana
Lipídeo de bactérias e eucariotos
• Ácidos graxos
• Ligação éster
Lipídeo de archaeas
• Polímeros de hidrocarbonetos (isopreno)
• Ligação éter
glicerol glicerol
Ligação ÉSTER
Ligação ÉTER
CADEIA DE HIDROCARBONETOS
ÁC. GRAXOS
Proteínas de membrana Embebidas na camada fosfolipídica Geralmente possuem uma superfície
externa (hidrofóbica) na região em associação com ac graxos
Transmembrana
Integrais
Periféricas
Fluidez da Membrana Moléculas fosfolipídicas e proteínas:
liberdade de movimentação Estrutura de mosaico fluido
Fluidez da Membrana
Lipídeos:
• Movimento lateral
• Movimento vertical ou flip-flop
Proteínas:
• Movimento lateral
Alta temperatura
A integridade da membrana pode ser afetada devido à grande movimentação das moléculas.
Baixa temperatura
A atividade da membrana podem ser prejudicada pela baixa movimentação das moléculas
Fluidez da Membrana Domínio Archea (termófilos, termoacidófilos e halófilos)
Glicerolipídios e Glicolipídios
Ligação do tipo ÉTER entre terpeno (fitanol - saturados) e glicerol
( estabilidade química e resistência à hidrólise)
* do tipo arqueol: formam bicamada típica (diéter)
* do tipo cardaquiol: formam monocamada (tetraéter)
- resistência e rigidez: sem alteração de insaturação
Principais lipídios: glicerol éter e diglicerol tetraéter
Comparação de membranas
Membrana Bactéria Archaea
Conteúdo proteico
Alto Alto
Composição lipídica
fosfolipídeos Sulfolipídeos, glicolipídeos, hidrocarbonetos ramificados,
isoprenoides, fosfolipídeos
Estrutura dos lipídios
cadeia linear cadeia ramificada
Ligação dos lipídos
éster éter (di e tetraeter)
Proteínas de transporte
Processos de transporte: natureza altamente específica
Muitas ptns reagem com somente uma molécula
Outras tem afinidade por uma classe química
Síntese das ptns: regulada pelos nutrientes presentes e suas concentrações
Transporte através de membranas biológicas
Bactérias e arqueas: nutrientes obtidos por permeabilidade da MC e
sistemas de transporte
* Que não requerem energia:
Difusão Passiva
* + [ ] para – [ ]
* Carboidratos e aminoácidos
Transporte através de membranas biológicas
* Que não requerem energia:
Osmose
- Água em resposta a [ ] soluto
Transporte através de membranas biológicas
* Que não requerem energia:
Difusão facilitada
- Proteínas transportadoras – movimento para dentro e pra fora
- Sem gradiente de [ ] e energia
- Exemplo: glicerol
Transporte através de membranas biológicas
• Tipos de transportes que requerem energia:
Transporte através de membranas biológicas
* Que requerem energia:
Transporte Simples (uniporte, simporte e antiporte)
- Permeases – canal – contra o gradiente – força próton-motiva
Transporte através de membranas biológicas* Que requerem energia:
Translocação de grupo
- Captação de determinados açúcares com a fosforilação do substrato
-Ptns transportadora é fosforilada no citoplasma e se liga ao açúcar livre na face externa da membrana
-Sistemas: fosfotransferases
-Quimiotaxia e outras vias metabólicas
Transporte através de membranas biológicas* Que requerem energia:
Sistema ABC (ATP Binding Cassete)
- AAs, íons, carboidratos, lipídios, drogas e proteínas
- Emprega ATP diretamente para transporte de soluto
- Gram -: facilitado por proteínas de ligação no espaço periplasmático; Gram +: ptns de ligação na superfície externa da membrana celular
Membranas Internas
Bactérias fotossintéticas
Invaginações ou continuidade
* Bactérias nitrificantes
- Enzima-chave oxidação amônia
* Bactérias fotossintéticas
- Bacterioclorofila e pigmentos de captação de luz
GERAÇÃO DE ATP
Parede Celular Estrutura externa rígida da membrana
citoplasmática Promove apoio e proteção Divisão em 2 grupos:
Bactérias Gram positivas: um único tipo de molécula e mais fina
Bactérias Gram negativas: multicamadas, complexa
COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAMCOLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM
Diversidade da petidoglicana Nem sempre o DAP esté presente Em todas as Gram negativas; em algumas
Gram positivas (lisina) Os açúcares estão sempre conectados por
ligação -1,4 As variações ocorrem entre as pontes Esqueleto: glucosamina e ácido murâmico
Composição da parede celular
Peptidioglicana ou mureína: N-acetilglucosamina e acido N-acetilmurâmico (-1,4) Grupo de aminoácidos: L-alanina, D-alanina, ac
glutâmico, lisina e ac. Diaminopimélico (DAP) Somente encontradas nas paredes celulares de
bactérias Presentes em bactériasGram positivas e negativas Mais de 100 variações
1-4
ác. N-acetil murâmicoN-acetil glicosamina
pentaglicinapentaglicina
L-AlaL-AlaD-GluD-Glu
D-AlaD-AlaL-Lis/m-DapL-Lis/m-Dap
Composição da parede celular
Bactérias Gram positivas: 90% da parede e em muitas camadas
Bactérias Gram negativas: 10% da parede
Composição da parede celular Bactérias Gram positivas Ac. Teicóico, Lipoteicóico e Teicurônico Macromoléculas com carga negativa: passagem de
íons Ác. teicóico: polímero de glicerol-fosfato ou ribitol-fosfato Ác. lipoteicóico: polímero de glicerol-fosfato ligado à lipídeos
de membrana Ác. teicurónico: polímero de ác. glucurônico alternado com
glicose
ác. teicóicoác. teicurônicác. lipoteicóico
pept
ideo
glic
ana
pept
ideo
glic
ana
ác. teicóico
ác. teicurônico
ác. teicóico
ác. teicurônico
peptideoglicana dissacarídeo
GlcNAc
ManNAc
Ligação fosfodiéster
Composição da parede celular Bactérias Gram negativas
Composição da parede celular Bactérias Gram negativasMembrana externa:
Dupla camadaPossui na sua face externa LPS (lipopolissacarídeo)Capacidade de excluir moléculas hidrofóbicas (proteção celular) e hidrofílicasPossui porinas: difusão passiva permeabilidade
Membrana Externa de Gram -
Considerada como endotoxina Salmonella, Shigella. Escherichia Toxicidade: polissacarídeos e lipídio A Ligadas a célula e liberadas na lise celular Nem todas as cel possuem LPS composto por
unidades repetidas Estruturas semelhantes a glicoesfingolipídios
(LOS) LOS: diversidade antigênica e estrutural
Fator de virulência Escape do SI (N-aceetilgalactosamina terminal em N.
gonorrhoea e H.ducreyi)
Composição da parede celular Bactérias Gram negativasLipopolissacarídeo (LPS):
2 porções: core polissacarídico e O-polissacarídeoPolissacarídeo O: 4 a 5 moléculas de açúcares repetidosPorção lipídica: lipídio A (ácidos graxos: ac. Capróico, ac laurínico, ac muristico, ac esteárico)Dissacarídeo ligado ao core por ácido cetodesoxioctanóico (KDO)
Composição da parede celular Bactérias Gram negativasLipoproteína:
Entre a camada externa e as camadas do peptidioglicanaContém 57 aminoácidos Peptidio ligado a resíduos do DAP na cadeia lateral Proteína mais abundanteFunção: estabilizar a membrana externa e ancorá-la na camada do peptidioglicana
Composição da parede celular Bactérias Gram negativas
Espaço Periplasmático:
Entre a membrana externa e a membrana internaContem a camada de peptidioglicana e uma solução de proteínas (gel)Cerca de 20 a 40 % do volume celularProteínas periplasmáticas: proteínas de ligação, enzimas hidrolíticas Oligossacarídeos derivados de mamebrana: osmorregulação
Polímero altamente ramificado de d-glicose (8 a 10 resíduos)
Parede celular de Micobactérias
Peptidioglicana, arabinogalactana e ácido micólico
Baixa permeabilidade susceptibilidade Peptidioglicana: N-acetilglicosamina e N-
glicolilmurâmico q forma suporte para arabinogalactana com ácido micólico
Arabinogalactana: D-galactose e D-arabinose, na configuração furanose Galactana: -D-galactofuranose
Ácido micólico Pelo menos 10 gêneros (Mycoplasma) Capturam esteróis do meio
cabeça polaranel esteróide
ác graxo
Esterol
Composição da parede celular Ácido Micólico
Lipídeos somente encontrados na parede de bactérias do gênero Mycobacterium
Também possui outros lipídeos (lipoarabinomananas e lipomanas)
Álcool-ácido resistência
Coloração: Método de Ziehl-Neelsen
Parede Celular de Micobactérias
Base da parede de Mycobacterium:
complexo ác. micólico-arabinogalactana-peptídeoglicana (mAGP)
Parede Celular de Arqueas Pseudopeptidoglicanas
– Peptídeoglicanas: polímeros de GlcNAc (b 1-4) MurNAc– Pseudopeptídeoglicanas: polímeros de GlcNAc (b 1-3)
NAcTalNA
Pentapeptídeo
Ausência de D-aa
Parede Celular de Arqueas
Pseudopeptidoglicanas
– A parede de outras arqueas podem consistir de polissacarídeos, glicoproteínas ou proteínas
– Função: impedir a lise osmótica e definir a forma celular
– Tipo mais comum : camada da superfície paracristalina ou camada S (proteína pu glicoproteína, simetria hexagonal)
Células desprovidas de parede
Destruição do peptideoglicano Lisozima: clica ligações β-1,4 Protoplasto: sem parede celular Esferoplasto: porções de parede
associada Alguns procariotos podem
sobreviver sem parede. Ex: micoplasma, Thermoplasma,
Clamydia Membranas extemamente
rígidas ou habitats osmoticamente protegidos
Camada S Estrutura proteica ou glicoprotéica ligada à parede Em todas as bactérias e sobretudo em
arqueobacterias (parede) Aparência cristalina Várias simetrias:
Oblíqua (2 monômeros) Tetragonal (4) Hexagonal (3 ou 6 )
Função: barreira permeável Adesão forma da célula ligação a nutrientes proteção contra SI
Cápsula e camada limosa Substâncias viscosas presentes na superfície
celular Polissacarídeos ancorados e proteínas Glicocálix: material contendo polissacarídeos
localizado no lado externo da célula = termo + abrangente Glicoproteínas e grande nº de polissacarídeos
(poliálcoois e açúcares aminados) Em alguns casos: síntese de polímero
extracelular por enzimas na superfície celular homopolímero ou heteropolímero
Cápsula e camada limosa Cápsula: camada condensada e bem
definida que circunda estreitamente a célula Função: capacidade de invasão; evasão do SI
Cápsula e camada limosa: Camada limosa: rede frouxa de fibrilas que
extende para fora da célula Função: aderência, biofilme
Cápsula e camada limosa: Funções:
Reservatório de água e nutrientes: proteção contra dessecação e servem como nutrientes
Aumento da capacidade de invasão Aderências Aumento da resistência microbiana a biocidas Produção industrial de polissacarídeos
extracelulares
Flagelos Presentes em archaeas e bactérias Gram
positivas e negativas Longos e finos, com uma extremidade livre
e a outra presa na célula Função: locomoção
Gasto de energia
Polar
Lofotríqueo
Peritríqueo
Estrutura flagelar
Morfologia helicoidal Filamento composto por flagelina Estrutura básica varia pouco em Bacteria Flagelina conservada: raízes evolutivas Archaea: diferentes tipos de flagelina
Estrutura muito distinta do flagelo de Bacteria
Estrutura flagelar• São subdivididos em 3 regiões:
Motor (Anéis)
Gancho - conecção
Filamento
Movimento flagelar Comprimento de ondacaracterístico para cada organismo Fazem rotação e nãoflexão
Sentido anti-horário Sentido horário
Energia força próton-motriz 1000 protons/rotação
Flagelos: Quimiotaxia e Sinalização celular Estímulo químico NUTRIENTES
Atraente Repelente
Magnetotaxia Bactérias aquáticas Partículas eletrondensas – Fe - magnetos
Fototaxia Bactérias fotossintéticas Vacúolos de gás H - flutuação
Aerotaxia Bactérias que requerem O2
Outros tipos de movimentação Pili do tipo IV: mobilidade independente de flagelo “twitching”: movimento contração Pseudomonas aeruginosa “gliding”: deslizamento Myxococcus xanthus
Pili e Fímbrias Filamentos longos e delgados
Polimerização de proteínas Medeiam adesão Quase em todas Gram – Possuem base ligada na membrana plasmática em Gram-
positivas e na membrana externa em Gram-negativas As fímbrias são menores, mais numerosas do que os pili
Fímbrias Em Gram + e Gram - Curtos e menos numerosos Característica hereditária Funções: adesão e biofilmes
Pili Similares às fímbrias Maiores e apenas um ou poucos Mais estudados em Gram - Funções: transferência genética
(conjugação) e adesão Variação antigênica
Pilus sexual(Pili F)
Pilus sexual(Pili F)
Célula hospedeira
Célula hospedeira
Pilus de adesãoPilus de adesão
AdesinaAdesina
ReceptorReceptor
Pili Motilidade: suas extremidades aderem as
superfícies da célula, e em seguida os pili se despolimerizam da sua extremidade terminal retraindo-se para o interior da célula movimento em direção a ponta aderente
Virulência de algumas bactérias Cepas enteropatogênicas de E.coli Estreptococos: proteína M aderência ao epitélio (ác.
Lipoteicóico) Variação antigênica pili de diferentes tipos antigênicos
Inibe atividade fagocítica
Endósporos Estruturas formadas por algumas
bactérias Gram +: gêneros Clostridium e Bacillus
Formadas pela privação de nutrientes Células latentes
A) Não identificadoB) B. cereusC) B. megaterium
Endósporos DNA Córtex:camada mais espessa;
peptidoglicana incomum (menor nº de ligações cruzadas), sensível a lisozima; papel na germinação
Parede do cerne: camada mais interna; peptidoglicana normal
Capa: resistência a agentes químicos
Exósporo: composto por proteínas, lipídios e carboidratos
Endósporos Processo de esporulação
Endósporos Processo de Germinação:
3 estágios: Ativação: meio nutricional rico ou outro agente que atue na capa condições ambientais favoráveis Iniciação: depende da espécie; receptores reconhecem efetores distintos como sinalização. O efetor autolisina degrada o peptidoglicana do cortexCaptação de água liberação de dipicolinato de cálcio degradação de vários componentes por enzimas hidroliticas. Crescimento: aparecimento de célula vegetativa após degradação do cortex e das camadas mais externas
Material genético Nucleóide:
Ausência de membrana nuclear e de aparelho mitótico
Região nuclear: DNA dupla hélice DNA + proteínas histona-like
Plasmídeos: DNA circulares, menores que o cromossomo Capazes de auto-duplicação
BACTÉRIASBACTÉRIASTécnicas de coloração:
Coloração SimplesPode ser positiva ou negativaColoração Simples PositivaColoração Simples Positiva Solução aquosa ou alcoólica de um único corante básico ligação superfície celular e material genético
Finalidade: realçar o micro-organismo por inteiro visualização da forma celular, tamanho e grupamento de célula.
Coloração simples negativaColoração simples negativaUtiliza um corante acídico repelido pelas cargas negativas da superfície celular
Lâmina fica corada micro-organismo mais claro Demonstração de cápsula mucóide em algumas espécies Exs de corantes: tinta nanquim ou nigrosina
http://escola.britannica.com.br/assembly/708/The-capsular-material-surrounding-these-bacteria-is-revealed-in-a
Acinetobacter calcoaceticus
Coloração Diferencial Uso de dois corantes contratantes colorações
diferentes em grupos distintos de bactérias Finalidades:
Separar grupos de bactérias diferentes Coloração de Gram Coloração de resistência a álcool-ácido
Visualizar estruturas particulares de alguns grupos de bactérias
Coloração de endósporos Coloração de flagelos
Coloração de Gram• Método de escolha para identificação de bactérias• 2 grupos principais: Gram positivas e Gram
negativas• Princípio da técnica:
diferença de composição da parede celular capacidade destas paredes em reter os
corantes
http://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/
Coloração de resistência ao álcool-ácido (Coloração de Ziehl-Neelsen e Coloração de Kinyoun)
• Métodos para identificação de micobactérias
• Princípios das técnicas: Existência de uma espessa camada de lipídios (ácido micólico)
Membrana pouco permeável a corantes
http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/20040615/d094324845a24eb3a7bfe0d1f8e4a637/5789_lores.jpg
Coloração de endósporos (Técnica de Schaeffer-Fulton)
• Endósporos: formas de resistência (altas temperaturas, congelamento, radiação, dessecação e agentes químicos
• Técnica:
O verde malaquita, a coloração primária, é aplicado a um e sfregaço fixado com calor e aquecido em vapor por cerca de cinco minutos
O calor auxilia a coloração a penetrar na parede do endosporo.
a preparação é lavada por cerca de 30 segundos com água, para remover o verde malaquita de todas as partes da célula, exceto dos endosporos.
A safranina é aplicada ao esfregaço para corar as porções da célula que não os endosporos
os endosporos aparecem em verde dentro de células vermelhas ou rosadas.
os endosporos são altamente refrativos, podem ser detectados no microscópio óptico quando não corados, mas não podem ser diferenciados de inclusões de material armazenado sem uma coloração especial
Coloração de flagelos (Técnica de Leifson)
• Flagelos: estruturas de locomoção• Princípios das técnicas: deposição do corante
na estrutura do flagelo• Mordente: ácido tânico• Corante: carbolfucsina• O esfregaço não deve ser fixado