Cinética da resposta imune inata induzida por diferentes … · 2018-11-20 · Obrigado por tudo....
Transcript of Cinética da resposta imune inata induzida por diferentes … · 2018-11-20 · Obrigado por tudo....
Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
Cinética da resposta imune inata induzida por diferentes adjuvantes vacinais
Fernando Augusto Siqueira Mathias
OURO PRETO, MG
Agosto, 2013
Fernando Augusto Siqueira Mathias
Cinética da resposta imune inata induzida por
diferentes adjuvantes vacinais
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas como parte das exigências para obtenção do grau de mestre na área de Imunobiologia de Protozoários pela Universidade Federal de Ouro Preto
Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis
Co-Orientadora: Dra. Cláudia Martins Carneiro
OURO PRETO, MG 2013
Mathias, F. A. S. Colaboradores
ii
Dra. Juliana Vitoriano de Souza I
Dra. Paula Melo de Abreu Vieira II
Dra. Nádia das Dores Moreira II
Ms. Bruno Mendes Roatt II
Ms. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares II
Ms. Jamille Mirelle de Oliveira Cardoso II
I - Instituto Butantan, São Paulo
II - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto
(NUPEB/UFOP)
Mathias, F. A. S. Epígrafe
iii
Na vida, não vale tanto o que temos, nem tanto importa o que somos. Vale o que realizamos com
aquilo que possuímos e, acima de tudo, importa o que fazemos de nós! (Chico Xavier)
Mathias, F. A. S. Dedicatória
iv
À minha Família, que me apoiou em todos
os momentos de minha caminhada e me deu
força para cumprir mais uma etapa da minha
vida.
Mathias, F. A. S. Agradecimentos
v
A Deus, por iluminar meus passos, dar força, paciência, perseverança e felicidade para conduzir
esse trabalho em harmonia com tantas pessoas que me auxiliaram nesse processo.
A meus pais, inabaláveis, vocês foram minha força nessa caminhada, muito obrigado pelas
orações, apoio, conselhos, segurança e incentivo para seguir sempre em frente, sem vocês isso
jamais teria ocorrido, amo vocês.
A minha Irma, Maria Augusta, por todos os bons momentos vividos, por toda ajuda, carinho e
dedicação. Você é como uma segunda mãe, te amo. Ao meu irmão Luiz Augusto, pela amizade e
companheirismo.
A minha Tia Isaura, por sempre estar presente e acreditar em mim, me apoiar em todas as horas
desde o início de minha graduação em Ouro Preto. Obrigado por tudo.
A incrível e única Republica Vira Saia, que mais que uma casa, se tornou minha família em Ouro
Preto, com a qual sempre pude contar nos momentos mais difíceis e felizes nessa cidade. Meu
obrigado aos irmãos virassaianos que tornaram essa caminhada muito mais fácil.
Aos amigos de Guaratinguetá, que mesmo com a distância torceram por mim, e de certo modo
estão sempre presentes.
A Letícia, pelos anos de convivência, apoio e amizade, obrigado por tudo.
Ao meu orientador professor Alexandre Barbosa Reis por toda a confiança e oportunidade de
executar esse trabalho e participar de um grupo tão unido quanto o nosso. Obrigado por todos
ensinamentos, paciência e ajuda no decorrer de todos esses anos.
A professora Cláudia por todo auxilio, exemplo de seriedade, dedicação, amor à pesquisa e
profissionalismo desempenhado no laboratório, fazendo com que esse grupo seja o que é. Muito
obrigado.
Mathias, F. A. S. Agradecimentos
vi
A Dra. Juliana Vitoriano de Souza, que com muita paciência, amizade e dedicação auxiliou no
meu processo de formação desde a iniciação científica. Muito obrigado por ter confiado em mim
para dar continuidade a esse trabalho, pelas palavras amigas de incentivo e cobrança em todos os
momentos apesar da distância. Desejo a você toda felicidade do mundo e sempre que puder te
ajudar em algo pode contar comigo.
Aos colaboradores desse trabalho, em especial a Paula, Nadia, Bruno e Rodrigo, que além da
grande amizade e convívio que proporcionaram, arregaçaram as mangas e me ajudaram na hora
mais difícil desse trabalho. Não existem palavras para agradecer toda ajuda e ensinamentos
passados ao longo de todos esses anos. São exemplos de profissionais a serem seguidos. Muito
Obrigado.
Aos meus grandes amigos, irmãos, Jamille Mirelle e Levi Eduardo, que entraram junto comigo
nessa caminhada desde a iniciação científica nos tempos de autoclave e que continuaremos
juntos no doutorado. Obrigado por todas as risadas, ferrações, rocks e companherismo.
A todos os alunos de IC que ajudaram nesse trabalho, em especial a Mariana Trevisan que me
ajudou na confecção das laminas histológicas, aos domingos para preparar os animais para as
necropsias nos dias seguintes. Obrigado.
A Flávia, Wendel, Carol, Ana, Kátia, Sheler, Henrique, Rory, Gleise, Luísa, Aline, Lucilene,
Renata, Tânia, Maria, Laser, Leoneide e a todos os demais integrantes da família LIMP/LPC
pelo ótimo convívio, amizade e apoio.
A UFOP e ao NUPEB, pela oportunidade de realizar uma pós-graduação de qualidade.
Ao CCA e todos os seus funcionários pela disposição e alegria sempre, no cuidado e manutenção
dos animais fundamentais para a realização da pesquisa científica.
Aos camundongos utilizados nesse projeto, pequenos soldados da ciência, sem eles nada seria
possível.
Mathias, F. A. S. Resumo
vii
Adjuvantes são substâncias que atuam na resposta imune inata e quando combinadas a vacinas com antígenos específicos, são capazes de produzir uma resposta mais intensa ao antígeno alvo. Adjuvantes atuam de várias formas para apresentar um antígeno para o sistema imune. Podem atuar como um sistema de depósito para antígenos, apresentando o antígeno durante um longo período de tempo. Além disso, essas substâncias são extremamente atrativas para o desenvolvimento de novas formulações vacinais contra várias doenças como a leishmaniose visceral. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a resposta imune induzida por uma dose única dos adjuvantes: Hidróxido de alumínio (Al(OH)3), Adjuvante Completo de Freund (ACF), Montanide Pet Gel A (MPGA), glicopiranosil lipídio A (GLA-SE) e Resiquimod (R-848) inoculados na pele de camundongos. Animais sensibilizados com salina foram utilizados como grupo controle. Os dados obtidos após a sensibilização com os adjuvantes demonstraram que todos adjuvantes foram capazes de promover alterações hematológicas nos leucócitos totais, bem como nas diferentes subpopulações. A análise fenotípica do sangue periférico mostrou que os animais imunizados com o adjuvante ACF (12h), GLA-SE e R-848 (24h) tiveram uma redução na subpopulação de linfócitos T CD4+, enquanto que os adjuvantes R-848 (12h) e MPGA (24h) apresentaram uma redução inicial de linfócitos T CD8+. A população de linfócitos B CD19+ também foi avaliada, na qual foi possível observar alterações em todos os grupos, contudo, os animais sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3 e GLA-SE apresentaram um aumento inicial em 24h. Em relação às células NK CD49b+, demonstraram distintos perfis nas diferentes imunizações com os adjuvantes, onde os animais dois grupos Al(OH)3 e R-848 reduziram nos tempos de 24h e 12h respectivamente. Os animais dos outros grupos apresentaram um aumento tardio: ACF (96h), MPGA (168h) e GLA-SE (168h). A população de monócitos CD14+ também foi avaliada, e os resultados mostraram que todos os adjuvantes, com a exceção do MPGA (96h) apresentaram um aumento recente. A avaliação dos níveis séricos de óxido nítrico induzido pelos distintos adjuvantes foi realizada nesse trabalho. Nossos resultados demonstram que os adjuvantes Al(OH)3 e ACF não foram capazes de induzir produção de NO, em contraste com os outros adjuvantes que mostraram um aumento em 1h e 12h (R-848), 48h (GLA-SE) e 168h e 336h (MPGA). O estudo histomorfológico foi realizado no local da imunização para avaliar a habilidade dos adjuvantes promover recrutamento celular. Os animais inoculados com o adjuvante Al(OH)3 não apresentaram diferenças entre os tempos da cinética, todavia, difere do grupo controle em toda análise. Os outros grupos demonstraram aumento já nos tempos iniciais. Os animais inoculados com o adjuvante ACF mostraram um aumento no recrutamento entre os tempos de 12h à 48h. Os animais inoculados com o adjuvante MPGA mostrou aumento na migração a partir de 48h, o grupo GLA-SE mostrou aumento entre os temos de 12h e 168h e finalmente os animais inoculados com R-848 mostraram grande recrutamento nos tempos de 1h, 24h e 48h. Assim, nossos dados demonstraram que os adjuvantes vacinais induziram recrutamento celular para o local do inóculo bem como mudanças nas células presentes no sangue periférico. Contudo, essas alterações apareceram em tempos distintos, provavelmente devido ao fato de eles terem diferentes constituições e, portanto, perfis de respostas imunes distintas que devem ser consideradas na sua seleção como adjuvantes vacinais. Esses dados nos estimulam a dar prosseguimento nos estudos a fim de compreender melhor esses mecanismos para poder implementar em futuras formulações vacinais seguras e efetivas.
Mathias, F. A. S. Abstract
viii
Adjuvants are substances that act in the innate immune response and when combined to vaccines with specific antigens, are capable of producing a more intense response to the target antigen. Adjuvants can act in various ways to present an antigen to the immune system. Can act as a depot system for the antigen, presenting the antigen over a long period of time. Therefore, these substances are extremely attractive for the development of new vaccine formulations against various diseases such as visceral leishmaniasis. Thus, the aim of this study was to evaluate the immune response induced by a single dose of the adjuvants: aluminum hydroxide (Al(OH)3), Freund's Complete Adjuvant (FCA), Montanide Pet Gel A (MPGA), glucopyranosyl lipid A (GLA-SE) and Resiquimod (R-848) applied to the skin of mice. Animals sensitized with saline were used as control group. The data obtained after sensitization with adjuvant demonstrated that all adjuvants were able to promote hematological alterations in total leukocytes levels, as well as in different subpopulations. Phenotypic analysis of peripheral blood showed that the animals immunized with adjuvant CFA (12h), GLA-SE and R-848 (24h) had a reduction in the subpopulation of CD4+ T lymphocytes, whereas the adjuvants R-848 (12h), and MPGA (24h) presented initial reduction of CD8+ T lymphocytes. The population of CD19+ B lymphocytes was also evaluated, in which it was possible to observe changes in all groups, however, the animals sensitized with adjuvant Al(OH)3 and GLA-SE presented an increase in recent time 24h. Regarding CD49b+ NK cells, distinct profiles in different immunizations with adjuvant were shown, where the animals of groups Al(OH)3 and R-848 were reduced in 24h and 12h respectively. The animals of the other groups showed an increase in late times: CFA (96h), MPGA (168h) and GLA-SE (168h). The population of CD14+ monocytes was also evaluated, and the results showed that all adjuvants except MPGA (96h) presented a recent increase. Evaluation of serum levels of nitric oxide induced by different adjuvants was made in this work. Our results showed that the adjuvants Al(OH)3 and CFA were not able to induce NO production, in contrast to the other adjuvants which showed an increase in 1h and 12h (R-848), 48h (GLA-SE) and 168h and 336h (MPGA). A histomorphological study was conducted at the site of immunization to evaluate the ability of adjuvants to induce promoting cell recruitment. The animals inoculated with adjuvant Al(OH)3 showed no difference in recruitment between the times of the kinetics, however, differ in the control group throughout the analysis. The other groups showed increases already in the early times. The animals inoculated with adjuvant CFA showed an increase in recruitment between the times of 12h to 48h. The animals inoculated with adjuvant MPGA showed increased migration from 48h, the GLA-SE group showed an increase between the times of 12h to 168h and finally the animals inoculated with R-848 showed greater recruitment in times of 1h, 24h and 48h. Thus, our data demonstrate that the adjuvant vaccine induced cellular recruitment to the site of inoculation as well as changes in the cells present in peripheral blood. However, these changes appeared at different times, probably due to the fact that they have different constitutions and hence different ways to induce immune responses that should be considered in their selection as vaccine adjuvants. These data encouraged us to continue studies to better understand these mechanisms in order to implement in future safe and effective vaccine formulations.
Mathias, F. A. S. Índice
ix
1. Introdução ................................................................................................................................. 1
2. Revisão da literatura................................................................................................................. 5
2.1. Adjuvantes vacinais ............................................................................................................. 6
2.2. Associação de antígenos e adjuvantes em diferentes formulações vacinais anti-
Leishmania .................................................................................................................................. 7
2.3. Adjuvantes e ativação do sistema imune ........................................................................... 10
2.4. A pele como principal via de imunização .......................................................................... 14
3. Justificativa .............................................................................................................................. 16
4. Objetivos .................................................................................................................................. 18
4.1. Objetivo Geral .................................................................................................................... 19
4.2. Objetivos Específicos......................................................................................................... 19
5. Material e Métodos ................................................................................................................. 20
5.1. Animais e grupos experimentais ........................................................................................ 21
5.2. Parâmetros Avaliados ........................................................................................................ 22
5.2.1. Parâmetros Hematológicos ......................................................................................... 22
5.2.3. Dosagem de óxido nítrico no soro .............................................................................. 23
5.2.4. Imunofenotipagem do sangue periférico .................................................................... 24
5.2.5. Análise fenotípica de células do sangue periférico ..................................................... 25
5.2.6. Processamento e avaliação histológica da pele ........................................................... 26
5.2.7. Análises estatísticas .................................................................................................... 27
6. Resultados ................................................................................................................................ 28
6.1. Cinética de leucócitos do sangue periférico em camundongos sensibilizados com os
adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848) .............................................. 29
6.2. Análise do perfil fenotípico das células mononucleares no sangue periférico:
Subpopulação de Linfócitos T (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e
monócitos (CD14+) em camundongos imunizados com diferentes adjuvantes vacinais
(Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). ............................................................................. 34
6.3. Análise dos níveis de Nitrato (NO-3) + Nitrito (NO-2) sérico de camundongos
sensibilizados com os diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-
848) ........................................................................................................................................... 45
Mathias, F. A. S. Índice
x
6.4. Quantificação do infiltrado inflamatório na pele de camundongos sensibilizados com os
diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848) ............................. 47
7. Discussão .................................................................................................................................. 50
8. Conclusão ................................................................................................................................. 61
9. Perspectivas ............................................................................................................................. 63
10. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 65
11. Anexo ...................................................................................................................................... 78
Mathias, F. A. S. Lista de Quadros
xi
Quadro 1: Principais adjuvantes já empregados em vacinas anti-Leishmania associados a
diferentes antígenos vacinais. ....................................................................................................... 10
Mathias, F. A. S. Lista de Figuras
xii
Figura 1: Delineamento experimental ......................................................................................... 22
Figura 2: Análise da frequência de células NK, linfócitos T e B e monócitos CD14+ ................ 26
Figura 3: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD4+ no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 36
Figura 4: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD8+ no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 38
Figura 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos B CD19+ no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 40
Figura 6: Avaliação longitudinal da população de células NK CD49b+ no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes. ......................................................... 42
Figura 7: Avaliação longitudinal da população de monócitos CD14+ no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 44
Figura 8: Avaliação longitudinal dos níveis séricos de NO em camundongos sensibilizados com
os diferentes adjuvantes ................................................................................................................ 46
Figura 9: Avaliação longitudinal do infiltrado celular na pele de camundongos sensibilizados
com os diferentes adjuvantes ........................................................................................................ 48
Figura 10: Fotomicrografias de cortes histológicos representativas do infiltrado celular na pele
de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes. .................................................... 49
Mathias, F. A. S. Lista de Quadros
xiii
Tabela 1: Avaliação longitudinal de leucócitos totais circulantes no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 30
Tabela 2: Avaliação longitudinal da população de neutrófilos circulantes no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 31
Tabela 3: Avaliação longitudinal da população de eosinófilos circulantes no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 32
Tabela 4: Avaliação longitudinal da população de monócitos circulantes no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 33
Tabela 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos circulantes no sangue periférico de
camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes .......................................................... 34
Mathias, F. A. S. Lista de Abreviaturas
xiv
ACF/CFA: Adjuvante Completo de Freund AIF: Adjuvante incompleto de Freund Al(OH)3: Hidróxido de Alumínio APCs: células apresentadoras de antígeno AS03: emulsão de óleo em água de tocoferol AS04: Associação dos adjuvantes MPL e BCG: Adjuvante Bacillus Calmette-Guerin CD14: Marcador de superfície celular de monócitos CD19: Marcador de superfície celular de linfócitos B CD3: Marcador de superfície celular de linfócitos T CD4: Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T auxiliares/indutores CD49b: Marcador de superfície celular de células NK CD8: Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T citotóxico/supressores DTH: resposta de hipersensibilidade tardia EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FAD: flavina-adenina dinucleótido FML: Fucose-manose ligante FSC: Forward Scatter/tamanho GLA-SE: Adjuvante Glicopiranosil Lipídio em solução estabilizadora gp63 glicoproteína 63 HBV: Vírus da Hepatite B HE: Hematoxilina-Eosina HPV: Vírus do Papiloma Humano IFN-γ: Interferon Gama IFN-α: Interferon alfa IFN-ω: Interferon ômega Ig: Imunoglobulinas IL: Interleucina iNOS: Inducible Nitric Oxide Synthase LBSap: Antígeno LB e Adjuvante Saponina LBSapSal: Antígeno LB, Adjuvante Saponina e proteínas de glândula de Lutzomyia longipalpis
LE: extrato de promastigota de Leishmania LeIF: fator de iniciação de alongamento em Leishmania LiESAp: Antígeno secretado e excretado de promastigotas de L. infantum LPS: Lipopolissacarídeo MDP: Adjuvante muramyl dipeptídeo MPGA: Montanide Pet Gel A MPL: Monofosforil Lipídio A MPL-SE®: Monofosforil Lipídio A em Solução estabilizadora NaNO2: Nitrito de sódio NK: células Natural Killer NO: Óxido Nítrico NO-2: Nitrito NO-3: Nitrato OVA: Ovalbumina PBMC: Peripheral Blood Mononuclears Cells/ Células Mononucleares do Sangue Periférico PBS: Phosphate Buffer Saline pDC: células dendríticas plasmocitóides PRRs: receptores de reconhecimento padrão Q+BCG: Vacina proteína quimérica associada ao Adjuvante Bacillus Calmette-Guerin QA-21: Fração purificada de saponina QS-21: Fração purificada de saponina R-837: Imiquimod R-848: Resiquimod rHA: glicoproteína recombinante hemaglutinina SE: Solução estabilizadora SMF: sistema mononuclear fagocitário SSC: Side Scatter/granulosidade cellular TGF-β: Fator de transformação do crescimento beta TLRs: receptores Toll-Like TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa Treg: Células T Reguladoras TSA: Proteína antioxidante tiol-específico
1. Introdução
Mathias, F. A. S. Introdução
2
As Leishmanioses são doenças causadas por protozoários pertencentes à ordem
Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (Ross, 1903). Apresentam como
formas evolutivas do parasito promastigotas e paramastigotas no tubo digestivo do inseto vetor e
formas amastigotas, capazes de invadir o sistema mononuclear fagocitário (SMF) do hospedeiro.
A transmissão dessa doença ocorre através da picada de fêmeas hematófagas infectadas dos
gêneros Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo (Lainson & Shaw, 1987).
As Leishmanioses possuem uma apresentação clínica espectral cujos sintomas variam em função
das diferentes manifestações da doença: cutânea, cutaneomucosa, difusa e visceral, de acordo
com a espécie de Leishmania causadora da infecção (WHO, 2010).
A estimativa é de 1,6 milhões de novos casos anualmente, onde cerca de 500.000 são da
forma visceral da doença (90% deles ocorrendo em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e
Sudão) (WHO, 2010). O Brasil é responsável por cerca de 90% dos casos em todo continente
americano (Desjeux, 2004; MS, 2006).
Inicialmente considerada como uma doença tipicamente rural apresentou, a partir da
década de 70, uma mudança desse cenário característico passando também a assumir um perfil
epidemiológico também em ambiente urbano (Alves & Bevilacqua, 2004), tornando-se endêmica
em várias regiões metropolitanas brasileiras na década seguinte (Werneck et al., 2008).
No Brasil, os cães são considerados o principal reservatório doméstico do parasito e
mantenedores do ciclo epidemiológico da doença tanto no ambiente rural quanto no urbano
(Deane & Deane, 1954; Reis et al., 2009). Pesquisas sobre a infecção por L. infantum em cães
sugerem que o controle da leishmaniose visceral humana (LVH) depende de um controle efetivo
da leishmaniose visceral canina (LVC) (Alvar et al., 2004; Dantas-Torres & Brandão-Filho,
2006; Costa, 2008; Reis et al., 2009; Reis et al., 2010). Do ponto de vista epidemiológico, a LVC
é considerada mais importante do que a doença humana, visto que apresenta maior prevalência e
que muitos animais assintomáticos de áreas endêmicas possuem elevado parasitismo cutâneo
(Marzochi et al.,1985; Reis et al., 2006).
Diante disso, o Ministério da Saúde (MS) preconiza um “tripé” de ações para o controle
da LV que consiste no combate ao vetor, eliminação dos cães soropositivos e tratamento
sistemático dos casos humanos. Contudo, em função da crescente mudança na relação homem-
cão na sociedade, onde esses animais fazem “parte” da família, eutanásia de cães soropositivos
muitas vezes sem qualquer sinal clínico da infecção, torna-se cada vez mais questionável e difícil
Mathias, F. A. S. Introdução
3
de se manter no programa de controle, uma vez que o Brasil é o único país do mundo que ainda
pratica a eutanásia de cães soropositivos (Palatnik et al., 2001).
Neste contexto, a imunoprofilaxia surge como uma alternativa promissora para o controle
da infecção. Alguns autores sugerem a aplicação de uma vacina anti-LVC, como uma importante
medida de controle, tanto para reduzir a incidência da infecção canina quanto humana (Marzochi
et al.,1985; Palatnik et al., 2001; Borja-Cabrera., 2002;. Fujiwara et al., 2005; Giunchetti et al.,
2008; Fernandes et al., 2008; Duthie et al., 2012).
No histórico de desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose no Brasil podemos citar:
Leishvacin®, composta por antígenos de promastigotas de L. amazonensis sonicadas, contra a
leishmaniose tegumentar americana (LTA) e que foi produzida pela extinta Biobrás (Mayrink et
al., 1996); Leishmune® produzida pela Fordog que se encontra ainda em testes e vem sendo
utilizada em clínicas veterinárias sob autorização do Ministério da Agricultura e Abastecimento
(Palatnik et al,. 2001) e Leish-Tec® uma vacina com proteína purificada de L. donovani
associada a saponina (Fernandes et al., 2008)
Nesta busca por potenciais vacinas protetoras, nosso grupo de pesquisa desenvolveu duas
vacinas, sendo uma constituída de antígenos heterólogos de L. braziliensis associada à saponina
como adjuvante (LBSap) em processo de transferência de tecnologia para Ouro Fino
Agronegócios e outra vacina que apresenta a associação de proteínas de glândula de Lutzomyia
longipalpis (LBSapSal) (Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Roatt et al., 2012).
Todas as vacinas contra leishmaniose desenvolvidas até hoje, têm como ideal a indução
de uma resposta imune protetora capaz de ativar tanto a imunidade celular quanto a humoral
(Reis et al., 2010). Desse modo, uma vacina efetiva contra a LVC é aquela capaz de induzir uma
resposta celular com aumento de citocinas do tipo 1 pró-inflamatórias como IFN-γ, IL-12 e TNF-
α e a diminuição da produção de citocinas do tipo 2 (imunomoduladoras) como IL-4, IL-10 e
TGF-β e ainda, o aumento da resposta humoral através da produção de IgG1 e IgG2. Além disto,
uma vacina ideal contra LVC também deveria induzir aumento da produção de óxido nítrico
proporcionando aumento da atividade microbicida em macrófagos bem como aumento de
linfócitos T CD4+ e de linfócitos T CD8+ Leishmania-específicos (Reis et al., 2010).
Contudo há muitas dificuldades para alcançar uma vacina ideal. Nesse sentido, há
necessidade do desenvolvimento e aprimoramento de vacinas anti-LVC ou anti leishmaniose
visceral humana (LVH), através da escolha de antígenos e adjuvantes efetivamente capazes de
Mathias, F. A. S. Introdução
4
ativar o sistema imune e direcionar a uma resposta desejada. Neste contexto, nosso grupo de
pesquisa iniciou a busca racional por novos possíveis componentes vacinais capazes de
proporcionar uma resposta mais rápida, efetiva, segura e duradoura.
Dessa forma, Vitoriano-Souza (2012) realizou um estudo cinético da resposta imune local
e sistêmica induzida pelos adjuvantes Saponina, Adjuvante Incompleto de Freund e Monofosforil
Lipídio A isolados ou associados ao antígeno total de Leishmania (Viannia) braziliensis como
componente antigênico da vacina LBSap. A partir dos promissores resultados obtidos nesse
trabalho, o presente estudo buscou dar continuidade a essa linha de pesquisa, contribuindo para o
desenvolvimento de uma plataforma de testes na pré-seleção de adjuvantes vacinais através da
avaliação da resposta imune desencadeada pelos seguintes adjuvantes: Hidróxido de Alumínio,
Adjuvante Completo de Freund, Glicopiranosil Lipídio A, Montanide Pet Gel A e Resiquimod.
Sendo assim, após observar qual tipo de resposta cada adjuvante induz isoladamente, seremos
capazes de fazer uma pré-seleção de futuros candidatos para serem utilizados isolados ou em
associação em novas composições vacinais anti-Leishmania. Em um futuro próximo
pretendemos avaliar a associação de adjuvantes na potencialização da resposta Tipo 1
verificando a capacidade destas associações apresentarem efeitos sinérgicos.
2. Revisão da literatura
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
6
2.1. Adjuvantes vacinais
Adjuvantes (do latim adjuvare = ajuda) são substâncias potencializadoras da resposta
imune capazes de serem utilizadas em combinação com um antígeno específico e produzirem
uma resposta imune mais intensa que o antígeno isoladamente (Ramon, 1926). Tem sido descrito
que a inclusão de um adjuvante na formulação de uma vacina apresenta vários benefícios como
amplificação da resposta imune, tornando-a mais eficaz e duradoura, melhora da memória
imunológica, diminuição da dose do antígeno, além da redução do número de doses,
repercutindo diretamente na queda do custo total na produção dessa vacina (Tritto et al., 2009).
Mais recentemente tem sido proposta, em algumas vacinas, a associação de mais de um
adjuvante visando alcançar o efeito desejado de imunização. Um exemplo recente são as vacinas
contra HPV e HBV comercialmente conhecidas como Cervarix® e Fendrix® (GlaxoSmithKline
Biologicals, Rixensart, Belgium) que consistem na associação dos adjuvantes hidróxido de
alumínio e MPL e fosfato de alumínio e MPL, respectivamente (Kundi, 2007; Schiller et al.,
2012; Garcia-Agudo et al., 2012) já licenciadas para uso em diverso países. Esta estratégia tem
sido usada no desenvolvimento de uma vacina contra malária a partir da associação dos
adjuvantes MPL e QS-21 (fração purificada da saponina) (Otsyula et al., 2013), caracterizando
uma tendência da vacinologia moderna.
Desde a descoberta da capacidade adjuvante dessas substâncias até os dias atuais,
passaram-se mais de 70 anos, sendo que a busca por substâncias capazes de amplificar a resposta
imune a antígenos tem se intensificado cada vez mais (O'hagan, Vaccines adjuvants: preparation
methods and research protocols, 2000), por meio de várias estratégias para melhorar a
imunogenicidade e segurança de candidatos vacinais.
A fase inicial do desenvolvimento dos adjuvantes vacinais foi desencadeada através da
utilização, principalmente, de antígenos atenuados ou mortos como observado na vacinação
contra a varíola realizada por Jenner (Hackett, Vaccine adjuvants: Immunological and Clinical
Principles, 2006). Todavia, o estudo da toxidade mostrou ainda que essas vacinas apresentavam
toxicidade em sua aplicação. Posteriormente, em uma segunda fase, buscando diminuir os efeitos
da toxicidade causados pelas formulações na primeira fase, iniciou-se o estudo com compostos
minerais e emulsões como, por exemplo, sais de alumínio e óleo-água respectivamente (Hackett,
Vaccine adjuvants: Immunological and Clinical Principles, 2006).
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
7
Os sais de alumínio foram utilizados em vacinas humanas em 1920 e são os únicos
adjuvantes licenciados para uso nos Estados Unidos. Por outro lado, na Europa, na última
década, novos adjuvantes foram licenciados para sua utilização em vacinas humanas como
MF59, AS03 contra H5N1 e mais recentemente uma associação entre hidróxido de alumínio
Al(OH)3 e monofosforil lipídio A (MPL) chamado de AS04 utilizado nas vacinas contra HBV
(Fendrix®) e HPV (Cervarix®) (Tritto et al., 2009).
É importante salientar que muitos adjuvantes vacinais conhecidos e utilizados em
diferentes vacinas experimentais foram descobertos empiricamente, e o progresso de
compreensão dos seus mecanismos de ação tem se evoluído lentamente, explicando em parte o
baixo número de adjuvantes aprovados para uso humano (Calabro et al., 2011).
2.2. Associação de antígenos e adjuvantes em diferentes formulações vacinais anti-
Leishmania
As vacinas contra leishmaniose têm ganhado destaque nos últimos anos e tem sido cada
vez mais incentivado o seu uso como medida de controle contra essa doença. Durante essa busca
por novas vacinas, vários antígenos e adjuvantes vacinais foram utilizados, mostrando diferentes
níveis de proteção. Mayrink et al (1996) desenvolveram uma vacina para cães composta por
promastigotas de L. braziliensis associada ao BCG como adjuvante. A vacina foi considerada
segura e sua proteção, após desafio experimental com L. infantum foi de 90% (em um estudo
controlado de Fase II em canil fechado) a partir de esfregaços e de isolamento de parasitos em
cultura, ambos a partir de medula óssea (Mayrink et al., 1996). Molano et al (2003) avaliaram
uma vacina contendo adjuvante BCG, porém este foi associado a proteínas de ácido ribossomal
Lip2a, Lip2b, P0 e histona H2A (vacina quimérica - Q+BCG) e verificaram 50% de proteção nos
cães imunizados. A utilização de uma vacina composta por BCG recombinante expressando a
proteína de superfície de Leishmania gp63 levou a um aumento da resposta imune mediada por
células com uma proteção significante contra o desafio por L. major e L. mexicana em modelo
murino (Connel et al., 1993). Já Streit et al (2000) observaram que a utilização de uma vacina
contendo BCG expressando o antígeno LCR1de L. donovani resultou num aumento da resposta
do tipo 1 com produção aumentada de IFN-γ e redução de IL-10.
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
8
Na França, foi desenvolvida uma vacina composta de antígeno secretado e excretado de
promastigotas de L. infantum (LiESAp). Essa vacina induziu em ensaios in vitro aumento de
IFN-γ e dos níveis de óxido nítrico e, consequentemente, da proliferação de células
mononucleares e, por fim, da atividade leishmanicida por macrófagos ativados (Lemesre et al.,
2005). Este antígeno, (LiESAp) associado ao adjuvante muramyl dipeptídeo (MDP) produziu
aumento dos níveis de óxido nítrico levando ao aumento do efeito leishmanicida (Holzmuller et
al., 2005). Atualmente, esta vacina se encontra no mercado europeu sob o nome comercial de
CaniLeish® sendo produzida pela empresa Virbac na França e consiste na associação
LiESAp/QS-21 (fração purificada da saponina) (Moreno et al., 2012).
Outro adjuvante que foi utilizado no estudo de vacinas anti-Leishmania foi o Montanide
associado aos antígenos: histona de L. infantum (H1), proteína acilada hidrofílica B1 de
superfície de L. donovani (HASPB1), e a associação de ambos. Além disso, nesse estudo foi
utilizado o adjuvante MPL-SE® associado às proteínas TSA (antioxidante tiol-específico),
LmSTI1 (proteína 1 indutora de stress em L. major) e LeIF (fator de iniciação de alongamento
em Leishmania) (MML). A vacina H1 foi a que apresentou os melhores resultados com a
manutenção de baixo parasitismo em cães vacinados (Moreno et al., 2007).
A vacina anti-Leishmania, Leishmune®, foi desenvolvida a partir da preparação
glicoprotéica enriquecida de promastigotas de L. donovani, nomeado FML (fucose-manose
ligante) (Palatnik et al., 1993), antigênica para uso humano (Palatnik et al., 1995) e canino
(Borja-Cabrera et al., 1999), formulada com o adjuvante Quillaja saponaria saponin e passou
por ensaios de Fase I-III tornando-se licenciada no Brasil (Parra et al., 2007; Fort Dodge Saúde
Animal Ltda).
No Brasil, ainda existe outra vacina disponível para comercialização denominada Leish-
Tec® (Hertape Calier Saúde Animal S/A), licenciada no Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA) para uso em cães. Esta vacina emprega a proteína recombinante de
amastigota A2 e o adjuvante saponina. Os resultados revelaram a indução de uma resposta imune
com a presença de IFN-γ, além de não converter os testes sorológicos que utilizam antígenos de
promastigotas, importante na discriminação entre os animais vacinados e infectados (Fernandes
et al., 2008).
Nosso grupo de pesquisa há mais de 20 anos ingressou nessa árdua tarefa de desenvolver
vacinas contra essa doença, e a partir do trabalho desenvolvido por Giunchetti (2007) que
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
9
possibilitou a elaboração de duas vacinas de primeira geração denominadas LBSap, constituída
por extrato de antígenos bruto de L. braziliensis associado ao adjuvante saponina e/ou associada
a saliva de Lutzomyia longipalpis (LBSapSal). Resultados preliminares demonstraram que a
vacina LBSap foi capaz de induzir uma forte atividade imunogênica após o processo vacinal,
particularmente relacionada a expansão de linfócitos T CD8+ circulantes e de linfócitos T CD8+
Leishmania-específicos (Giunchetti et al., 2007) (Quadro 1). Contudo, apesar desses resultados,
acreditamos que nossa tarefa de buscar uma vacina segura e eficaz dependa além do antígeno, da
escolha do adjuvante vacinal para alcançarmos uma resposta imune desejada. Portanto, a pré-
seleção de adjuvantes através da observação dos seus eventos imunológicos em camundongos é
fundamental para futuros testes de imunogenicidade e inocuidade de novas constituições vacinais
anti-Leishmania, podendo também ser aplicados na elaboração de outras vacinas, dependendo
dos resultados obtidos.
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
10
Quadro 1: Principais adjuvantes já empregados em vacinas anti-Leishmania associados a diferentes antígenos vacinais.
Autores/ Ano Adjuvante Antígeno/ Vacina Desafio Modelo Experimental
Mayrink et al., 1996 BCGL. braziliensis/
LeishvaccinL. infantum Cães
Molano et al., 2003 BCG
Lip2a, Lip2b, P0 e
histona H2A/ vacina
quimérica - Q+BCG
L. infantum Cães
Connel et al., 1993 BCG gp63 L. major e L. mexicana Camundongos
Streit et al., 2000
BCG expressando o
antígeno LCR1de L.
donovani
gp63 L. infantum Camundongos
Lemesre et al., 2005
Holzmuller et al, 2005
muramyl dipeptídeo
(MDP)
antígeno secretado e
excretado de
promastigotas de
L .infantum (LiESAp)
L. infantum Cães
Moreno et al., 2007 Montanide e MPL-SEH1, HASPB1, proteínas
TSA, LmSTI1, LeIFL. infantum Cães
Palatnik et al., 1993 SaponinaFML (fucose-manose
ligante)/ Leishmune®L. infantum Cães
Giunchetti et al., 2007 SaponinaL. braziliensis/
LBSapL. infantum Cães
Giunchetti et al., 2007 Saponina
L. Braziliensis
Saliva de Lutzomia
longipalpis/ LBSapSal
L. infantum Cães
Moretno et al., 2012 QA-21 LiESAp L. infantum Cães
2.3. Adjuvantes e ativação do sistema imune
Os adjuvantes podem apresentar comportamentos distintos dependendo da via de inóculo
escolhida para sua administração, do tipo de antígeno associado, assim como dos seus métodos
de preparação, natureza química ou sistema de entrega (dispersão em meio aquoso,
emulsificações ou mesmo encapsulados) (Guy, 2007). De forma geral, os adjuvantes têm seu
papel fundamental na ativação da resposta imune inata através de vários receptores de
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
11
reconhecimento padrão (PRRs) como os diversos receptores Toll-Like (TLRs). No entanto,
podem criar um microambiente celular adequado importante no direcionamento e diferenciação
de uma resposta imune adquirida tanto do Tipo 1 quanto do Tipo 2 (Korsholm et al., 2010).
Dentre os adjuvantes estudados, os sais de alumínio merecem destaque uma vez que estão
presentes na composição das vacinas humanas para tétano, difteria, poliomielite, hepatite A e B
entre outras (Lindblad, 2004). No entanto, muito pouco se sabe sobre os mecanismos de ação
relevantes na indução da resposta imune do tipo 2, com aumento na produção de IL-1, IL-4, IL-
5, IL-13 e IgE (Brewer et al., 1999). Acredita-se que os adjuvantes de alumínio não ativam o
sistema imune através de receptores Toll-like, mas sim por aumentar a estabilidade e
concentração do antígeno no local do inóculo (Schnare & Barton, 2001).
O BCG (Bacillus Calmette-Guerin) é um adjuvante capaz de induzir uma resposta mista,
mas predominantemente do Tipo 1, com produção de citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-12,
entre outras (Wangoo et al., 2000; Luo et al., 2003). Este adjuvante esteve presente em diversas
formulações vacinais contra leishmaniose (Mauel, 2002; Ravindran & Ali, 2004), como
exemplificado anteriormente.
As saponinas são outra classe de adjuvantes pertencentes a um grupo de glicosídeos
triterpenos, obtidos na casa de árvores da espécie Quillaja saponaria, sendo muito utilizadas na
indústria de cosméticos e como fitoterápicos (Cox & Coulter, 1997; Sparg et al., 2004). Pode ser
utilizada nas formas de extrato cru, Quil A (parcialmente purificada) ou QS-21 (forma mais
purificada). Esse adjuvante apresenta um perfil de resposta mista com indução de uma resposta
do Tipo 1 (células TCD8+ e produção de IgG2a) além de uma resposta do Tipo 2 (Liu et al.,
2002).
Outro adjuvante clássico de grande importância é o Adjuvante Completo de Freund
(ACF), composto de bacilos mortos de Mycobacterium tuberculosis e uma emulsão água em
óleo. Amplamente utilizado em modelos experimentais para o estudo de doenças autoimunes
devido a sua grande capacidade imunogênica, ativando o sistema imune com consequente
recrutamento celular e produção de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, sabe-se que tanto
ACF quanto o AIF ativam o sistema imune via TLR-2 (Lim, 2002). A utilização do ACF leva a
uma resposta forte de longa duração com aumento nos níveis de anticorpos antígeno-específico
circulantes, aumento na resposta de linfócitos T, aumento na apresentação e ativação de células
dendríticas, devido aos componentes da parede celular de M. tuberculosis (Tsuji et al., 2000), e
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
12
uma resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) nos linfonodos drenantes, levando até a
formação de úlceras no local do inóculo. Além disso, tem sido demonstrada a formação de
granulomas nos tecidos tanto próximos quanto distantes do local do inóculo (Billiau e Matthys,
2001). Estudos com a utilização do Adjuvante Completo de Freund associado ao colágeno do
tipo II na imunização de camundongos DBA/1 mostraram que esse induz a produção das
citocinas IL-2, IFN-γ e IL-10 (Stasiuk et al., 1996).
Adjuvantes mais modernos também têm sido estudados e propostos na composição de
algumas vacinas. Nessa classe, o adjuvante Glicopiranosil Lipídio (GLA) surge como um
adjuvante sintético derivado de um Lipídio A Hexa-acilado, agonista de TLR4, induzindo uma
resposta do Tipo 1, principalmente a maturação de células dendríticas, com aumento na
expressão das moléculas CD40 e CD86 e concomitantemente a liberação de citocinas pró-
inflamatórias e quimiocinas (TNF-α, IL-6, IL-12p40, MCP-1, CCL5 e CXCL10) responsáveis
pelo tráfego celular (Coler et al., 2011). Esse adjuvante é análogo ao Lipopolissacarídeo (LPS),
todavia não apresenta sua toxicidade, um importante fator na escolha de um bom adjuvante.
Além disso, apesar de tanto o LPS quanto o Monofosforil lipídio A (MPLA) serem capazes de
induzirem uma resposta do Tipo 1, o GLA-SE que consiste na adição de uma emulsão óleo em
água estabilizadora (SE) apresenta uma resposta celular e humoral mais intensa (Pantel et al.,
2012).
Quanto ao seu uso em diferentes composições vacinais, o GLA-SE vem sendo estudado
na composição da vacina Fluzone® contra os vírus da Influenza (H1N1, H3N2) e tem
demonstrado resultados promissores tanto na resposta celular quanto na resposta humoral com a
produção de diversos anticorpos (Coler et al., 2010). Além disso, ele também vem sendo
empregado em associação com a glicoproteína recombinante hemaglutinina (rHA) na formulação
de uma vacina contra a gripe aviária (H5N1), onde observou-se novamente o aumento de uma
resposta do tipo 1 com proliferação de linfócitos TCD4+ produtores de interferons (Clegg et al.,
2012). Lambert e colaboradores (2012) realizaram um estudo em camubdongos comparando o
GLA apenas em emulsão aquosa com GLA-SE e observaram que apesar do último apresentar
uma resposta mais intensa, ambos ativaram TLR4 pelas vias de sinalização dependentes de
MyD88 e TRIF com aumento na expressão de genes para quimiocinas (CXCL9, CXCL10,
CCL2, CCL3 e MCP-1), além de citocinas como TNF-α e IFN-γ no sangue.
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
13
Outro grupo de adjuvantes que vêm sendo estudados são os pertencentes a família
imidazoquinolina como o Imiquimod (R-837) e o Resiquimod (R-848), agonistas de TLR7.
Foram denominados de modificadores da resposta imune e foram descobertos em 1980 (Wu et
al., 2004). Esses adjuvantes são capazes de ativar células dendríticas plasmocitóides (pDC),
principais células produtoras de interferon no sangue como IFN-α e IFN-ω. Além disso, o
Resiquimod estimula as pDC a produzirem outras citocinas como TNF-α e IP-10, aumentando
também expressão de CCR7, marcadores de co-estimulação e a viabilidade dessas células
(Gibson et al., 2002). Ahonen et al também observaram que a utilização do Resiquimod leva a
um aumento da maturação das células dendríticas induzindo a expressão de moléculas de
superfície como CD83, CD80, CD86 e CD40, além da produção de citocinas pró-inflamatórias
(IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-α) e quimiocinas (IL-8, MIP-α, MCP-1), aumentando assim a
proliferação de linfócitos T (Ahonen et al., 1999). Dessa forma, Wagner e Ahonen (1999)
demonstraram que tanto o Imiquimod quanto o Resiquimod são adjuvantes que além de
direcionar para uma resposta imune do tipo 1 com a produção de IFN-γ e ativação de células
TCD4+ e TCD8+, atuam também como moduladores de uma resposta do tipo 2, com inibição na
produção de citocinas IL-4 e IL-5.
Recentemente, o adjuvante polimérico Montanide vem sendo testado para o uso
veterinário. Parker et al. (2009) conduziram um estudo avaliando a eficácia e segurança do
Montanide frente a imunização com diversos compostos antigênicos em vários modelos animais.
Esse adjuvante demonstrou-se seguro e sem reações intensas no local do inóculo (Parker et al,
2009), podendo exercer seu mecanismo de ação através de diversas formas, incluindo a liberação
lenta do antígeno, recrutamento e estimulação de APCs (Aucouturier et al., 2002)
Resultados do trabalho desenvolvido com a vacina contra o vírus da Hepatite C em
camundongos Balb/c utilizando os adjuvantes CpG ODN e Montanide ISA 720 (um adjuvante a
base de óleo e um agente emulsificador da família monoleato de manide) mostraram uma forte
produção de IFN-γ por células TCD4+ e altos títulos de anticorpos, principalmente IgG2a,
direcionando assim para uma resposta predominantemente do tipo 1 mais intensa do que o CpG
ODN separado (Qiu et al., 2008).
Contrário a outros trabalhos, durante a triagem clínica de fase 1 para o desenvolvimento
de uma vacina contra o vírus da AIDS (HIV) com o adjuvante Montanide foi demonstrado um
alto índice de reações inflamatórias de moderadas a intensas, com formação de granulomas em
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
14
alguns casos nos voluntários (Toledo et al., 2001), mostrando assim, que apesar de ser um bom
indutor de uma resposta celular e humoral, apresenta problemas quanto as reações inflamatórias
no local do inóculo.
Dentro desse contexto da seleção de novos adjuvantes para melhorar a composição e
eficácia de vacinas contra leishmaniose, nosso grupo de pesquisa iniciou os estudos nessa área
que culminou no trabalho de Vitoriano-Souza et al., (2012) no qual foram avaliadas a cinética do
recrutamento celular e a produção de citocinas na pele de camundongos sensibilizados com os
adjuvantes vacinais: Saponina, Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) e MPLA. Nesse estudo
foi possível observar que todos os adjuvantes estudados promoveram um recrutamento celular
para o local do inóculo, principalmente de neutrófilos, macrófagos e linfócitos além da produção
de citocinas com o perfil Tipo 1 (IL-2, IL-6, IFN-γ e TNF-α), Tipo 2 (IL-4) e Tipo 17 (IL-17)
(Vitoriano-Souza et al., 2012). Contudo, apresentaram peculiaridades importantes para a pré-
seleção de algum adjuvante para ser associado aos antígenos de Leishmania patenteados pelo
nosso laboratório. Além disso, esses resultados descritivos nos incentivaram a continuar esta
linha de pesquisa, com a análise de outros adjuvantes vacinais visando avaliar os tipos celulares e
o microambiente imune induzidos individualmente por essas substâncias antes de testarmos
diferentes composições vacinais.
2.4. A pele como principal via de imunização
Como uma interface de proteção entre órgãos internos e o meio ambiente, a pele se
depara com uma série de toxinas, organismos patogênicos e estresses físicos. Para combater
esses ataques contra o microambiente cutâneo, a pele funciona mais do que como uma barreira
física, sendo um órgão imunológico ativo. Respostas imunes na pele envolvem um arsenal de
células imunocompetentes e modificadores de resposta imunobiológica, incluindo citocinas
(Salmon et al., 1994).
Dentre as rotas de imunização parenteral, a pele destaca-se por ser um local que funciona
como órgão imune. Além disso, proporciona uma conexão com os capilares linfáticos e veias que
levam até os órgãos periféricos do sistema imune, como os linfonodos (Puri et al., 2000).
A rota intradérmica apresenta a vantagem de entregar o antígeno e fatores para a
maturação das células dendríticas no compartimento que elas residem, tornando mais rápida a
Mathias, F. A. S. Revisão da Literatura
15
apresentação de antígenos e consequentemente migração para o linfonodo drenante (Disis et al.,
1996). Puri e colaboradores demonstraram que a administração intradérmica de microesferas foi
primeiramente distribuída das camadas da derme e da epiderme, que contém inúmeras células
imunes como as células de Langerhans, queratinócitos, melanócitos, linfócitos, leucócitos
migrantes, mastócitos e macrófagos (Puri et al., 2000). Em conjunto, as células da epiderme,
atuam como um reservatório imenso de modificadores da resposta imune. As citocinas
produzidas na epiderme permitem recrutar e ativar uma grande variedade de células
inflamatórias (Salmon et al., 1994; Puri et al., 2000). Muitas destas citocinas são liberadas a
partir da epiderme quando a barreira cutânea é comprometida, seja por trauma direto, infecções
ou toxinas. A liberação local destas citocinas e a absorção sistêmica através do plexo vascular
superficial da derme superior servem como um sinal de início para o sistema imune do
hospedeiro que a barreira externa (pele) foi comprometida (Salmon et al., 1994). Dessa forma,
por ser um órgão imune de fácil acesso, a pele torna-se um local de imunização atrativo para
utilização em protocolos vacinais.
Visto que a escolha do adjuvante é importante no direcionamento da resposta imune
desejada em uma vacina, esse trabalho possui como proposta o estudo da resposta imune inata
induzida pelos adjuvantes vacinais: Adjuvante Completo de Freund (ACF), Resiquimod (R-848),
Glicopiranosil lipídio A (GLA-SE®), Hidróxido de Alumínio (Al(OH)3) e Montanide Pet Gel A
(MPGA). Deste modo, buscando avaliar possíveis alterações no perfil de células sanguíneas após
os diferentes tempos foi realizado leucograma do sangue e a contagem diferencial em esfregaços
sanguíneos. Além disto, fragmentos de pele foram coletados para confecção de lâminas e
subsequente análise histopatológica. Também foram avaliados os níveis de óxido nítrico sérico.
Esses dados contribuirão para o entendimento dos mecanismos inflamatórios da resposta imune
inata importante para o direcionamento da resposta imune adaptativa.
3. Justificativa
Mathias, F. A. S. Justificativa
17
Apesar de serem utilizados há mais de setenta anos em composições vacinais, ainda são
poucos os adjuvantes licenciados para o uso humano pelos órgãos reguladores, devido
principalmente ao fato de que em sua maioria foram descobertos de forma empírica e seus
mecanismos de ação ainda são pouco compreendidos e explorados. Além disto, ainda são
escassos os ensaios pré-clínicos e clínicos que determinam o grau de tolerância, inocuidade e
toxicidade dos adjuvantes.
Considerando essa escassez de estudos referentes aos mecanismos imunes induzidos por
adjuvantes, é de fundamental importância a compreensão sobre os processos pelos quais esses
atuam na ativação da resposta imune. Deste modo, torna-se relevante a observação dos eventos
de migração celular no local do inóculo através da análise do perfil celular induzido pelos
adjuvantes, essenciais na composição e no desenvolvimento de um microambiente imune. O
entendimento desses eventos auxiliará na compreensão desse microambiente que está
intimamente relacionado ao recrutamento celular e aumento da apresentação de antígenos
importantes na formação e direcionamento da resposta imune adaptativa, que dependendo do
adjuvante utilizado poderá apresentar um perfil do Tipo 1, Tipo 2 ou uma resposta mista. Sendo
assim, o presente estudo buscou elucidar, não só o envolvimento desses mecanismos, mas
também a busca racional através do rastreamento das ações dos adjuvantes no contexto in vivo e
ex vivo em aplicações vacinais por meio de ensaios pré-clínicos que permitirão seu futuro uso em
protocolos imunoterapêuticos.
4. Objetivos
Mathias, F. A. S. Objetivos
19
4.1. Objetivo Geral
Avaliar a cinética da resposta imune inata induzida por diferentes adjuvantes vacinais em modelo
murino.
4.2. Objetivos Específicos
Nos intervalos de 1, 12, 24, 48, 96, 168 e 336 horas após a sensibilização com os adjuvantes
vacinais:
• Quantificar e diferenciar as populações de leucócitos no sangue periférico;
• Analisar o perfil fenotípico das células mononucleares no sangue periférico: Linfócitos T
CD3+ (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e monócitos (CD14+);
• Quantificar os níveis de óxido nítrico (NO) sérico;
• Determinar as alterações histológicas na pele.
5. Material e Métodos
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
21
5.1. Animais e grupos experimentais
Para realização deste estudo, foram utilizados 210 camundongos machos Mus musculus
albinos da linhagem Swiss com aproximadamente um mês de idade. Os animais utilizados nesse
trabalho foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro
Preto (UFOP). Durante os experimentos, os animais foram acondicionados em gaiolas
apropriadas e oferecidos água e ração comercial ad libitum, diariamente.
Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
Federal de Ouro Preto/UFOP registrado sob o parecer N° 2011/26. Todos os procedimentos
foram realizados de acordo com os princípios éticos preconizados pelo COBEA (Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal).
No Fluxograma 1 encontra-se o delineamento experimental deste estudo. Os animais
foram inoculados pela via intradérmica na região dorsal com diferentes adjuvantes vacinais em
dose única e avaliados após 1, 12, 24, 48, 96, 168 e 336 horas. Os animais foram distribuídos em
seis grupos experimentais (n=5 por grupo/hora), além de um grupo controle inoculado com
solução salina estéril 0,9% por via intradérmica, conforme descrito abaixo.
Grupo CS (Controle Salina): inoculado com 50μL de solução salina estéril 0,9% (controle
salina);
Grupo ACF (Adjuvante Completo de Freund): inoculado com 50μL do adjuvante completo
de Freund (Sigma Chemical CO, St Louis, USA);
Grupo MPGA (Montanide Pet Gel A): inoculado com 50μL do adjuvante Montanide Pet Gel
A® (Seppic, Paris, França) ;
Grupo GLA-SE: inoculado com 50μL do adjuvante Glicopiranosil Lipídio A (Alexis
Biochemicals, San Diego, USA) (emulsão estável -GLA-SE) na concentração de 50μg por dose;
Grupo Al(OH)3: inoculado com 50μL do adjuvante Hidróxido de Alumínio (Sigma-Aldrich Co
St. Louis, MO, USA) na concentração de 180μg por dose;
Grupo Resiquimod (R-848): inoculado com 50μL do adjuvante Resiquimod (Sigma Chemical
CO, St Louis, USA) na concentração de 25μg por dose.
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
22
As doses inoculadas de cada adjuvante tiveram volume final estabelecido em 50μL, dose
recomendada para o modelo murino utilizando a via intradérmica para imunização, em
conformidade com o estabelecido pelo Guidelines for the Research Use of Adjuvants of Animal
Care na Use Staff (http://oacu.od.nih.gov/ARAC/freunds.pdf). As concentrações utilizadas dos
adjuvantes foram fundamentadas de acordo com trabalhos da literatura.
Para a coleta de sangue, os animais foram anestesiados pela administração intraperitoneal
de tiopental sódico 2,5% diluído conforme instrução do fabricante (Tiopentax – Cristalia®,São
Paulo, Brasil, 30mg/Kg). Posteriormente, os animais receberam uma dose letal do anestésico e
foram necropsiados para obtenção dos fragmentos de pele do local do inóculo.
Al(OH)3CS ACF GLA-SE MPGA R-848
210 camundongos Swiss
1 12 24 48 96 168 336 Horas
Coleta de Sangue
Contagem Global de Leucócitos
Contagem Diferencialde Leucócitos Ex vivo
Dosagem NO séricoImunofenotipagem de células sanguíneas
Necropsia
Pele
Histopatologia (HE)
Figura 1: Delineamento experimental
5.2. Parâmetros Avaliados
5.2.1. Parâmetros Hematológicos
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
23
A coleta de sangue foi realizada com o anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-
acético) pelo plexo orbital com auxílio de uma pipeta, onde 50mL do sangue foram processados,
para a realização do hemograma no aparelho Auto Hematology Analyzer (Mindray BC-2800Vet,
Hamburgo, Alemanha). Dentre os parâmetros do hemograma, decidiu-se avaliar apenas a global
de leucócitos (leucograma) determinado em número de leucócitos/mm3, pois não houve
alterações significativas em relação à série vermelha do sangue. A contagem diferencial de
células foi realizada utilizando aproximadamente 10ml de sangue para a confecção de esfregaços
sanguíneos corados com o corante Panótico Rápido InstantProv (Newprov®, Pinhais, Brasil) e
avaliada por microscopia óptica em objetiva de imersão. Desta forma, foi determinado o
percentual de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos, por meio da contagem de 100
leucócitos/lâmina. Cerca de 200μL de sangue coletado em EDTA foi utilizado para a realização
da imunofenotipagem das células mononucleares do sangue periférico, conforme será descrito
mais adiante.
Coletou-se também sangue em um tubo sem anticoagulante, centrifugado a 10000xg por 10
minutos para obtenção das amostras de soro para as análises de óxido nítrico (NO).
5.2.3. Dosagem de óxido nítrico no soro
A dosagem de óxido nítrico foi realizada de modo indireto no soro de camundongos
(Green & Wagner, 1982), onde foram detectados os níveis de nitrito (NO2-) e nitrato (NO3
-).
Alíquotas de 50mL foram previamente descongeladas e transferidas para tubos de 500mL
para serem diluídas em 50mL de água destilada. Para a conversão de nitratos a nitritos, foram
adicionados às amostras 30mL de um coquetel contendo 10mL de FAD (flavina-adenina
dinucleótido) (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA), 10mL de NADPH (Fosfato de
dinucleótido de nicotinamida e adenina) (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA) e 10mL de
Nitrato redutase (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA). As amostras foram incubadas
overnight a temperatura de 37ºC. Após o tempo de incubação foi realizado o processo de
desproteinização através da adição de 10mL de Sulfato de Zinco (ZnSO4) (Sigma-Aldrich Co St.
Louis, MO, USA) seguido por cinco minutos de centrifugação a 5000 rpm. Após essa etapa
foram adicionadas a placas de 96 poços, 50mL das amostras preparadas e 50mL da solução de
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
24
Griess, em duplicata, incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente. O reagente foi
preparado na hora do uso, misturando partes iguais de duas soluções A e B na proporção de 1:1.
A Solução A era composta de Sulfanilamida 1% em H3PO4 2,5% e a solução B composta por
Naftilenadiamino 0,7%. As leituras foram realizadas no leitor de ELISA (Molecular Devices, E
Max, Berkeley, Califórnia, USA) a 540nm. Os resultados expressos em mM foram determinados
após a extrapolação de valores obtidos de uma curva padrão utilizando nitrito de sódio (NaNO2)
nas concentrações de 0,78 a 100mM para cada placa.
5.2.4. Imunofenotipagem do sangue periférico
O perfil imunofenotípico das populações e subpopulações de células do sangue periférico
de camundongos foi avaliado por citometria de fluxo. Anti-CD3 (PE Hamster anti-Mouse CD3,
clone 145-2C11, Biolegend), anti-CD4 (PercP-CyTM 5.5 Rat anti-Mouse CD4, clone RM4-5,
BD PharmingenTM), anti-CD8 (FITC Rat anti-Mouse CD8a, clone 5H10, Catalg), anti-CD14
(FITC Rat anti-Mouse CD14, clone Sa2-8, eBioscience), anti-CD19 (FITC Rat anti-Mouse
CD19, clone 6D5, Catalg) e anti-CD49b (FITC Rat Anti-Mouse CD49b, clone DX5, BD
PharmingenTM) foram os anticorpos monoclonais utilizados nesse experimento.
Para a realização desta metodologia, foram colocados 5μL do anticorpo monoclonal
previamente diluído em PBS estéril e 10% de soro de rato, seguido pela adição de 25μL de
sangue periférico total coletado em EDTA (Sigma-Aldrich Co St. Louis, MO, USA) em cada
tubo. Estas amostras foram homogeneizadas em vórtex e incubadas por 30 minutos à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz. Após o período de incubação, as amostras foram submetidas à lise
dos eritrócitos, adicionando-se 2mL de solução de lise (Facs lysing solution - Becton Dickinson,
San Jose, EUA) em constante homogeneização em vórtex, incubadas por 10 minutos a
temperatura ambiente e então submetidas à centrifugação (600xg por 7 minutos a 18°C). O
sobrenadante foi descartado e iniciou-se a etapa de lavagem dos leucócitos com 3mL de PBS-
Wash (pH 7,4), empregando-se as mesmas condições de centrifugação anteriormente citadas.
Na etapa final, os leucócitos foram fixados com 200μL de solução fixadora (10g/L de
paraformaldeído, 1 % de cacodilato de sódio, 6,67g/L de cloreto de sódio, pH 7,2) e os
parâmetros fenotípicos e morfométricos das células presentes em cada tubo foram determinados
no citômetro de fluxo (FACScalibur® Becton Dickinson, Moutain View, CA, USA). Um total de
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
25
15.000 eventos foi lido para cada amostra. O programa CELLQuest® (Franklin Lakes, NJ, USA)
foi utilizado para a aquisição dos dados. O programa Flow Jo (Flow Cytometry Analysis
Software 7.6, Tree Star, Inc. Ashland, USA) foi utilizado para análise de dados. Ligações
inespecíficas foram monitoradas através de isotipos marcados com fluorocromos combinados
para fornecer controles negativos confiantes. Houve monitoração da autofluorescência através de
um controle negativo de suspensão de células incubadas na ausência de anticorpos marcados
com fluorocromos, mas na presença de tampões de diluição e de lavagem.
5.2.5. Análise fenotípica de células do sangue periférico
A análise da frequência de células mononucleares foi realizada de acordo com o fenótipo
selecionado. A avaliação das células NK e linfócitos T e B foi realizada através de análise
convencional, onde a população celular de interesse (R1) (Figura 1A) foi estabelecida para
linfócitos em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC).
Após a seleção da região de interesse, a frequência de populações celulares, dentro de R1, foi
obtida em gráficos bidimensionais de distribuição pontual de fluorescência (Figura 1B).
A análise de monócitos CD14+ foi realizada a partir da construção de gráficos de
fluorescência FL1/anti-CD-14 FITC versus granulosidade (SSC) (Figura 1C).
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
26
Figura 2: Análise da frequência de células NK, linfócitos T e B e monócitos CD14+. (A) Gráfico de distribuição pontual tamanho versus granulosidade utilizado para a seleção da população de linfócitos – R1. (B) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual de células T CD8+ e linfócitos em R1. (C) Gráfico de distribuição pontual FL1 versus granulosidade utilizado para quantificar o percentual de monócitos CD14+.
5.2.6. Processamento e avaliação histológica da pele
As biopsias foram realizadas na sala de procedimento do Centro de Ciência Animal da
Universidade Federal de Ouro Preto, onde foram retirados fragmentos de pele previamente
demarcados que indicavam o local do inóculo dos diferentes adjuvantes (CS, Al(OH)3 ACF,
Montanide Pet Gel A, GLA-SE e Resiquimod). O material coletado foi dividido de forma
simétrica em duas amostras, sendo uma congelada em freezer -80ºC para análises imunológicas e
1K
800
600
400
200
00 200 400 600 800 1K
Gra
nulo
sida
de
Tamanho
A
100 101 102 103 104
CD8 - FITC
100
101
102
103
104
CD
3 -P
E
B
1K
800
600
400
200
0
Gra
nulo
sida
de
100 101 102 103 104
CD14 - FITC
C
1K
800
600
400
200
00 200 400 600 800 1K
Gra
nulo
sida
de
Tamanho
A
100 101 102 103 104
CD8 - FITC
100
101
102
103
104
CD
3 -P
E
B
1K
800
600
400
200
0
Gra
nulo
sida
de
100 101 102 103 104
CD14 - FITC
1K
800
600
400
200
0
Gra
nulo
sida
de
100 101 102 103 104
CD14 - FITC
C
Mathias, F. A. S. Material e Métodos
27
a outra fixada em formol 10% tamponado, e posteriormente, processada no histotécnico (OM
CM 69, Metal. OMA LTDA, São Paulo, Brasil) e incluída em parafina. Estes procedimentos
operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas (LIMP/NUPEB/UFOP).
Após o processamento histológico, o material foi cortado em micrótomo (5 mm) para a
obtenção de uma fita de tecido que foi depositada sobre uma lâmina de vidro e corada pelo
método de Hematoxilina/Eosina (HE) para avaliação das alterações histopatológicas, bem como
para quantificação do infiltrado inflamatório.
As células inflamatórias presentes na derme/epiderme foram quantificadas em 20
imagens aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 mm2). As imagens visualizadas pela
objetiva de 40x foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM5000B acoplada ao
microscópio Leica e do programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1 Leica Microsystems-
Switzerland-Ltd). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado programa Leica QWin V3
(Leica Microsystems-Switzerland-Ltd). A escolha pela análise em 20 imagens foi devido a um
estudo prévio no laboratório onde foi realizada uma curva de estabilidade avaliando o número
necessário de campos que deveriam ser obtidos para que assim pudesse ser representativo do
todo.
5.2.7. Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prisma 5.0
(Prism Software, Irvine, CA, USA). Para a confirmação da normalidade dos dados foi utilizado o
teste Kolmogorov-Smirnoff. Posteriormente foi realizada a análise de variância (ANOVA one-
way) seguido do teste de Turkey para determinar as diferenças específicas entre os grupos em
relação ao infiltrado celular na pele, contagem diferencial e global de leucócitos no sangue
periférico e níveis de óxido nítrico no soro. Em todas as análises estatísticas as diferenças foram
consideradas significativas quando o valor de P<0,05.
6. Resultados
Mathias, F. A. S. Resultados
29
Os resultados obtidos nesse trabalho serão descritos inicialmente através de uma
abordagem longitudinal, ou seja, serão mostradas diferenças significativas obtidas dentro do
mesmo grupo experimental ao longo dos tempos da cinética. Posteriormente, será apresentada
uma análise comparativa dos grupos sensibilizados com os adjuvantes em relação ao grupo
controle.
6.1. Cinética de leucócitos do sangue periférico em camundongos sensibilizados com os
adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848)
Devido à capacidade de adjuvantes ativarem a resposta imune inata levando ao
recrutamento celular, decidiu-se avaliar o impacto gerado tanto na população de leucócitos totais
circulantes quanto nas distintas subpopulações (neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos)
durante a cinética (1h, 12h, 24h, 48h, 96h, 168h e 336h) após o inóculo com os diferentes
adjuvantes (Hidróxido de Alumínio - Al(OH)3, Adjuvante completo de Freund - ACF,
Montanide Pet Gel A-MPGA, Glicopiranosil Lipídio A-GLA-SE e Resiquimod - R-848).
Na análise longitudinal foi observado no grupo MPGA um aumento significativo de
leucócitos totais circulantes em 48h. Já nos grupos GLA-SE, R-848 e Al(OH)3 observou-se um
aumento mais tardio no tempo de 96h e no grupo ACF em 336h (Tabela 1). Quando os
adjuvantes foram comparados com o grupo controle ao longo da cinética observou-se nos grupos
GLA-SE e R-848 aumento significativo de leucócitos totais nos tempos de 48h e 96h, enquanto
no grupo MPGA aumento em 48h e no grupo Al(OH)3 foi observado aumento em 96h (Tabela
1).
Mathias, F. A. S. Resultados
30
Tabela 1: Avaliação longitudinal de leucócitos totais circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h
CS 2825±505,8 2980±766,2 2580±1078 2460±926,3 2540±1071 3420±1013 4040±1667
Al(OH)3 2280±788,7 2960±1403 2760±433,6 3220±1394 5740±867,8 5880±1535 3000±2166
ACF 2540±705,7 2800±620,5 3080±622,1 3500±547,7 2920±630,1 3360±1148 4560±1165
MPGA 1960±687,7 2080±719 3280±1599 4260±907,2 3520±1052 4120±1621 3900±935,4
GLA-SE 2920±1188 4860±2198 3500±1239 4520±1487 7260±1415 4950±1725 5500±761,6
R-848 2400±1056 2580±1057 3420±759,6 4760±1917 4940±1696 3860±929 5680±955
a,b,e
*
*
a,c *
a* a,b
a,b,c * a,b,c,d
a*
Após a análise de leucócitos totais circulantes foi avaliado os valores absolutos nas
populações de neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos.
A avaliação da cinética da população de neutrófilos circulantes mostrou aumento
significativo no período mais tardio de 336h no grupo ACF, enquanto que no grupo Al(OH)3
observou-se aumento nos tempos de 96h e 168h. Já o grupo estimulado com o adjuvante GLA-
SE apresentou um aumento dessa população inicialmente no tempo de 12h (Tabela 2). Na
comparação com o grupo controle, observou-se que os grupos GLA-SE e R-848 apresentaram
aumento significativo a partir de 12h que seguiu até os tempos tardios de 96h e 168h,
respectivamente. Além disso, nos grupos Al(OH)3 e MPGA observaram-se diferenças nos
tempos tardios de 96h e 168h, respectivamente (Tabela 2).
Mathias, F. A. S. Resultados
31
Tabela 2: Avaliação longitudinal da população de neutrófilos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h
CS 728,3±123,6 432,8±130,4 537,6±211,3 487±131,3 563,6±192,1 653±272,7 1132±392,6
Al(OH)3 517,6±236,8 686,2±476,8 677±101 722,4±307,6 1784±394,2 1613±649,4 271,7±214,7
ACF 543,2±92,71 623,6±299,7 662,4±231,5 787,8±241,9 617,6±75,33 714,6±284,3 1330±633,1
MPGA 566,4±319,5 793±283,7 1195±656,1 1065±378,8 719,8±212,7 1350±491,2 1170±483,2
GLA-SE 787,2±400,9 3562±1801 1210±283,9 1698±751,6 2582±932,1 1834±1028 1438±444,9
R-848 642±329,7 1089±483,1 963,8±109,5 1215±390 1173±400,6 1176±358,1 1152±214,8
a,b,c,d,g * a,b,c,d,g
b,c,d,e
a,b,c,e
a,c,g *
* *
* *
* *
*
*
*
Em relação à população de eosinófilos, observou-se nos grupos GLA-SE e Al(OH)3
aumento no tempo de 96h e no grupo MPGA aumento em 168h. Quando foi realizada a
comparação com o grupo controle apenas o grupo GLA-SE apresentou aumento significativo no
tempo de 96h (Tabela 3).
Mathias, F. A. S. Resultados
32
Tabela 3: Avaliação longitudinal da população de eosinófilos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848) . Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h
CS 49,75±18,15 37,60±23,29 42,60±26,49 32,40±25,90 26±11,14 45,80±14,50 43,33±23,07
Al(OH)3 26,60±9,91 45,20±34,20 57,20±33,24 23±2,64 106,8±56,51 55,50±15,55 33,33±17,39
ACF 42,80±17,87 53,60±27,52 28,75±4,85 34,25±6,02 35±14,32 42,20±26,53 45,60±11,65
MPGA 24,40±8,44 20,80±7,19 27,75±13,07 40±8,04 35,20±10,52 48,20±19,98 35±3,16
GLA-SE 39,20±23,16 48,60±21,98 26,33±4,04 48,75±13,12 255±91,64 49,50±17,25 67,25±21,50
R-848 39,80±9,23 38,20±32,28 28,67±0,57 52,50±31,14 49,40±16,96 56±17,31 53,25±6,13
a,d
a,b
a,b,c,d,f,g *
A análise da população de monócitos circulantes, evidenciou que os grupos R-848 e
GLA-SE apresentaram aumento desta população em 48h, sendo que no grupo GLA-SE este
aumento se manteve até o fim da cinética. No grupo Al(OH)3 houve aumento significativo em
96h e 168h e nos grupos ACF e MPGA no tempo de 336h. Na comparação com o grupo controle
observou-se que no tempo de 1h os grupos ACF e Al(OH)3 apresentaram redução significativa,
seguido de aumento no tempo de 96h. Já nos grupos R-848 e GLA-SE se observou aumento no
tempo de 48h, sendo que o último também apresentou aumento no tempo de 336h (Tabela 4).
Mathias, F. A. S. Resultados
33
Tabela 4: Avaliação longitudinal da população de monócitos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h
CS 132,7±32,88 86,60±38,78 86,25±31,12 88,40±48,71 135,8±36,54 121,5±63,69 94±55,44
Al(OH)3 57,60±16,68 136,6±52,97 109,5±37,65 140,6±60,67 285,8±53,30 231,4±56,88 111±89,84
ACF 93,40±45,85 138,3±38,46 97,50±17,06 77,40±30,62 51,60±22,73 84,40±66,87 240,6±85,18
MPGA 82,75±38,69 44,80±33 39,60±22,52 71,20±21,51 47±31,59 83±40,63 151,3±35,70
GLA-SE 59,40±21,76 119,5±88,15 78,40±42,70 195±67,15 274,3±67,74 251±81,50 242±31,08
R-848 99,20±25,96 118±46,80 142,4±65,23 231,8±103,3 224±110,1 167,3±55,23 165,8±46,80
a,b,c,d,g * a,c
a,c,d,e,f *
b,c,d,e
a * a,b,c a,c a,c *
*
*
*
a *
A análise longitudinal da população de linfócitos mostrou aumento no grupo R-848 em
48h, 96h e 336h enquanto que nos grupos GLA-SE e Al(OH)3 apresentaram aumento a partir do
tempo de 96h. Em relação às análises comparativas entre os diferentes adjuvantes e o grupo
controle foi observado uma redução significativa em 12h nos grupos GLA-SE e ACF., sendo que
no grupo GLA-SE observou-se aumento posteriormente em 96h e no grupo ACF houve aumento
em 48h. Já o grupo MPGA mostrou aumento em 48h enquanto os grupos R-848 e Al(OH)3 em
96h apenas (Tabela 5).
Mathias, F. A. S. Resultados
34
Tabela 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos circulantes no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle no mesmo tempo. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
1h 12h 24h 48h 96h 168h 336h
CS 1942±468,3 2423±613,8 1889±910,6 1739±592,9 1784±817,5 2619±837,6 2880±1115
Al(OH)3 1678±628,2 2092±899,5 1942±399,3 2280±937,8 3564±554,9 3948±854,4 1585±1415
ACF 1861±617,2 2007±486,2 2273±365,4 2585±320,7 2216±673,2 2519±831,7 2943±543,4
MPGA 1300±348,1 1249±395,7 2002±1003 3071±596,6 2700±851,5 2638±1148 2551±570,7
GLA-SE 2034±827,4 1149±465,3 2117±862,7 2564±1024 4227±539,5 2858±716,8 3753±405,6
R-848 1247±288,8 1344±580,2 2237±542,7 3225±1445 3689±1085 2479±563,2 4277±853
a,b,c,d * b a,b,c
a,g * a,b,c,g
a,b a,b * a,b,c,f
*
*
*
*
6.2. Análise do perfil fenotípico das células mononucleares no sangue periférico:
Subpopulação de Linfócitos T (CD4+ e CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e
monócitos (CD14+) em camundongos imunizados com diferentes adjuvantes vacinais
(Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848).
Após observar que os adjuvantes induziram alterações nas populações de leucócitos
circulantes, decidiu-se realizar uma análise imunofenotípica a fim de caracterizar melhor quais
subpopulações celulares estavam aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (1h, 12h, 24h,
48h, 96h, 168h e 336h). Os resultados encontram-se representados em gráficos de linhas nas
Figuras 2, 3, 4, 5 e 6 que estarão representando as subpopulações de linfócitos T (CD4+), T
(CD8+), linfócitos B (CD19+), células NK (CD49b+) e monócitos (CD14+), respectivamente.
Mathias, F. A. S. Resultados
35
Ao avaliar a subpopulação de linfócitos T CD4+ foi possível observar que o grupo ACF
induziu redução no percentual dessas células no sangue já no tempo inicial de 12h, enquanto que
no grupo GLA-SE e R-848 observou-se redução dessa população em 24h. Ainda no grupo R-848
observou-se redução também em 48h. Já o grupo MPGA apresentou redução no período tardio
(96h) (Figura 3).
Na análise comparativa dos adjuvantes com o grupo controle, notou-se que no tempo de
12h, o grupo ACF apresentou redução significativa de linfócitos CD4+ enquanto que o grupo
GLA-SE demonstrou aumento (p<0,05) no mesmo tempo. Além disso, o grupo R-848 mostrou
redução significativa em relação ao grupo controle no tempo de 48h. O grupo MPGA apresentou
redução dessa população no tempo de 96h enquanto que o grupo Al(OH)3 demonstrou aumento
no mesmo tempo (Figura 3).
Mathias, F. A. S. Resultados
36
Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848
0
40
80
0
40
80
0
40
80
1 12 24 48 96 168
336
0
40
80
1 12 24 48 96 168
336
0
40
80
d
d d
*
*
*
*
**
*
*
Perc
entu
al d
e Li
nfóc
itos T
CD
4+ (%
)
Tempo (horas)
a,c,f,g
a,c,f,g
a,b,c
a,b b b ba,b
a
a,b
a
Figura 3: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD4+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
A subpopulação de linfócitos T CD8+ também foi avaliada neste estudo. Na análise
longitudinal, o grupo R-848 apresentou redução significativa (p<0,05) no tempo de 12h. No
grupo MPGA houve redução de linfócitos T CD8+ a partir de 24h. Por fim, apenas no último
tempo da cinética (336h) o grupo GLA-SE apresentou redução em relação ao seu tempo inicial
(1h).
Mathias, F. A. S. Resultados
37
Em relação às análises comparativas, no tempo de 24h observou-se no grupo GLA-SE
aumento significativo em relação ao controle. Já o grupo MPGA apresentou redução
significativa em 96h enquanto que o grupo R-848 demonstrou aumento no mesmo tempo (Figura
4).
Mathias, F. A. S. Resultados
38
0
20
40
0
20
40
0
20
40
1 12 24 48 96 168
336
0
20
40
1 12 24 48 96 168
336
0
20
40
Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848
a a
a,ba
a
a
aa
a,d a,d
d
Perc
entu
al d
e Li
nfóc
itos T
CD
8+ (%
)
Tempo (horas)
**
*
Figura 4: Avaliação longitudinal da população de linfócitos T CD8+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Após as avaliações em relação às subpopulações de linfócitos T, realizaram-se as análises
da população de linfócitos B CD19+. Os grupos GLA-SE e Al(OH)3 apresentaram aumento
Mathias, F. A. S. Resultados
39
significativo (p<0,05) de linfócitos B a partir do tempo de 24h, sendo que o primeiro durou até o
final da cinética enquanto que o segundo se manteve até 48h. O grupo ACF mostrou aumento
dessa subpopulação em 24h enquanto que o grupo MPGA o aumento foi observado nos tempos
de 48h e 96h. Já o grupo R-848 apresentou uma redução inicial (12h) dessa população. (Figura
5).
Ao comparar os grupos que receberam os diferentes adjuvantes vacinais com o grupo
controle, observou-se que já no tempo de 12h o grupo R-848 mostrou redução significativa,
enquanto que o grupo ACF apresentou redução em 24h com posterior aumento em 48h. Além
disso, o grupo GLA-SE mostrou aumento no tempo de 48h quando comparado ao grupo
controle, assim como o grupo Al(OH)3 que também apresentou no tempo mais tardio de 336h
(Figura 5).
Mathias, F. A. S. Resultados
40
0
50
100
0
50
100
0
50
100
1 12 24 48 96 168
336
0
50
100
1 12 24 48 96 168
336
0
50
100
Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848
d,e,fb b
a,b a,b a,ba,b a,b
b b
a b
b
bb
b
*
*
*
**
*
*
**Pe
rcen
tual
de
Linf
ócito
s BC
D19
+ (%
)
Tempo (horas)
Figura 5: Avaliação longitudinal da população de linfócitos B CD19+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Após as análises das populações e subpopulações de linfócitos (T e B) foi realizada a
imunofenotipagem da população de células natural killer (NK) CD49b+. Durante as análises
Mathias, F. A. S. Resultados
41
longitudinais foi evidenciado no grupo Al(OH)3 uma redução dessa população nos tempos de
24h 96h e 168h (Figura 6). Além disso, o grupo R-848 mostrou aumento no tempo de 1 hora.
Por outro lado, o grupo ACF apresentou redução tardia dessa população no tempo de 96h
enquanto os grupos MPGA e GLA-SE apresentaram comportamentos similares, com aumento da
população de células NK no tempo de 168h.
Nas análises comparativas entre os grupos imunizados com diferentes adjuvantes e o
grupo controle, com exceção dos grupos ACF e Al(OH)3, todos os outros grupos apresentaram
diferenças significativas (p<0,05) no tempo de 1h. O grupo Al(OH)3 apresentou aumento no
tempo inicial de 12h seguido de uma redução no tempo de 24h que persistiu até o tempo tardio
de 168h. Já o grupo GLA-SE mostrou níveis percentuais menores de células NK durante toda
cinética avaliada com diferenças significativas em relação ao controle também nos tempos de 1,
12 e 96h. Os animais sensibilizados com o adjuvante MPGA apresentaram reduções também nos
tempos de 1, 24, 48 e 96 horas quando comparado ao controle, enquanto que os que foram
sensibilizados com o grupo R-848, após o aumento no tempo de 1h, apresentaram redução no
tempo inicial de 24h. Por fim, o grupo ACF apresentou também redução significativa em relação
ao controle no tempo de 168h (Figura 6).
Mathias, F. A. S. Resultados
42
0
4060
80
0
20
4060
80
0
4060
80
1 12 24 48 96 168
336
0
4060
80
1 12 24 48 96 168
336
0
40
80
Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848
a,f
b
a,ba,b
a
a aa,c a,c a a
*
*
*
*
* *
*
*
*
**
*
*
*
*
Perc
entu
al d
e cé
lula
s NK
CD
49b+ (
%)
Tempo (horas)
Figura 6: Avaliação longitudinal da população de células NK CD49b+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados são expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
No presente estudo também foi avaliada a população de monócitos CD14+ circulantes.
Na análise longitudinal observou-se que os grupos ACF e R-848 mostraram aumento inicial no
tempo de 12h, enquanto que o grupo Al(OH)3 mostrou esse aumento no tempo de 24h e 96h. Já
Mathias, F. A. S. Resultados
43
o grupo GLA-SE mostrou aumento da população de monócitos no tempo de 48h que seguiu até
168h. Além disso, o grupo MPGA mostrou aumento mais tardio no tempo de 96h.
Quando foi realizada a comparação entre os grupos que foram sensibilizados com
diferentes adjuvantes com o grupo controle, observou-se já no tempo de 1h que o grupo R-848
apresentava diferença significativa. O grupo GLA-SE apresentou redução no tempo de 24h com
posterior aumento em 96 horas enquanto que o grupo R-848 demonstrou aumento em relação ao
controle nos tempo de 12h e 168h. Além disso, os animais sensibilizados com o adjuvante
MPGA apresentaram redução nos tempos de 24 e 48, seguido por aumento em 96 horas. No
grupo Al(OH)3 observou-se aumento significativo nos tempos de 24, 96 e 168 horas (Figura 7).
Mathias, F. A. S. Resultados
44
0
30
60
0
30
60
0
30
60
1 12 24 48 96 168
336
0
30
60
1 12 24 48 96 168
336
0
30
60
Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848
aa b,c,d c,d
a,c a,ca,b,ca a,b
a,b a,bb
b
aa
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
Perc
entu
al d
e M
onóc
itos C
D14
+ (%
)
Tempo (horas)
c,d
Figura 7: Avaliação longitudinal da população de monócitos CD14+ no sangue periférico de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores percentuais ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Mathias, F. A. S. Resultados
45
6.3. Análise dos níveis de Nitrato (NO-3) + Nitrito (NO-2) sérico de camundongos
sensibilizados com os diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-
848)
Após a análise dos leucócitos totais e das diferentes populações celulares do sangue
periférico, foi avaliado se os diferentes adjuvantes (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848)
são capazes de induzirem alterações nos níveis de óxido nítrico (NO) sérico após o sensibilização
durante toda a cinética (1h, 12h, 24h, 48h, 96h, 168h e 336h).
Neste contexto, os animais sensibilizados com o adjuvante R-848 apresentaram aumento
de NO nos tempos de 1 e 12 horas enquanto que o grupo GLA-SE apresentou um pico no tempo
de 48h. O grupo MPGA apresentou aumento dos níveis séricos de NO nos tempos mais tardios
de 168h e 336h (Figura 8). Todavia, quando as análises comparativas foram realizadas em
relação ao grupo controle, observou-se que o grupo GLA-SE apresentou aumento significativo
desde o tempo de 1h até o tempo de 96h enquanto que o grupo MPGA apresentou aumento em
168h (Figura 8).
Mathias, F. A. S. Resultados
46
0
40
80
0
40
80
0
40
80
0
40
80
a,b,d
a,b,d
1h 12h
24h
48h
96h
168h
336h
0
40
80
a,b,e,f,g
1h 12h
24h
48h
96h
168h
336h
0
40
80
a,b
**
*
*
*
*
Nitr
ato
+ N
itrito
(mM
/L)
Tempo (horas)
CS Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848
Figura 8: Avaliação longitudinal dos níveis séricos de NO em camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Mathias, F. A. S. Resultados
47
6.4. Quantificação do infiltrado inflamatório na pele de camundongos sensibilizados com os
diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-848)
Neste trabalho, também foi realizada a quantificação do infiltrado inflamatório no local
do inóculo, gerados pelos diferentes adjuvantes vacinais (Al(OH)3, ACF, MPGA, GLA-SE, R-
848). Foi realizada esta quantificação, visto que esse recrutamento é essencial para a formação de
um microambiente celular que posteriormente irá direcionar a resposta imune adaptativa.
Sendo assim, nas análises longitudinais, observou-se que o adjuvante R-848 induziu um
aumento significativo no número de células inflamatórias presentes no local do inóculo no tempo
de 1h que persistiu até o tempo de 96h. Já o grupo ACF mostrou aumento significativo no
recrutamento celular para o local do inóculo em 12h, 24h e 48h. O grupo GLA-SE induziu
aumento no infiltrado celular de 12h até 168h. O grupo MPGA apresentou aumento significativo
no tempo de 48h que persistiu até o último tempo da cinética (Figura 9), todavia esse adjuvante
levou a formação de úlceras no local do inóculo a partir do tempo de 24h (dados não mostrados).
Na análise comparativa, observamos que os grupos ACF e MPGA apresentaram
diferenças significativas em praticamente todos os pontos avaliados da cinética, com exceção do
tempo de 168h para o grupo ACF. Os grupos GLA-SE e Al(OH)3 apresentaram diferenças no
intervalo entre os tempos de 12h e 168h. Por fim, o grupo R-848 apresentou diferenças nos
tempos de 1h, 24h e 48 horas quando comparado ao grupo controle (Figura 9).
Mathias, F. A. S. Resultados
48
0
200
400
0
200
400
0
200
400
a,e,f,g
a a,g
0
200
400
a a aa
1h 12h
24h
48h
96h
168h
336h
0
200
400
a,ga,g
a,g
a,ga,g
1h 12h
24h
48h
96h
168h
336h
0
200
400
gg
g g
*
*
* *
** *
* *
* * **
* * *
** *
**
* * **
*
Tempo (horas)
CS Al(OH)3
ACF MPGA
GLA-SE R-848Núm
ero
de c
élul
as/ 7
4588
mm2
Figura 9: Avaliação longitudinal do infiltrado celular na pele de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes (CS Al(OH)3 ACF MPGA GLA-SE R-848 ). Os resultados estão expressos em valores absolutos ± desvio padrão. As letras a,b,c,d,e,f e g indicam a diferença entre os tempos na análise longitudinal e (*) indica diferença em relação ao grupo controle. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
Mathias, F. A. S. Resultados
49
A B
C D
E F
G H
Figura 10: Fotomicrografias de cortes histológicos representativas do infiltrado celular na pele de camundongos sensibilizados com os diferentes adjuvantes: grupo controle (A), hidróxido de alumínio (B); adjuvante completo de Freund nos tempos iniciais de 12, 24 e 48 horas (C) e nos tempos mais tardios de 96, 168 e 336 horas (D); Montanide Pet Gel A no tempo de 1h (E) e nos tempos posteriores (F); Glicopironasil Lipídio A nos tempos de 12 a 168 horas (G); Resiquimod (H) em toda cinética. Hematoxilina-Eosina. Barra=50μm.
7. Discussão
Mathias, F. A. S. Discussão
51
O estudo e o desenvolvimento de vacinas iniciou-se com o uso de patógenos vivos
atenuados ou inativados. Contudo, desde o início até hoje, o estudo com essas vacinas se deparou
com grandes obstáculos como dificuldades quanto à sua utilização frente a doenças desafiadoras
como a hepatite C ou a AIDS devido a fatores como o risco de infecção de indivíduos normais e
imunossuprimidos ou ainda, efeitos colaterais causados pela imunização com organismos totais,
sendo assim, seu uso foi proibido por questões éticas (Singh & O’Hagan, 1999).
A busca por vacinas seguras e eficazes prosseguiu através de novas abordagens como a
utilização de proteínas recombinantes, peptídeos sintéticos, DNA plasmidial. Contudo, essas
vacinas, apesar de não apresentarem os mesmos problemas das primeiras formulações vacinais,
mostram-se ainda pouco imunogênicas, necessitando da presença de outras substâncias
adjuvantes em suas formulações para obtenção de resultados mais consistentes e confiáveis
(Singh & O’Hagan, 2002; Reed, 2009).
Sendo assim, a escolha de adjuvantes para melhorar a resposta imunogênica dos
antígenos vacinais que são co-administrados, estimulando a imunidade celular e humoral, tem
sido uma abordagem importante no desenho das vacinas de última geração (Singh & O’Hagan,
1999; Tritto et al., 2009). Inicialmente, o estudo de adjuvantes foi conduzido de forma mais
empírica. Nos dias atuais, existe uma necessidade de desenvolver novos adjuvantes de forma
racional em função do progresso recente da compreensão da resposta imune, principalmente da
resposta imune inata (Guy, 2007). Acredita-se que estas substâncias são a chave para os eventos
imunes como a entrega dos antígenos vacinais para os tecidos linfoides bem como sua influência
na ativação de células apresentadoras de antígenos (Schijns, 2000). Além da escolha do
adjuvante, outras características como, a dosagem e a rota de imunização também podem
influenciar nos padrões de reconhecimento de epítopos bem como, nos perfis de resposta imune
adquirida no âmbito dos compartimentos celular e humoral (Hu et al., 1990).
Sendo assim, o perfil celular da pele possui alta relevância em estudos de imunização
vacinal, uma vez que esta pode atuar como órgão imune. O tecido linfoide associado à pele
contém células especializadas capazes de aumentar a resposta imune como os queratinócitos que
produzem imunomediadores como IL-1 e TNF-α hábeis na ativação de linfócitos, macrófagos e
células dendríticas. O espaço intercelular no interstício da pele proporciona um ambiente que
favorece a ligação com o sistema linfático e vasos que terminam nos órgãos imunes periféricos
como os linfonodos e o baço (Kupper, 1990; Yokoyama et al., 1997; Puri et al., 2000).
Mathias, F. A. S. Discussão
52
Nesse contexto, esse trabalho analisa de forma descritiva e experimental os diversos
elementos da resposta imune na pele e sangue após a sensibilização com os adjuvantes:
Hidróxido de Alumínio, Adjuvante Completo de Freund, Montanide Pet Gel A, Glicopiranosil
Lipídio A e Resiquimod através de uma única imunização pela via intradérmica em
camundongos Swiss.
Para esta finalidade, primeiramente avaliou-se a resposta sistêmica induzida no sangue
periférico desses animais durante a cinética (1h, 12h, 24h, 48h, 96h, 168h e 336 horas). Nossos
dados mostraram através da análise do quadro hematológico pelo leucograma que todos os
adjuvantes promoveram alterações nos níveis de leucócitos totais bem como nas diferentes
populações avaliadas. Todavia, cada adjuvante se comportou de forma diferente, devido ao fato
das suas diferentes composições serem capazes de atuar na ativação do sistema imune de forma
distinta (Gupta et al., 1995; Vogel, 1995). Estas diferenças nos permitiram discriminar quais
adjuvantes apresentaram uma resposta mais precoce ou mais tardia após a sensibilização.
De forma mais detalhada, nossos resultados em relação à população de neutrófilos
mostraram que camundongos imunizados apenas com o adjuvante GLA-SE apresentaram
aumento precoce (12h) desse tipo celular, enquanto que camundongos imunizados com os
adjuvantes Al(OH)3 e ACF mostraram elevação no número absoluto de neutrófilos apenas nos
tempos mais tardios (96h e 336h, respectivamente). É importante frisar que estas células compõe
a primeira linha de defesa da imunidade inata contra patógenos, além de atuarem como
imunoreguladores na produção de citocinas (IL-12, IL-10, TNF-α, IFN-γ) formando uma ligação
entre a imunidade inata e adquirida (Nathan, 2006; Appelberg, 2007). Aparentemente, o
adjuvante GLA-SE possui mecanismos próprios capazes de estimular o sistema imune mais
precocemente que os demais adjuvantes testados. Vitoriano-Souza et al.(2012), em um estudo
similar observaram recrutamento na pele e uma mobilização no sangue periférico de neutrófilos
induzidos pelos adjuvantes Monofosforil lipídio A, adjuvante incompleto de Freund e Saponina
principalmente no tempo de 12 horas, enfatizando a importância dessas substâncias na ativação
da resposta imune inata.
Camundongos vacinados com distintos antígenos poliproteicos associados ao GLA-SE e
posteriormente desafiados com L. major apresentaram aumento no número de neutrófilos no
local do desafio (Peters et al., 2012).
Mathias, F. A. S. Discussão
53
Outro dado interessante observado em nosso trabalho foi a presença da população de
eosinófilos nos animais sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3, GLA-SE e MPGA
respectivamente em alguns pontos da cinética. O aumento de eosinófilos induzido por Al(OH)3
já foi descrito anteriormente em outros trabalhos como em um estudo utilizando camundongos
Balb/c, no qual foi demonstrado que seis dias após serem sensibilizados com Al(OH)3 observou-
se aumento na população de eosinófilos produtores de IL-4, responsáveis pela ativação de
linfócitos B (Wang & Weller, 2008). Sabe-se que estas células estão ligadas principalmente ao
direcionamento de uma resposta do Tipo 2, na qual o hidróxido de alumínio é sabidamente um
importante indutor (Brewer et al., 1996). Além disso, Sano et al. (1999), comparando os
adjuvantes Al(OH)3 e ACF, observaram que ambos eram capazes de promover inflamação
desencadeada por eosinófilos, sendo que o segundo apresentava níveis bem menores no
infiltrado inflamatório devido a presença de Mycobacterium tuberculosis na composição do
adjuvante, que também é responsável pelo direcionamento de uma resposta pró-inflamatória do
tipo 1. Todavia de forma inesperada, foi observado aumento dessa população em 96 horas em
quatro dos cinco animais do grupo sensibilizado com o adjuvante GLA-SE que sabidamente
direciona para uma resposta do Tipo 1. Ainda não sabemos qual seria o real papel destes
eosinófilos nos animais sensibilizados com GLA-SE e acreditamos que estudos posteriores
poderão elucidar que tipo de modulação esta população estará realizando nos animais
imunizados com este adjuvante.
Os resultados referentes à população de monócitos mostraram aumento dessa população
nos grupos de camundongos imunizados com os adjuvantes R-848 e GLA-SE em 48h, sendo que
no último, perdurou até o tempo de 336h. Já nos grupos de animais sensibilizados com Al(OH)3,
ACF e MPGA essas alterações foram observadas mais tardiamente. A análise da população de
monócitos é extremamente relevante, uma vez que estes diferenciam-se em macrófagos e células
dendríticas, após a sua migração para os tecidos periféricos (Auffray et al., 2007; Domínguez &
Ardavín, 2010). Além disso, estas células pertencem ao sistema mononuclear fagocitário (SMF),
atuando na imunidade inata, sendo responsáveis pela remoção de detritos e infecções
microbianas e produção de citocinas como interferons, interleucinas, quimiocinas e fatores de
crescimento (Serbina et al., 2008). Sendo assim, o aumento dessa população sugere a capacidade
dos adjuvantes GLA-SE e R-848 ativarem mais precocemente o sistema imune inato através de
células fundamentais, permitindo assim a fagocitose e processamento do antígeno vacinal bem
Mathias, F. A. S. Discussão
54
como a modulação do sistema imune e consequentemente o combate de patógenos intracelulares.
Essas alterações no perfil de leucócitos do sangue provavelmente refletem algumas das
diferentes mudanças ocorridas no local do inóculo após a sensibilização com distintos
adjuvantes.
De forma interessante, ao avaliar ainda no sangue, o perfil imunofenotípico por
citometria de fluxo de Linfócitos T, mais especificamente Linfócitos T CD4+, observou-se já nos
tempos iniciais da cinética que os grupos de camundongos imunizados com ACF (12h), GLA-SE
e R-848 (24h) apresentaram redução desta subpopulação de linfócitos T, enquanto que o grupo
MPGA apresentou essa redução apenas mais tardiamente. Ao analisar a subpopulação de
linfócitos T CD8+ os grupos que apresentaram redução dessa população nos tempos iniciais
foram R-848 (12h) e o MPGA (24h). Essas reduções provavelmente estão ligadas ao processo de
migração celular para o local do inóculo por ação dos adjuvantes. Em um estudo semelhante,
Lambert e colaboradores (2012) observaram que o adjuvante GLA-SE apresenta já no tempo de
24h um infiltrado moderado de neutrófilos e linfócitos no local do inóculo, além de promover
aumento tanto de células dendríticas quanto de linfócitos T totais nos linfonodos drenantes.
No trabalho de Xu et al. (2006) foi demonstrado que a utilização do adjuvante R-848
induz ao aumento da expressão de TLR8 em células dendríticas derivadas de monócitos. Estas
por sua vez produzem altos níveis de IL-12 que ativam tanto linfócitos T CD4+, a produzirem
citocinas pró-inflamatórias, quanto linfócitos T CD8+, aumentando sua sensibilidade para o
reconhecimento de antígenos, bem como sua atividade funcional. Qiu et al. (2008) observaram
que a associação dos adjuvantes MPGA e CpG ODN promoveu maior ativação de linfócitos T
CD4+ do que quando utilizado isoladamente .
Em outro estudo, buscando avaliar a resposta dos adjuvantes Al(OH)3, ACF, Montanide®
ISA 720 e GLA-SE em camundongos C57BL/6 empregando diferentes protocolos vacinais foi
demonstrado que o grupo vacinado com hidróxido de alumínio foi o que menos induziu a
ativação de linfócitos TCD4+ e TCD8+ enquanto que ACF e Montanide apresentaram níveis
semelhantes de ativação entre si, superiores ao anterior, mas inferior ao GLA-SE, que apresentou
os níveis mais elevados de ativação dessas subpopulações de linfócitos T (de Cassan et al.,
2011). Estes resultados diferem um pouco dos nossos pela intensidade da resposta imune obtida,
muito provavelmente devido ao fato de que nesse estudo além de os animais serem de uma
linhagem diferente da nossa, receberam mais de uma dose de uma vacina composta pelo
Mathias, F. A. S. Discussão
55
adjuvante associado a outros antígenos. Todavia, nossos resultados mostram que esses
adjuvantes de fato, apesar de uma única dose, seguem um padrão em seu modo de ação.
Jahnisch et al. (2013) observaram em uma abordagem in vitro que células dendríticas
previamente sensibilizadas com o adjuvante R-848 ao serem co-cultivadas com células T
promoveram a proliferação de linfócitos T CD4+ e T CD8+, além do aumento dos níveis de IL-12
e IFN-γ. É importante ressaltar que os linfócitos T CD4+ desempenham um papel fundamental no
desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa, auxiliando no recrutamento e ativação de
outras células imunes como linfócitos T CD8+, linfócitos B, macrófagos, monócitos, neutrófilos
e eosinófilos. Além disso, as citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4+ são capazes de
direcionar o sistema imune para uma resposta Th1, Th2, Th17 ou Treg (Zhu & Paul, 2010;
O’Shea & Paul, 2010). O fluxo de linfócitos T entre o sangue e os órgãos linfoides periféricos
requer que essas células sejam móveis e sensíveis a estímulos específicos do tecido (Miller et al.,
2003). Além disso, células T efetoras são essenciais para a eliminação de patógenos no local da
infecção, assim como as células T citotóxicas (T CD8+) atuam na eliminação de patógenos
através da liberação de grânulos líticos e opsonização com receptores pró-apoptóticos. Por outro
lado, as células T CD4+ auxiliares sinalizam através da sinapse imunológica para que as células
infectadas sejam envolvidas por sinais efetores e produzam citocinas e quimiocinas para o
recrutamento de outras células (Muller et al., 2012).
Em relação ao perfil de células B CD19+ também avaliada em nosso estudo, observou-se
que os grupos sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3 e GLA-SE apresentaram aumento mais
recente dessa população no tempo de 24h enquanto os outros grupos apresentaram aumento nos
tempos de 48h. Esta população é responsável pela produção das diversas classes de
imunoglobulinas (Ig) na resposta humoral. Além disso, tem sido demonstrado seu papel na
apresentação de antígenos nos linfonodos, principalmente apresentando antígenos solúveis para
linfócitos T CD4+ específicos (Garside et al., 1998). Após essa interação, as células B antígeno-
específico recebem sinais das células T, levando a sua proliferação e mudança de classe de
isotipo (MacLennan et al., 1997; Pape et al., 2003).
Diferentes trabalhos da literatura tem avaliado a presença de células B induzidas por
adjuvantes. Em relação aos adjuvantes a base de alumínio, estes são conhecidos por direcionar
para uma resposta imune do tipo 2, com aumento na ativação e proliferação policlonal de células
B produtoras de IgG1 e IgE, além de citocinas como IL-4 e IL-5 (Grun & Maurer, 1989; Brewer
Mathias, F. A. S. Discussão
56
et al., 1997). Korsholm e colaboradores (2010) evidenciaram que a utilização do adjuvante
Al(OH)3 gerava aumento de linfócitos B após 26h na cavidade intraperitoneal onde foi realizado
o inóculo. Em outro trabalho, Jordan e colaboradores (2004) observaram que a utilização do
alum (hidróxido de alumínio) levava a ativação e proliferação de células B em camundongos
C57BL/6 independentemente de sua associação ao antígeno. Esses resultados corroboram com os
que foram encontrados em nosso trabalho, demonstrando que o hidróxido de alumínio sozinho é
capaz de prover sinais da imunidade inata, ativando assim esta população celular.
Lambert e colaboradores (2012) realizaram um estudo onde observaram que o adjuvante
GLA-SE era capaz de induzir aumento na expressão da quimiocina CXCL13, quimiocina
responsável pelo recrutamento de linfócitos B, com um pico em 24h e se manteve elevada até
96h, indo de encontro dessa forma com os resultados obtidos em nosso trabalho. Baldwin e
colaboradores (2009) demonstraram que camundongos vacinados com um lipídio A hexacilado
sintético derivado do GLA emulsificado em uma solução estabilizadora (SE) apresentaram
aumento nos títulos de IgG2a, demonstrando assim que as células B são também capazes de
direcionar para um perfil de resposta imune do Tipo 1.
Já em relação ao adjuvante completo de Freund (ACF) estudos demonstram que,
dependendo da via de inoculação, apresenta uma intensidade de resposta distinta. Todavia, tanto
em animais imunizados pela via intraperitoneal quanto pela via subcutânea apresentaram uma
resposta mista Tipo1/Tipo2 (Oscherwitz et al., 2006). Resultados semelhantes foram encontrados
por Habjanec e colaboradores (2010) onde comparando o ACF a outros adjuvantes associados ao
antígeno OVA (ovalbumina), este mostrou-se como um forte indutor tanto de IgG1 quanto de
IgG2a, sendo que dentre as combinações testadas apresentou a menor razão Tipo1/Tipo2, ou
seja, uma resposta preferencialmente mista.
Por outro lado, o adjuvante Montanide® vem sendo testado no desenvolvimento de uma
vacina e em terapias contra o câncer, devido sua elevada capacidade de ativar linfócitos B
produtores de anticorpos (Montero et al., 2009). Contudo, nossos resultados demonstraram um
aumento ao longo da cinética dessa população, todavia sem apresentar diferenças com o grupo
controle. Esse resultado pode ser atribuído a diversos componentes como a dose utilizada,
ausência do antígeno vacinal, além do fato do adjuvante utilizado em nosso estudo apresentar
uma diferença na formulação que consiste em uma emulsificação de óleos minerais ou não
associados a água em suas possíveis combinações (Montanide ISA 51) ao invés de uma
Mathias, F. A. S. Discussão
57
emulsificação em gel (Montanide Pet Gel A®) que forma um sistema de depósito,
proporcionando uma liberação gradual de um possível antígeno associados (www.seppic.com
acessado em 23 março de 2013).
De forma interessante, camundongos imunizados com o adjuvante R-848 apresentaram
uma redução inicial no tempo de 12h da população de linfócitos B seguido de um aumento e
normalização dos seus níveis em 48h que seguiu até o fim da cinética. Estudos in vitro
demonstraram que o R-848 é capaz de ativar células B que se transformam em plasmócitos e
começam a produzirem anticorpos como IgM (North et al., 2010). Jahnmatz e colaboradores
(2013) observaram em um estudo in vitro que tanto o adjuvante R-848 quanto a citocina IL-12
são capazes de ativar células B produtoras de IgG, todavia, a combinação de ambos levaram a
uma ativação muito mais intensa de duradoura.
Outra população avaliada no presente estudo foi a de células natural killer (NK) que
desempenham importante papel no sistema imune inato e são capazes de identificar com acurácia
células infectadas, neoplásticas de células normais (Bellelis et al., 2013). As células NK são
células citotóxicas efetoras capazes de lisar as células alvo sem a necessidade de uma exposição
prévia ao antígeno (Sikora et al., 2011). Além da atividade citotóxica essas células possuem a
habilidade de secretar citocinas e sua população no sangue periférico leva cerca de três a cinco
dias após a infecção para aumentar antes que se inicie a imunidade adaptativa (Ferlazzo & Munz,
2004). Os resultados demonstraram que animais sensibilizados com os adjuvantes ACF (96h),
MPGA (168h) e GLA-SE (168h), seguiram esse padrão de aumento dessa população no sangue
periférico após as imunizações, enquanto que os adjuvantes Al(OH)3 e R-848 apresentaram
redução de células NK nos tempos de 24h e 12h, respectivamente.
Estudos recentes comparando a resposta dos adjuvantes MPL e Al(OH)3 demonstraram
que no tempo de 26h que o primeiro adjuvante apresentou um aumento na expressão de CD69
(marcador de ativação) da população de células NK enquanto que o segundo uma redução
significativa desta população celular (Korsholm et al., 2010).
A utilização do ACF em trabalhos avaliando seu efeito contra doenças autoimunes como
diabetes do tipo 1, demonstraram ativação de células NK, que são essenciais na proteção contra a
doença no modelo murino (Lee et al., 2004). Estudos posteriores demonstraram que o adjuvante
completo de Freund foi capaz de ativar as células NK através da ação de células NK T (Lee et
al., 2011). Tanto o grupo MPGA quanto o grupo GLA-SE, apesar de apresentarem um aumento
Mathias, F. A. S. Discussão
58
em 168 horas apresentaram menores níveis dessa população em diversos pontos da cinética
quando comparado ao grupo controle. Provavelmente pode estar ocorrendo uma migração de
células NK para os tecidos linfoides, todavia, são necessários mais estudos para confirmar essa
hipótese. Em um estudo com o GLA-SE in vitro avaliando seu efeito em PBMCs de indivíduos
novos e velhos demonstrou que este adjuvante induz um pequeno aumento dos níveis de IFN-γ
devido sua ativação direta de células NK (Behzad et al., 2012). Ikeda et al. (1993) avaliaram a
resposta de um lipídio sintético A análogo ao GLA em diversas linhagens de camundongos e
observaram o aumento da atividade das células NK e, consequentemente, da atividade citolítica,
mesmo em camundongos imunodeficientes.
Em outro estudo, os pesquisadores avaliaram o efeito do adjuvante R-848, entre outros
como o ACF, e foi demonstrado que no segundo dia pós-imunização o adjuvante apresentou um
elevado recrutamento de células NK provenientes do sangue periférico para os linfonodos
drenantes ao contrário do adjuvante de Freund (Martin-Fontecha et al., 2004). Esses resultados
corroboram com os nossos, onde é possível observar uma diminuição significativa já em 12h no
sangue, devido provavelmente à migração preferencial dessas células aos linfonodos drenantes.
Por fim, a última avaliação imunofenotípica realizada foi a da população de monócitos
CD14+. Conforme dito anteriormente, essas células são importantes componentes do sistema
fagocitário mononuclear, atuam na imunidade inata auxiliando na remoção de detritos e
infecções microbianas. Nossos resultados mostraram que praticamente todos os adjuvantes, com
exceção do MPGA (96h) apresentaram um aumento recente dessa população no sangue
periférico.
A utilização do Al(OH)3 promove a ativação de monócitos em 48h após sua
sensibilização que começam a se diferenciar em células dendríticas com aumento na expressão
de MHC IIhigh, CD86high e CD83+, e consequentemente sua maturação (Ulanova et al., 2001).
Todavia, quando utilizadas culturas puras (95 a 99%) de monócitos CD14+, o hidróxido sozinho
não é capaz de promover essa diferenciação, demonstrando assim a importância das células T
nesse contexto (Ulanova et al., 2001).
Em relação ao adjuvante completo de Freund, Brack et al. (2004) demonstraram que em
24h, 48h e 96h após a imunização de ratos Wistar, ocorreu aumento na ativação da população de
monócitos que migraram para o local do inóculo. Um estudo comparando distintos adjuvantes
agonistas de receptores do tipo Toll como MPL (TLR4), R-848 (TLR7/8) e CpG (TLR9)
Mathias, F. A. S. Discussão
59
observou que apesar de todos promoverem a expansão de monócitos CD14+, os dois últimos
foram os que apresentaram ativação mais rápida, intensa e duradoura (Kwissa et al., 2012).
Nossos resultados demonstraram que o R-848 promoveu aumento recente em 12h dessa
população enquanto que o GLA-SE, agonista TLR4, apresentou um aumento em 48h, de modo
similar aos resultados obtidos por Kwissa et al., (2012).
A capacidade que um imunógeno possui de induzir a produção de óxido nítrico é
considerada um fator fundamental, pois também indica sua capacidade de produção de citocinas
do tipo 1, fundamentais no estabelecimento de uma resposta imune protetora contra patógenos
intracelulares. Dessa forma, a produção de NO pela iNOS possibilita que os macrófagos ativados
eliminem diversos patógenos intracelulares (Rivera et al., 2001). Dessa forma, nossos resultados
demonstram que o adjuvante Al(OH)3 não foi capaz de induzir nenhuma alteração na produção
de NO, concordando com o que é descrito na literatura, pois, se trata de um adjuvante que induz
uma resposta do tipo 2. Guerra et al. (2011) demonstraram que a utilização do adjuvante
Al(OH)3 associado a extrato de promastigota de Leishmania (LE) para induzir uma resposta do
tipo 2 polarizada não foi capaz de produzir níveis de NO diferentes do grupo controle salina,
bem como a utilização do ACF + LE. Todavia quando utilizado a combinação ACF + LE foi
observado diferença significativa na produção de NO quando comparado ao grupo imunizado
apenas com LE (Guerra et al., 2011). Esses resultados corroboram com os obtidos em nosso
trabalho, onde, o ACF apesar de apresentar um pequeno aumento da produção de NO, não
apresenta diferenças em relação ao grupo controle.
Em um trabalho recente avaliando a eficácia do tratamento contra leishmaniose visceral
utilizando a associação de uma droga ao adjuvante R-848, Duong et al. (2013) observaram que
com o aumento da concentração do adjuvante ocorria o aumento dos níveis de NO .
Finalmente decidiu-se avaliar quais alterações locais seriam as responsáveis pelas
modificações sistêmicas apresentadas anteriormente. Uma vez que é relatado que a expressão de
genes pró-inflamatórios e mediadores inflamatórios no local do inóculo dos adjuvantes vacinais
induz a migração de células a partir da circulação sanguínea para o local de imunização (Mosca
et al., 2008).
Tomando em conjunto os resultados obtidos no presente estudo que demonstraram que
todos adjuvantes foram capazes de promover recrutamento celular para o local do inóculo. Essa
capacidade de induzir inflamação local é uma importante característica compartilhada pela
Mathias, F. A. S. Discussão
60
maioria dos adjuvantes conhecidos e está intimamente relacionada à imunogenicidade dessas
substâncias (Schijns, 2000). No entanto, pode-se observar que cada adjuvante induziu esse
processo inflamatório de modo particular discriminando assim o modo de ação de cada um e sua
respectiva eficiência.
Sendo assim, nossos resultados demonstraram que o adjuvante Al(OH)3 apesar de não ter
apresentado variações ao longo de toda a cinética, demonstrou uma migração celular superior ao
grupo controle. O grupo ACF por sua vez, apresentou um intenso recrutamento celular nos
tempos iniciais de 12h à 48h com uma redução posterior no tempo de 96h, todavia superior ao
grupo controle. O grupo MPGA durante toda a cinética apresentou aumento em relação ao grupo
controle, sendo a partir do tempo de 48h aumento significativo em relação aos tempos anteriores
que seguiu até o fim da cinética. Contudo esse adjuvante já no tempo de 24h apresentou a
formação de úlceras no local do inóculo, que seguiram até o fim da cinética. Os animais
sensibilizados com o adjuvante GLA-SE apresentaram uma cinética interessante, com aumento
recente do infiltrado celular em 12h que permaneceu até o tempo mais tardio de 168h. Por fim, o
grupo imunizado com o adjuvante R-848 apresentou aumento discreto do infiltrado celular,
todavia superior ao grupo controle nos tempos iniciais de 1h, 24h e 48h.
É importante ressaltar que esse recrutamento celular é essencial para a formação de um
microambiente imunocompetente favorável ao processamento de antígenos, apresentação e
subsequente estimulação da resposta imune celular onde serão produzidas citocinas, quimiocinas
atrativas para outras populações celulares (Medzhitov & Janeway, 1997; Kensil et al., 2004;
Vitoriano-Souza et al., 2012).
Todavia, são necessários mais estudos que visem avaliar a resposta desses adjuvantes
(isolados ou combinados), principalmente os que direcionam para uma resposta do tipo 1
associados a antígenos de interesse como o de Leishmania spp. para o desenvolvimento de novas
formulações vacinais anti-Leishmania.
61
8. Conclusão
Mathias, F. A. S. Conclusão
62
O conjunto de dados obtidos no trabalho intitulado: “Cinética da resposta imune inata
induzida por diferentes adjuvantes vacinais” nos permite concluir que todos os adjuvantes
vacinais induziram recrutamento celular para o local do inóculo bem como alterações nas células
presentes no sangue periférico. Todavia, demonstraram diferenças em relação ao tempo de ação,
por apresentarem diferentes constituições e, consequentemente, perfis de respostas imunes
distintas que devem ser consideradas na sua seleção como adjuvantes vacinais.
Essa cinética estudada nos permite selecionar o(s) melhor(es) adjuvante(s) que
apresentam uma resposta mais rápida para futuros testes vacinais anti-Leishmania.
Sendo assim, observou-se que os adjuvantes GLA-SE e R-848 apresentaram resultados
promissores, tanto no sangue, onde inclusive foram capazes de estimular a produção de NO
sérico, importante característica da resposta imune do tipo 1, como na pele no local do inóculo,
com aumento no recrutamento celular nos tempos iniciais.
9. Perspectivas
Mathias, F. A. S. Perpectivas
64
A partir da realização deste trabalho foi possível obter importantes informações sobre o
contexto da resposta imune inata desencadeada por estes adjuvantes tanto no local do inóculo
quanto no sangue periférico. Além disso, a identificação dos adjuvantes que apresentam resposta
do tipo 1 mais adequada para sua utilização em futuras formulações anti-Leishmania. Neste
sentido, a continuidade desse trabalho tem como principais objetivos, avaliar:
• A resposta desses adjuvantes associados ao antígeno de Leishmania;
• A expressão de mRNA de receptores do tipo Toll, quimiocinas e citocinas
envolvidas nesta resposta;
• Tráfego celular in vivo através da técnica microscopia intravital na pele a fim de
verificar os eventos de recrutamento (rolamento e adesão) celular promovidos
pelos adjuvantes em alguns pontos pré-determinados da cinética;
• Principais populações celulares presentes no local do inóculo pela técnica de
microscopia confocal.
10. Referências Bibliográficas
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
66
Ahonen, C. L., Gibson, S. J., Smith, R. M., Pederson, L. K., Lindh, J. M., Tomai, M. A., Vasilakos, J. P. (1999) Dendritic cell maturation and subsequent enhanced T-cell stimulation induced with the novel synthetic immune response modifier R-848. Cell Immunol 197: 62-72.
Alvar, J., Canavate, C., Molina, R., Moreno, J., Nieto, J. (2004) Canine leishmaniasis. Adv. Parasitol., v.57, p.1–88.
Alves, W.A., Belacqua, P.D. (2004) Quality of diagnosis of canine visceral leishmaniasis in epidemiological surveys: an epidemic in Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, 1993-1997. Cad Saúde Pública 20: 259-265.
Appelberg, R. (2007) Neutrophils and intracellular pathogens: beyond phagocytosis and killing. Trends Microbiol 15: 87-92.
Aucouturier, J., Dupuis, L., Deville, S., Ascarateil, S., Ganne, V. (2002) Montanide ISA 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines. Expert Rev Vaccines 1: 111-118.
Auffray, C., Fogg, D., Garfa, M., Elain, G., Join-Lambert, O., Kayal, S., Sarnacki, S., Cumano, A., Lauvau, G., Geissmann, F. (2007) Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science 317: 666-670.
Baldwin, S. L., Shaverdian, N., Goto, Y., Duthie, M. S., Raman, V. S., Evers, T., Mompoint, F., Vedvick, T. S., Bertholet, S., Coler, R. N., Reed, S. G. (2009) Enhanced humoral and Type 1 cellular immune responses with Fluzone adjuvanted with a synthetic TLR4 agonist formulated in an emulsion. Vaccine 27: 5956-5963.
Behzad, H., Huckriede, A. L., Haynes, L., Gentleman, B., Coyle, K., Wilschut, J. C., Kollmann, T. R., Reed, S. G., McElhaney, J. E. (2012) GLA-SE, a synthetic toll-like receptor 4 agonist, enhances T-cell responses to influenza vaccine in older adults. J Infect Dis 205: 466-473.
Bellelis, P., Barbeiro, D. F., Rizzo, L. V., Baracat, E. C., Abrao, M. S., Podgaec, S. (2013) Transcriptional changes in the expression of chemokines related to natural killer and T-regulatory cells in patients with deep infiltrative endometriosis. Fertil Steril.
Billiau, A., Matthys, P. (2001) Modes of action of Freund's adjuvants in experimental models of autoimmune diseases. J Leukoc Biol 70: 849-860.
Borja-Cabrera, G. P., Correia Pontes, N. N., da Silva, V. O., Paraguai de Souza, E., Santos, W. R., Gomes, E. M., Luz, K. G., Palatnik, M., Palatnik de Sousa, C. B. (2002) Long lasting protection against canine kala-azar using the FML-QuilA saponin vaccine in an endemic area of Brazil (Sao Goncalo do Amarante, RN). Vaccine 20: 3277-3284.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
67
Borja-Cabrera, G. P., Da Silva, V. O., Da Costa, R. T., Reis, A. B., Mayrink, W., Genaro, O., Palatnik-de-Sousa, C. B. (1999) The fucose-mannose ligand-ELISA in the diagnosis and prognosis of canine visceral leishmaniasis in Brazil. Am J Trop Med Hyg 61: 296-301.
Brack, A., Labuz, D., Schiltz, A., Rittner, H. L., Machelska, H., Schafer, M., Reszka, R., Stein, C. (2004) Tissue monocytes/macrophages in inflammation: hyperalgesia versus opioid-mediated peripheral antinociception. Anesthesiology 101: 204-211.
Brewer, J. M., Alexander, J. (1997) Cytokines and the mechanisms of action of vaccine adjuvants. Cytokines Cell Mol Ther 3: 233-246.
Brewer, J. M., Conacher, M., Hunter, C. A., Mohrs, M., Brombacher, F., Alexander, J. (1999) Aluminium hydroxide adjuvant initiates strong antigen-specific Th2 responses in the absence of IL-4- or IL-13-mediated signaling. J Immunol 163: 6448-6454.
Brewer, J. M., Conacher, M., Satoskar, A., Bluethmann, H., Alexander, J. (1996) In interleukin-4-deficient mice, alum not only generates T helper 1 responses equivalent to freund's complete adjuvant, but continues to induce T helper 2 cytokine production. Eur J Immunol 26: 2062-2066.
Calabro, S., Tortoli, M., Baudner, B. C., Pacitto, A., Cortese, M., O'Hagan, D. T., De Gregorio, E., Seubert, A., Wack, A. (2011) Vaccine adjuvants alum and MF59 induce rapid recruitment of neutrophils and monocytes that participate in antigen transport to draining lymph nodes. Vaccine 29: 1812-1823.
Clegg, C. H., Roque, R., Van Hoeven, N., Perrone, L., Baldwin, S. L., Rininger, J. A., Bowen, R. A., Reed, S. G. (2012) Adjuvant solution for pandemic influenza vaccine production. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 17585-17590.
Coler, R. N., Baldwin, S. L., Shaverdian, N., Bertholet, S., Reed, S. J., Raman, V. S., Lu, X., DeVos, J., Hancock, K., Katz, J. M., Vedvick, T. S., Duthie, M. S., Clegg, C. H., Van Hoeven, N., Reed, S. G. (2010) A synthetic adjuvant to enhance and expand immune responses to influenza vaccines. PLoS One 5: e13677.
Coler, R. N., Bertholet, S., Moutaftsi, M., Guderian, J. A., Windish, H. P., Baldwin, S. L., Laughlin, E. M., Duthie, M. S., Fox, C. B., Carter, D., Friede, M., Vedvick, T. S., Reed, S. G. (2011) Development and characterization of synthetic glucopyranosyl lipid adjuvant system as a vaccine adjuvant. PLoS One 6: e16333.
Connell, N. D., Medina-Acosta, E., McMaster, W. R., Bloom, B. R., Russell, D. G. (1993) Effective immunization against cutaneous leishmaniasis with recombinant bacille Calmette-Guerin expressing the Leishmania surface proteinase gp63. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 11473-11477.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
68
Costa, C. H. (2008) Characterization and speculations on the urbanization of visceral leishmaniasis in Brazil. Cad Saude Publica 24: 2959-2963.
Cox, J.C. & Coulter, A.R. (1997) Adjuvants - a classification and review of their modes of action. Vaccine 15(3): 248-256.
Dantas-Torres, F., Brandao-Filho, S. P. (2006) Visceral Leishmaniasis In Brazil: Revisiting Paradigms Of Epidemiology And Control. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 48(3):151-156, May-June.
de Cassan, S. C., Forbes, E. K., Douglas, A. D., Milicic, A., Singh, B., Gupta, P., Chauhan, V. S., Chitnis, C. E., Gilbert, S. C., Hill, A. V., Draper, S. J. (2011) The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. J Immunol 187: 2602-2616.
Deane, L. M., Deane, M. P. (1954) Dogs naturally infected by Leishmania donovani in Ceara. Hospital (Rio J) 45: 703-707.
Desjeux, P. (2004) Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 27, 305-318.
Disis, M. L., Bernhard, H., Shiota, F. M., Hand, S. L., Gralow, J. R., Huseby, E. S., Gillis, S., Cheever, M. A. (1996) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines. Blood 88: 202-210.
Dominguez, P. M., Ardavin, C. (2010) Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunol Rev 234: 90-104.
Duong, A. D., Sharma, S., Peine, K. J., Gupta, G., Satoskar, A. R., Bachelder, E. M., Wyslouzil, B. E., Ainslie, K. M. (2013) Electrospray encapsulation of toll-like receptor agonist resiquimod in polymer microparticles for the treatment of visceral leishmaniasis. Mol Pharm 10: 1045-1055.
Duthie, M. S., Raman, V. S., Piazza, F. M., Reed, S. G. (2012) The development and clinical evaluation of second-generation leishmaniasis vaccines. Vaccine 30: 134-141.
Ferlazzo, G., Munz, C. (2004) NK cell compartments and their activation by dendritic cells. J Immunol 172: 1333-1339.
Fernandes, A. P., Costa, M. M., Coelho, E. A., Michalick, M. S., de Freitas, E., Melo, M. N., Luiz Tafuri, W., Resende Dde, M., Hermont, V., Abrantes Cde, F., Gazzinelli, R. T. (2008) Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein. Vaccine 26: 5888-5895.
Fujiwara, R. T., Bueno, L. L., Vale, A. M., Franca-Silva, J. C., da Costa, R. T., Quetz Jda, S., Machado-Coelho, G. L., Reis, A. B., Martins Filho, O. A., Genaro, O., Nascimento, E., Mayrink,
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
69
W. (2005) Flow cytometric assay in peripheral blood of dogs--reference values for leukocytes from Brazilian beagles. Pol J Vet Sci 8: 17-22.
Garcia-Agudo, R., Aoufi Rabih, S., Araque Torres, P., Dolores Fraga Fuentes, M., Carlos Valenzuela Gamez, J., Mancha Ramos, J., Maria Tenias Burillo, J. (2012) Efficacy of a hepatitis B vaccination schedule with two cycles of four double doses of conventional vaccine and four doses of adjuvanted vaccine in chronic kidney disease patients evaluated for renal transplantation. Transplant Proc 44: 2532-2534.
Garside, P., Ingulli, E., Merica, R. R., Johnson, J. G., Noelle, R. J., Jenkins, M. K. (1998) Visualization of specific B and T lymphocyte interactions in the lymph node. Science 281: 96-99.
Gibson, S. J., Lindh, J. M., Riter, T. R., Gleason, R. M., Rogers, L. M., Fuller, A. E., Oesterich, J. L., Gorden, K. B., Qiu, X., McKane, S. W., Noelle, R. J., Miller, R. L., Kedl, R. M., Fitzgerald-Bocarsly, P., Tomai, M. A., Vasilakos, J. P. (2002) Plasmacytoid dendritic cells produce cytokines and mature in response to the TLR7 agonists, imiquimod and Resiquimod. Cell Immunol 218: 74-86.
Giunchetti, R. C., Correa-Oliveira, R., Martins-Filho, O. A., Teixeira-Carvalho, A., Roatt, B. M., de Oliveira Aguiar-Soares, R. D., Coura-Vital, W., de Abreu, R. T., Malaquias, L. C., Gontijo, N. F., Brodskyn, C., de Oliveira, C. I., Costa, D. J., de Lana, M., Reis, A. B. (2008) A killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays immunogenicity in dogs. Vaccine 26: 623-638.
Giunchetti, R. C., Correa-Oliveira, R., Martins-Filho, O. A., Teixeira-Carvalho, A., Roatt, B. M., de Oliveira Aguiar-Soares, R. D., de Souza, J. V., das Dores Moreira, N., Malaquias, L. C., Mota e Castro, L. L., de Lana, M., Reis, A. B. (2007) Immunogenicity of a killed Leishmania vaccine with saponin adjuvant in dogs. Vaccine 25: 7674-7686.
Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. (1982) Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal Biochem 126: 131-138.
Grun, J. L., Maurer, P. H. (1989) Different T helper cell subsets elicited in mice utilizing two different adjuvant vehicles: the role of endogenous interleukin 1 in proliferative responses. Cell Immunol 121: 134-145.
Guerra, R. N., Silva, V. M., Aragao-Franca, L. S., Oliveira, P. R., Feitosa, R., Nascimento, F. R., Pontes-de-Carvalho, L. C. (2011) Babassu aqueous extract (BAE) as an adjuvant for T helper (Th)1-dependent immune responses in mice of a Th2 immune response-prone strain. BMC Immunol 12.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
70
Gupta, R. K., Chang, A. C., Griffin, P., Rivera, R., Siber, G. R. (1996) In vivo distribution of radioactivity in mice after injection of biodegradable polymer microspheres containing 14C-labeled tetanus toxoid. Vaccine 14: 1412-1416.
Guy, B. (2007) The perfect mix: recent progress in adjuvant research. Nat Rev Microbiol 5: 505-517.
Habjanec, L., Halassy, B., Tomasic, J. (2010) Comparative study of structurally related peptidoglycan monomer and muramyl dipeptide on humoral IgG immune response to ovalbumin in mouse. Int Immunopharmacol 10: 751-759.
Hackett, C. J., Harn, D. A. (2006) Vaccine adjuvants immunological and clinical principles. Humana Press.
Holzmuller, P., Cavaleyra, M., Moreaux, J., Kovacic, R., Vincendeau, P., Papierok, G., Lemesre, J. L. (2005) Lymphocytes of dogs immunised with purified excreted-secreted antigens of Leishmania infantum co-incubated with Leishmania infected macrophages produce IFN gamma resulting in nitric oxide-mediated amastigote apoptosis. Vet Immunol Immunopathol 106: 247-257.
Hu, J. G., Yokoyama, T., Kitagawa, T. (1990) Studies on the optimal immunization schedule of experimental animals. V. The effects of the route of injection, the content of Mycobacteria in Freund's adjuvant and the emulsifying antigen. Chem Pharm Bull (Tokyo) 38: 1961-1965.
Ikeda, S., Neyts, J., Matsuura, M., Kiso, M., Hasegawa, A., Nishimura, C., De Clercq, E. (1993) Protective activity of the lipid A analogue GLA-60 against murine cytomegalovirus infection in immunodeficient mice. J Gen Virol 74: 1399-1403.
Jahnisch, H., Wehner, R., Tunger, A., Kunze, A., Oehrl, S., Schakel, K., Rohayem, J., Bornhauser, M., Tonn, T., Bachmann, M., Schmitz, M. (2013) TLR7/8 agonists trigger immunostimulatory properties of human 6-sulfo LacNAc dendritic cells. Cancer Lett.
Jahnmatz, M., Kesa, G., Netterlid, E., Buisman, A. M., Thorstensson, R., Ahlborg, N. (2013) Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J Immunol Methods.
Jordan, M. B., Mills, D. M., Kappler, J., Marrack, P., Cambier, J. C. (2004) Promotion of B cell immune responses via an alum-induced myeloid cell population. Science 304: 1808-1810.
Kensil, C. R., Mo, A. X., Truneh, A. (2004) Current vaccine adjuvants: an overview of a diverse class. Front Biosci 9: 2972-2988.
Korsholm, K. S., Petersen, R. V., Agger, E. M., Andersen, P. (2010) T-helper 1 and T-helper 2 adjuvants induce distinct differences in the magnitude, quality and kinetics of the early inflammatory response at the site of injection. Immunology 129: 75-86.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
71
Kundi, M. (2007) New hepatitis B vaccine formulated with an improved adjuvant system. Expert Rev Vaccines 6: 133-140.
Kupper, T. S. (1990) The activated keratinocyte: a model for inducible cytokine production by non-bone marrow-derived cells in cutaneous inflammatory and immune responses. J Invest Dermatol 94: 146S-150S.
Kwissa, M., Nakaya, H. I., Oluoch, H., Pulendran, B. (2012) Distinct TLR adjuvants differentially stimulate systemic and local innate immune responses in nonhuman primates. Blood 119: 2044-2055.
Lainson, R., Shaw, J.J. (1987) Evolution, classification and geographical distribution. The Leishmaniasis. London: Academic Press, 1–120.
Lambert, S. L., Yang, C. F., Liu, Z., Sweetwood, R., Zhao, J., Cheng, L., Jin, H., Woo, J. (2012) Molecular and Cellular Response Profiles Induced by the TLR4 Agonist-Based Adjuvant Glucopyranosyl Lipid A. PLoS One 7: e51618.
Lee, I. F., Qin, H., Trudeau, J., Dutz, J., Tan, R. (2004) Regulation of autoimmune diabetes by complete Freund's adjuvant is mediated by NK cells. J Immunol 172: 937-942.
Lee, I. F., van den Elzen, P., Tan, R., Priatel, J. J. (2011) NKT cells are required for complete Freund's adjuvant-mediated protection from autoimmune diabetes. J Immunol 187: 2898-2904.
Lemesre, J. L., Holzmuller, P., Cavaleyra, M., Goncalves, R. B., Hottin, G., Papierok, G. (2005) Protection against experimental visceral leishmaniasis infection in dogs immunized with purified excreted secreted antigens of Leishmania infantum promastigotas. Vaccine 23: 2825-2840.
Lindblad, E. B. (2004) Aluminium adjuvants--in retrospect and prospect. Vaccine 22: 3658-3668.
Liu, G., Anderson, C., Scaltreto, H., Barbon, J., Kensil, C.R. (2002) QS-21 structure/function studies: effect of acylation on adjuvant activity. Vaccine 20(21-22): 2808-2815.
Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. (2003) Role of Th1 and Th2 cytokines in BCG-induced IFN-gamma production: cytokine promotion and simulation of BCG effect. Cytokine 21: 17-26.
MacLennan, I. C., Gulbranson-Judge, A., Toellner, K. M., Casamayor-Palleja, M., Chan, E., Sze, D. M., Luther, S. A., Orbea, H. A. (1997) The changing preference of T and B cells for partners as T-dependent antibody responses develop. Immunol Rev 156: 53-66.
Martin-Fontecha, A., Thomsen, L. L., Brett, S., Gerard, C., Lipp, M., Lanzavecchia, A., Sallusto, F. (2004) Induced recruitment of NK cells to lymph nodes provides IFN-gamma for T(H)1 priming. Nat Immunol 5: 1260-1265.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
72
Marzochi, M. C., Coutinho, S. G., De Souza, W. J., De Toledo, L. M., Grimaldi Junior, G., Momen, H., Pacheco Rda, S., Sabroza, P. C., De Souza, M. A., Rangel Junior, F. B. (1985) Canine visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil. Clinical, parasitological, therapeutical and epidemiological findings (1977-1983). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 80: 349-357.
Mauel, J. Vaccination against Leishmania infections (2002). Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 2: 201-226.
Mayrink, W., Genaro, O., Silva, J. C., da Costa, R. T., Tafuri, W. L., Toledo, V. P., da Silva, A. R., Reis, A. B., Williams, P., da Costa, P. W. (1996) Phase I and II open clinical trials of a vaccine against Leishmania chagasi infections in dogs. Mem Inst Oswaldo Cruz 91: 695-697.
Medzhitov, R., Janeway, C. A., Jr. (1997) Innate immunity: impact on the adaptive immune response. Curr Opin Immunol 9: 4-9.
Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. (2003) Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 2604-2609.
Ministério da Saúde (2006), Manual de vigilância e controle daLeishmaniose Visceral, Secretaria de vigilância em saúde, Brasília, Brasil. 120p.
Molano, I., Alonso, M. G., Miron, C., Redondo, E., Requena, J. M., Soto, M., Nieto, C. G., Alonso, C. (2003) A Leishmania infantum multi-component antigenic protein mixed with live BCG confers protection to dogs experimentally infected with L. infantum. Vet Immunol Immunopathol 92: 1-13.
Montero, E., Valdes, M., Avellanet, J., Lopez, A., Perez, R., Lage, A. (2009) Chemotherapy induced transient B-cell depletion boosts antibody-forming cells expansion driven by an epidermal growth factor-based cancer vaccine. Vaccine 27: 2230-2239.
Moreno, J., Nieto, J., Masina, S., Canavate, C., Cruz, I., Chicharro, C., Carrillo, E., Napp, S., Reymond, C., Kaye, P. M., Smith, D. F., Fasel, N., Alvar, J. (2007) Immunization with H1, HASPB1 and MML Leishmania proteins in a vaccine trial against experimental canine leishmaniasis. Vaccine 25: 5290-5300.
Moreno, J., Vouldoukis, I., Martin, V., McGahie, D., Cuisinier, A. M., Gueguen, S. (2012) Use of a LiESP/QA-21 vaccine (CaniLeish) stimulates an appropriate Th1-dominated cell-mediated immune response in dogs. PLoS Negl Trop Dis 6: e1683.
Mosca, F., Tritto, E., Muzzi, A., Monaci, E., Bagnoli, F., Iavarone, C., O'Hagan, D., Rappuoli, R., De Gregorio, E. (2008) Molecular and cellular signatures of human vaccine adjuvants. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 10501-10506.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
73
Muller, A. J., Filipe-Santos, O., Eberl, G., Aebischer, T., Spath, G. F., Bousso, P. (2012) CD4+ T cells rely on a cytokine gradient to control intracellular pathogens beyond sites of antigen presentation. Immunity 37: 147-157.
Nathan, C. (2006) Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol 3: 173-182.
North, C. M., Crawford, R. B., Lu, H., Kaminski, N. E. (2010) 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-mediated suppression of toll-like receptor stimulated B-lymphocyte activation and initiation of plasmacytic differentiation. Toxicol Sci 116: 99-112.
O'Hagan, D.T. (2000) Vaccines adjuvants: preparation methods and research protocols. Human Press Inc.
Oscherwitz, J., Hankenson, F. C., Yu, F., Cease, K. B. (2006) Low-dose intraperitoneal Freund's adjuvant: toxicity and immunogenicity in mice using an immunogen targeting amyloid-beta peptide. Vaccine 24: 3018-3025.
O'Shea, J. J., Paul, W. E. (2010) Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science 327: 1098-1102.
Otsyula, N., Angov, E., Bergmann-Leitner, E., Koech, M., Khan, F., Bennett, J., Otieno, L., Cummings, J., Andagalu, B., Tosh, D., Waitumbi, J., Richie, N., Shi, M., Miller, L., Otieno, W., Otieno, G. A., Ware, L., House, B., Godeaux, O., Dubois, M. C., Ogutu, B., Ballou, W. R., Soisson, L., Diggs, C., Cohen, J., Polhemus, M., Heppner, D. G., Jr., Ockenhouse, C. F., Spring, M. D. (2013) Results from tandem Phase 1 studies evaluating the safety, reactogenicity and immunogenicity of the vaccine candidate antigen Plasmodium falciparum FVO merozoite surface protein-1 (MSP1(42)) administered intramuscularly with adjuvant system AS01. Malaria Journal 12: 29.
Palatnik-de-Sousa, C. B., dos Santos, W. R., Franca-Silva, J. C., da Costa, R. T., Reis, A. B., Palatnik, M., Mayrink, W., Genaro, O. (2001) Impact of canine control on the epidemiology of canine and human visceral leishmaniasis in Brazil. Am. J. Trop.Med. Hyg. 65: 510-517.
Palatnik-de-Sousa, C. B., Dutra, H. S., Borojevic, R. (1993) Leishmania donovani surface glycoconjugate GP36 is the major immunogen component of the fucose-mannose ligand (FML). Acta Trop 53: 59-72.
Palatnik-de-Sousa, C. B., Gomes, E. M., Paraguai-de-Souza, E., Palatnik, M., Luz, K., Borojevic, R. (1995) Leishmania donovani: titration of antibodies to the fucose-mannose ligand as an aid in diagnosis and prognosis of visceral leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg 89: 390-393.
Pantel, A., Cheong, C., Dandamudi, D., Shrestha, E., Mehandru, S., Brane, L., Ruane, D., Teixeira, A., Bozzacco, L., Steinman, R. M., Longhi, M. P. (2012) A new synthetic TLR4
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
74
agonist, GLA, allows dendritic cells targeted with antigen to elicit Th1 T-cell immunity in vivo. Eur J Immunol 42: 101-109.
Pape, K. A., Kouskoff, V., Nemazee, D., Tang, H. L., Cyster, J. G., Tze, L. E., Hippen, K. L., Behrens, T. W., Jenkins, M. K. (2003) Visualization of the genesis and fate of isotype-switched B cells during a primary immune response. J Exp Med 197: 1677-1687.
Parker, R., Deville, S., Dupuis, L., Bertrand, F., Aucouturier, J. (2009) Adjuvant formulation for veterinary vaccines: Montanide™ Gel safety profile. Procedia in Vaccinology 1: 140-147.
Parra, L. E., Borja-Cabrera, G. P., Santos, F. N., Souza, L. O., Palatnik-de-Sousa, C. B., Menz, I. (2007) Safety trial using the Leishmune vaccine against canine visceral leishmaniasis in Brazil. Vaccine 25: 2180-2186.
Peters, N. C., Bertholet, S., Lawyer, P. G., Charmoy, M., Romano, A., Ribeiro-Gomes, F. L., Stamper, L. W., Sacks, D. L. (2012) Evaluation of recombinant Leishmania polyprotein plus glucopyranosyl lipid A stable emulsion vaccines against sand fly-transmitted Leishmania major in C57BL/6 mice. J Immunol 189: 4832-4841.
Puri, N., Weyand, E. H., Abdel-Rahman, S. M., Sinko, P. J. (2000) An investigation of the intradermal route as an effective means of immunization for microparticulate vaccine delivery systems. Vaccine 18: 2600-2612.
Qiu, Q., Wang, R. Y., Jiao, X., Jin, B., Sugauchi, F., Grandinetti, T., Alter, H. J., Shih, J. W. (2008) Induction of multispecific Th-1 type immune response against HCV in mice by protein immunization using CpG and Montanide ISA 720 as adjuvants. Vaccine 26: 5527-5534.
Ramon, G. (1926) Procedes pour accroite la production des antitoxins. Ann. Inst. Pauster 40: 1-10.
Ravindran, R., Ali, N. (2004) Progress in vaccine research and possible effector mechanisms in visceral leishmaniasis. Current molecular medicine 4(6): 697-709.
Reed, S. G., Bertholet, S., Coler, R. N., Friede, M. (2009) New horizons in adjuvants for vaccine development. Trends Immunol 30: 23-32.
Reis, A. B., Giunchetti, R. C., Carrillo, E., Martins-Filho, O. A., Moreno, J. (2010) Immunity to Leishmania and the rational search for vaccines against canine leishmaniasis. Trends Parasitology 26: 341-349.
Reis, A. B., Martins-Filho, O. A., Teixeira-Carvalho, A., Carvalho, M. G., Mayrink, W., Franca-Silva, J. C., Giunchetti, R. C., Genaro, O., Correa-Oliveira, R. (2006) Parasite density and impaired biochemical/hematological status are associated with severe clinical aspects of canine visceral leishmaniasis. Res Vet Sci 81: 68-75.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
75
Reis, A. B., Martins-Filho, O. A., Teixeira-Carvalho, A., Giunchetti, R. C., Carneiro, C. M., Mayrink, W., Tafuri, W. L., Correa-Oliveira, R. (2009) Systemic and compartmentalized immune response in canine visceral leishmaniasis. Vet Immunol Immunopathol 128: 87-95.
Rivera, A., Chen, C. C., Ron, N., Dougherty, J. P., Ron, Y. (2001) Role of B cells as antigen-presenting cells in vivo revisited: antigen-specific B cells are essential for T cell expansion in lymph nodes and for systemic T cell responses to low antigen concentrations. Int Immunol 13: 1583-1593.
Roatt, B. M., Aguiar-Soares, R. D., Vitoriano-Souza, J., Coura-Vital, W., Braga, S. L., Correa-Oliveira, R., Martins-Filho, O. A., Teixeira-Carvalho, A., de Lana, M., Figueiredo Gontijo, N., Marques, M. J., Giunchetti, R. C., Reis, A. B. (2012) Performance of LBSap vaccine after intradermal challenge with L. infantum and saliva of Lu. longipalpis: immunogenicity and parasitological evaluation. PLoS One 7: e49780.
Sai-Kiang Lim. Freund adjuvant induces TLR2 but not TLR4 expression in the liver of mice. International Immunopharmacology.
Salmon, J. K., Armstrong, C. A., Ansel, J. C. (1994) The skin as an immune organ. West J Med 160: 146-152.
Sano, K., Haneda, K., Tamura, G., Shirato, K. (1999) Ovalbumin (OVA) and Mycobacterium tuberculosis bacilli cooperatively polarize anti-OVA T-helper (Th) cells toward a Th1-dominant phenotype and ameliorate murine tracheal eosinophilia. Am J Respir Cell Mol Biol 20: 1260-1267.
Schijns, V. E. (2000) Immunological concepts of vaccine adjuvant activity. Curr Opin Immunol 12: 456-463.
Schiller, J.T., Castellsague, X., Villa, L.L., Hildesheim, A. (2008) An update of prophylactic human papillomavirus L1 virus-like particle vaccine clinical trial results. Vaccine 26 Suppl 10: K53-61.
Schnare, M., Barton, G. M., Holt, A. C., Takeda, K., Akira, S., Medzhitov, R. (2001) Toll-like receptors control activation of adaptive immune responses. Nat Immunol 2: 947-950.
Serbina, N. V., Jia, T., Hohl, T. M., Pamer, E. G. (2008) Monocyte-mediated defense against microbial pathogens. Annu Rev Immunol 26: 421-452.
Sikora, J., Mielczarek-Palacz, A., Kondera-Anasz, Z. (2011) Role of natural killer cell activity in the pathogenesis of endometriosis. Curr Med Chem 18: 200-208.
Singh, M., O'Hagan, D. (1999) Advances in vaccine adjuvants. Nat Biotechnol 17: 1075-1081.
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
76
Singh, M., O'Hagan, D. T. (2002) Recent advances in vaccine adjuvants. Pharm Res 19: 715-728.
Sparg, S. G., Light, M. E., van Staden, J. (2004) Biological activities and distribution of plant saponins. J Ethnopharmacol 94: 219-243.
Stasiuk, L. M., Abehsira-Amar, O., Fournier, C. (1996) Collagen-induced arthritis in DBA/1 mice: cytokine gene activation following immunization with type II collagen. Cell Immunol 173: 269-275.
Streit, J. A., Recker, T. J., Donelson, J. E., Wilson, M. E. (2000) BCG expressing LCR1 of Leishmania chagasi induces protective immunity in susceptible mice. Exp Parasitol 94: 33-41.
Toledo, H., Baly, A., Castro, O., Resik, S., Laferte, J., Rolo, F., Navea, L., Lobaina, L., Cruz, O., Miguez, J., Serrano, T., Sierra, B., Perez, L., Ricardo, M. E., Dubed, M., Lubian, A. L., Blanco, M., Millan, J. C., Ortega, A., Iglesias, E., Penton, E., Martin, Z., Perez, J., Diaz, M., Duarte, C. A. (2001) A phase I clinical trial of a multi-epitope polypeptide TAB9 combined with Montanide ISA 720 adjuvant in non-HIV-1 infected human volunteers. Vaccine 19: 4328-4336.
Tritto, E., Mosca, F., De Gregorio, E. (2009) Mechanism of action of licensed vaccine adjuvants. Vaccine 27(25-26): 3331-3334.
Tsuji, S., Matsumoto, M., Takeuchi, O., Akira, S., Azuma, I., Hayashi, A., Toyoshima, K., Seya, T. (2000) Maturation of human dendritic cells by cell wall skeleton of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin: involvement of toll-like receptors. Infect Immun 68: 6883-6890.
Ulanova, M., Tarkowski, A., Hahn-Zoric, M., Hanson, L. A. (2001) The Common vaccine adjuvant aluminum hydroxide up-regulates accessory properties of human monocytes via an interleukin-4-dependent mechanism. Infect Immun 69: 1151-1159.
Vitoriano-Souza, J., Moreira, Nd, Teixeira-Carvalho, A., Carneiro, C. M., Siqueira, F. A., Vieira, P. M., Giunchetti, R. C., Moura, S. A., Fujiwara, R. T., Melo, M. N., Reis, A. B. (2012) Cell recruitment and cytokines in skin mice sensitized with the vaccine adjuvants: saponin, incomplete Freund's adjuvant, and monophosphoryl lipid A. PLoS One 7: e40745.
Vogel, F. R. (1995) Immunologic adjuvants for modern vaccine formulations.
Wagner, T. L., Ahonen, C. L., Couture, A. M., Gibson, S. J., Miller, R. L., Smith, R. M., Reiter, M. J., Vasilakos, J. P., Tomai, M. A. (1999) Modulation of TH1 and TH2 cytokine production with the immune response modifiers, R-848 and imiquimod. Cell Immunol 191: 10-19.
Wang, H. B., Weller, P. F. (2008) Pivotal advance: eosinophils mediate early alum adjuvant-elicited B cell priming and IgM production
Mathias, F. A. S. Referência Bibliográfica
77
Wangoo, A., Brown, I. N., Marshall, B. G., Cook, H. T., Young, D. B., Shaw, R. J. (2000) Bacille Calmette-Guerin (BCG)-associated inflammation and fibrosis: modulation by recombinant BCG expressing interferon-gamma (IFN-gamma). Clin Exp Immunol 119: 92-98.
Werneck, G.L. (2008) Forum: geographic spread and urbanization of visceral leishmaniasis in Brazil. Introduction. Cad Saude Publica 24: 2937-2940.
WHO (2010) World Health Organization. Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases.
Wu, J. J., Huang, D. B., Tyring, S. K. (2004) Resiquimod: a new immune response modifier with potential as a vaccine adjuvant for Th1 immune responses. Antiviral Res 64: 79-83.
Xu, S., Koldovsky, U., Xu, M., Wang, D., Fitzpatrick, E., Son, G. Koski, G. Czerniecki, B. J. (2006) High-avidity antitumor T-cell generation by toll receptor 8–primed, myeloid- derived dendritic cells is mediated by IL-12 production. Surgery 140: 170-178.
Yokoyama, M., Hassett, D. E., Zhang, J., Whitton, J. L. (1997) DNA immunization can stimulate florid local inflammation, and the antiviral immunity induced varies depending on injection site. Vaccine 15: 553-560.
Zhu, J., Paul, W. E. (2010) Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res 20: 4-12.
11. Anexo
Mathias, F. A. S. Anexo
79