Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus...

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE

Caracterização Fenotípica e

Genotípica de Staphylococcus

aureus Isolados de Pacientes com

Infecções Cutâneas Atendidos em

Unidades de Assistência à Saúde na

Cidade de Porto Alegre-RS

Autor: Luciane Cristina Gelatti Orientador: Pedro Alves d’ Azevedo

Co-orientador: Renan Rangel Bonamigo

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da

Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau de Mestre.

2009

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1 I

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE

Caracterização Fenotípica e

Genotípica de Staphylococcus

aureus Isolados de Pacientes com

Infecções Cutâneas Atendidos em

Unidades de Assistência à Saúde na

Cidade de Porto Alegre-RS

Autor: Luciane Cristina Gelatti Orientador: Pedro Alves d’ Azevedo

Co-orientador: Renan Rangel Bonamigo Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da

Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito para a obtenção do grau de Mestre.

2009

2 II

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Irineu e Sueli, pelo apoio e carinho em todos os

momentos da minha vida.

Ao meu irmão Gerson e meu sobrinho Gustavo, pela certeza do amor

que nos une, apesar da distância.

Ao Günther que me incentivou em todos os momentos. Pelo carinho,

amizade, dedicação e paciência. Sem o seu apoio a conclusão deste trabalho

teria sido mais difícil.

Ao Prof. Dr. Pedro Alves d’Azevedo pela orientação constante em todos

os momentos da realização deste trabalho. Obrigada pelo carinho dispensado

e o entendimento de minha ausência em alguns períodos desta jornada.

Ao Prof. Dr. Renan Rangel Bonamigo pelo acompanhamento e apoio

ofertados em todas as etapas deste curso de Pós-Graduação.

Aos colegas do Ambulatório de Dermatologia Sanitária do Rio Grande

do Sul, em especial à Dra. Letícia Maria Eidt, pelo exemplo de ética e

dedicação constante. Ao técnico de enfermagem do serviço de Hanseníase do

ADS, Paulo Cézar de Moraes por sua presteza na etapa de coleta de dados

dos pacientes incluídos no estudo.

À equipe do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), pelo

aporte dispensado na realização das técnicas de biologia molecular.

À Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre pelo

incentivo à pesquisa e aprimoramento científico.

A todos os que auxiliaram na execução deste trabalho e que estiveram

presentes neste momento: obrigada!

3 III

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 05 2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 07 2.1 O gênero Staphylococcus ................................................................ 07 2.2 Staphylococcus aureus..................................................................... 08

2.2.1 Fatores de virulência.............................................................................. 09

2.2.2 Resistência aos antimicrobianos beta-lactâmicos.................................. 12 2.2.3 Infecções nosocomiais............................................................................. 18

2.2.4 Infecções comunitárias............................................................................ 22

2.2.5 Tipos de clones MRSA circulantes......................................................... 28

3. OBJETIVOS....................................................................................................... 34 3.1 Objetivo Geral...................................................................................... 34 3.2 Objetivos Específicos......................................................................... 34 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 35 5. ARTIGO CIENTÍFICO......................................................................................... 53 ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS........................................................................ 54 ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS............................................................... 68 6. CONCLUSÕES................................................................................................... 83 7. ANEXOS............................................................................................................. 84 Artigo destinado a seção de ‘’relato de caso’’ da Revista Brasileira de

Medicina Tropical................................................................................................ 85

Artigo destinado a “seção de revisão” dos Anais Brasileiros de Dermatologia.... 94

Trabalho aceito para publicação no 49th ICAAC..................................................109

Trabalhos apresentados em Congressos............................................................110

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa...........................................................113

Termo de consentimento livre e esclarecido.......................................................116

4 IV

LISTA DE ABREVIATURAS

CA-MRSA MRSA associados ou adquiridos na comunidade CCR Cassete chromossome recombinase CDC Centers for Disease Control and Prevention CEB Clone Epidêmico Brasileiro CH Clone Húngaro CI Clone Ibérico

CNI/J Clone Nova Iorque/Japão DNA Ácido desoxirribonucleico

EMRSA 15 e 16 Clone Epidêmico MRSA 15 e16 EUA Estados Unidos da América GM1 monossialogangliosídeo

HA-MRSA MRSA associados ou adquiridos no hospital HlgA Gama hemolisina componente A HlgB Gama hemolisina componente B HlgC Gama hemolisina componente C

IS Sequência de inserção Kb Kilobases

ORF Open reading frame ORSA Oxacillin-resistant Staphylococcus aureus OSPC Oceania South Pacific Clone PAC Pneumonias adquiridas na comunidade PBP Penicillin binding protein PCR Polymerase Chain Reaction PVL Panton-Valentine leucocidina mm Milímetros

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus SCCmec Cassete cromossômico estafilocócico mec

SWP Oceania Southwest Pacific TSN The Surveillance Network USA United States of America

WA-MRSA Western-Australia MRSA

5

1. INTRODUÇÃO

O Staphylococcus aureus é uma das causas mais frequentes de

infecções nosocomiais e comunitárias, as quais podem apresentar altos índices

de morbidade e mortalidade (Forbes et al, 1998; Bannerman, 2003). O S.

aureus é encontrado colonizando a microbiota natural, principalmente a

nasofaringe e a pele, podendo tornar-se patogênico em condições como a

quebra da barreira cutânea ou a diminuição da imunidade. Os traumas que

comprometem a integridade da barreira cutânea constituem-se no principal

fator facilitador para a ação deste microrganismo, o agente etiológico mais

comum de infecções cutâneas (Altemeier et al, 1955; Ferreira et al, 1985;

Barraviera,1994).

As infecções mais comuns envolvem a pele (impetigos, celulites,

erisipelas) e lesões cutâneas em sítios diversos. A maioria das infecções

estafilocócicas são agudas e podem disseminar-se para diferentes tecidos e

provocar focos metastáticos. Quadros clínicos graves, como bacteremia,

pneumonia, osteomielite, endocardite, miocardite, pericardite, meningite,

abscessos musculares e cerebrais, são também frequentemente

documentados (Lowy,1998).

Os isolados de S. aureus com resistência in vitro ao antimicrobiano

oxacilina ou à cefoxitina são denominados ORSA (“oxacillin-resistant

Staphylococcus aureus”) ou MRSA (“methicillin-resistant Staphylococcus

aureus”). Tradicionalmente, as infecções causadas por este patógeno estavam

limitadas aos hospitais (HA-MRSA), entre pacientes apresentando fatores de

risco bem estabelecidos: internação em unidade de tratamento intensivo,

6

prolongada hospitalização, doença de base grave, procedimentos cirúrgicos,

exposição prolongada ou repetida aos antimicrobianos e a proximidade física

entre pacientes hospitalizados com pacientes colonizados ou infectados por

MRSA (Thompson et al, 1982; Bootsma et al, 2006).

A partir da década passada, infecções por este microrganismo têm sido

documentadas de forma crescente em pacientes provenientes da comunidade.

Os indivíduos normalmente acometidos por este “novo patógeno” não

apresentam os clássicos fatores de risco associados com a aquisição do MRSA

e foram denominados CA-MRSA (MRSA associados ou adquiridos na

comunidade) (Said-Salim et al, 2003).

Dessa forma, este trabalho objetivou realizar um estudo epidemiológico-

molecular em Staphylococcus aureus, provenientes de infecções de pele, em

duas unidades assistenciais na cidade de Porto Alegre-RS, para o melhor

conhecimento da emergência local desses novos padrões de resistência e suas

implicações epidemiológicas e clínicas.

7

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 O gênero Staphylococcus

O gênero Staphylococcus apresenta bactérias Gram-positivas, em forma

de cocos, com aproximadamente 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, que podem

apresentar-se isolados, aos pares, em cadeias curtas ou formando

agrupamentos semelhantes a “cachos de uva”. São imóveis, não esporulados

e, geralmente, não capsulados, apresentando positividade para catalase

(Koneman et al, 1997), com exceção das espécies S. saccharolyticus e S.

aureus subsp. anaerobius, que são catalase negativa (Bertrand et al, 2002).

Macroscopicamente, as colônias em meio de cultivo sólido são

relativamente grandes, com 1 a 2 mm de diâmetro, arredondadas, opacas,

cremosas e com uma coloração que varia de acinzentado até o amarelo-ouro.

A coloração amarelo-dourada é devido à presença de pigmentos carotenóides

na membrana citoplasmática dos S. aureus; e essa característica macroscópica

e prova da coagulase positiva, fermentação do manitol e produção de

dexoribonuclease complementa a identificação manual dessa espécie

(Koneman et al, 1997; Lowy, 1998).

As principais espécies envolvidas em doenças no ser humano são o

Staphylococcus aureus, o Staphylococcus epidermidis, o Staphylococcus

saprophyticus, o Staphylococcus haemolyticus e o Staphylococcus

lugdunensis. O S. aureus é a espécie mais frequentemente isolada e está

relacionado com uma ampla variedade de infecções em seres humanos

(Koneman et al, 1997).

8

2.2 Staphylococcus aureus

O S. aureus é o patógeno humano mais destacado entre as espécies

pertencentes ao gênero Staphylococcus. Trata-se de um microrganismo

comensal presente em diversas partes do corpo, principalmente na pele e nas

mucosas, como nasofaringe, axilas, vagina, faringe, períneo, umbigo

(crianças), trato urinário e feridas abertas (Forbes et al, 1998; Lowy, 1998;

Bannerman, 2003).

Dentre os sítios anatômicos, a região anterior das narinas apresenta o

maior índice de colonização, cuja prevalência é de aproximadamente 40%

entre as pessoas adultas sadias, podendo esta ser persistente (10 a 40%) ou

intermitente (30 a 70%). Acredita-se que o processo inicial de colonização das

narinas ocorra por uma interação entre proteínas da bactéria e carboidratos

presentes na mucina da secreção nasal (Lowy, 1998).

A partir do estabelecimento da colonização nasal, o indivíduo contamina

as próprias mãos e passa a ser um carreador de bactérias. O estado de

portador assintomático é um fator de risco importante na epidemiologia e

patogênese da doença, visto que a maioria das infecções nosocomiais são

adquiridas após exposição a mãos contaminadas de profissionais da saúde,

que podem estar colonizados transitoriamente com estafilococos de seu próprio

reservatório ou através do contato com outros pacientes infectados, ou mesmo,

colonizados (Lowy, 1998).

Os índices de colonização por S. aureus são maiores entre pacientes

com diabetes, usuários de drogas endovenosas, pacientes que requerem

hemodiálise e pacientes com sorologia positiva para o vírus da

9

imunodeficiência adquirida. Kluytmans e colaboradores revisaram 59 trabalhos

científicos, transversais, publicados entre 1934 e 1994, e analisaram a taxa

média de S. aureus nas narinas de portadores em diversos grupos

populacionais. Na população em geral, a taxa média de portador nasal foi de

37,2% (Kluytmans et al, 1997). A colonização é um fator de risco importante,

visto que 11% a 43% dos pacientes colonizados adquirem infecção (Lowy,

1998).

Um estudo do “SENTRY Antimicrobial Surveillance Program” para

monitorar a prevalência de patógenos e os padrões de resistência aos

antimicrobianos em infecções relacionadas à assistência à saúde em centros

médicos localizados na América do Norte, América Latina e Europa relata que

o S. aureus é o patógeno mais frequente em infecções de pele e tecidos moles,

no período de 1998 a 2004 (Moet et al, 2007).

As infecções estafilocócicas podem ser causadas por bactérias do

próprio indivíduo, de outros doentes ou de portadores sadios, iniciando após o

contato com áreas traumatizadas da pele ou mucosas, permitindo ao

microrganismo o acesso aos tecidos adjacentes ou à corrente sanguínea. No

entanto, a infecção pode ficar localizada ou disseminar-se, o que depende da

interação complexa entre os fatores de virulência do S. aureus e os

mecanismos de defesa do hospedeiro (Lowy, 1998).

2.2.1 Fatores de virulência

O S. aureus possui propriedades que podem contribuir para sua

habilidade de causar doenças, promovendo sucesso na sua instalação,

10

desenvolvimento e manutenção no tecido do hospedeiro (Koneman et al,

1997; Forbes et al, 1998). A virulência se deve a vários fatores, celulares e

extracelulares, entre os quais se destacam: a cápsula (exopolissacarídeo), os

peptideoglicanos, o ácido teicóico, as adesinas, a proteína A, as enzimas

catalase, betalactamases, coagulase livre, coagulase ligada, hemolisinas,

proteases, lipases, hialoronidase e a fibrolisina, toxinas estafilocócicas e as

exoproteínas (Koneman et al, 1997; Cookson, 1997; John et al, 1997; Lowy,

1998).

Um fator de virulência de grande importância produzido por alguns

isolados de S. aureus são as leucocidinas, que são toxinas bicomponentes,

compostas por duas cadeias polipeptídicas: o componente S (do inglês: slow-

eluting proteins, proteínas que eluem vagarosamente) e o componente F (do

inglês: fast-eluting proteins, proteínas que eluem rapidamente). Esta família era

composta inicialmente pelos bicomponentes da leucocidine de Panton-

Valentine (lukS-PV e lukF-PV) e da gama-hemolisina (HlgA, HlgB e HlgC), os

quais agiriam de forma sinérgica na gênese e manutenção de síndromes

clínicas. Os isolados de S. aureus capazes de produzir ambas as toxinas

podem codificar seis duplas diferentes, com efeitos de virulência distintos

dependendo do tipo de combinação formada (Murray et al, 2003).

O componente S se liga aos gangliosídeos GM1 nos leucócitos e o

componente F, que apresenta atividade enzimática, adenosina difosfato ribosila

a proteína que controla o metabolismo do fosfatidilinositol, que é uma

importante molécula sinalizadora nas células eucarióticas, envolvida no

controle dos processos celulares. Desta forma, a ação dessa toxina altera o

metabolismo fosfolipídico, causando interrupção das atividades normais da

11

célula (Salyers & Whitt, 2002). A lise por estas toxinas é mediada pela

formação de poros com posterior aumento da permeabilidade a cátions e

instabilidade osmótica (Murray et al, 2003).

A leucocidina de Panton Valentine (PVL) é uma das leucocidinas

produzidas por alguns isolados de S. aureus, principalmente aqueles

associados a infecções comunitárias. As primeiras evidências da atividade

leucolítica causada por alguns isolados de S. aureus foi observada em 1894,

por Van de Velde em infecções pleurais, ao demonstrar um isolado “mais

virulento”. O pesquisador descreveu que esse clone “mais virulento”

apresentava uma substância capaz de lisar leucócitos, e foi denominada de

substância leucocidina, (do inglês: substance leucocidine ou leukocidin) (Van

de Velde, 1894). Panton e Valentine, em 1932, estudando culturas originárias

de furúnculos detectaram e fizeram a primeira descrição da leucocidina e ainda

demonstraram a ligação entre a presença da toxina e o desenvolvimento de

abscessos severos de pele (Panton & Valentine, 1932).

A PVL é codificada pelos genes lukF-PV e lukS-PV, e sua presença está

associada a casos de infecções de pele, principalmente furúnculos e

abscessos, mas podem também causar infecção tecidual necrotizante,

pneumonia fulminante e sepse grave em crianças e jovens previamente

saudáveis (Crieber et al, 1992; Lina et al, 1999; Gillet et al, 2002). Lina e

colaboradores conduziram um estudo que demonstrou a presença dos genes

codificadores da PVL em 172 isolados de S. aureus provenientes de diferentes

processos infecciosos, através da reação em cadeia da polimerase (PCR).

Dados deste estudo demonstraram uma associação de positividade para PVL

em isolados de S. aureus provenientes de pneumonias adquiridas na

12

comunidade e em infecções graves de pele como furunculose e abscessos

cutâneos (Lina et al, 1999).

Mais recentemente, índices altos de mortalidade foram atribuídos a

isolados com esse determinante de virulência em indivíduos jovens

apresentando pneumonia necrotizante (Gillet et al, 2002). Posteriormente,

outros grupos de bicomponentes formadores de leucocidinas foram relatados:

LukM e lukE-lukD. Esse último proveniente de S. aureus isolados de pacientes

apresentando quadros de diarréia associada ao uso de antimicrobiano e

impetigo (Gravet et al, 1998; Gravet et al, 1999; Gravet et al, 2001).

2.2.2 Resistência aos antimicrobianos beta-lactâmicos

A implantação da antibioticoterapia no início da década de 1930, com a

utilização da sulfanilamida (descoberta por Gerhardt Domagk, em 1932),

ofereceu o primeiro desafio ao S. aureus. Contudo, ao verificarmos a evolução

da resistência frente a este antimicrobiano, observamos que, já no final daquela

década surgiam os primeiros isolados resistentes, apresentando um efeito

limitado devido à sua pobre efetividade clínica na presença de pus.

No início da década de 40, os Staphylococcus aureus, isolados de

diferentes processos infecciosos apresentavam uma boa resposta terapêutica à

penicilina, mas o uso contínuo deste antibiótico ocasionou a seleção de

isolados resistentes (Brumfitt & Miller, 1989). O mecanismo de resistência foi

determinado pela produção de uma beta-lactamase (penicilinase), uma serina

protease capaz de clivar o anel beta-lactâmico dessa classe de antimicrobiano,

tornado-a inativa. A resistência in vitro à penicilina demonstrada pelos isolados

13

de S. aureus em diferentes hospitais e regiões do mundo tornou inadequado o

uso profilático ou clínico deste antimicrobiano. Atualmente, menos de 5% dos

isolados apresentam perfil de sensibilidade à penicilina (Lowy, 1998).

Em 1960, penicilinas semi-sintéticas mais resistentes à ação de beta-

lactamases (meticilina e oxacilina) foram lançadas no mercado como

alternativa terapêutica para isolados produtores de penicilinase, uma vez que

esta droga não sofre ação dessa enzima. No entanto, isolados de S. aureus

apresentando um novo mecanismo de resistência às penicilinas semi-sintéticas

foram identificados imediatamente após a sua utilização na prática clínica

(Jevons, 1961). Essa resistência está relacionada à alteração de proteínas

ligadoras de penicilina (PBPs do inglês: penicillin binding proteins) codificada

por um gene cromossômico denominado mecA e sem relação com a produção

de beta-lacatamases. As amostras que a apresentam são frequentemente

referidas pela sigla MRSA (do inglês: methicillin-resistant Staphylococcus

aureus). Os S. aureus possuem normalmente quatro PBPs, e se tornam

resistentes aos antimicrobianos beta-lactâmicos pela produção de uma PBP

adicional, denominada de PBP2a ou PBP2’, que não está presente nos

isolados sensíveis (Chambers, 1997; Lowy, 1998). Esta PBP adicional se liga

fracamente às penicilinas e a outros beta-lactâmicos. É capaz de substituir a

função das outras PBPs bacterianas, atuando de forma plenamente funcional

durante o processo de transpeptidação e mantendo a síntese da parede celular

bacteriana (Chambers, 1997). A PBP2a tem a capacidade de preservar a

integridade da parede celular durante o crescimento e a divisão celular,

enquanto as enzimas usuais são inibidas por antimicrobianos beta-lactâmicos.

14

O gene mecA é parte integrante de um elemento genômico denominado

“cassete cromossômico estafilocócico mec” (SCCmec) (Katayama et al, 2000).

O SCCmec é um elemento genético móvel, integrado ao cromossomo dos

MRSA, flanqueado por sequências diretas e repetidas. Este elemento é uma

ilha genômica que está inserida no cromossomo na porção final 3’ de uma

região de fase aberta de leitura (orf, open reading frame) de função

desconhecida, denominada orfX, localizada próximo à origem de replicação de

S. aureus (Ito et al, 1999).

O SCCmec é formado por dois essenciais componentes genéticos, o

complexo do gene mec, que codifica resistência à oxacilina, e o complexo do

gene ccr (do inglês: cassette chromossome recombinase), responsável por sua

mobilidade. A região J (do inglês: junkyard) compreende todo o restante do

material genético do SCCmec. O complexo do gene mec compreende a

sequência de inserção IS431 às regiões do gene mecA e os seus

controladores, mecR1 e mecRI (Ito et al, 2001; Ma et al, 2002; Ito et al, 2004).

O controle da expressão do gene mecA é determinada pelos genes mecR1 e

mecl. O produto do gene mecl reprime a expressão do mecA ao se ligar ao

operador e esta repressão é revertida pela presença de meticilina ou outro

antimicrobiano beta-lactâmico no meio.O gene mecR1 codifica uma proteína

transmembrana que reconhece a presença de beta-lactâmicos e induz à

transcrição do gene mecA e consequente síntese de PBP2a (Ito et al, 2001;

McKinney et al, 2001).Três maiores classes do complexo do gene mec tem

sido identificadas em isolados de S. aureus resistentes à meticilina. A classe A

contém o complexo mec íntegro e é composta do mecA, genes reguladores,

mecR1 e mecI, e sequência de inserção IS431 (do inglês: sequence insertion).

15

As classes B e C apresentam os genes regulatórios interrompidos pelas

sequências de inserção IS1272 e IS431, respectivamente.

O complexo do gene ccr codifica recombinases que medeiam a excisão

e integração entre os componentes do SCCmec no cromossomo e são

responsáveis por sua mobilidade, permitindo a transmissão horizontal da

resistência entre isolados da mesma espécie ou entre espécies diferentes. Há

pelo menos cinco alotipos para o complexo do gene ccr (1, 2, 3, 4 e 5). Os tipos

1 a 4 de ccr carreiam os genes ccrA e ccrB, enquanto o tipo 5 carreia o gene

recombinase ccrC. As diferentes combinações entre o complexo do gene mec

e o complexo do gene ccr são utilizadas para classificar os tipos de SCCmec

em uma determinada categoria (Wu et al, 1996; Katayama et al, 2000; Ito et

al, 2001; McKinney et al, 2001; Hiramatsu et al, 2001; Wisplinghoff et al,

2003).

Até o presente, seis classes de SCCmec foram bem caracterizadas. Elas

diferem entre si no tamanho e composição genética. Estes elementos móveis

são classificados como tipo I, II, III, IV, V e IV, baseado na natureza do

complexo do gene mec e do gene ccr. Também diferem de acordo com a

composição da região J do DNA, que apesar de não possuir função claramente

definida, auxilia na descrição dos subtipos de SCCmec (Ito et al, 2001; Ito et

al, 2004; Ma et al, 2005; Oliveira et al, 2006).

Mais recentemente, SCCmec carreando estruturas mais intrincadas tem

sido reportados. Alguns contêm múltiplos complexos do gene ccr e outros,

apresentam diferentes combinações, atribuindo neste último, a mobilidade do

cassete cromossômico à atividade de recombinases colocadas na porção

16

adjacente do SCCmec (Diep et al, 2006; Goering et al, 2007; Heusser et al,

2007; Takano et al, 2008).

Na Suécia, a prevalência de MRSA está abaixo de 1%, mas a

diversidade genética encontrada é bastante grande. Neste contexto, um novo

tipo de cassete cromossômico móvel foi caracterizado, e seguindo a

nomenclatura preexistente deverá ser denominado de SCCmec tipo VII,

aumentando para sete o número de integrantes da família SCCmec (Berglund

et al, 2008).

O SCCmec tipo I apresenta peso molecular de aproximadamente 34,3

Kb. Não apresenta nenhum gene de resistência acoplado aos antimicrobianos,

com exceção do gene mecA. O SCCmec tipo II (53,0 Kb) além de apresentar

genes de resistência aos beta-lactâmicos, apresenta uma cópia integrada em

plasmídio (pUB110) e um transposon (Tn554).O plasmídio pUB110 carreia um

gene responsável por resistência à kanamicina, tobramicina e bleomicina. O

tipo III (66 Kb) contém genes determinantes de resistência integrada em

plasmídio (pT181), que codificam resistência à tetraciclina, e duas cópias do

transposon Tn554, que carreia o gene ermA, responsável pela resistência

induzível a macrolídeos (eritromicina, claritromicina, azitromicina), lincosamidas

(clindamicina, lincomicina) e estreptogramina B (quinupristina, pristinimicina)

(Ito et al, 2001). O SCCmec tipo IIIa difere do SCCmec tipo III pela ausência do

pT181 e seus elementos IS431. O SCCmec tipo IIIb não apresenta as cópias

integradas de Tn554, pT181 e do operon mer com suas sequências de

inserção associadas (Oliveira et al, 2002). Esses três tipos de SCCmec têm

sido geralmente descritos em isolados clínicos de MRSA de origem hospitalar

(HA-MRSA). Com exceção do SCCmec I, os tipos II e III possuem acoplados

17

ao cromossomo bacteriano vários determinantes de resistência, caracterizando

a multiresistência frequentemente observada em isolados provenientes de

ambientes hospitalares (HA-MRSA). Diferentemente, os isolados classificados

como CA-MRSA geralmente carreiam SCCmec tipos IV ou V e apresentam

maior sensibilidade aos antimicrobianos (Amorim et al, 2002; Perez-Roth et

al, 2004; Tenover et al, 2006).

Os isolados de S. aureus portadores do SCCmec tipo IV (20,9-24 Kb)

possuem resistência predominante aos antimicrobianos beta-lactâmicos. Este

tipo de elemento móvel é dividido nos subtipos IVa, IVb, IVc e IVd, baseado

nas diferenças da região J (Ma et al, 2002; Ito et al, 2003; Boyle-Vavra &

Daum, 2007). O SCCmec V (28 Kb), como os tipos IV e VI codifica resistência

exclusiva aos beta-lactâmicos (Ito et al, 2001; Ito et al, 2004; Oliveira et al,

2006). O primeiro relato de SCCmec tipo V ocorreu na Austrália, em uma

amostra MRSA oriunda da comunidade (Ito et al, 2004). Boyle-Vavra e

colaboradores, demonstraram uma nova variante em Taiwan para o SCCmec

tipo V , designada como SCCmec VT, em isolados que produziam leucocidina

de Panton Valentine e apresentam uma nova conformidade de ccrC (ccrC2)

(Coombs et al, 2004; O'Brien et al, 2004; Boyle-Vavra et al, 2005). O

SCCmec tipo VI, apresenta um novo alotipo de ccrAB (ccrAB4). A sua

presença foi observada em isolados MRSA inicialmente classificados como

pertencentes ao clone pediátrico e que apresentavam o SCCmec tipo IV. A

partir da observação deste novo alotipo, as amostras do clone pediátrico,

portanto, podem ser classificadas como SCCmec IV ou VI, dependendo da

composição do complexo do gene ccr, ccrAB2 ou ccrAB4, respectivamente

(Oliveira et al, 2006).

18

E, finalmente, um novo cassete móvel foi identificado na Suécia, em uma

amostra MRSA (JCSC6082) proveniente de um abscesso abdominal

subcutâneo. Os critérios epidemiológicos definiram este isolado como de

origem comunitária, apesar da paciente apresentar história prévia de

hospitalização. A intervenção cirúrgica ocorreu em decorrência de uma

salpingite e no abscesso presente foram observados resquícios de sutura

realizada há 24 anos. O novo elemento móvel carreia o complexo gênico ccr

tipo 5 e a classe C1 do complexo mec (5C1). Como sugerido pelo grupo de

pesquisadores este novo elemento deverá receber uma numeração Romana

(VII), sendo aguardada apenas a decisão do Comitê Internacional para

classificação deste novo cassete cromossômico (Berglund et al, 2008).

Isolados clínicos MRSA oriundos de infecções comunitárias

frequentemente carreiam SCCmec tipo IV, uma ilha de menor tamanho,

quando comparada aos elementos genéticos carreados pelos clones

associados com infecções nosocomiais, como os SCCmec I-III. Desta forma,

os isolados comunitários apresentam uma grande susceptibilidade aos

antimicrobianos não-betalactâmicos, explicada pela ausência de outros genes

de resistência acoplados ao complexo genômico SCCmec (Ito et al, 2001;

Daum et al, 2002).

2.2.3 Infecções nosocomiais

Segundo critérios do CDC, infecção nosocomial é uma situação

localizada ou sistêmica que resulta de uma reação adversa da presença de um

agente(s) infeccioso (s) ou sua(s) toxina(s) e que não estava presente nem em

19

incubação no momento da admissão hospitalar. Dados obtidos deste mesmo

Centro de Vigilância estimam que 5 a 10% dos pacientes hospitalizados

adquirem algum tipo de infecção. Outros dados revelam que mesmo com a

utilização de materiais descartáveis e técnicas de esterilização as taxas de

infecção hospitalar cresceram em 36% nos últimos 20 anos.

Dentre os microrganismos envolvidos em infecções hospitalares, o

S.aureus tem sido a maior causa de morbidade e mortalidade (Bannerman,

2003). Resultados de vigilância do “Surveillance and Control of Pathogens of

Epidemiologic Importance (SCOPE) mostraram que a taxa de mortalidade por

infecções sistêmicas em hospitais norte-americanos foi de 27%. Destes, o S.

aureus foi o agente responsável por uma taxa de mortalidade de 25%

(Wenzel & Edmond, 2001). Dados recentes, obtidos de outro programa de

vigilância mostram que o S. aureus permanece como um dos principais

agentes causadores de infecções relacionadas à assistência à saúde,

independente do período analisado, e o principal patógeno obtido de infecções

de pele e tecidos moles em centros médicos localizados na América do Norte,

América Latina e Europa, nos anos de 1998 a 2004 (Moet et al, 2007).

Infecções por S. aureus são também demonstradas pelo serviço de vigilância

eletrônica “The Surveillance Network-USA” (TSN), no qual o S. aureus foi o

mais prevalente dentre os pacientes hospitalizados (18,7% de todos os

isolados bacterianos) e o segundo mais prevalente entre os pacientes

ambulatoriais (14,7%), com dados coletados no período compreendido entre

1998 e 2005 (Styers et al, 2006). No Brasil, de acordo com resultados do

SENTRY, o S. aureus aparece em segundo lugar como o agente mais

frequente isolado em pneumonias (Sader et al, 2001).

20

Isolados de S. aureus com resistência in vitro ao antimicrobiano oxacilina

ou à cefoxitina são denominados ORSA (do inglês oxacillin-resistant

Staphylococcus aureus) ou MRSA (do inglês methicillin-resistant

Staphylococcus aureus). Apesar de a oxacilina ser usada no Brasil, e não a

meticilina, continua sendo empregada a expressão “meticilina resistente” ou

MRSA para designar as linhagens resistentes a este antimicrobiano (Amato et

al, 2000) e, por conseguinte, a todos os antimicrobianos apresentando o anel

beta-lactâmico, incluindo cefalosporinas e carbapenêmicos.

Alguns fatores de risco para aquisição do MRSA hospitalar (HA-MRSA)

estão bem estabelecidos: internação em unidade de tratamento intensivo,

prolongada hospitalização, grave doença de base, procedimentos cirúrgicos,

exposição prolongada ou repetida aos antimicrobianos e a proximidade física

entre pacientes hospitalizados com pacientes colonizados ou infectados por

MRSA (Thompson et al, 1982; Bootsma et al, 2006). Bootsma e

colaboradores, em recente estudo, demonstraram que a proximidade física

entre os pacientes é o principal fator na expansão de surtos, resultando em

aumento significativo do número de casos (Bootsma et al, 2006). Outro fator

de risco associado à colonização ou infecção por MRSA inclui os profissionais

da saúde, através de suas mãos contaminadas. Estes profissionais adquirem

transitoriamente o microrganismo, através do contato com o paciente infectado,

ou mesmo, colonizado, ou ainda pelo contato indireto, através do ambiente, via

reservatórios inanimados (Boyce et al, 1997).

Desde o primeiro relato de um isolado clínico resistente à meticilina em

1961 (Barber, 1961), o S. aureus tem sido reconhecido como o principal

patógeno hospitalar, apresentando taxas crescentes de infecção em todo o

21

mundo. Nos Estados Unidos da América, dados de vigilância do programa

NNIS (National Nosocomial Infections Surveillance) mostraram que a

prevalência de infecções por MRSA aumentou de 35,9% em 1992 para 64,4%

em 2003, entre os pacientes internados em UTIs (NNIS 2004; Klevens et al,

2006). Dados do programa SENTRY entre 1997 a 1998, demonstraram que

31% dos S. aureus isolados de pele e tecidos moles de pacientes dos hospitais

participantes da América Latina eram resistentes à meticilina (Gales et al,

2000). Taxas crescentes de MRSA foram observadas em pacientes com

diagnóstico de pneumonia nestes mesmos hospitais em 1998 (Lewis et al,

2000).

Na Inglaterra, um levantamento de dados demonstrou que as

notificações de morte atribuídas a infecções por MRSA aumentaram de 8%

para 44% em cinco anos. Houve um aumento de 3% para 28% em

bacteriemias e de 13% para 44% em pneumonias (Crowcroft et al, 2002). Em

março de 2005, os índices relatados de prevalência por MRSA eram 59,2% em

pacientes hospitalizados e 55% em pacientes de UTIs atendidos em hospitais

americanos (Styers et al, 2006). Dados de 2002 a 2005 do Consórcio

Internacional de Controle de Infecção, em cinquenta e cinco unidades de

tratamento intensivo em oito países em desenvolvimento (Argentina, Brasil,

Colômbia, Índia, México, Marrocos, Peru e Turquia) revelaram altas taxas de

infecção por MRSA em pacientes apresentando pneumonia associada a

ventilação mecânica ou infecções sanguíneas associadas a cateteres venosos

centrais, sendo em ambos aproximadamente 85% (Rosenthal et al, 2006).

Uma vez detectados isolados resistentes à meticilina, as opções

terapêuticas tornam-se bastante escassas, contribuindo para o alto custo que o

22

combate a este tipo de infecção acarreta. Desta forma, a aquisição de MRSA

pode levar a consequências graves para os pacientes e instituições, pois as

infecções causadas por estes patógenos implicam em terapêutica com

antimicrobianos de uso parenteral exclusivo, de toxidade e custo elevados.

Assim, além de prolongar o tempo de hospitalização, se faz necessário

medidas intensivas de controle da infecção (Huang & Platt, 2003).

2.2.4 Infecções comunitárias

Além de representar um dos principais patógenos responsáveis por

infecções hospitalares, o S. aureus é também um dos principais agentes

isolados de pacientes com infecções de pele e subcutâneo adquiridas na

comunidade, incluindo foliculites, impetigos, celulites e erisipelas (Forbes et al,

1998). Importante ressaltar que a infecção da pele e tecido celular subcutâneo

por S. aureus é frequentemente o foco inicial das septicemias estafilocócicas,

independente da faixa etária e do ambiente em que o paciente adquiriu a

infecção. Estudo recente nos Estados Unidos, avaliando pacientes com

infecção de pele e partes moles atendidos em unidades de emergência de 11

cidades americanas mostrou que o S. aureus foi obtido em 320 de 422

pacientes atendidos, aparecendo em primeiro lugar entre os agentes isolados

(Moran et al, 2006).

Aproximadamente 1-10 % de todos os casos de pneumonias adquiridas

na comunidade (PAC) são atribuídas ao S. aureus, e apresentam altos índices

de mortalidade e morbidade (Luna et al, 2000). Micek e colaboradores

conduziram um estudo retrospectivo com 208 pacientes com PAC entre 2003-

23

2005, o qual demonstrou que o S. aureus foi o segundo agente mais frequente,

sendo precedido apenas por isolados de Streptococcus pneumoniae (Micek et

al, 2007).

Tradicionalmente, as infecções causadas por S.aureus resistentes à

meticilina (MRSA) eram exclusivamente documentadas em hospitais (HA-

MRSA, do inglês: hospital acquired methicillin-resistant Staphylococcus

aureus). Entretanto, nos últimos anos, infecções em pacientes provenientes da

comunidade causadas por MRSA (CA-MRSA, do inglês: community acquired

methicillin-resistant Staphylococcus aureus) têm sido relatadas em vários

países do mundo (Rubio et al, 1999; Salmenlinna et al, 2002; Vandenesch et

al, 2003; Miklasevics et al, 2004; Chen et al, 2005). Isolados de CA-MRSA

causam, com frequência, infecções envolvendo a pele e partes moles, como

celulites e abscessos. No entanto, podem ser responsáveis por infecções

graves, como pneumonias e faciítes necrotizantes, bacteremias e choque

séptico (Diep et al, 2006; John & Schreiber, 2006).

Infecções por isolados de CA-MRSA estão habitualmente associadas a

crianças, jovens e pessoas saudáveis, especialmente as que vivem

aglomeradas ou que têm estrito contato físico entre si. A grande maioria dos

relatos na literatura relaciona atletas de esportes coletivos, indivíduos do

serviço militar, encarcerados, usuários de drogas endovenosas, desabrigados e

crianças de creches, sendo estes os indivíduos com risco aumentado de

desenvolver infecções por CA-MRSA. A apresentação típica seria de um jovem

atleta com abscesso e celulite e que, provavelmente, teria fatores contribuintes

como contato físico, dano cutâneo, e compartilhamento de equipamento

24

contaminado (CDC, 2003; Zinderman et al, 2004; Dietrich et al, 2004;

Nguyen et al, 2005; Kluytmans-Vandenbergh & Kluytmans, 2006).

Epidemiologicamente, isolados clínicos de MRSA são definidos como

CA-MRSA se coletados de pacientes ambulatoriais, ou coletados até 48 horas

após admissão hospitalar. Mas o critério tempo não deve ser considerado em

pacientes com fatores de risco para aquisição de HA-MRSA. Hospitalização

recente, uso de antimicrobianos, procedimentos cirúrgicos, uso de cateter

venoso ou dispositivos intravasculares e cutâneos de longa permanência e

internação em casa de repouso devem ser excluídos (Salgado et al, 2003;

CDC, 2005). O perfil fenotípico de sensibilidade aumentado aos

antimicrobianos, com exceção aos beta-lactâmicos, é uma característica

frequentemente observada. Se traduz pela ausência de outros genes de

resistência, à exceção do mecA, no complexo genômico SCCmec, de

representantes dos tipos IV e V, comumente associados a infecções

comunitárias. Os SCCmec IV e V apresentam uma ilha de resistência de menor

tamanho, quando comparada às ilhas carreadas por clones isolados em

infecções hospitalares (SCCmec I,II e III) (Amorim et al, 2002; Perez-Roth et

al, 2004; Tenover et al, 2006), e que na grande maioria conferem

multiresistência a esses isolados. A correta discriminação entre as formas de

infecção comunitária e hospitalar atribuídas ao MRSA devem ser

complementadas com a avaliação dos padrões genotípicos, através de

técnicas de epidemiologia molecular (Shopsin et al, 2003; Ribeiro et al,

2005; Kluytmans-Vandenbergh & Kluytmans 2006).

A expressão da leucocidina de Panton Valentine (PVL) é outra

importante característica genética associada com as cepas de CA-MRSA. A

25

PVL é codificada pelos genes lukF-PV e lukS-PV, e sua presença em isolados

de S. aureus está associada à necrose tecidual e destruição de leucócitos,

através da formação de poros na membrana celular (Dufour et al, 2002). A

presença desta exotoxina pode ser verificada através da pesquisa de genes

específicos, por reação em cadeia da polimerase. Em um estudo realizado nos

Estados Unidos, 98% dos isolados oriundos de infecções de pele e tecidos

moles apresentaram genes codificadores da PVL (Moran et al, 2006).

As infecções frequentemente associadas com essas cepas envolvem a

pele e tecidos moles, como furúnculos, foliculites, impetigos, artrite séptica e

até mesmo fasceíte necrotisante. Além disso, podem ser responsáveis por

infecções invasivas como endocardites, meningites, pneumonias e septicemia

grave (Lina et al, 1999; Gillet et al, 2002; Miller et al, 2005). A apresentação

clínica inicial observada nas infecções de pele normalmente é acompanhada

de dor intensa, sendo referida por alguns pacientes como semelhante à picada

de um aracnídeo (Diep et al, 2000). Por outro lado, esta apresentação clínica

pode levar a certo confundimento no diagnóstico da infecção por CA-MRSA,

visto que algumas lesões desenvolvem um abscesso com escara central, com

aparência similar à picada da Loxosceles reclusa. Dominguez (2004) relatou

uma série de casos nos quais as lesões foram previamente diagnosticadas e

tratadas como mordedura de aranha e até mesmo atribuídas ao vírus Varicella

Zoster (Dominguez, 2004).

Infecções como a fasciíte necrosante são incomuns por Staphylococcus

aureus, mas o crescente número de casos provocados por CA-MRSA se torna

preocupante. Em um estudo norte-americano de 2005, 14 de 843 pacientes

apresentaram-se com fasciíte necrosante durante um período de 15 meses. O

26

principal fator de risco associado a esses casos foi o uso de drogas injetáveis,

e todos os isolados de S. aureus mostraram genótipo similar e a presença de

genes codificadores da PVL (Miller et al, 2005).

Na América do Sul infecções causadas por MRSA em pacientes não-

hospitalizados foram observadas inicialmente em 2001, no Uruguai. A princípio,

casos esporádicos foram relatados, mas com o subsequente aumento do

número de infecções de pele em pacientes da comunidade por este patógeno,

houve a caracterização de um surto (Ma et al, 2005).

No Brasil, os primeiros isolados caracterizados como CA-MRSA tinham

apresentação clínica de furunculose e artrite séptica (Ribeiro et al, 2005).

Ainda não existem estudos de prevalência no Brasil, mas dados de outros

países, como os Estados Unidos, mostram que há uma grande variação de

frequência relacionada à geografia. Um estudo conduzido em 11 centros de

emergência de diferentes cidades dos EUA, durante agosto de 2004, obteve

uma taxa de prevalência global de 59%, com variação entre 15 a 74% (Moran

et al, 2006).

Um estudo multicêntrico, realizado na Argentina demonstrou uma alta

prevalência de Staphylococus aureus resistentes à meticilina isolados de

infecções em crianças provenientes da comunidade. Dentre as 447 amostras

analisadas nos anos de 2006 e 2007, 281 se encaixavam nos critérios

definidos para CA-MRSA. Essa investigação demonstrou que 62% dos isolados

eram oriundos de infecções de pele e partes moles. O estudo enfatiza uma

revisão urgente na terapia antimicrobiana empírica realizada para o tratamento

de lesões de pele, em crianças oriundas da comunidade (Paganini et al,

2008).

27

A infecção comunitária por MRSA têm sido motivo de preocupação, uma

vez que tal microrganismo não responde aos antimicrobianos beta-lactâmicos

comumente usados no tratamento empírico de diversas infecções na

comunidade (Diep et al, 2000). Em 1999, nos estados de Minessota e Dakota

do Norte, 4 crianças evoluíram a óbito por infecções atribuídas ao CA-MRSA

(CDC, 1999). Nesses casos, o uso de cefalosporinas foi inicialmente instituído

como tratamento. A demora no uso do antimicrobiano correto pode ter

contribuído para este desfecho.

Em outro estudo realizado nos Estados Unidos da América (EUA)

mostrou que 80% dos pacientes com infecções de pele e partes moles

receberam tratamento empírico. Destes, 57% não responderam ao tratamento,

pois o microrganismo apresentou resistência. Estes achados sugerem a

necessidade de reconsiderar as escolhas de tratamentos empíricos para

infecções em pele e tecidos moles em áreas onde MRSA é prevalente na

comunidade (Moran et al, 2006). Em um hospital-escola da Califórnia-EUA,

um estudo demonstrou a presença de 87% de MRSA entre os S. aureus

isolados de pacientes apresentando infecções cutâneas atendidos no setor de

emergência. Este estudo defende a drenagem dos abscessos cutâneos como

tratamento preferencial, em contrapartida ao uso de antimicrobianos

(Rajendran et al, 2007). Há algumas controvérsias na escolha do tratamento e,

até mesmo do antimicrobiano para o manejo das infecções de pele causadas

por S. aureus. As cefalosporinas estão entre os com maiores índices de

utilização.

As infecções causadas por MRSA deixaram de ser um problema

exclusivo do ambiente hospitalar e estão se tornando um problema emergente

28

na comunidade. Até o momento, os fatores de risco associados às infecções

por MRSA comunitário não estão completamente estabelecidos e o influxo de

pacientes ambulatoriais nas unidades de saúde pode ter impacto na

epidemiologia intra-hospitalar deste patógeno. É possível que os pacientes

colonizados ou infectados por MRSA SCCmec IV permaneçam sem as

medidas adotadas para controle da disseminação de MRSA, havendo a

possibilidade de disseminação intra-hospitalar dessa cepa. Por outro lado,

pacientes colonizados por MRSA SCCmec IV podem ser submetidos a

cirurgias ou procedimentos nos quais a profilaxia para MRSA deve ser

considerada, aumentando o risco de infecção nestes pacientes.

A escassez de estudos de prevalência é um fator limitante do

conhecimento da epidemiologia local relacionada ao CA-MRSA. Um aspecto

importante que pode facilitar o conhecimento da existência dessas cepas

circulantes é o cultivo laboratorial de infecções de pele e tecidos moles, em

locais de atendimento primário, como as unidades de emergência dos hospitais

ou em centros de assistência dermatológica. Assim, com a identificação do

microrganismo e realização do teste de susceptibilidade poderá ser instituído

um tratamento apropriado e direcionar as medidas de controle para este

patógeno.

2.2.5 Tipos de clones MRSA circulantes

Na atualidade, a tipagem molecular tem possibilitado obter novos dados,

que dão origem à epidemiologia molecular. No caso do S. aureus,

recentemente, depois de analisar uma grande variedade de cepas que circulam

29

em diferentes regiões do mundo e em diferentes períodos, foi evidenciado que

as cepas MRSA têm uma estrutura clonal conservada e que conta com um

número reduzido de clones com capacidade de disseminação global (Bustos-

Martínez et al, 2006). Com auxílio de técnicas moleculares, foi verificada a

existência de cinco clones principais de S. aureus resistentes à oxacilina

disseminados internacionalmente, classificados como clone Ibérico (CI) ou

USA500, clone Epidêmico Brasileiro (CEB)/Húngaro (CH), clone Nova

Iorque/Japão (CNI/J) ou USA100, clone Pediátrico Epidêmico ou USA800 e

clone EMRSA-16 ou USA200. A designação destas linhagens de MRSA reflete

a região na qual eles foram inicialmente identificados, ou indicam alguma

propriedade epidemiológica característica de determinada linhagem (Oliveira

et al, 2002).

A presença do clone Ibérico (SSCmec I) foi relatada pela primeira vez

em um surto nosocomial em 1989, na cidade de Barcelona, Espanha

(Dominguez et al, 1994). Posteriormente, este mesmo clone foi identificado

em vários países incluindo Portugal, Itália, Polônia, Bélgica, Alemanha,

Escócia, Suíça, França, República Tcheca e Estados Unidos (Sanches et al,

1995). Estudos mais recentes demonstram um decréscimo na incidência do

clone Ibérico no continente europeu, possivelmente decorrente de uma

substituição por outras linhagens clonais (Perez-Roth et al, 2002; Cuevas et

al, 2002; Melter et al 2003; Montesinos et al, 2006).

No Brasil, a partir de 1993 tem sido detectado um clone epidêmico

designado como clone Epidêmico Brasileiro (SCCmec IIIa). A descrição

ocorreu inicialmente em vários hospitais na cidade de São Paulo (Sader et al,

1994). Devido à sua capacidade de disseminação, estudos posteriores já

30

demonstraram a presença deste mesmo clone em outras cidades brasileiras

separadas por grandes áreas geográficas, como Manaus e Porto Alegre

(Teixeira et al, 1995). Isolados deste mesmo clone têm sido também

detectados em outros países, incluindo Argentina, Uruguai, Paraguai, Chile,

Portugal, Itália, República Tcheca e Grécia (Aires de Sousa et al, 1998;

Oliveira et al, 1998; Melter et al, 1999; Aires de Sousa et al, 2001;

Coimbra et al, 2003; Aires de Sousa et al, 2003; Aires-de-Sousa et al,

2008). Na Ásia, um estudo recente demonstrou que aproximadamente 90% dos

isolados MRSA são similares ao CEB (Feil et al, 2008).

Estudos em hospitais brasileiros demonstram que as infecções

causadas pelo MRSA são elevadas, sendo o CEB o clone de maior prevalência

e amplamente disseminado em nosso território (Loureiro et al, 2002). Outros

estudos revelam que estes isolados apresentam elevada resistência a vários

antimicrobianos, com consequente aumento no tempo de hospitalização e

mortalidade no caso de infecções (Farias et al, 1997; Moreira et al, 1998). O

clone Húngaro (SCCmec III) detectado primeiramente na Hungria é uma

variante do clone Epidêmico Brasileiro (SCCmec IIIa). O tipo III contém genes

codificadores de resistência integrada no plasmídio pT 181, diferentemente do

tipo IIIa que apresenta o plasmídio pI258 (Oliveira et al, 2000).

O clone de MRSA denominado Pediátrico (SCCmec IV) foi descrito

inicialmente em Lisboa-Portugal, em 1992, recebendo esta denominação por

terem sido isoladas em enfermarias que atendiam principalmente crianças (Sa-

Leao et al, 1999). Estudos posteriores demonstraram a presença deste clone

na Polônia, Estados Unidos, Colômbia e no Brasil (Sa-Leao et al, 1999; Melo

et al, 2004) . Um fato interessante observado nestes isolados é o padrão de

31

resistência aumentado aos antimicrobianos em relação ao CEB. Em estudo

conduzido por Aires de Sousa e colaboradores em Portugal, em 2006,

demonstrou a presença de apenas um único isolado representante desta

linhagem, sendo proveniente de um adulto hospitalizado em região mais ao Sul

do país (Aires de Sousa et al, 2008).

O clone Nova Iorque/Japão (SCCmec II) foi relatado inicialmente como

disseminado em Nova Iorque e Tóquio e, posteriormente, observado

amplamente distribuído em vários hospitais nos Estados Unidos (Aires de

Sousa et al, 2000). Atualmente, o clone MRSA com SCCmec tipo II

multiresistente é considerado predominante nos casos de infecções adquiridas

em hospitais nos Estados Unidos. A predominância do clone NI/J no Japão foi

corroborada por um estudo entre 245 isolados clínicos de MRSA oriundos de

diversos materiais clínicos de pacientes hospitalizados durante um período de

cinco anos (2001-2005). Esse estudo revelou uma porcentagem de

similaridade de 91,4% ao tipo II na tipagem do SCCmec (Zaraket et al, 2007).

Mais recentemente, estudos têm revelado a presença deste clone em países

europeus, como Hungria e Portugal (Amorim et al, 2007; Conceição et al,

2007). No Brasil, apenas um isolado similar ao clone Nova Iorque/Japão foi

documentado até o presente momento, colonizando um paciente em hospital

no Rio de Janeiro no ano de 2005 (de Miranda et al, 2007).

Os clones E-MRSA-15 e E-MRSA-16 emergiram no Reino Unido em

1991, e estão largamente distribuídos, sendo responsáveis por

aproximadamente 90% de todos os isolados MRSA naquele país. O clone E-

MRSA-15 (SCCmec IV) além de ser detectado em vários países europeus, tem

sido responsável pela substituição de clones previamente existentes em

32

diversas regiões do mundo (Johnson et al, 2001; Johnson et al, 2005).

Atualmente, este clone está disseminado em vários países da Europa,

incluindo Alemanha, República Tcheca, Espanha e Portugal (Witte et al, 1997;

Melter et al, 2006; Amorim et al, 2007; Alcoceba et al, 2007). Na Ásia, este

clone representou 66,1% de todos os isolados de MRSA provenientes de

hospitais locais em Singapura no primeiro semestre de 2006 (Hsu et al, 2007).

Além dos clones internacionais epidêmicos, outras linhagens

genotípicas têm sido descritas localmente, responsáveis muitas vezes pela

substituição dos clones internacionais. No oeste da Austrália, foram detectados

os primeiros isolados CA-MRSA, no final de 1980, causando infecção na

população indígena local. Foram, então, chamados de WA-MRSA (“Western

Australian” MRSA) (Udo et al, 1993). Depois disso, duas outras linhagens de

CA-MRSA emergiram na Austrália e na Nova Zelândia: o clone “Queensland” e

o clone “Oceania Southwest Pacific” (SWP), também denominado de OSPC

(“Oceania South Pacific Clone”) (Nimmo et al, 2000; Munckhof et al, 2003).

Os clones USA foram descritos pela primeira vez nos Estados Unidos da

América; o clone USA400 foi relatado no centro-oeste dos Estados Unidos em

unidades neonatais e em infecções puerperais. O USA300 tem sido relatado

em muitas regiões dos Estados Unidos, principalmente em jogadores de futebol

americano e presidiários (Bratu et al, 2006).Um estudo de Huang e col.

demonstrou que dos CA-MRSA isolados em infecções de pele e tecidos moles

na Califórnia, 87% eram clones USA300 (Huang et al, 2006). Recentemente,

foi reportado que aproximadamente 50% dos MRSA coletados de infecções de

pele e tecidos moles nos Estados Unidos pertencem ao clone USA300 (Moran

et al, 2006) e menos frequentemente ao USA400 (Maree et al, 2007).

33

No Brasil, os primeiros isolados caracterizados como CA-MRSA eram

similares ao clone OSPC e eram provenientes de uma única cidade no sul do

país (Porto Alegre) (Ribeiro et al, 2005). Posteriormente, um estudo

demonstrou a presença deste mesmo clone em isolados na região Sudeste

(Rio de Janeiro) (Ribeiro et al, 2007). Estas duas áreas geográficas estão

separadas por mais ou menos 1.500 quilômetros de distância, demonstrando

assim a disseminação do clone OSPC em diferentes regiões do país. O estudo

demonstrou também a presença de outras linhagens SCCmec IV

classicamente comunitárias, o USA300 e o USA400 recuperados de infecções

de pele e pneumonia.

A origem das cepas CA-MRSA, todavia, está sujeita a debates. Uma das

possibilidades é a descendência silvestre de cepas hospitalares, ocorrida por

meio de uma transformação vertical. Entretanto, num estudo onde se comparou

cepas hospitalares com cepas da comunidade, não se encontrou uma relação

entre as cepas HA-MRSA e CA-MRSA.

Outra possibilidade é que as cepas comunitárias surgiram como uma

consequência de uma transferência vertical dos genes da resistência à

meticilina. A transferência horizontal é possibilitada graças ao complexo do

gene ccr que se encontra no SCCmec, que codifica recombinases

responsáveis por sua mobilidade. É possível que essa transferência ocorra

pouco, e que as cepas CA-MRSA são conseqüência de um desses raros

eventos de transferência do gene mec, de um doador a um receptor

susceptível (Bustos-Martínez et al, 2006). Essas hipóteses estão, ainda, sob

estudos.

34

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Determinar as características fenotípicas e genotípicas de

Staphylococcus aureus, através do isolamento de amostras de infecções de

pele e tecidos moles em uma amostra de pacientes da cidade de Porto Alegre-

RS.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Verificar a presença do gene mecA, nos isolados de S. aureus;

-Identificar os diferentes tipos de elementos genéticos móveis-cassete

estafilocócico do gene mec (SCCmec), nos isolados de MRSA;

-Caracterizar as linhagens genotípicas de MRSA;

-Identificar a presença do gene lukF, codificador da PVL (Panton

Valentine LeuKocidin).

35

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Resistant Staphylococcus aureus Clones in Portuguese Hospitals: Surveillance

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53

5. ARTIGO CIENTÍFICO Artigo formatado conforme recomendações do International Journal of

Dermatology.

54

Staphylococcus aureus with susceptibility profile compatible with CA-MRSA in

south Brazil

1Luciane Cristina Gelatti1, Renan Rangel Bonamigo1, Fernanda Matsiko

Inoue2, Mirian Silva do Carmo2, Fernanda Marques da Silva Castrucci2, Ana Paula

Becker1, Antônio Carlos Campos Pignatari2, Pedro Alves d’ Azevedo1

1. Laboratório de Cocos Gram-positivos, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS. 2. Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP. Endereço para correspondência: Dra Luciane Cristina Gelatti.Laboratório de Cocos Gram-positivos, UFCSPA. Rua Sarmento Leite 245/Sala 203, 90050-170 Porto Alegre,RS. Tel: 55 51 3303-9000 e-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

55

Abstract

Introduction: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an

important pathogen commonly associated with nosocomial infections. However, it has

also been associated with community-acquired skin and soft tissue infections. There

are few data on the identification and prevalence of CA-MRSA infections in Brazil.

Purpose: To characterize Staphylococcus aureus isolates from community-

acquired skin and soft tissue infections.

Methods: Cross-sectional study of 104 patients with community-acquired skin

and soft tissue infections attending two health care centers in Porto Alegre, south

Brazil. Phenotypic characterization followed the Manual of Clinical Microbiology (2007)

recommendations. Molecular analysis of the isolates included detection of the mecA

gene by PCR, gene SCCmec typing, Panton-Valentine leukocidin (PVL) detection,

pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), and multilocus sequence typing (MLST).

Results: Of the 104 samples, 58 Staphylococcus aureus isolates were

obtained, of which five (8.6%) had a CA-MRSA-resistant profile. All five isolates had

the mecA gene and amplified to SCCmec type IV. Analysis of chromosomal DNA by

PFGE revealed the presence of two clusters related to international clones (OSPC and

USA300) with a Dice similarity coefficient >80%. The study was complemented by

MLST, which detected three different strains: ST30, ST8 and ST45, the latter not

presenting any relation with the clones compared in PFGE.

Conclusion: The presence of CA-MRSA reveals an important change in the

epidemiology of this pathogen, i.e. that resistant isolates can be found outside the

hospital setting. This study adds new elements to the knowledge of the molecular

biology of infections by MRSA with SCCmec type IV in south Brazil.

56

Introduction

Staphylococcus aureus is a microorganism responsible for a wide variety of

infectious diseases. The major concern refers mainly to methacyllin-resistant isolates,

which traditionally were limited to the hospital[1]. However, in recent years, community-

related MRSA (CA-MRSA) infections have been reported worldwide[2-5]. CA-MRSA

isolates frequently cause infections involving the skin and soft tissues, such as cellulite

and abscesses, but they might be responsible for severe infections such as necrotizing

pneumonia and fasciitis, bacteremia and septic shock[6, 7].

Infections by CA-MRSA isolates are usually associated with children, young

adults and healthy people, particularly those living close together or having close

physical contact with each other. Most reports in literature refer to athletes of team

sports, individuals doing military service, prison inmates, intravenous drug users,

homeless people and children in daycare centers, as having a higher risk of developing

CA-MRSA infections. The typical presentation would be a young athlete with abscess

and cellulitis, with contributing factors such as physical contact, skin lesions, and

sharing of contaminated equipment[8-12].

Epidemiologically, clinical MRSA isolates are defined as CA-MRSA if collected

from outpatients or collected up to 48 hours after hospital admission. However, the time

criterion should not be considered in patients with risk factors for HA-MRSA. Recent

hospitalization, use of antimicrobial drugs, surgical procedures, use of long-term

indwelling catheter or other intravascular and cutaneous devices, and admission to

nursing homes should be excluded[13, 14]. A phenotypic profile of increased

susceptibility to antimicrobial agents, except for beta-lactams, is a commonly observed

characteristic. This manifests itself as a lack of other resistance genes, except for

mecA, in the SCCmec genomic complex, of types IV and V representatives, usually

associated with community-acquired infections. SCCmec type IV and V present a

57

smaller resistance island when compared to the islands carried by isolated clones in

nosocomial infections (SCCmec I, II, and III)[15-17], which usually impart multi-

resistance to these isolates.

Panton-Valentine leukocidin (PVL) expression is another important genetic

characteristic associated with CA-MRSA strains. PVL is encoded by luk-PV and lukS-

PV genes, and its presence in S. aureus isolates is associated with tissue necrosis and

leukocyte destruction by forming pores in the cell membrane[18]. This exotoxin may be

detected by searching for specific genes by polimerase chain reaction.

CA-MRSA infections are subject of much concern, as the microorganism does

not respond to beta-lactam antimicrobial agents commonly used to empirically treat

various community infections[19].

The purpose of our study was to characterize Staphylococcus aureus isolates

from community-acquired skin and soft tissue infections in the city of Porto Alegre,

while searching for CA-MRSA.

Materials and Methods

The research was approved by the Ethics Committee in Research of the

Complexo Hospitalar da Santa Casa de Porto Alegre and the Ethics Committee in

Health Research of the Escola Pública de Saúde do Rio Grande do Sul. To take part in

the study, each patient or his or her legal representative signed a free and informed

consent form.

Bacterial isolates

In a cross-sectional study, the Staphylococcus aureus investigated originated

from skin and soft tissue infections of patients attending two reference healthcare

centers in south Brazil, namely the Sanitary Dermatology Outpatient Clinic of Rio

Grande do Sul and the Emergency Unit of the Complexo Hospitalar Santa Casa de

Porto Alegre, between September 2007 and March 2008.

58

Patients' inclusion criteria were a) male and female outpatients or patients

admitted to the hospital up to 48 hours before, b) presence of pyoderma (folliculitis,

furunculosis, impetigo), and c) signing of a free and informed consent form by the

patient or his or her legal representative. Exclusion criteria were a) presence of risk

factors associated with health care, such as recent hospital admission or surgical

interventions, presence of intravenous catheter or long-term indwelling

intravascular or cutaneous devices, and admission to nursing homes, b) isolation

from other microorganisms except for Staphylococcus aureus, c) positive samples

in duplicate, and d) patient or his or her legal representative did not consent taking

part in the study.

In addition to the clinical diagnostic and the phenotypic and genotypic

characteristics of the S. aureus, age and gender of patients with pyoderma were also

evaluated.

Sample collection

After decontaminating the margins and surface of the lesion with physiological

saline and 70% alcohol, biological material was collected with a sterile swab. The

material thus collected was sent to the Microbiology Laboratory of the Federal

University of Health Sciences of Porto Alegre where standard procedures for bacterial

isolation and identification of microorganisms present in the lesions were followed.

Phenotypic characterization

Phenotypic characterization followed the Manual of Clinical Microbiology

recommendations[20]. The tests used for identifying the Staphylococcus aureus were

Gram staining, growth and fermentation on mannitol agar, coagulase and DNAse

detection. Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Staphylococcus epidermidis ATCC

12228 were used as positive and negative control, respectively.

59

Susceptibility test

Disk diffusion test was performed according to CLSI recommendations[21]

with disks containing following antimicrobial agents: cefoxitin (30 µg), ciprofloxacin (5

μg), clindamycin (2 μg), chloramphenicol (30 μg), erythromycin (15 μg), gentamicin (10

μg), linezolid (30 μg), oxacillin (1 μg), trimethoprim-sulfamethoxazole (25 μg), and

vancomycin (30 μg). Resistance to macrolides and lincosamides was assessed by D-

test, with a distance of 15-26 mm between the clindamycin (2 µg) and erythromycin

(15 µg) disks, as previously described[22]. S. aureus ATCC 25923 was used as quality

control of the disk diffusion technique.

Molecular characterization

The complete molecular characterization (presence of the mecA gene,

determination of SCCmec type, detection of gene lukF, PFGE, and MLST) was

performed for the MRSA isolates. Gene mecA characterization and SCCmec typing

were performed by multiplex PCR assay, according to protocol previously developed

by Zhang et al.[23]. To detect the PVL-encoding gene, primers were synthesized

according to Figueiredo et al.[24], from genomic DNA sequences of the GenBank

database (GenBank access number AB006796). Analysis of chromosomal DNA of

MRSA isolates was performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), according to

protocol established by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC, Atlanta,

GA) for S. aureus molecular typing[25]. Multilocus sequence typing (MLST) was

performed following the procedures and recommendations described for MLST at

http://www.mlst.net.

Results

One-hundred and four patients, mostly males (70.1%) were analyzed for a

period of seven months. With regard to age, 10 patients (9.6%) were children, 27

(26%) were between 18 and 39 years old, and 67 (64.4%) were 40 years old or older.

60

Isolation of Staphylococcus aureus was obtained in 58 (55.8%) patients with

skin and soft tissue infections; five S. aureus isolates (8.6%) were resistant to oxacillin

and cefoxitin, having been characterized as CA-MRSA. Other patients showed

negative cultures or growth of various microorganisms. The resistance profile to

antimicrobials of the MRSA isolates is shown in Table 1. Most MRSA showed to be

multi-susceptible, a phenotypic characteristic observed in isolates characterized as

community-acquired.

All samples characterized as MRSA showed PCR amplification of the mecA

gene and amplified to SCCmec type IV by Zhang et al. method (2005). Among the type

IV SCCmec samples, three presented amplification of the PVL-encoding gene. PFGE

analysis of chromosomal DNA revealed two clusters related to international clones

(Figure 1), with a Dice similarity coefficient >80%. The study was supplemented with

MLST, which detected three different strains: ST30, ST8 and ST45, the latter not

presenting any relation with clones compared with PFGE.

Discussion

The present study allowed demonstrating the presence of MRSA among

Staphylococcus aureus isolates characterized as community-acquired (CA-MRSA in

8.6% of the cases), showing a change in the epidemiology of this microorganism, as

resistant isolates were found outside a hospital setting. The findings confirm the

potential emergence of MRSA in community settings in Porto Alegre, Brazil, in

individuals who do not have traditional risk factors for infection by this pathogen.

CA-MRSA isolates obtained in the present study showed an increased

susceptibility profile to antimicrobial agents, although three isolates showed resistance

to other antimicrobials, such as chloramphenicol (AD554), ciprofloxacin and

erythromycin (A31652), and erythromycin and clindamycin (A31651). Results herein

61

parallel those described by Chen et al. (2003) and Ribeiro et al. (2007), who revealed

CA-MRSA strains resistant to other non beta-lactam antimicrobials[5, 26].

The molecular characterization showed the presence of clonal type IV in all

MRSA isolates. The findings corroborate the increased susceptibility to antimicrobials,

attributed to SCCmec type IV, which is smaller and usually does not aggregate other

resistance determinants, unlike classical hospital strains. Analysis of chromosomal

DNA revealed a similarity to the OSPC clone in two isolates. Of the two patients

infected with CA-MRSA similar to the OSPC clone (SCCmec IV, ST30, PVL+), one

developed severe necrotizing pneumonia (A31656), secondary to soft tissue lesions

and was hospitalized for 50 days. The second patient infected with CA-MRSA of the

same clone showed recurrent furunculosis and was treated with first-generation

cephalosporin, however, with no cure of the lesions. Isolates pertaining to this clone

showed Panton-Valentine leukocidin-encoding genes, which contributed to aggravating

the clinical status.

The results confirm findings reported by Ribeiro et al. in isolates of skin

infections in the same Brazilian city in 2005[24]. The presence of circulating OSPC

clone is alarming, since an outbreak in the neighbor country Uruguay was attributed to

this very clone and several patients developed severe pneumonia[27]. Although

presenting SCCmec IV, ST30 and PVL+, a third isolate (A31655) did not show any

similarity with the OSPC clone. Another international clone found in our study was the

USA300 (SCCmec IV, ST8, PVL-). Most isolates pertaining to the USA300 clone

showed the PVL-encoding genes[17], however, recent studies have shown samples

that do not produce the toxin[26, 28]. The USA300 clone has been reported in many

regions of the USA, especially among football players and prison inmates[11, 29]. A

recent study in the US has shown that 50% of the MRSA isolates from skin and soft

tissue infections belong to the USA300 clone[28].

62

We emphasize the importance of identification and therapeutic practice in

infections associated with Staphylococcus aureus, particularly those caused by

methicillin-resistant isolates. In 1999, four children in the states of Minnesota and North

Dakota in the USA died from infections brought about by CA-MRSA[30]. In these

cases, cephalosporins were initially used in the treatment, and the delay in using an

appropriate antimicrobial agent may have contributed to this outcome. Another study

conducted in the USA showed that 80% of the patients with skin and soft tissue

infections received empirical treatment. Of these, 57% did not respond to treatment,

since the microorganism was resistant[28].These findings suggest the need for

reassess the choice of empirical treatments for skin and soft tissue infections in areas

where MRSA is prevalent in the community. In a teaching hospital in California, USA,

MRSA were detected in 87% of S. aureus isolates from patients with skin infections

treated at its emergency center. This study supports the drainage of skin abscesses as

a preferred treatment in opposition to using antimicrobial agents[31]. Despite

controversies concerning the choice of treatment and even of the antimicrobial agent to

manage skin infections caused by S. aureus, cephalosporins are amongst those with

highest utilization rates.

The emergence of S. aureus type IV as a pathogen associated with

community-acquired skin and soft tissue infections is remarkable. Another important

aspect that might prevent the dissemination of this microorganism is the certainty that

these strains are circulating outside the hospital setting. Thus, the importance of

laboratory cultivation and antimicrobial profiling of clinical material from skin and soft

tissue infections in primary care facilities, such as hospital emergency centers and

dermatological care centers is unequivocal.

Therefore, by identifying the microorganism and performing a susceptibility

test, an appropriate treatment may be implemented, which focuses control measures

on this pathogen.

63

The presence of CA-MRSA reflects a change in the epidemiology of this

pathogen, whereby resistant isolates can be found outside the hospital setting. The

study adds novel elements to the knowledge of molecular biology of MRSA infections

with SCCmec type IV in south Brazil, particularly in the city of Porto Alegre.

64

______________________________________________________________

Table 1. Resistance profile to antimicrobial agents of methycillin-resistant

Staphylococcus aureus in CA-MRSA isolates in Porto Alegre, Brazil.

Isolate Isolation Date Resistance profile SCCmec type A31651 09 Oct. 2007 CFO, CLI, ERI, OXA IV

A31652 08 Nov. 2007 CFO, CIP, ERI, OXA IV

A31655 30 Oct. 2007 CFO, OXA IV

A31656 22 Nov. 2007 CFO, OXA IV

AD554 12 Dec. 2007 CFO, CLO, OXA IV

65

______________________________________________________________

Figure 1. Cluster analysis of CA-MRSA samples containing SCCmec type IV

compared to international standard samples, using Dice similarity coefficient.

Sample identification SCCmec

66

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68

Staphylococcus aureus com perfil de sensibilidade compatível ao CA-MRSA

no sul do Brasil

2Luciane Cristina Gelatti1, Renan Rangel Bonamigo1, Fernanda Matsiko

Inoue2, Mirian Silva do Carmo2, Fernanda Marques da Silva Castrucci2, Ana Paula

Becker1, Antônio Carlos Campos Pignatari2, Pedro Alves d’ Azevedo1

1. Laboratório de Cocos Gram-positivos, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS. 2. Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP. Endereço para correspondência: Dra Luciane Cristina Gelatti.Laboratório de Cocos Gram-positivos, UFCSPA. Rua Sarmento Leite 245/Sala 203, 90050-170 Porto Alegre,RS. Tel: 55 51 3303-9000 e-mail: [email protected]


69

Resumo

Introdução: Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)

representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, mas

também têm sido associado a infecções de pele e tecidos moles adquiridas na

comunidade. Há escassez de dados referentes à identificação e prevalência das

infecções atribuídas ao CA-MRSA no Brasil.

Objetivo: Caracterizar os isolados de Staphylococcus aureus provenientes de

infecções de pele e tecidos moles de origem comunitária.

Métodos: Estudo transversal, com 104 pacientes apresentando infecções de

pele e tecidos moles de origem comunitária, atendidos no Ambulatório de

Dermatologia Sanitária do Rio Grande do Sul e na Emergência do Complexo

Hospitalar da Santa Casa de Porto Alegre. A caracterização fenotípica foi realizada

segundo recomendações do Manual de Microbiologia Clínica (2007). A análise

molecular dos isolados incluiu a detecção do gene mecA por PCR, tipagem do gene

SCCmec, pesquisa da toxina leucocidina de Panton Valentine, eletroforese em gel em

campo pulsado (PFGE) e sequenciamento multilocus (MLST).

Resultados: Nas 104 coletas realizadas, 58 isolados de Staphylococcus

aureus foram obtidos e 5 (8,6 %) apresentaram perfil de resistência de CA-MRSA.

Todas apresentavam o gene mecA e amplificaram para SCCmec IV. A análise do DNA

cromossômico (PFGE) revelou a presença de 2 clusters relacionados a clones

internacionais (OSPC e USA300), com similaridade maior a 80% pelo coeficiente de

Dice. O estudo foi complementado pela técnica de MLST e demonstrou 3 linhagens

diferentes: ST30, ST8 e ST45. Este último não apresentando relação com os clones

comparados no PFGE.

70

Conclusão: A presença de CA-MRSA reflete uma mudança na epidemiologia

deste patógeno, onde isolados apresentando resistência podem ser encontrados fora

do ambiente hospitalar. Este estudo adiciona novos elementos no conhecimento da

biologia molecular das infecções por MRSA no sul do Brasil, apresentando cassete

cromossômico tipo IV.

71

Introdução

O Staphylococcus aureus é um microrganismo responsável por uma ampla

variedade de enfermidades infecciosas. A grande preocupação está relacionada,

principalmente, com os isolados resistentes à meticilina (MRSA) que, tradicionalmente,

estavam limitados aos hospitais[1]. Entretanto, nos últimos anos, infecções em

pacientes provenientes da comunidade causadas por MRSA (CA-MRSA) têm sido

relatadas em vários países do mundo[1-5]. Isolados de CA-MRSA causam, com

frequência, infecções envolvendo a pele e partes moles, como celulites e abscessos.

No entanto, podem ser responsáveis por infecções graves, como pneumonias e

faciítes necrotizantes, bacteremias e choque séptico[6, 7].

Infecções por isolados de CA-MRSA estão habitualmente associadas a

crianças, jovens e pessoas saudáveis, especialmente as que vivem aglomeradas ou

que têm estrito contato físico entre si. A grande maioria dos relatos na literatura

relaciona atletas de esportes coletivos, indivíduos do serviço militar, encarcerados,

usuários de drogas endovenosas, desabrigados e crianças de creches, sendo estes os

indivíduos com risco aumentado de desenvolver infecções por CA-MRSA. A

apresentação típica seria de um jovem atleta com abscesso e celulite e que,

provavelmente, teria fatores contribuintes como contato físico, dano cutâneo, e

compartilhamento de equipamento contaminado[8-12].

Epidemiologicamente, isolados clínicos de MRSA são definidos como CA-

MRSA se coletados de pacientes ambulatoriais, ou coletados até 48 horas após

admissão hospitalar. Mas o critério tempo não deve ser considerado em pacientes

com fatores de risco para aquisição de HA-MRSA. Hospitalização recente, uso de

antimicrobianos, procedimentos cirúrgicos, uso de cateter venoso ou dispositivos

intravasculares e cutâneos de longa permanência e internação em casa de repouso

devem ser excluídos[13, 14]. O perfil fenotípico de sensibilidade aumentado aos

72

antimicrobianos, com exceção aos beta-lactâmicos, é uma característica

frequentemente observada. Se traduz pela ausência de outros genes de resistência, à

exceção do mecA, no complexo genômico SCCmec, de representantes dos tipos IV e

V, comumente associados a infecções comunitárias. Os SCCmec IV e V apresentam

uma ilha de resistência de menor tamanho, quando comparada às ilhas carreadas por

clones isolados em infecções hospitalares (SCCmec I,II e III)[15-17], e que na grande

maioria conferem multiresistência a esses isolados.

A expressão da leucocidina de Panton Valentine (PVL) é outra importante

característica genética associada com as cepas de CA-MRSA. A PVL é codificada

pelos genes lukF-PV e lukS-PV, e sua presença em isolados de S. aureus está

associada à necrose tecidual e destruição de leucócitos, através da formação de poros

na membrana celular[18]. A presença desta exotoxina pode ser verificada através da

pesquisa de genes específicos, por reação em cadeia da polimerase.

A infecção comunitária por MRSA têm sido motivo de preocupação, uma vez

que tal microrganismo não responde aos antimicrobianos beta-lactâmicos comumente

usados no tratamento empírico de diversas infecções na comunidade[19].

O objetivo do nosso estudo foi o de caracterizar os isolados de

Staphylococcus aureus provenientes de infecções de pele e tecidos moles de origem

comunitária na cidade de Porto Alegre a procura do CA-MRSA.

Materiais e métodos

O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

Complexo Hospitalar da Santa Casa de Porto Alegre e pelo Comitê de Ética em

Pesquisa em Saúde, da Escola de Saúde Pública do Rio Grande do Sul. Para

participar do estudo, o paciente ou seu responsável legal assinaram um termo de

consentimento livre e esclarecido.

73

Isolados bacterianos

Em um delineamento de estudo transversal, os Staphylococcus aureus

investigados foram originados de infecções de pele e partes moles apresentadas por

pacientes atendidos em centros de referência do sul do Brasil: Ambulatório de

Dermatologia Sanitária do Rio Grande do Sul e Unidade de Emergência do Complexo

Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, entre setembro de 2007 e março de 2008.

Os critérios de inclusão de pacientes neste estudo foram: a) pacientes

ambulatoriais ou coletados até 48 horas após admissão hospitalar, de ambos os

sexos. b) presença de piodermites (foliculites, furunculose, impetigo). c) assinatura do

paciente ou seu responsável legal no termo de consentimento livre e esclarecido.

Os critérios de exclusão dos mesmos foram: a) presença de fatores de risco

associados à assistência a saúde: hospitalização ou intervenções cirúrgicas recentes,

presença de cateter venoso ou dispositivos intravasculares e cutâneos de longa

permanência, e residência em instituição de saúde. b) isolamento de outros

microrganismos senão Staphylococcus aureus. c) amostras positivas em duplicata. d)

o não consentimento do paciente ou de seu responsável legal para o estudo proposto.

Foram avaliados além do diagnóstico clínico e das características fenotípicas

e genotípicas do S. aureus, a idade e o sexo dos pacientes portadores de piodermites.

Coleta das amostras

Procedeu-se a coleta do material biológico das lesões com auxílio de swab

estéril, após descontaminação das margens e superfície da lesão com solução

fisiológica e álcool a 70%. O material coletado foi encaminhado ao Laboratório de

Microbiologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, onde

foram realizados os métodos convencionais para o isolamento e identificação

bacteriana dos microrganismos presentes nas lesões.

74

Caracterização fenotípica

A caracterização fenotípica foi realizada segundo recomendações do Manual

de Microbiologia Clínica[20]. Para a identificação de Staphylococcus aureus, foram

utilizadas as seguintes provas: coloração de Gram, crescimento e fermentação do

ágar manitol, detecção da coagulase e DNAse. Staphylococcus aureus ATCC 25923 e

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 foram usadas como controle de qualidade

positivo e negativo respectivamente.

Teste de susceptibilidade

O teste de disco-difusão foi realizado de acordo com as recomendações do

CLSI[21] e os discos usados continham os agentes antimicrobianos: cefoxitina (30 µg),

ciprofloxacina (5 μg), clindamicina (2 μg), cloranfenicol (30 μg), eritromicina (15 μg),

gentamicina (10 μg), linezulida (30 μg), oxacilina (1 μg), trimetropim-sulfametoxazol

(25 μg) e vancomicina (30μg). A resistência aos macrolídeos e lincosaminas foi

verificada pela realização do teste D, atribuindo uma distância de 15 a 26 mm entre o

disco de clindamicina (2 µg) e o disco de eritromicina (15 µg), como descrita

previamente[22]. S. aureus ATCC 25923 foi usada como controle de qualidade da

técnica de disco-difusão.

Caracterização molecular

A completa caracterização molecular (presença do gene mecA, determinação

do tipo de SCCmec, detecção do gene lukF, PFGE e MLST) foi realizada para os

isolados MRSA. A determinação do gene mecA e do tipo de SCCmec foi realizada

utilizando-se o método de PCR multiplex, segundo o protocolo desenvolvido

previamente por Zhang e colaboradores[23]. Para a detecção do gene que codifica a

PVL, os primers foram sintetizados conforme Figueiredo e colaboradores[24], a partir

de sequências de DNA genômico incluídas no banco de dados GenBanK (número de

acesso GenBank AB006796). A análise do DNA cromossômico dos isolados MRSA foi

realizada pela técnica de eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE), segundo

75

protocolo estabelecido pelo CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,

Georgia), para tipagem molecular de S. aureus[25]. O sequenciamento multilocus

(MLST) foi realizado seguindo os procedimentos e recomendações descritas sobre

MLST no endereço digital http://www.mlst.net.

Resultados

Durante o período de 7 meses, foram analisados 104 pacientes, sendo a

maioria constituída por indivíduos do sexo masculino (70,1%). Quanto à faixa etária,

10 (9,6%) eram crianças, 27 (26%) tinham idade entre 18 a 39 anos e 67 (64,4%)

pacientes tinham 40 anos ou mais.

O isolamento de Staphylococcus aureus foi obtido em 58 (55,8%) pacientes

com infecções de pele e partes moles; 5 isolados de S. aureus (8,6%) apresentaram

perfil de resistência aos discos de oxacilina e cefoxitina, sendo caracterizados como

CA-MRSA. Os outros pacientes apresentavam culturas negativas ou crescimento de

microrganismos diversos. O perfil de resistência aos antimicrobianos para os isolados

MRSA está representado na tabela 1. Os MRSA, na maioria apresentaram-se

multissensíveis, característica fenotípica observada em isolados caracterizados como

comunitários.

Todas as amostras caracterizadas como MRSA apresentaram amplificação

para o gene mecA na PCR e amplificaram para SCCmec IV, pela metodologia de

Zhang e colaboradores (2005). Dentre as amostras SCCmec tipo IV, três

apresentaram amplificação para o gene que codifica PVL. A análise do DNA

cromossômico (PFGE) revelou a presença de 2 clusters relacionados a clones

internacionais (figura 1), com similaridade maior a 80% pelo coeficiente de Dice. O

estudo foi complementado pela técnica de MLST e demonstrou 3 linhagens diferentes:

ST30, ST8 e ST45. Este último não apresentando relação com os clones comparados

no PFGE.

76

Discussão

O presente estudo possibilitou demonstrar a presença de MRSA entre os

isolados de Staphylococcus aureus caracterizados como comunitários (CA-MRSA em

8,6% dos casos), demonstrando uma mudança na epidemiologia deste microrganismo,

onde isolados com resistência são encontrados fora do ambiente hospitalar. Estes

achados confirmam provável a emergência do MRSA em ambiente de comunidade em

Porto Alegre (Brasil), em indivíduos que não apresentam os tradicionais fatores de

risco estabelecidos para infecção por este patógeno.

Os isolados CA-MRSA obtidos no presente estudo apresentaram perfil de

sensibilidade aumentado aos antimicrobianos, apesar de três isolados expressarem

resistência a alguns outros antimicrobianos, como ao cloranfenicol (AD554);

ciprofloxacina e eritromicina (A31652); eritromicina e clindamicina (A31651). Os

resultados aqui demonstrados se equivalem com os descritos por Chen e

colaboradores (2003) e Ribeiro e colaboradores (2007), que revelam cepas CA-MRSA

apresentando resistência a outros antimicrobianos não beta-lactâmicos[5, 26].

A caracterização molecular demonstrou a presença do tipo clonal IV em todos

os isolados MRSA. Os achados confirmam a apresentação de um perfil aumentado de

sensibilidade aos antimicrobianos, atribuídos ao cassete cromossômico IV, que

apresenta menor tamanho e, na maioria das vezes não agrega outros determinantes

de resistência, diferentemente das cepas hospitalares clássicas. A análise do DNA

cromossômico revelou similaridade ao clone OSPC em dois isolados. Dos 2 pacientes

infectados por CA-MRSA similar ao clone OSPC (SCCmec IV, ST30, PVL+), um

desenvolveu pneumonia necrozante grave (A31656), secundária a lesão em partes

moles e permaneceu internado por 50 dias. O outro paciente infectado por CA-MRSA

pertencente a esse mesmo clone, apresentava furunculose de repetição e foi tratado

com cefalosporina de primeira geração, sem cura das lesões. Os isolados

77

pertencentes a este clone apresentam os genes codificadores da leucocidina de

Panton Valentine, fator contribuinte para o agravamento do quadro clínico.

Os resultados confirmam os achados descritos por Ribeiro e colaboradores,

em isolados de infecções de pele nesta mesma cidade brasileira, em 2005[24]. A

presença do clone OSPC circulante é preocupante, visto que no país vizinho Uruguai

um surto foi atribuído a este mesmo clone e vários pacientes desenvolveram

pneumonia grave[27]. Um terceiro isolado (A31655), apesar de possuir SCCmec IV,

ST30 e PVL+, não apresentou similaridade ao clone OSPC. O outro clone

internacional verificado em nosso estudo foi o USA300 (SCCmec IV, ST8 e PVL-). A

grande maioria dos isolados pertencentes ao clone USA300 apresentam os genes

codificadores da PVL[17], no entanto, estudos mais recentes demonstram amostras

não produtoras dessa toxina[26, 28]. O clone USA300 tem sido relatado em muitas

regiões dos Estados Unidos da América, principalmente entre jogadores de futebol

americano e presidiários[11, 29]. Em estudo mais recente realizado nos Estados

Unidos demonstrou que 50% dos MRSA isolados de infecções de pele e tecidos moles

pertencem ao clone USA300[28].

Ressaltamos a importância do reconhecimento e conduta terapêutica em

infecções associadas aos Staphylococcus aureus, principalmente aquelas causadas

por isolados resistentes à meticilina. Nos estados de Minessota e Dakota do Norte

(Estados Unidos da América), em 1999, 4 crianças evoluíram a óbito por infecções

atribuídas ao CA-MRSA[30]. Nesses casos, o uso de cefalosporinas foi inicialmente

instituído como tratamento. A demora no uso do antimicrobiano correto pode ter

contribuído para este desfecho. Um outro estudo realizado nos EUA mostrou que 80%

dos pacientes com infecções de pele e partes moles receberam tratamento empírico.

Destes, 57% não responderam ao tratamento, pois o microrganismo apresentou

resistência[28]. Estes achados sugerem a necessidade de reconsiderar as escolhas de

tratamentos empíricos para infecções em pele e tecidos moles em áreas onde MRSA

78

é prevalente na comunidade. Em um hospital-escola da Califórnia-EUA, foi

demonstrada a presença de 87% de MRSA entre os S. aureus isolados de pacientes

apresentando infecções cutâneas atendidos no setor de emergência. Este estudo

defende a drenagem dos abscessos cutâneos como tratamento preferencial, em

contrapartida ao uso de antimicrobianos[31].

Apesar das controvérsias na escolha do tratamento e, até mesmo do

antimicrobiano para o manejo das infecções de pele causadas por S. aureus, as

cefalosporinas estão entre os com maiores índices de utilização.

É notável a emergência de S. aureus tipo IV como um patógeno associado a

infecções de pele e partes moles adquiridas na comunidade. Um aspecto importante

que pode evitar a disseminação desse microrganismo é a certeza da circulação

dessas cepas fora do ambiente hospitalar. Com isso, observa-se a importância do

cultivo laboratorial e da realização do perfil antimicrobiano em material clínico

proveniente de infecções de pele e partes moles, em locais de atendimento primário,

como as unidades de emergência dos hospitais ou em centros de assistência

dermatológica.

Assim, com a identificação do microrganismo e realização do teste de

susceptibilidade poderá ser instituído um tratamento apropriado e, com isso direcionar

as medidas de controle para este patógeno.

A presença de CA-MRSA reflete uma mudança na epidemiologia deste

patógeno, onde isolados apresentando resistência podem ser encontrados fora do

ambiente hospitalar. Este estudo adiciona novos elementos no conhecimento da

biologia molecular das infecções por MRSA no sul do Brasil, principalmente na cidade

de Porto Alegre, apresentando cassete cromossômico tipo IV.

79

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81

______________________________________________________________

Tabela 1. Perfil de resistência aos antimicrobianos de Staphylococcus aureus

resistentes à meticilina, isolados CA-MRSA em Porto Alegre, RS.

Isolado Data do isolamento Perfil de resistência SCCmec A31651 09 Oct. 2007 CFO, CLI, ERI, OXA IV

A31652 08 Nov. 2007 CFO, CIP, ERI, OXA IV

A31655 30 Oct. 2007 CFO, OXA IV

A31656 22 Nov. 2007 CFO, OXA IV

AD554 12 Dec. 2007 CFO, CLO, OXA IV

82

____________________________________________________________

Figura 1. Análise de clusters das amostras CA-MRSA contendo SCCmec IV,

comparando com amostras padrões internacionais, utilizando o coeficiente de

similaridade de Dice.

SCCmec Identificação da amostra

83

6. CONCLUSÕES

- As amostras MRSA amplificaram para o gene mecA, confirmando a

sensibilidade atribuída ao teste de susceptibilidade por disco difusão utilizando

os dicos de oxacilina (1 μg) e cefoxitina (30 μg), na detecção de resistências no

Laboratório de Microbiologia;

- Todas as amostras CA-MRSA carreavam SCCmec tipo IV, fortalecendo

a hipótese que amostras comunitárias apresentam predominantemente este

tipo de cassete cromossômico;

- A análise do DNA cromossômico (PFGE) revelou a presença de 2

clusters relacionados a clones internacionais (OSPC e USA300), sugerindo

provável a emergência do CA-MRSA em ambientes da comunidade;

- Detectou-se três isolados carreando o gene para PVL, dois

pertencentes ao clone OSPC e um apesar de possuir SCCmec IV, ST30 e

PVL+, não apresentou similaridade a esse clone;

- O nosso estudo revelou o primeiro caso de pneumonia necrozante

grave, secundária a lesão em partes moles atribuído ao CA-MRSA, este

isolado apresentou similaridade ao clone OSPC, PVL+ e ST 30.

84

7. ANEXOS

Produção científica adicional

Artigo destinado a seção de ‘’relato de caso’’ da Revista da Sociedade

Brasileira de Medicina Tropical.

85

Sepse por Staphylococus aureus resistente à meticilina adquirido na comunidade no sul do Brasil

Sepsis for methicillin-resistant Staphylococcus aureus community-acquired in south of Brazil

3Luciane Cristina Gelatti1, Tereza Sukiennik2, Ana Paula Becker1, Fernanda Matsiko Inoue3, Mirian Silva

do Carmo3, Fernanda Marques da Silva Castrucci3, Antônio Carlos Campos Pignatari3, Luis Carlos

Ribeiro2, Renan Rangel Bonamigo1 e Pedro Alves d’ Azevedo1

RESUMO

Staphylococcus aureus resistente à meticilina foi inicialmente descrito como um típico microrganismo

adquirido em infecções nosocomiais. No entanto, nos últimos anos Staphylococcus aureus resistente à

meticilina adquirido na comunidade é causa de infecções de pele e tecidos moles, mas infecções graves

como pneumonia e sepse podem ocorrer. Este relato descreve um caso de sepse em criança, complicado

com pneumonia secundária a lesão em partes moles por Staphylococcus aureus resistente à meticilina

adquirido na comunidade no Sul do Brasil. O paciente foi atendido em Unidade de Emergência com

história de ferimento provocado por trauma em membro inferior que evoluiu para celulite, pneumonia e

sepse.

Palavras-chaves: Staphylococcus aureus. Meticilina. Sepse.

ABSTRACT

1. Laboratório de Cocos Gram-positivos, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS. 2. Controle de Infecção, Complexo Hospitalar da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, Porto Alegre, RS. 3. Laboratório Especial de Microbiologia Clínica, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP. Endereço para correspondência: Dra Luciane Cristina Gelatti.Laboratório de Cocos Gram-positivos, UFCSPA. Rua Sarmento Leite 245/Sala 203, 90050-170 Porto Alegre, RS. Tel: 55 51 3303-9000 e-mail: [email protected]


86

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus was initially described as typical nosocomial pathogen.

However, in recent years methicillin-resistant Staphylococcus aureus community-acquired is a cause of

skin and soft-tissues infections, but infections such as pneumonia and sepsis either can occur. This report

describes a case of sepsis in children, complicated by pneumonia secondary to soft tissue injury caused by

methicillin-resistant Staphylococcus aureus community-acquired in South of Brazil. The patient was

attended on Emergency Unit with a history of injury caused in left thigh that evolved for cellulitis,

pneumonia and sepsis.

Key-words: Staphylococcus aureus. Methicillin. Sepsis.

O Staphylococcus aureus faz parte da microbiota natural, principalmente da pele, podendo tornar-se

patogênico em condições como a quebra da barreira cutânea ou diminuição da imunidade. Os traumas que

comprometem a integridade da barreira cutânea constituem-se na principal causa de mudança de

comportamento deste microrganismo, para o agente etiológico mais comum de infecções cutâneas1 2 6 .

As infecções mais comuns envolvem a pele (celulite, impetigo) e feridas em sítios diversos. Algumas

infecções por Staphylococcus aureus são agudas, piogênicas e podem disseminar para diferentes tecidos e

provocar focos metastáticos. Episódios mais graves, como bacteremia, pneumonia, osteomielite,

endocardite, miocardite, pericardite, meningite, abscessos musculares e cerebrais, são também

frequentemente documentados. Portadores nasais e pacientes colonizados por Staphylococcus aureus têm

sido descritos como fator de risco para o desenvolvimento de infecções, e 11% a 43% dos pacientes

colonizados adquirem infecção. O aspecto do processo infeccioso depende dos fatores de virulência do

patógeno e de mecanismos de defesa do hospedeiro11.

Os isolados de Staphylococcus aureus que apresentam resistência à meticilina são denominados MRSA,

e representam um importante patógeno nosocomial. Vários fatores de risco estão relacionados com

aquisição deste microrganismo: internação em unidade de tratamento intensivo, prolongada

hospitalização, doença de base grave, procedimentos invasivos e exposição prolongada ou repetida aos

antimicrobianos5 11. A resistência à meticilina é determinada pelo staphylococcal cassette chromosome

87

mec (SCCmec), que carreia o gene mecA, o qual apresenta baixa afinidade por todos os antimicrobianos

beta-lactâmicos9.

Tradicionalmente, as infecções causadas por este patógeno estavam limitadas aos hospitais, porém, a

partir da década passada, infecções foram descritas em todo o mundo, de forma crescente em crianças e

adultos provenientes da comunidade, sem os tradicionais fatores de risco, e foram denominados de

Staphylococcus aureus resistentes à meticilina associados ou adquiridos na comunidade (CA-MRSA)8 15.

As síndromes clínicas causadas por estes isolados se estendem de infecções de pele e partes moles até

pneumonia e sepse grave3 4 13.

Os isolados de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina associados ou adquiridos na comunidade

apresentam características fenotípicas e genéticas distintas, quando comparadas às cepas típicas isoladas

nos hospitais. Duas importantes características genéticas estão associadas com os isolados comunitários: a

presença do SCCmec do tipo IV ou V , os quais são elementos genéticos menores e na grande maioria

carream apenas resistência aos antimicrobianos beta-lactâmicos. No entanto, Staphylococcus aureus

resistentes à meticilina isolados em infecções hospitalares são na maioria multidrogas resistentes e

apresentam SCCmec I, II ou III7 14 . A presença de genes codificadores da exotoxina leucocidina de

Panton-Valentine (PVL) é outra importante característica observada nos isolados comunitários. A

presença desta toxina causa necrose tecidual e destruição de leucócitos, através da formação de poros na

membrana celular. A maioria dos isolados portadores deste gene está associado a infecções de pele,

principalmente furúnculos e abscessos, mas pode também causar pneumonia e sepse grave10.

RELATO DE CASO

Quadro clínico e exames. Paciente masculino, 7 anos de idade, morador da região metropolitana de

Porto Alegre, Sul do Brasil, foi atendido em Unidade Pediátrica de Emergência apresentando quadro

séptico com dificuldade respiratória e escarro hemoptóico. Em exame físico foi observada a presença de

ferimento em membro inferior esquerdo que evoluiu para celulite. A análise laboratorial do sangue no

momento da admissão revelou contagem total de leucócitos 21.040µ/l (89% neutrófilos, sendo 21% de

bastonetes, 4% linfócitos, 6% monócitos e 1% eosinófilos); plaquetas 168.000/µl ; hemoglobina 11,2g/dl;

88

velocidade de sedimentação das hemácias (VHS) 91mm; uréia 45mg/dl, creatinina 0,6mg/dl; sódio

126mEq/L e potássio 3,6mEq/L. Cultura de sangue foi realizada. Em radiografia de tórax foi evidenciada

uma imagem compatível com pneumonia bilateral. O diagnóstico clínico inicial foi de pneumonia e

celulite em coxa esquerda. Foi realizada drenagem cirúrgica da celulite apresentando abscesso em

membro inferior esquerdo (MIE) e em Rx dessa região foi observado comprometimento ósseo. Em

hemocultura coletada no momento da admissão foi observado crescimento de um Staphylococcus aureus

resistente à meticilina. O quadro evoluiu de forma grave e evidenciou-se a presença de abscesso hepático

e múltiplos abscessos pulmonares, além de aneurisma de vaso pulmonar com comunicação brônquica que

provocou o quadro de hemoptise. O paciente foi submetido a embolização do aneurisma, apresentando

uma boa resposta. Recebeu tratamento antimicrobiano com clindamicina por 44 dias, mais 14 dias de

gentamicina com boa evolução. Após 50 dias de internação obteve alta hospitalar em bom estado clínico,

com resolução completa do quadro pulmonar e hepático.

Caracterização fenotípica e genotípica do isolado bacteriano. A identificação da espécie/gênero foi

realizada por técnica microbiológica rotineira e o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de acordo

com a metodologia de disco-difusão estabelecida pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),

2008. Um Staphylococcus aureus resistente à meticilina foi isolado na cultura de sangue colhido no

momento da admissão e também no exame bacteriológico de secreção purulenta do abscesso obtido com

o debridamento realizado em membro inferior esquerdo (MIE). O isolado foi resistente para oxacilina e

cefoxitina, mas susceptível para outros antimicrobianos não-betalactâmicos incluindo eritromicina,

clindamicina, vancomicina, sulfametoxazol-trimetropim, ciprofloxacina, doxiciclina, tigeciclina e

gentamicina. O estudo molecular pela reação em cadeia da polimerase (PCR) incluiu a determinação do

gene mecA, tipo de SCCmec e a presença do gene lukF codificador da toxina leucocidina de Panton-

Valentine. O tipo clonal deste isolado foi investigado por pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). O

isolado de Staphylococcus aureus foi caracterizado como mecA positivo e com staphylococcal cassette

chromosome mec tipo IVc e leucocidina de Panton-Valentine positiva. O tipo clonal desse isolado foi

identificado como similar ao clone OSPC.

89

DISCUSSÃO

O nosso estudo demonstra um caso de sepse complicado com pneumonia grave secundária a lesão em

partes moles, acometendo uma criança atendida em Unidade de Emergência de um grande hospital e que

permaneceu internada por 50 dias. Um Staphylococcus aureus com resistência apenas à meticilina foi

identificado na hemocultura e na secreção purulenta proveniente do abscesso em membro inferior

esquerdo. Neste estudo, todas as características epidemiológicas iniciais obtidas, acompanhadas do perfil

fenotípico de sensibilidade observado convertiam a um Staphylococcus aureus resistente à meticilina

adquirido na comunidade. A caracterização molecular demonstrou a presença do SCCmec tipo IVc e

similar ao clone OSPC, confirmando os achados descritos por Ribeiro e cols, em isolados de infecções de

pele nesta mesma cidade brasileira16. A presença do clone OSPC circulante é preocupante, visto que no

país vizinho Uruguai um surto foi atribuído a este mesmo clone12.

O desenvolvimento de infecções graves causadas por MRSA contribui com o aspecto relevante deste

patógeno também como agente causal de infecção em pacientes da comunidade. Os isolados de

Staphylococcus aureus resistentes à meticilina até pouco tempo eram considerados típicos patógenos

nosocomiais e apresentando perfil de sensibilidade reduzido aos antimicrobianos. No entanto, com a

descrição de múltiplos casos em todo o mundo de infecções em adultos e crianças, sem os tradicionais

fatores de risco para sua aquisição e apresentando perfil de sensibilidade aumentado aos antimicrobianos

pôde ser observada a emergência do Staphylococcus aureus resistente à meticilina adquirido na

comunidade como um novo patógeno.

A gravidade das infecções é atribuída em grande parte a presença da toxina de Panton Valentine,

frequentemente descrita em isolados pertencentes ao clone OSPC. Este parece ser o primeiro relato de

sepse complicado com pneumonia secundária a lesão em partes moles no Brasil, causado por

Staphylococcus aureus resistente à meticilina comunitário apresentando leucocidina de Panton Valentine.

O reconhecimento de cepas de MRSA sugerindo esse determinante genético é bastante importante, visto o

aspecto fulminante da infecção desenvolvida. A presença de características fenotípicas e genéticas

distintas entre as cepas de Staphylococcus aureus fazem da investigação clínica e do cultivo laboratorial,

90

apoiado em técnicas de biologia molecular um conjunto cada vez mais importante na contenção deste

patógeno.

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93

Artigo detinado a secção de ‘’revisão’’ dos Anais Brasileiros de Dermatologia.

94

“Staphylococcus aureus resistentes à meticilina: disseminação emergente na

comunidade.”

Resumo: Staphylococcus aureus é uma bactéria responsável por uma ampla variedade

de enfermidades infecciosas. A grande preocupação está relacionada, principalmente,

com os isolados resistentes à meticilina (MRSA) que, tradicionalmente, estavam

limitadas aos hospitais. Nos últimos anos, infecções causadas por MRSA associadas ou

adquiridas na comunidade (CA-MRSA) têm sido relatadas com freqüência crescente em

todo o mundo. Algumas características fenotípicas e genéticas são distintas entre a

forma de infecção hospitalar e a comunitária. Atualmente, verifica-se um perfil de

sensibilidade reduzido para diferentes antimicrobianos; sendo assim faz-se necessário

um alerta aos profissionais da saúde, particularmente aos dermatologistas, para a

importância da distinção entre as formas de infecções, evitando uma terapia empírica

incorreta e sem sucesso.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, MRSA, CA-MRSA, infecções

“Methicillin-resistant Staphylococcus aureus : community emergent dissemination.”

Abstract: Staphylococcus aureus is responsible for an ample variety of

infections diseases. The main concerning is about meticillin resistant isolates (MRSA),

this isolates were usually limited to hospitals. In the last years, community associated or

acquired MRSA infections (CA-MRSA) have been related frequently and have

emerging on world. Some phenotypic and genotypic characteristics are distinct between

hospital and community infection. Actually in we come across a reduced sensibility

profile to different antimicrobial, thus it is necessary an alert to health professionals,

dermatologists in particular, about importance to know differences about the infections,

preventing a wrong and unsuccessful empiric therapy.

95

Keywords: Staphylococcus aureus, MRSA, CA-MRSA, infections

INTRODUÇÃO

Staphylococcus aureus é encontrado colonizando a flora natural, principalmente

da pele, podendo tornar-se patogênico em condições como a quebra da barreira cutânea

ou diminuição da imunidade. Os traumas que comprometem a integridade da barreira

cutânea constituem-se na principal causa de mudança de comportamento deste

microrganismo, para agente etiológico mais comum de infecções cutâneas . É

responsável por uma grande variedade de infecções, como infecções na pele e no

subcutâneo, infecções pós-cirúrgicas, osteomielites, pneumonias, abscessos,

endocardites e bacteremia . É umas das causas mais comuns de infecções nosocomiais,

bem como de infecções comunitárias que podem apresentar altos índices de morbidade

e mortalidade.

1 2 3

4

A terapia antimicrobiana para infecções por este microrganismo inicialmente era

simples. A primeira vez que um antimicrobiano foi utilizado clinicamente foi contra

uma amostra de Staphylococcus aureus, a partir da descoberta da penicilina, que

funcionou muito bem até a década de 1960, quando começaram a aparecer isolados

resistentes a este antimicrobiano. Para contornar o problema, foi criado o beta-lactâmico

sintético, meticilina, que era resistente à ação das beta-lactamases que o Staphylococcus

aureus produzia. Entretanto, logo após o advento da meticilina, surgiram relatos de

amostras resistentes também a este antimicrobiano, além da expressão de

multiresistência. Estas cepas foram denominadas de MRSA (Staphylococcus aureus

resistentes à meticilina) e são resistentes a todos os antimicrobianos beta-lactâmicos 4.

96

Os antimicrobianos beta-lactâmicos se ligam a proteínas que participam da

síntese da parede celular, chamadas PBPs - Proteínas Ligadoras de Penicilina,

impedindo a formação da parede celular, resultando em lise bacteriana. O mecanismo de

resistência à meticilina está relacionado ao desenvolvimento de uma PBP adicional, a

PBP2a, que é plenamente funcional, mas não tem afinidade por antimicrobianos beta-

lactâmicos. A codificação destas novas PBPs, tornando estes patógenos resistentes à

oxacilina, está relacionada à aquisição do gene mecA, o qual faz parte de um elemento

genético móvel detectado em isolados de MRSA. Este gene é parte integrante de um

elemento genômico denominado “cassete cromossômico estafilocócico mec”

(SCCmec)5.

Tradicionalmente, as infecções causadas pelo MRSA estavam limitadas aos

hospitais (HA-MRSA), mas, nos últimos anos, as infecções associadas ou adquiridas na

comunidade (CA-MRSA) estão sendo documentadas de forma crescente em todo o

mundo (Gráfico 1) 6. Epidemiologicamente, isolados clínicos de MRSA são definidos

como CA-MRSA se coletados de pacientes ambulatoriais, ou coletados até 48 horas

após admissão hospitalar. Fatores de risco como: hospitalização recente, procedimentos

cirúrgicos, uso de cateter venoso ou dispositivos intravasculares e cutâneos de longa

permanência, e internação em casa de repouso devem ser excluídos 7.

S. aureus RESISTENTES À METICILINA ADQUIRIDOS NA

COMUNIDADE

Além de representar um dos principais patógenos associado a infecções

hospitalares, o S. aureus é também um dos principais agentes isolados de pacientes com

97

infecções de pele e subcutâneo adquiridas na comunidade, incluindo foliculites,

impetigos, celulites e erisipelas 8. Diferentemente dos HA-MRSA, que carregam o

elemento genético móvel, denominado cassete cromossômico estafilocócico mec

(SCCmec) dos tipos I, II e III, os CA-MRSA carregam preferencialmente o SCCmec do

tipo IV e eventualmente o tipo V. Esse tipo de cassete cromossômico é menor que os

outros tipos e não possui genes acoplados que codificam resistência a outros

antimicrobianos não beta-lactâmicos. Assim, de forma geral, o CA-MRSA é susceptível

à maioria dos antimicrobianos não beta-lactâmicos 9. Essa característica genotípica é

expressa na grande maioria, em um antibiograma que apresenta resistência apenas ao

disco de oxacilina ou cefoxitina; marcadores da resistência aos beta-lactâmicos (Figura

1).

Outra importante característica genética associada com as cepas de CA-MRSA

são os genes da citotoxina Panton-Valentine leucocidina (PVL). A PVL é codificada

pelos genes lukF e lukS, e sua presença em isolados de S. aureus está associada à

necrose tecidual e destruição de leucócitos, através da formação de poros na membrana

celular 10 . A presença desta exotoxina pode ser verificada através da pesquisa de genes

específicos, por reação em cadeia da polimerase (PCR) (Figura 2). Em um estudo

realizado nos Estados Unidos, 98% dos isolados apresentaram genes codificadores da

PVL 11. As infecções freqüentemente associadas com essas cepas são: furúnculos,

foliculites, impetigo, artrite séptica, fasciite necrotizante, pneumonia e septicemia grave

12 13 14.

Os antimicrobianos orais que são geralmente ativos para as infecções

estafilocócicas por CA-MRSA incluem tetraciclinas, trimetropim/sulfametoxazol,

fluorquinolonas e clindamicina. Para as formas clínicas potencialmente graves,

98

relacionam-se: linezolida, tigeciclina, daptomicina, teicoplamina e vancomicina. A

clindamicina é um antimicrobiano frequentemente utilizado como estratégia terapêutica

no tratamento de infecções estafilocócicas em pele e tecidos por apresentar uma boa

penetração e potencial antitoxina. No entanto, a grande preocupação deste tipo de

terapia empírica está na expressão da resistência induzível à clindamicina, que pode

apresentar no antibiograma resistência à eritromicina e falsa sensibilidade à

clindamicina. Este fenótipo de resistência pode ser identificado pelo laboratório de

microbiologia através do teste de susceptibilidade com os discos de eritromicina e

clindamicina, o D-teste (“disk test”) 15 16.

A emergência de isolados de CA-MRSA é considerada preocupante, visto que o

tratamento empírico de uma variedade de infecções comunitárias de pele e tecidos

moles e até mesmo pneumonias são realizadas com antimicrobianos beta-lactâmicos 17.

Um estudo realizado nos Estados Unidos da América (EUA) mostrou que 80%

dos pacientes com infecções de pele e partes moles receberam tratamento empírico;

destes, 57% não responderam ao tratamento, pois o microrganismo apresentou

resistência. Estes achados sugerem a necessidade de reconsiderar as escolhas de

tratamentos empíricos para infecções em pele e tecidos moles em áreas onde MRSA é

prevalente na comunidade11. Em um hospital-escola da Califórnia-EUA, um estudo

demonstrou a presença de 87% de MRSA entre os S. aureus isolados de pacientes

apresentando infecções dermatológicas atendidos no setor de emergência. Este estudo

defende a drenagem dos abscessos cutâneos como tratamento preferencial, em

contrapartida ao uso de antimicrobianos18.

99

Há algumas controvérsias na escolha do tratamento e, até mesmo do

antimicrobiano para o manejo das infecções de pele causadas por S. aureus. As

cefalosporinas estão entre os com maiores índices de utilização.

ASPECTOS CLÍNICOS DA INFECÇÃO POR CA-MRSA

O primeiro relato de uma forma de CA-MRSA ocorreu em 1993, na Austrália,

detectado em populações indígenas locais 19 e, em 2002, ganhou atenção nos Estados

Unidos após surtos de infecções cutâneas em atletas de Los Angeles 20. Em 2003, no

Missouri-EUA um estudo realizado entre jogadores profissionais de futebol americano,

demonstrou a presença de MRSA em lesões de pele, em 5 de 58 jogadores do time 21.

Na América do Sul infecções causadas por MRSA em pacientes não-

hospitalizados foram observadas inicialmente em 2001, no Uruguai. A princípio casos

esporádicos foram relatados, mas com o subseqüente aumento do número de infecções

de pele em pacientes da comunidade por este patógeno houve a caracterização de um

surto 22. No Brasil, os primeiros isolados caracterizados como CA-MRSA tinham

apresentação clínica de furunculose e artrite séptica 17 .

Um estudo multicêntrico, realizado na Argentina demonstrou uma alta

prevalência de Staphylococus aureus resistente a meticilina isolados de infecções em

crianças provenientes da comunidade. Dentre as 447 amostras analisadas nos anos de

2006 e 2007, 281 se encaixavam nos critérios definidos para CA-MRSA. Essa

investigação demonstrou que 62% dos isolados eram oriundos de infecções de pele e

partes moles. O estudo enfatiza uma revisão urgente na terapia antimicrobiana empírica

realizada para o tratamento de lesões de pele, em crianças oriundas da comunidade 23.

100

A elucidação das infecções causadas por cepas de CA-MRSA é de interesse

especial aos dermatologistas, já que tem alta probabilidade de se apresentar como

infecção de pele e tecidos moles. Em um estudo comparativo entre CA-MRSA e HA-

MRSA mostrou-se que infecções de pele e tecido subcutâneo eram muito mais

prevalentes em pacientes com isolados de CA-MRSA (75%) do que por HA-MRSA

(37%) 9 .

Epidemiologicamente, as infecções relacionadas às cepas de CA-MRSA estão

habitualmente associadas a crianças, jovens e pessoas saudáveis, especialmente as que

vivem aglomeradas ou que têm estrito contato físico umas com as outras. A grande

maioria dos relatos na literatura relaciona atletas de esportes coletivos, indivíduos do

serviço militar, encarcerados, usuários de drogas endovenosas, desabrigados e crianças

de creches, sendo estes os indivíduos com risco aumentado de desenvolver infecções

por CA-MRSA. A apresentação típica seria de um jovem atleta com abscesso e celulite

adjacente e que, provavelmente teria fatores contribuintes como contato físico, dano

cutâneo, e compartilhamento de equipamento contaminado.

Infecções como a fasciite necrosante são incomuns por Staphylococcus aureus,

porém o crescente número de casos provocados por CA-MRSA se torna preocupante.

Em um estudo norte-americano de 2005, 14 de 843 pacientes apresentaram-se com

fasciite necrosante durante um período de 15 meses. O principal fator de risco associado

a esses casos foi o uso de drogas injetáveis, e todos os isolados de S. aureus mostraram

genótipo similar e a presença de genes codificadores da toxina Panton-Valentine

Leucocidina 13. Ainda não existem estudos de prevalência no Brasil, mas dados de

outros países, como os Estados Unidos, mostram que há uma grande variação de

freqüência relacionada à geografia. Um estudo conduzido em 11 centros de emergência

101

de diferentes cidades dos EUA, durante agosto de 2004, obteve uma taxa de prevalência

global de 59%, com variação entre 15 a 74%11.

TIPOS DE CLONES DE CA-MRSA CIRCULANTES

Na atualidade, a tipagem molecular tem possibilitado obter novos dados, que dão

origem a epidemiologia molecular. No caso de S. aureus, recentemente, depois de

analisar uma grande variedade de cepas que circulam em diferentes regiões do mundo e

em diferentes períodos, se encontrou que as cepas MRSA têm uma estrutura clonal

conservada e que conta com um número reduzido de clones com capacidade de

disseminação global 6 .

Os primeiros isolados de CA-MRSA foram detectados no oeste da Austrália, no

final de 1980, causando infecção na população indígena local; então, foram chamados

de WA-MRSA (“Western Australian” MRSA) 19. Depois disso, duas outras linhagens

de CA-MRSA emergiram na Austrália e na Nova Zelândia: o clone “Queensland” e o

clone “Oceania Southwest Pacific” (SWP), também denominado de OSPC (“Oceania

South Pacific Clone”) 24 25 . Os clones USA foram descritos pela primeira vez nos

Estados Unidos da América; o clone USA400 foi relatado no centro-oeste dos Estados

Unidos em unidades neonatais e infecções puerperais. O USA300 tem sido relatado em

muitas regiões dos Estados Unidos, principalmente em jogadores de futebol americano e

presidiários 26.Um estudo de Huang e col. demonstrou que dos CA-MRSA isolados em

infecções de pele e tecidos moles na Califórnia, 87% eram clones USA300 27 .

Recentemente, foi reportado que aproximadamente 50% dos MRSA coletados de

infecções de pele e tecidos moles nos Estados Unidos pertencem ao clone USA300 11 e

menos frequentemente ao USA40028.

102

No Brasil, os primeiros isolados caracterizados como CA-MRSA eram similares

ao clone OSPC e eram provenientes de uma única cidade no Sul do país (Porto Alegre)

17. Posteriormente, um estudo demonstrou a presença deste mesmo clone em isolados na

região Sudeste (Rio de Janeiro) 29. Estas duas áreas geográficas estão separadas por

mais ou menos 1.500 quilômetros de distância, demonstrando assim a disseminação do

clone OSPC em diferentes regiões do país. O estudo demonstrou também a presença de

outras linhagens SCCmec IV classicamente comunitárias, o USA300 e o USA400

recuperados de infecções de pele e pneumonia.

A origem das cepas CA-MRSA, todavia, está sujeita a debates. Uma das

possibilidades é a descendência silvestre de cepas hospitalares, ocorrida por meio de

uma transformação vertical. Entretanto, num estudo onde se comparou cepas

hospitalares com cepas da comunidade, não se encontrou uma relação entre as cepas

HA-MRSA e CA-MRSA. Outra possibilidade é que as cepas comunitárias surgiram

como uma conseqüência de uma transferência vertical dos genes da resistência à

meticilina. A transferência horizontal é possibilitada graças ao complexo do gene ccr

que se encontra no SCCmec, que codifica recombinases responsáveis por sua

mobilidade. Pensa-se que essa transferência ocorre pouco, e que as cepas CA-MRSA

são conseqüência de um desses raros eventos de transferência do gene mec, de um

doador a um receptor susceptível. Todas estas hipóteses estão, ainda, sob estudos 6.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As infecções causadas por MRSA deixaram de ser problemas exclusivos

associados ao ambiente hospitalar e estão se tornando um problema emergente na

comunidade. Até o momento, os fatores de risco associados às infecções por MRSA

comunitário não estão completamente estabelecidos e o influxo de pacientes

103

ambulatoriais nas unidades de saúde pode ter impacto na epidemiologia intra-hospitalar

deste patógeno. É possível que os pacientes colonizados ou infectados por MRSA

SCCmec IV permaneçam sem as medidas adotadas para controle da disseminação de

MRSA, havendo a possibilidade de disseminação intra-hospitalar dessa cepa. Por outro

lado, pacientes colonizados por MRSA SCCmec IV podem ser submetidos à cirurgias

ou procedimentos onde a profilaxia para MRSA deve ser considerada, aumentando o

risco de infecção nestes pacientes.

Sugere-se que, em pacientes ambulatoriais nos quais sejam isolados MRSA

apresentando susceptibilidade a vários antimicrobianos, deva ser considerado para o

diagnóstico, uma possível infecção por CA-MRSA. Estudos genéticos incluindo

tipagem do gene SCCmec, PFGE (“pulsed-field gel electrophoresis”), detecção de genes

codificadores da PVL e MLST (“multilocus sequence typing”), podem ser aplicados

para uma melhor caracterização dessa bactéria.

A escassez de estudos de prevalência é um fator limitante do conhecimento da

epidemiologia local relacionada ao CA-MRSA. Um aspecto importante que pode

facilitar o conhecimento da existência dessas cepas circulantes é o cultivo laboratorial

de infecções de pele e tecidos moles, em locais de atendimento primário, como as

unidades de emergência dos hospitais ou em centros de assistência dermatológica.

Assim, com a identificação do microrganismo e realização do teste de susceptibilidade

poderá ser instituído um tratamento apropriado e direcionar as medidas de controle para

este patógeno.

104

REFERÊNCIAS

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Estudio multicéntrico sobre las infecciones pediátricas por Staphylococcus aureus

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2008; 106: 397-403.

24. Nimmo GR, Schooneveldt J, O’Kane G, McCall B, Vickery A. Community

acquisition of gentamicin-sensitive methicillin-resistant Staphylococcus aureus in

Southeast Queensland, Australia. J Clin Microbiol. 2000; 38:3926-31.

25. Munckhof WJ, Schooneveldt J, Coombs GW, Hoare J, Nimmo GR . Emergence of

community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in

Queensland, Australia. Int Infect Dis. 2003; 7: 259-67.

26. Bratu S, Landmand D, Gupta J, Irehan M, Panwar M, Quale J. A population-based

study examining the emergente of community-associated methicillin-resistant

Staphylococcus aureus USA300 in New York City. Ann Clin Microbiol Antimicrob.

2006;5:29.

108

27. Huang H, Flynn NM, King JH, Monchaud C, Morita M, Cohen SH. Comparisons of

community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and

hospital-associated MRSA infections in Sacramento, California. J Clin

Microbiol.2006;44:2423-27.

28. Maree CL, Daum RS, Boyle-Vavra S, Matayoshi K, Miller LG. Community-

associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates causing healthcare-

associated infections. Emerg Infect Dis. 2007; 13:236-42.

29. Ribeiro A, Coronado AZ, Silva-Carvalho MC, Ferreira-Carvalho BT, Dias C,

Rozenbaum R, et al. Detection and characterization of international community-

acquired infections by methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Rio de

Janeiro and Porto Alegre cities causing both community-and hospital-associated

diseases. Diagn Microbiol Infect Dis. 2007; 59:339-45.

109

Trabalho aceito para apresentação no 49th ICAAC

Staphylococcus aureus susceptibility profile like CA-MRSA in southern Brazil

L. Gelatti, F. Inoue, M. Carmo, R. Bonamigo, A. Becker, A. C. C. Pignatari, P. A.

d’Azevedo.

Background: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an important

pathogen commonly associated to nosocomial infections. Recently MRSA infections

has emerged as an important pathogen in the community setting causing skin and soft

tissue infections.There are few data concerning CA-MRSA infections identification and

prevalence in Brazil.

Methods: Cross-sectional study of 104 patients with pyoderma lesions reported as

being acquired in the community attended at 2 centers at the city of Porto Alegre, in the

south of Brazil. MRSA isolates were characterized by molecular methods including

mecA and Panton-Valentine leukocidin (PVL) detection, SCCmec typing, pulsed-field

gel electrophoresis (PFGE) analysis and multilocus sequence typing (MLST).

Results: 5 (8.6 %) out of 58 S. aureus isolated from 104 samples where MRSA. These

5 isolates were mecA + and SCCmec type IV. Three of these isolates were PVL +.

PFGE analysis revealed profiles similar to OSPC e USA300 clones and MLST types

ST30, ST8 e ST45 were detected.

Conclusion: The presence of CA-MRSA belonging to internationally disseminated

PFGE and MLST clones reveals an important change in the epidemiology of this

pathogen and adds new elements in the knowledge of S. aureus community acquired

skin and soft tissue infections in southern Brazil.

110

Trabalhos apresentados em Congressos

‘’Septicemia por Staphylococcus aureus resistente à meticilina adquirido na

comunidade (CA-MRSA) no sul do Brasil.’’

GELATTI, L.C.; SUKIENNIK, T.; BECKER, A.P.; CARMO, M.S.D.; MARQUES, F.S.;

PIGNATARI, A.C.; RIBEIRO, L.C.; AZEVEDO, P.A.D.

In: 1° Simpósio Internacional de Microbiologia Clínica, Gramado-RS.

‘’Avaliação microbiológica de úlceras em pacientes pós-alta de hanseníase no RS.’’

GELATTI, L.C.; EIDT, L.M.; BECKER, A.P.; GANASSINI, L., FREITAS, H.; AZEVEDO,

P.A.D.


‘’Análise molecular de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA)

apresentando perfil de sensibilidade sugestivo de MRSA adquirido na comunidade. ’’

GELATTI, L.C.; AGNES, G.; RESENDE, M.C.C.; BECKER, A.P.; GANASSINI, L.;

BONAMIGO, R.R.; AZEVEDO, P.A.D.


‘’Perfil de sensibilidade ao Ácido Fusídico em isolados de Staphylococcus aureus

resistentes à meticilina adquiridos na comunidade (CA-MRSA).’’

BECKER, A.P.; GELATTI, L.C.; RESENDE, M.C.C.; BONAMIGO, R.R.; AZEVEDO,

P.A.D.


111

“Perfil antimicrobiano de bactérias isoladas de úlceras hansênicas em pacientes pós-

alta de hanseníase. ’’

GELATTI, LC; EIDT, LM; BECKER, AP; GANASSINI, L; FREITAS, H; BONAMIGO,

RR; D’AZEVEDO, PA.

In: 11° Congresso Brasileiro de Hansenologia, Porto Alegre-RS.

‘’Caracterização fenotípica e genotípica de Staphylococcus aureus resistente à

meticilina adquirido na comunidade (CA-MRSA).’’

LUCIANE CRISTINA GELATTI; TEREZA SUKIENNIK; RENAN RANGEL BONAMIGO;

FERNANDA MATSIKO INOUE; MIRIAN SILVA DO CARMO; ANA PAULA BECKER;

ANTÔNIO CARLOS CAMPOS PIGNATARI; PEDRO ALVES d’ AZEVEDO.

In: 1° Congresso Latino-Americano de Resistência Microbiana, Santa Cruz do Sul-RS.

‘’Staphylococcus aureus em lesões de pele e subcutâneo de origem comunitária.’’

LUCIANE CRISTINA GELATTI, RENAN RANGEL BONAMIGO, PEDRO ALVES d’

AZEVEDO.

In: 1° Congresso Latino-Americano de Resistência Microbiana, Santa Cruz do Sul-RS.

‘’Perfil bacteriano e antimicrobiano de isolados em úlceras cutâneas hansênicas de

pacientes após alta. ’’

LUCIANE CRISTINA GELATTI, LETÍCIA MARIA EIDT, ANA PAULA BECKER,

LETÍCIA GANASSINI, HENRIQUE FREITAS, RENAN RANGEL BONAMIGO, PEDRO

ALVES D’ AZEVEDO.

In: 18° Jornada Sul-brasileira de Dermatologia.

112

‘’Prevalência do Staphylococcus aureus e do CA-MRSA em piodermites no sul do

Brasil.’’

LUCIANE CRISTINA GELATTI, RENAN RANGEL BONAMIGO, PEDRO ALVES D’

AZEVEDO.


‘’Análise molecular dos isolados estafilocócicos com perfil de sensibilidade compatível

com CA-MRSA. ’’

LUCIANE CRISTINA GELATTI, GRASIELA AGNES, MARIAH C. C. RESENDE,

LETÍCIA GANASSINI, ANA PAULA BECKER, RENAN RANGEL BONAMIGO, PEDRO

ALVES D’ AZEVEDO.


113

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Irmandade da Santa Casa de

Misericórdia de Porto Alegre

115

Parecer do Comitê de Ética na Pesquisa em Saúde da Escola de Saúde

Pública da Secretaria da Saúde do Rio Grande do Sul

116

Termo de consentimento livre e esclarecido

FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE PORTO ALEGRE

DEPARTAMENTO DE PÓS-GRADUAÇÃO IRMANDADE DA SANTA CASA DE MISERICÓRDIA DE PORTO ALEGRE

CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

(Obrigatório para Pesquisa Científica em Seres Humanos Resolução no. 196 de 10/10/96 - Conselho Nacional de Saúde)

1.TÍTULO DO PROJETO: Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus aureus Isolados de Pacientes Atendidos na Emergência do Complexo Hospitalar da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre e no Ambulatório de Dermatologia Sanitária do Rio Grande do Sul 2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS DO ESTUDO Estamos realizando uma pesquisa que estuda uma bactéria chamada Staphylococcus

aureus. Essa bactéria é encontrada na pele como flora natural, mas pode tornar-se

patogênica em condições como a quebra da barreira cutânea ou diminuição da

imunidade. As infecções mais comuns envolvem a pele e feridas em sítios diversos. As

infecções hospitalares são em grande parte causadas por S.aureus meticilina-resistente

(MRSA), e estão associadas a um considerável índice de morbi-mortalidade, prolongado

período de hospitalização, uso de antimicrobianos mais caros e com isso, custos

aumentados para os hospitais. Nos últimos anos, um número crescente de relatos tem

mostrado a emergência de um novo tipo de S. aureus meticilina-resistente. O MRSA

que até então era considerado um patógeno hospitalar, começou a ser observado em

pacientes da comunidade. A emergência de cepas de MRSA na comunidade é

preocupante em todo o mundo, elas apresentam características distintas das cepas de

origem hospitalar. A presença de diferenças entre o S. aureus hospitalar e o

comunitário e sua identificação faz do presente trabalho um instrumento útil no

monitoramento e reconhecimento local dos casos de MRSA-comunitário.

3.PROCEDIMENTOS UTILIZADOS

A pesquisa será realizada através da coleta do material com auxílio de swab estéril.

Serão realizados procedimentos microbiológicos e moleculares específicos para

caracterização do S. aureus. A pesquisa não interfere no tratamento, forma de

acompanhamento ou atenção prestada ao paciente.

117

4.DESCONFORTO OU RISCOS ESPERADOS

Não há risco algum na participação da pesquisa, visto que os procedimentos de coleta

são rotineiros e de fácil execução.

5. BENEFÍCIOS

Verificar a emergência de S.aureus resistentes à meticilina na comunidade,

acompanhada da caracterização fenotípica e genotípica desse microrganismo.

6. PROCEDIMENTOS ALTERNATIVOS QUE POSSAM SER VANTAJOSOS

Não há.

7. GARANTIA DE RESPOSTA A PERGUNTAS E DÚVIDAS

Os pesquisadores envolvidos, estão disponíveis para esclarecimentos e perguntas que

possam surgir.

8. LIBERDADE DE ABANDONAR A PESQUISA SEM PREJUÍZO PARA SI

O paciente participante da pesquisa pode solicitar a sua retirada da mesma a qualquer

momento sem prejuízo no seu tratamento, acompanhamento e atenção médica.

9. GARANTIA DE PRIVACIDADE

Ressaltamos que a concordância em participar deste estudo não altera o tratamento que

está sendo realizado. Os dados obtidos são confidenciais e utilizados apenas para fins

científicos nesta pesquisa, os nomes dos participantes não serão divulgados.

10. COMPROMISSO COM INFORMAÇÃO ATUALIZADA DO ESTUDO

O participante poderá, a qualquer momento, solicitar informações a respeito do

andamento do estudo.

11. DISPONIBILIDADE DE TRATAMENTO MÉDICO

A disponibilidade de tratamento não sofrerá interferência pela pesquisa.

12. CONTATOS

Se você tiver qualquer dúvida que não tenha sido esclarecida, como questões

relacionadas aos procedimentos propostos, com implicações éticas, entre em contato

com o pesquisador responsável – Luciane Cristina Gelatti, através do telefone 3211-

0356 ou 9966-3835, ou com o Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação Faculdade de

Ciências Médicas do Rio Grande do Sul, através do telefone 3303-9000, ou na Rua

Sarmento Leite, 245.

118

TERMO DE CONSENTIMENTO Eu, ...................................................................(paciente ou responsável legal) fui informado dos objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada. Recebi informação a respeito do tratamento recebido e esclareci minhas dúvidas. Sei que em qualquer momento poderei solicitar novas informações e modificar minha decisão se assim eu o desejar. O pesquisador responsável........................................................................ certificou-me de que todos os dados desta pesquisa serão confidenciais, bem como o seu tratamento não será modificado em razão desta pesquisa e terei liberdade de retirar meu consentimento de participação na pesquisa, face a estas informações. Declaro que recebi cópia do presente Termo de Consentimento. ________________________________ Assinatura do Paciente ou Responsável ________________________________ Nome do Paciente ou Responsável ________________________________ Assinatura do Pesquisador ________________________________ Nome do Pesquisador Este formulário foi lido para _______________________________ (nome do paciente) em _____/_____/_______ (data) pelo _______________________ (nome do pesquisador) enquanto eu estava presente. ________________________ Assinatura de testemunha ________________________ Nome da Testemunha Porto Alegre _____ de ___________________ de 200____.

119

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Título da pesquisa: Caracterização Fenotípica e Genotípica de Staphylococcus aureus isolados de Pacientes Atendidos no Ambulatório de Dermatologia Sanitária Porto Alegre-RS. Estamos realizando uma pesquisa que estuda uma bactéria chamada Staphylococcus aureus. Essa bactéria é encontrada normalmente na pele, mas às vezes podem causar infecções, como furúnculos. A grande preocupação está no aumento de infecções por esta bactéria fora dos hospitais e aumento de sua resistência na comunidade, diminuindo os antibióticos que podem ser usados contra ela. A coleta do material das infecções será realizada pelo pesquisador após o atendimento médico, com auxílio de swab (cotonete) estéril. O material será avaliado no laboratório de microbiologia para possível crescimento da bactéria em estudo. A pesquisa não interfere no tratamento médico prestado ao paciente e os resultados obtidos estarão contribuindo com a comunidade no conhecimento desta bactéria. Qualquer dúvida que não tenha sido esclarecida, entre em contato com o pesquisador -Luciane Cristina Gelatti, através do telefone 9191-5275 ou no Comitê de Ética em Pesquisa da Secretaria Municipal de Saúde através do telefone 3289-2784. Declaro que recebi cópia do presente Termo de Consentimento. ________________________ Assinatura do paciente ou responsável legal ________________________ Nome do paciente ________________________ Assinatura do Pesquisador ________________________ Nome do Pesquisador Data : ___/___/___

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