Docentes: Prof. Dr. Felipe S. Chambergo – fscha@usp.br Prof. Dr. Luiz P. M. Andrioli – lpma@usp.br Monitores: MSc. Patrícia Pereira Adriani - paty_adriani@hotmail.com Bchr. Gustavo Roncoli - gustavoroncoli@hotmail.com Bchr. Daniela De Lucena Pedroso - pedrosoddl@usp.br Servidores não-docentes: Sr. Tec. Clarino do Divino Vieira Local: Laboratório de Biotecnologia, 1° andar bloco didático A2 - EACH/USP.

USP – 2019

Biotecnologia ACH5545 Engenharia Genética e Biologia Molecular

Atividades de Laboratório 2º Semestre 2019

SEM DATAS ATIVIDADE DOCENTE 5 29.08 Análise de Bioinformática, Extração de DNA genômico,

plasmidial e proteínas. Quantificação e Separação de Biomoléculas por Eletroforeses

Andrioli /Chambergo

05.09 SEMANA PÁTRIA / NÃO HAVERÁ AULA 6 12.09 Sistemas Procarióticos: Vetores de Clonagem e

Expressão - PCR, Enzimas de modificação de DNA, Clonagem e

Transformação

Andrioli/ Chambergo

8 26.09 Visita Turma 1 -Customer Experience Center – ThermoFisher*

14:00-18:00 h

9 03.10 Análise de Biomoléculas: DNA e Proteínas I - Transferência

Andrioli /Chambergo

11 17.10 Análise de Biomoléculas: DNA e Proteínas II - Revelação

Andrioli /Chambergo

13 31.10 Expressão de Proteínas heterólogas em bactéria e Análise SDS-PAGE

Purificação de Proteínas e Determinação de atividade enzimática

Andrioli /Chambergo

15 14.11 Visita Turma 2 - Customer Experience Center – ThermoFisher*

14:00-18:00 h

17 28.11 Hibridação in situ Andrioli /Chambergo

Aviso

Atividades no laboratório poderão ser gravadas e/ou fotografadas. Eventuais imagens captadas poderão ser armazenadas e utilizadas para veiculação e/ou divulgação na mídia em geral, escrita, falada, televisiva ou eletrônica de difusão e transmissão por qualquer meio de comunicação, pela Coordenação do Curso de Biotecnologia, em território nacional ou internacional. Cede-se pelo(a) discente, a título gratuito, autorização que abrange todos os direitos relacionados à veiculação de imagem e som.

POR RAZÕES DE SEGURANÇA É OBRIGATÓRIO

Avental abaixo do joelho e mangas compridas Luvas Calça comprida

Cabelo preso Sapato fechado

Os alunos serão divididos em grupos e cada grupo deverá encaminhar APENAS UM RELATÓRIO: -Atividades de Laboratório - Monografia da proteína em estudo Data de 05/12/2019 (no e-mail fscha@usp.br) Normas durante as atividades no laboratório: -Utilizar de forma adequada e em todo momento avental e, durante o trabalho, utilizar luvas. -Seguir as indicações dos monitores e do professor. -Utilizar de forma adequada e com supervisão do monitor ou professor reagentes, materiais e equipamentos de uso no laboratório. -Descartar reagentes e materiais em local específico. -Manter a ordem em todo momento, não consumir alimentos, bebidas ou fumar no laboratório. -Limpar e cuidar dos materiais utilizados e da bancada de trabalho. -Qualquer dúvida solicitar esclarecimentos ao monitor ou professor. -Todo material biológico ou contaminado, antes de ser descartado, deverá ser esterilizado por autoclavagem.

Objetivos a) Introduzir os estudantes nas técnicas básicas de

Biologia molecular e Engenharia Genética para o estudo de biomoléculas: DNA, RNA e proteínas.

b) Introduzir técnicas de análise quantitativa e qualitativa de biomoléculas. c) Incentivar os estudantes ao trabalho de ensino e pesquisa laboratorial. d) Aumentar o interesse pela pesquisa desenvolvida em laboratório.

Modelos Para atender os objetivos propostos, utilizaremos microrganismos de uso comum no laboratório de pesquisa, não patógenos a humanos, animais ou plantas. Assim, no presente semestre utilizaremos como modelo de estudo os genes: I) Gene gfp (Green Fluorescent Protein) de Aequorea victoria; II) Gene bfp (Blue Fluorescent Protein) versão mutante de GFP; III) Gene dsRed (Red Fluorescent Protein) de Discosoma sp; IV) Gene bap (Bacterial alkaline phosphatase) de E. coli e, V) Gene lacZ (β-galactosidase) de E. coli.

Semana Prática nº 1 Atividade 1: Análise de Bioinformática do modelo em estudo Procedimento: 1) Cada grupo deverá selecionar, entre a lista de genes modelo de estudo:

I) Gene gfp (Green Fluorescent Protein) de Aequorea victoria; II) Gene bfp (Blue Fluorescent Protein) versão mutante de GFP; III) Gene dsRed (Red Fluorescent Protein) de Discosoma sp; IV) Gene bap (Bacterial alkaline phosphatase) de E. coli e, V) Gene lacZ (β-galactosidase) de E. coli.

• Um gene que codifica para uma proteína fluorescente, e; • Um gene que codifica para uma enzima. 2) A sequência de DNA codificadora de cada gene será fornecida a cada grupo. 3) Utilizando ferramentas de bioinformática e revisão de literatura científica, o grupo deverá obter e apresentar o máximo de informações disponíveis sobre as duas proteínas selecionadas. 4) A análise de cada gene de estudo será a MONOGRAFIA, parte do relatório final de atividades práticas da disciplina.

Atividade 2: Extração de DNA e Proteínas

Aula: Extração de DNA genômico de bactérias

Aula: Extração de DNA plasmidial de bactérias

Aula: Extração de proteínas de Levedura

Atividade 3: Quantificação espectrofotométrica de biomoléculas

Aula: Quantificação de proteínas pelo método colorimétrico de Bradford

Aula: Quantificação de DNA

Atividade 4: Separação de biomoléculas por eletroforese

Aula: Eletroforeses de DNA

Aula: Eletroforeses de proteínas: SDS-PAGE

DOGMA CENTRAL

DNA cromossômico x DNA plasmidial

Resuspende as células em Buffer + RNAse

Lisis com NaOH/SDS

Neutralização com alta concentração de sais. Sais-SDS, precipita proteínas, DNA cromossômico e restos celulares. DNA plasmidial renatura e permanece em solução.

Restos celulares são removidos por centrifugação ou filtração

1-Precipita com álcool e recupera ácido nucléico 2- DNA liga a sílica na presença de sais.

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Prof. Dr. Felipe Chambergo USP - 2019

EXTRAÇÃO DE DNA

Possíveis fontes de DNA:

•sangue periférico • células da mucosa oral • células do bulbo capilar • células descamadas da pele • etc

Metodologia Geral:

•rompimento das células nucleadas • precipitação das proteínas (solventes orgânicos, “salting-out”) • precipitação do DNA (etanol e sal - NaCl, NaAc) • em muitos casos o isolamento do DNA é desnecessário.

• Detergente – Solubiliza lipídeos e proteínas de membrana • Sais – Facilitam a precipitação do DNA • Álcool – Precipita o DNA • NaOH desnatura o DNA cromossômico, plasmidial e proteínas. • RNase degrada o RNA liberado • Fenol/cloroformio remove proteínas e os ácidos nucléicos permanecem na fase aquosa

Aula: Extração de DNA genômico de bactérias (Wilson K. 2001 doi: 10.1002/0471142727.mb0204s56.)

Procedimento: 1. Realizar uma cultura por 12-18 h de cepa E.coli. Posteriormente, colocar 1,5 mL da cultura em microtubos de 1,5 mL. 2. Centrifugar a 12 000 rpm, temperatura ambiente por 4 minutos; 3. Remover o sobrenadante; 4. Suspender as bactérias em 567 µL de buffer TE, 3 µL de SDS 10% e 3 µL de proteinase K (20 mg/mL). Em seguida, homogeinizar e incubar durante 1 h a 37°C. 5. Adicionar 100 µL de NaCl 5 M e homogeneizar. 6. Em seguida, acrescentar 80 µL de solução de CTAB/NaCl, homogeinizar e incubar durante10 min a 65°C. 7. Adicionar um volume de 80 µL de clorofórmio/álcool isoamílico, centrifugar à 12.000 rpm à temperatura ambiente por 5 minutos. 8. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Extrair o DNA com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Centrifugar a 12.000 rpm, temperatura ambiente por 5 minutos. 9. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Extrair o DNA com 0,6 vol de isopropanol. 10. Centrifugar a 12.000 rpm à temperatura ambiente por 10 minutos. 11. Lavar o precipitado com etanol 70%. Descartar o sobrenadante e deixar secar o precipitado no meio ambiente ou estufa. 12. Ressuspender o precipitado em 100 μl de tampão TE. O DNA pode ser armazenado a 4°C por alguns meses ou a -20°C por tempo indeterminado. 13. Realizar uma eletroforese em gel de agarose (1%), utilizando 10 µL do DNA genômico obtido.

Aula: Extração de DNA plasmidial de bactérias em pequena escala:“Miniprep” Procedimento: 1. Realizar uma cultura de E.coli, contendo o plasmídeo, em 5 mL de meio LB com antibiótico, incubar por 12-18 h sob agitação à 37°C. 2. Posteriormente, colocar 1,5 mL da cultura em microtubo de 1,5 mL. 3. Centrifugar à 12.000 rpm em temperatura ambiente por 4 minutos e remover o sobrenadante. 4. Acrescentar mais 1,5 mL da cultura nos respectivos tubos e repetir os passos 2 e 3. 5. Suspender o sedimento bacteriano em 100 µL da Solução I. 6. Acrescentar 200 µL da Solução II. Misturar por inversão, NÃO VORTEXAR OS TUBOS. Uma solução viscosa deverá ser formada imediatamente devido à lise das células. 7. Acrescentar 150 µL da Solução III. Misturar por inversão, NÃO VORTEXAR OS TUBOS. Um precipitado branco deverá ser formado imediatamente. Este precipitado contém DNA genômico e restos celulares. O DNA plasmidial permanecerá em solução. 8. Centrifugar os tubos à 12.000 rpm, temperatura ambiente, por 10 minutos. 9. Remover o sobrenadante cuidadosamente e transferilo para outro tubo. 10. Acrescentar 1 mL de etanol absoluto gelado a cada tubo. 11. Incubar os tubos no gelo por 15 minutos 12. Em seguida, centrifugar à 12.000 rpm, à 4°C, durante 10 minutos. 13. Remover o sobrenadante. 14. Adicionar 300 µL de etanol 70% (NÃO SUSPENDER NEM VORTEXAR OS TUBOS). 15. Centrifugar à 12.000 rpm, à 4°C, por 10 minutos. 16. Centrifugar à 10.000 rpm, temperatura ambiente, por 7 minutos. 17. Remover o sobrenadante. O DNA deve formar um pellet branco. É IMPORTANTE REMOVER TODO O ETANOL. Deixar secar a temperatura ambiente. 18. Acrescentar 50 µL de água destilada e deionizada estéril e suspender o pellet de DNA. O DNA pode ser armazenado a 4°C por alguns meses ou a -20°C por tempo indeterminado 19. Realizar uma eletroforese em gel de agarose (1%), utilizando 10 µL do plasmídeo obtido na miniprep.

Aula: Extração de proteínas de Levedura

Procedimento: 1. Realizar uma cultura de Saccharomyces cerevisiae em 5mL de meio YPD por 12-18 h sob agitação à 37°C. Colocar 1,5 mL da cultura em microtubos de 1,5 mL; 2. Centrifugar a 12.000 rpm, temperatura ambiente, durante 4 minutos; 3. Suspender o precipitado em 500 µl de tampão de extração; 4. Adicionar um volume equivalente a 500 µl de microesferas/perolas de vidro (tamanho de 450 a 600 µm); 5. Agitar em Vortex por 4 min, em velocidade máxima; 6. Transferir o lisado para um tubo de mirocentrifuga gelado e centrifugar a 14.000 rpm por 3 min, à 4 °C; 7. Separar o sobrenadante do material sedimentado. 8. Realizar uma eletroforese em gel de SDS-PAGE, utilizando 10 µL do sobrenadante obtido.

Aula: Quantificação de proteínas pelo método colorimétrico de Bradford Procedimentos: 1. Preparar o reagente de Bradford, na razão Bradford: água - 1:4; 2. Preparar 5 diluições da proteína standard (0.2, 0.4, 0.6, 0.8.e 1.0 mg/mL); 3. Transferir 20 µL de cada amostra standard e da sua amostra a um tubo limpo. REALIZAR EM DUPLICATA OU TRIPLICATA; 4. Adicionar 1 mL de reagente de Bradford a cada tubo e vortexar. 5. Incubar durante 5 minutos em temperatura ambiente; 6. Medir a absorbância a 595 nm. 7. Construir a curva standard utilizando papel milimetrado. 8. Determinar a concentração de proteína na amostra utilizada.,

Aula: Quantificação de DNA Procedimento: 1. Ligar o espectrofotômetro e selecionar o comprimento de onda de 260 nm, seguindo o procedimento indicado pelo fabricante; 2. Inserir no espectrofotômetro a cubeta de quartzo contendo água (branco ou controle) e fazer a leitura para zerar o aparelho; 3. Preparar uma diluição de água: DNA - 1:250, transferir para a cubeta de quartzo. 4. Fazer a leitura e determinar a concentração da amostra. DO260 = 1 equivale a 50 ug/mL de dsDNA

Aula: Eletroforeses de DNA Procedimento: 1. O preparo do gel depende das dimensões da cuba a ser utilizada. Partiremos do pressuposto que vamos utilizar uma cuba de 15 cm x 20 cm, a qual acomoda 100 mL de agarose; 2. Pesar 1 g de agarose ultra pura; 3. Adicionar 100 mL de tampão TAE 1X; 4. Aquecer em micro-ondas, até a ebulição (cerca de 1 min.); 5. Deixar esfriar até ~50°C, e adicionar 5 µL de corante SYBR Safe (Life Technologies); 6. Despejar imediatamente a solução de agarose na “caminha” montada com o respectivo pente; 7. Aguardar até que ocorra a gelificação do gel; 8. Remover o pente cuidadosamente; 9. Completar o volume da cuba com TAE 1X; 10. Preparar as amostras a serem quantificadas misturando 1 µL de DNA, 3 µL de água milli-Q autoclavada, e 1 µL de tampão de aplicação da amostra 6 x; 11. Aplicar uma amostra de DNA em cada poço do gel; 12. Ligar os cabos a fonte e ao aparato de eletroforese e ligar a força, ajustando para 80 V; Obs: A “caminha” deve ser posicionada do polo negativo para o positivo. 13. Após 30 minutos observar o gel sob luz azul, fotografando-o se necessário.

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

(-)

80 V

(+)

migração

1 2 3

400pb 300pb

200pb

100pb

Fragmentos de DNA separados pelo tamanho em pares de bases (pb)

Poços para aplicação das amostras de DNA

Corante de DNA SYBR

Figura 3. Eletroforeses em gel de agarose 1% de PCR do gene ApoB apartir de ghDNA obtido de mucosa oral. Linha 1: amostra # 1; linha 2: amostra # 2; linha 3: amostra # 4; linha 4: amostra # 5; linha 5: amostra # 7; linha 6: amostra # 8. Aplicados 5 uL de ghDNA + 5 uL de tampão de corrida, corante SYBR Green (Lifetechnologies, USA). Seta vermelha indica a amostra de DNA.

PM 1 2 3 4 5 6

Figura 3. Eletroforeses em gel de agarose de hDNA. A. PCR do gene APO a partir de DNA obtido de mucosa oral. Linha 1: amostra # 1; linha 2: amostra # 2; linha 3: amostra # 4; linha 4: amostra # 5; linha 5: amostra # 7; linha 6: amostra # 8. Aplicados 5 uL de ghDNA + 5 uL de tampão de corrida, corante SYBR Green (Lifetechnologies, USA). (24/09/2014). PM: Peso Molecular 1 kb DNA ladder. B. ghDNA obtido de mucosa oral. Linha 1: amostra # 1; linha 2: amostra # 2; linha 3: amostra # 4; linha 4: amostra # 5; Aplicados 5 uL de ghDNA + 5 uL de tampão de corrida, corante SYBR Green (Lifetechnologies, USA). (24/09/2014). PM: Peso Molecular 1 kb DNA ladder. 03/10/2014).

PM 1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 PM

A.

B.

Figura 2. Eletroforeses em gel de agarose 1% de ghDNA obtido de mucosa oral. Linha 1: amostra # 1; linha 2: amostra # 2; linha 3: amostra # 4; linha 4: amostra # 5; linha 5: amostra # 7; linha 6: amostra # 8. Aplicados 5 uL de ghDNA + 5 uL de tampão de corrida, corante SYBR Green (Lifetechnologies, USA). (24/09/2014).

1 2 3 4 5 6

M 3)

M M

M

1) 2)

4)

A/B C/D E/F G/H

A/B C/D E/F G/H

A/B C/D E/F G/H

A/B C/D E/F G/H

Fig. # 1. Eletroforese em gel de Agarose 0.8%, do produto de PCR (1 µL). 1)Placa # 1, 2)Placa # 2, 3)Placa # 3, 4)Placa # 4. M: Marker 1 kb DNA leader (GIBCO BRL. USA); A/B, C/D, E/F, G/H: fileiras correspondentes a cada placa.

Aula: Eletroforeses de proteínas: SDS-PAGE Procedimento: 1. Montar o suporte para preparação do gel de poliacrilamida; 2. Preparar a mistura do gel de separação 10%, como indicado na tabela; 3. Aplicar a mistura do gel de separação e aguardar até polimerizar; 4. Preparar a mistura do gel de entrada 5%, como indicado na tabela; 5. Aplicar a mistura do gel de entrada, colocar os pentes com o número e tamanho de poços a serem utilizados e aguardar até polimerizar; 6. Preparar as amostras, misturando com tampão de aplicação de amostras. Ferver por 5 minutos, deixar esfriar. 7. Utilizando agulha, depositar as amostras em cada poço. 8. Conectar os fios, seguindo o código de cores, na fonte de eletroforeses. Ligar a 80 V e deixar correr até 2 cm antes do fim do gel. 9. Mergulhar o gel na solução corante de proteínas por 30 minutos. Visualizar e registrar fotograficamente.

Técnicas de Biología Molecular:

Eletroforeses e PCR

ELETROFORESES:

Separação de biomoléculas, sob ação de um campo elétrico, é feita de

acordo com o tamanho e carga elétrica das moléculas.

Tipos de eletroforeses

Para separar proteínas e peptídos -Eletroforese em papel (acetato de celulose, uso: separar aminoácidos e peptídos). -Eletrofores em gel acrilamida:bisacrilamida. -Eletroforese bidimensional (separão por: ponto isoelétrico e peso molecular). Para separar DNA -Eletrofores em agarose. -Eletroforese capilar (sequenciamento de DNA, utiliza-se capilares de sílica fundida a potenciais elevados 20 a 30 kV em um campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por ar). Eletroforese de campo pulsado (separa grandes moléculas (até 600kb), cromossomos inteiros , utiliza-se sucessivos campos elétricos alternados).

Figura 3. Análise da expressão e purificação de TrTBP por eletroforese SDS/PAGE (12,5%). A) Expressão: Linha 1- lisado de bactéria não induzida (10 µL); Linha 2- lisado de bactéria induzida (10 µL). B) Purificação: Linha 1 – fração insolúvel (10 µL); Linha 2 – fração solúvel (10 µL); Linhas 3, 4 e 5 - frações obtidas durante eluição da proteína a partir da coluna ‘HiTrap Chelating’ carregada com Ni2+(10 µL). PM: Marcador de peso molecular Benchmark protein (Invitrogen, USA).

60

40

20

15

25

kDa 1 2

60

40

20

15

25

1 kDa 2 3 4 5 A B

PM PM

Figura 1 – Eletroforeses SDS-PAGE (12,5%) da expressão e purificação da proteína recombinante TrEH2, em E. coli BL21. (1) Amostra de 20 µL da bactéria não induzida; (2) Amostra de 20 µL da bactéria induzida com 0,5 mM de imidazol; (3) Amostra de 20 µL do precipitado do lisado bacteriano (não solúvel); (4) Amostra de 20 µL do sobrenadante do lisado bacteriano (solúvel); (5) Amostra de 20 µL das frações coletadas após a purificação. (PM) peso molecular BenchMark protein ladder (Invitrogen).

PM