XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba

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AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES QUÍMICAS NOS COMPONENTES M INERAIS EM

REPARO DE DEFEITOS ÓSSEOS APÓS LASERTERAPIA E AÇÃO DE CALCITONINA EM FÊMURES DE RATOS

Abreu, G. M. A. 1, Bustamante, S. N. 2, E. A. L. 2, Arisawa, E. A. L. 2, Santo, A. M. E. 2

1 Universidade do Vale do Paraíba, Faculdade de Ciências da Saúde, Curso de Odontologia, Av. Shishima

Hifumi, 2911, 12244-000, São José dos Campos, SP, PABX (12) 3947-1000 2 Universidade do Vale do Paraíba, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, IP&D/LEVB, Av. Shishima

Hifumi, 2911, 12244-000, São José dos Campos, SP, PABX (12) 3947-1166 magnoabreu@apcd.org.br, mirela@univap.br, amesanto@univap.br

Resumo- Estudos têm avaliado os efeitos da laserterapia de baixa potência (LLLT) na promoção da osteogênese, bem como na aceleração desse processo em fraturas. Entretanto, os efeitos da redução do tempo de regeneração sobre as propriedades químicas e mecânicas ainda não estão totalmente estabelecidas. Este estudo objetivou avaliar, ex vivo, as alterações químicas em defeitos cirúrgicos realizados em ratos com osteoporose induzida, tratados com calcitonina, associada ou não à LLLT, como adjuvante no processo de regeneração óssea. Foram utilizados 20 ratos Wistar, machos, tratados com calcitonina, nos grupos Cal e CaLa, em dias alternados até a data do sacrifício. Os grupos La e CaLa foram irradiados transcutaneamente em dois pontos ao redor da lesão durante 21 dias, a cada 48 horas. Todos os grupos foram avaliados quanto aos componentes químicos inorgânicos por meio da técnica de micro-Fluorescência de Raios-X por Energia Dispersiva (µED). A melhor relação Ca/P foi observada no grupo CaLa. O presente estudo permitiu estabelecer um procedimento para medidas analíticas qualitativa e semi-quantitativa dos componentes minerais do osso pela técnica de µ-ED.

Palavras-chave: Fluorescência de raios-X, Calcitonina, Laser, Osteoporose, Reparo Ósseo Área do Conhecimento: Ciências da Saúde, Odontologia, Engenharia Biomédica Introdução

A osteoporose tem sido definida como uma doença esquelética que se caracteriza com a perda de massa óssea e deteriorização da microarquitetura do tecido ósseo (ÅKESSON, 2003; BINKLEY, 2006; BORGES, BILEZIKIAN, 2006; BORGES, BRANDÃO, 2006; GENNARI et al., 2003;). A principal conseqüência desta manifestação é a ocorrência de fraturas de baixo impacto devido a perda da força de resistência do tecido ósseo (ÅKESSON, 2003, BINKLEY, 2006). Estima-se que 40 a 50% das mulheres no mundo apresentarão fraturas advindas da osteoporose em algum momento de suas vidas e que 25 a 33% dos homens sofrerão da mesma doença (BINKLEY, 2006). É previsto, ainda, que o número de casos de osteoporose dobrará, mundialmente, até 2025, sendo este aumento, mais acentuado entre os homens e justificado pelo fato da doença ainda ser negligenciada para este gênero (BINKLEY, 2006).

Assim, a osteoporose torna-se um grande problema de saúde pública e econômico devido ao alto custo de tratamento dos pacientes acometidos (ÅKESSON, 2003; BINKLEY, 2006; GULLBERG et al., 1997). Acresce-se o fato de altos índices de

morbidade e mortalidade estarem associados às fraturas osteoporóticas (BINKLEY, 2006; GENNARI et al., 2003; GULLBERG et al., 1997).

A etiologia é reconhecidamente multifatorial relacionando gênero, idade, genética e fatores ambientais (ÅKESSON, 2003). Muitos destes sinais ainda não estão bem determinados, mas sabe-se que uma gama variada de hormônios e fatores locais estão envolvidos com esta ativação (ÅKESSON, 2003). Entre os hormônios mais reconhecidos estão os hormônios sexuais, estrógeno e testosterona, a calcitonina,o hormônio do crescimento, a insulina, hormônios paratiroidianos e tiroidianos, assim como alguns fatores locais como interleucinas – IL-1, IL-6, IL-11, prostaglandinas e FNT–fator de necrose tumoral (ÅKESSON, 2003; FALAHATI-NINI et al., 2000; GENNARI et al., 2003; FROST, 1999; ROBLINGH et al., 2006; SEIBEL, 2006). Embora a testosterona também execute papel importante na manutenção dos níveis de densidade óssea nos homens, o estrógeno é também o esteróide dominante na regulação do metabolismo ósseo, nesse gênero (GENNARI et al., 2003).

Vários tratamentos têm sido propostos para a osteoporose sendo a reposição de calcitonina amplamente utilizada através de injeções intramusculares ou aerosóis nasais (ÅKESSON,

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2003; ALMEIDA, et al., 2007; ARISAWA, et al., 2007; BORGES, BILEZIKIAN, 2006;). A calcitonina é um hormônio polipeptídeo produzido pela glândula tireóide, que exerce papel importante na inibição da reabsorção óssea e da atividade osteoclástica (ÅKESSON, 2003; ARISAWA et al., 2007). A administração de calcitonina exógena inibe a reabsorção óssea através da redução da atividade osteoclástica, diminuindo os riscos de fraturas (BORGES, BILEZIKIAN, 2006).

A laserterapia de baixa potência (LLLT) tem sido utilizada na promoção da saúde em várias áreas da medicina (MELLO et al., 2007) e motivado trabalhos utilizando-a na fotobiomodulação (KARU, 2007). A emissão de determinados comprimentos de ondas de luz sobre o tecido pode estimular a atividade osteoblástica, acelerando a formação de tecido ósseo, aumento da vascularização, organização das fibras colágenas e aumento dos níveis de ATP no local irradiado (LIRANI-GALVÃO et al., 2006; KARU, 2007). A utilização de fótons de luz na modulação da atividade celular leva a respostas bioquímicas intracelulares sem a propagação de calor e sem causar danos aos tecidos (HAWKINS, ABRAHAMSE, 2006). Os efeitos bioquímicos ainda não são completamente determinados (KARU, 2007; HAWKINS, ABRAHAMSE, 2006). Acredita-se que a luz é absorvida pelas mitocôndrias através das membranas celulares ativando ou inativando enzimas, favorecendo a produção de ATP, alterando as propriedades químicas de macromoléculas, melhorando a permeabilidade ao cálcio e favorecendo a proliferação celular (KARU, 2007; HAWKINS, ABRAHAMSE, 2006).

Os tipos de diodos utilizados para emissão da luz assim como especificações dos parâmetros variam entre os vários aparelhos disponíveis e a finalidade da terapia. Dispositivos com diodos de GaAlAs têm sido utilizados com sucesso na área médica (KARU, 2007). Contenção de edemas, controle da dor, tratamento de dermatites, alívio de dores músculo-esqueléticas, tratamento de inflamações crônicas, tratamento de doenças auto-imunes, entre outras, são exemplos da aplicação do laser de baixa intensidade dentro da área médica (LIRANI-GALVÃO et al., 2006; KARU, 2007).

A grande incidência de casos de osteoporose, os tratamentos disponíveis associados à alta tecnologia das técnicas terapêuticas e analíticas motivaram a realização desde trabalho. O efeito da radiação laser nas estruturas biológicas é complexo e reflete uma maior inter-relação intrínseca à matéria viva. A associação da hidroxiapatita às fibras colágenas é a responsável pela dureza e resistência do tecido ósseo.

Costuma-se classificar os diversos fosfatos de cálcio pela sua razão molar Ca/P.

A espectroscopia por energia dispersiva de fluorescência de RX (µ-EDX) é um método analítico multielementar capaz de avaliar qualitativa e semi-quantitativamente as amostras irradiadas (ANJOS et al. 2004; ANTUNES et al., 2005). Sua principal vantagem reside no fato de ser um método não destrutivo que identifica, em curto espaço de tempo os elementos inorgânicos na estrutura da amostra com mínimo ou nenhum preparo anterior para análise (ANJOS et al. 2004; ANTUNES et al., 2005). Esta técnica analítica é baseada na medida da intensidade (número de fótons coletados por unidade de tempo) dos raios-X característicos emitidos pelos elementos que constituem a amostra, quando devidamente excitados (BERTIN, 1978). A intensidade da energia característica emitida pelos componentes da amostra é diretamente proporcional à concentração de cada elemento presente na amostra. Portanto, uma avaliação quantitativa por comparação pode ser conduzida para se determinar a relação entre os teores dos elementos cálcio (Ca) e fósforo (P) presentes no composto mineral (hidroxiapatita) da estrutura óssea.

Este estudo objetivou avaliar, ex vivo, as alterações químicas em defeitos cirúrgicos realizados em ratos com osteoporose induzida, tratados com calcitonina, associada ou não à LLLT, como adjuvante no processo de regeneração óssea. Metodologia

Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal – São José dos Campos sob nº L035/2003/CEP. Foram utilizados 20 ratos machos adultos (Rathus norvegicus, variação albinus) com 60 dias de idade, peso aproximado de 200 gramas. Os animais foram alimentados com ração e água ad libitum e divididos aleatoriamente em 4 grupos iguais: controle – C, calcitonina – Cal, laser – La, calcitonina + laser – CaLa. A eutanásia foi realizada 21 dias após o inicio do tratamento. Os animais passaram por dois momentos cirúrgicos, seguindo protocolo de assepsia e anestesia. A primeira cirurgia foi realizada com a finalidade de remover os testículos bilateralmente. Sessenta dias após a castração foram realizados defeitos ósseos cirúrgicos na região do fêmur. Para a lesão óssea utilizou-se uma broca tipo lança, 2,8 mm de diâmetro, com auxilio do motor de baixa rotação, na velocidade de 1100 rpm, sob irrigação constante com soro fisiológico a 0,09% durante todo ato cirúrgico. Imediatamente após a sutura foi administrada a calcitonina de salmão (Miacalcic –

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NOVARTIS), na dose de 2UI/Kg, IM, nos animais dos grupos Cal e CaLa. A aplicação da calcitonina manteve-se em dias alternados até o sacrifício dos animais. Para a LLT foi utilizado o equipamento THERA LASER® (D. M. C. Equipamentos Ltda São Carlos – SP) diodo semicondutor de GaAlAs, no infravermelho próximo (830nm), com parâmetros de radiação: densidade de energia de 20 J/cm², potência 10 x 10 -3 W, comprimento de onda 800 nm, área do feixe (fibra ótica) 0,002827 cm², modo de aplicação pontual, por 6 segundos. Os animais dos grupos La e CaLa, foram irradiados transcutaneamente em dois pontos ao redor da lesão durante 21 dias, a cada 48 horas, sendo que, a primeira irradiação ocorreu imediatamente após a cirurgia.

As medidas de fluorescência de raios-X foram efetuadas após o armazenamento das amostras em formol. Para análise dos componentes minerais, cálcio (Ca) e fósforo (P) das amostras foi utilizado um espectrofotômetro de Fluorescência de Raios-X marca Shimadzu, modelo µEDX-1300, no LEVB/IP&D/UNIVAP (Figura 2).

A superfície da amostra foi analisada por dispersão de energia de raios-X caracteristicos da amostra utilizando-se, como fonte de excitação, a radiação proveniente de um tubo de ródio (Rh) acoplado a um sistema computadorizado. A região de reparo tecidual foi seccionada ao meio, em sentido longitudinal, com disco HD 15C em 500 rpm. A varredura foi feita em mapeamento de área com 40x30 pontos, passo de 50 µm, tempo de leitura de 260 segundos por área na região de borda de lesão. A contagem da radiação foi feita por um detector semicondutor de Si (Li) refrigerado por nitrogênio líquido. A tensão foi ajustada em 15 kV e a corrente com ajuste automático.

Figura 1: Fotografia de uma amostra referente ao grupo CaLa 21 dias, com indicação, no detalhe, da região analisada.

Utilizou-se como referência o reagente de hidroxiapatita estequiométrica sintética, marca Sigma-Aldrich, grau de pureza 99.99% Ca10(PO4)6(OH)2.

Os parâmetros fundamentais para cálculo do balanço da fórmula química foram estabelecidos para os pesos relativos de Ca, P e O.

Figura 2: Fotografia do espectrofotômetro de Fluorescência de Raios-X, marca Shimadzu (modelo µEDX-1300). No detalhe: compartimento do porta-amostras. A análise estatística descritiva foi realizada considerando-se as médias, desvios padrões e coeficientes de variação para cada um dos componentes e suas relações. Os dados numéricos foram obtidos a partir do valor médio dos pontos resultantes de uma linha de 0,5 mm de comprimento sobre a área mapeada (Figura 3).

Figura 3: Fotografia da área mapeada referente ao grupo CaLa 21 dias em escala de cor.

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Resultados

Os valores encontrados na relação cálcio e fósforo (Ca/P) das amostras estudadas foram avaliados tendo como referência o valor em porcentagem de peso da hidroxiapatita estequiométrica que é de 2,16.

Comparando-se os valores obtidos com relação à proporção Ca/P, observou-se que os grupos C e CaLa, apresentaram valores próximos aos da hidroxiapatita estequeométrica, sendo 2,10 para o grupo C e 2,21 para o grupo CaLa, como mostrado no gráfico da Figura 4. Para os grupos Cal e La os valores foram 2,04 e 2,00, respectivamente.

Controle Calcitonina Laser Calcitonina + Laser0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

2,002,10 2,04

2,21

Rel

ação

Ca/

P

Grupos de Tratamento

Figura 4: Relação Ca/P para os grupos C, Cal, La e CaLa (% de peso).

A taxa de deposição de cálcio em % de peso,

após 21 dias, pode ser observada através do gráfico da Figura 5. Para o grupo C este valor foi de 28,38%, 31,91% para o grupo Cal, 31,43% para La e 32,17 % para o grupo CaLa.

Por outro lado, para taxa de deposição para o fósforo foi 13,47 para C, 15,58 para Ca, 15,66 para La e 14,54 % em peso para o grupo CaLa, conforme demonstrado no gráfico da Figura 6.

Controle Calcitonina Laser Calcitonina + Laser0

5

10

15

20

25

30

35

40

31,91 31,43 32,17

Cál

cio

(% p

eso)

Grupos de Tratamento

28,38

Figura 5: Teor de Cálcio depositado nas amostras de C, Cal, La e CaLa (em % de peso).

Controle Calcitonina Laser Calcitonina + Laser0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

15,58

13,47

15,66

Fós

foro

(%

pes

o)

Grupos de Tratamento

14,54

Figura 6: Teor de fósforo depositado nas amostras dos grupos C, Cal, La e CaLa (% de peso).

Em relação aos teores de Ca, considerando-se os valores médios obtidos para as amostras, os grupos Cal, La e CaLa apresentaram valores similares, enquanto apenas o grupo C apresentou menor taxa de deposição (Figura 5). Entretanto, considerando-se os valores médios do teor de P, os grupos Cal e La (Figura 6) mostraram maior taxa de deposição deste componente. Discussão

A homeostase do cálcio e fósforo no

organismo depende de diferentes mecanismos para sua regulação. Diversos tratamentos com base na farmacologia e laserterapia têm sido aplicados para favorecer a fixação desses minerais no organismo (GENNARI et al., 2007; KHADRA et al. 2004).

A calcitonina sintética tem sido utilizada largamente no tratamento da osteoporose, inibindo a atividade osteoclástica e favorecendo a remodelação óssea, com redução de fraturas ósseas na ordem de 33 a 36% (BORGES & BILEZIKIAN, 2006). Akesson (2003) e Frost (2004) salientam que a calcitonina tem papel determinante na manutenção do cálcio no tecido ósseo e sua ausência ou diminuição determinará a qualidade na remodelação.

A laserterapia, associada ou não a outros tratamentos, também tem sido aplicada no controle das patologias metabólicas de tecido ósseo (LOPES et al., 2007; KAMALI et al., 2007). Kamali, (2007) e Karu, (2009) relatam que a luz laser tem capacidade de favorecer a remodelação tecidual, estimulando a biomodulação celular, a síntese de colágeno, assim como a melhora da atividade celular de células sanguíneas, macrófagos, fibroblastos e condrócitos na área de lesão óssea. A síntese de RNA, DNA e ATP também são favorecidas com a aplicação da laserterapia (KHADRA et al. 2004).

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De fato, os resultados obtidos no presente estudo mostraram que a taxa de deposição de cálcio foi maior para os animais dos grupos tratados com calcitonina sintética, isoladamente ou associada à LLLT.

A relação Ca/P indica o desvio de estequiometria da hidroxiapatita, componente fundamental para a resilencia do tecido ósseo. Portanto, as taxas de deposição diversas para os componentes minerais analisados podem determinar a faixa de variação em relação ao valor padrão estequiométrico. A hidroxiapatita sintética tem o valor de 2,16. Portanto quanto mais próximo deste valor, mais adequada estará a mineralização desse tecido.

O grupo La apresentou a menor relação Ca/P entre os grupos analisados, indicando que a deposição de fósforo é maior que a de cálcio neste grupo. Estes resultados são justificados pelo fato de que esta é uma relação fortemente influenciada por qualquer alteração de seus componentes. Os resultados corroboram com os relatados em estudos precedentes, que mostraram que a eficácia do tratamento LLLT está presente de forma mais efetiva nos estágios iniciais do processo de reparo tecidual (SEIBEL et al., 2006; KAMALI et al., 2007).

O resultado obtido com valor Ca/P mais próximo da hidroxiapatita estequiométrica nas amostras analisadas foi observado no grupo submetido à associação de tratamentos laserterapia e calcitonina, grupo CaLa, concordando com a literatura (NASCIMENTO et al., 2009).

As reorganizações bioquímicas no organismo são comuns e a laserterapia tem capacidade de alterar essas relações (ANTUNES et al., 2005).

A técnica de µED-XRF utilizada na análise das amostras do presente estudo, apresentou-se como ferramenta útil na avaliação dos componentes inorgânicos presentes no tecido calcificado (BARANOWSKA et al., 2004). A análise qualitativa e semi-quantitativa dos componentes inorgânicos das amostras foram verificadas sem que houvesse destruição da amostra ou qualquer alteração em sua estrutura, concordando com os autores que defendem que a técnica é não destrutiva, segura e eficaz para análise bioquímica de compostos inorgânicos (BERTINI, 1978; ANJOS et al., 2004).

Conclusão Com base nos parâmetros utilizados no

presente estudo, a análise por µED-XRF mostrou-se ferramenta útil no estudo de compostos inorgânicos em tecido duro, permitindo as análises qualitativa e semi-quantitativa dos componentes e de suas proporções nesse tecido.

Observou-se que a melhor opção de protocolo de tratamento entre as estudadas na presente pesquisa foi a associação entre calcitonina e laserterapia.

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP - processo: 2008/05786-4. Referências

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