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AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA URINA, OSMOLARIDADE, pH e URÉIA SOBRE O ESPERMATOZÓIDE CANINO

ISRAEL PEREIRA DOS SANTOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

MARÇO, 2007

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA URINA, OSMOLARIDADE, pH E URÉIA SOBRE O ESPERMATOZÓIDE CANINO


Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.

Orientador: Profª. Isabel Candia Nunes da Cunha

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

MARÇO, 2007

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA URINA, OSMOLARIDADE, pH E URÉIA SOBRE O ESPERMATOZÓIDE CANINO


Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.

Aprovada em 29 de março de 2007. Comissão examinadora:

Profº. José Frederico Straggiotti Silva (Doutor, Reprodução Animal) - UENF

Profº. Marcelo Rezende Luz (Doutor, Reprodução Animal) – UFES

Profª. Maria Luisa Celia López Alvarez (Doutora, Ciências Biológicas) - UENF

Profª. Isabel Candia Nunes da Cunha-orientadora (Doutora, Reprodução Animal)-UENF

ii

FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca do CCTA/UENF 056/2007-09-27

Santos, Israel Pereira dos

Avaliação dos efeitos doa urina, osmolaridade, pH e uréia sobre oespermatozóide canino / Israel Pereira dos Santos. 2007.

51f.

Orientador: Isabel Candia Nunes da Cunha Dissertação (Mestrado em Produção Animal) – Universidade Estadual dp

Norte Fluminense Darcy ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias.Campos dos Goytacazes, RJ, 2007.

Bibliografia: f.47-51.

1. Sêmen 2. espermatozóide 3. Canino 4. Urina 5. Reprodução Animal I.Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências eTecnologias Agropecuárias. II. Título.

CDD – 636.70824

ii

“Ser autêntico carioca é possuir dignidade

de existir sem ambições supérfluas. É bastar-se a si mesmo na certeza

de ser um privi legiado do destino.”

Di Cavalcanti

iii

Aos meus pais, Cláudio e Denise,

ao meu irmão Pedro,

que além de serem a minha família,

são meus maiores amigos.

DEDICO

iv

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Norte Fluminense, pelo curso de Pós-graduação

em Produção Animal.

À Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior – CAPES,

pela concessão da bolsa de estudos.

À Professora Isabel Candia Nunes da Cunha pela orientação e por

proporcionar a oportunidade de trabalhar com reprodução de carnívoros.

Ao Professor Edésio Tenório de Melo pela co-orientação, auxiliando no

planejamento do experimento.

Aos amigos Marcelo Lobo, Maurício van Tilburg e Bethania Lopes pela

companhia tanto nas longas horas de trabalho, como também nos momentos de lazer

que a cidade de Campos me proporcionou.

Aos colegas e amigos do NuARC: Amanda, Carla, Cristina, Gabriela, Kassia,

Leonardo, Letícia, Márcia e Renata pelo aprendizado tanto durante as reuniões, quanto

durante o exercício da clínica reprodutiva de pequenos animais.

A André Gimenes, Helga Fernandes Gomes e Professora Maria Clara Caldas

Bussiere pela preciosa colaboração, permitindo que seus cães participassem do

experimento.

Ao Professor Osvaldo de Almeida Resende pela revisão final do texto e ao

Silvério Jr. pela contribuição na análise dos dados.

Aos alunos, técnicos e todos os funcionários do LRMGA que contribuíram

direta ou indiretamente para o meu trabalho.

v

BIOGRAFIA

ISRAEL PEREIRA DOS SANTOS, filho de Cláudio César dos Santos e Denise

Ferreira Pereira dos Santos, carioca de coração, nasceu em 11 de agosto de 1979 na

cidade de Brasília-DF.

Concluiu o curso técnico em Agropecuária pelo Colégio Técnico da

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), em Seropédica-RJ no ano de

1997 e o curso de Medicina Veterinária pela UFRRJ em 2004. Durante a graduação foi

monitor das disciplinas Fisiologia da Reprodução e Inseminação Artificial no

Departamento de Reprodução e Avaliação Animal do Instituto de Zootecnia da UFRRJ,

além de ser Bolsista da Prefeitura do Rio de Janeiro no Instituto Municipal de Medicina

Veterinária Jorge Vaitsman.

Foi admitido em março de 2005 no Curso de Pós-graduação em Produção

Animal, Mestrado, Biotecnologia da Reprodução, da Universidade Estadual do Norte

Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes, submetendo-se à defesa de

dissertação para a conclusão do curso em março de 2007.

vi

CONTEÚDO LISTA DE ABREVIAÇÕES..............................................................................................vii RESUMO........................................................................................................................viii ABSTRACT………………………………………………………………………………………ix 1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................1 2. OBJETIVOS..................................................................................................................3

Objetivo geral:.............................................................................................................................3 Objetivos específicos:.................................................................................................................3

3. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................4 3.1) Coleta do sêmen .................................................................................................................4 3.2) Contaminação do sêmen por urina .....................................................................................5 3.3) Efeitos da urina sobre o sêmen...........................................................................................5 3.4) Como evitar os efeitos deletérios da urina sobre o sêmen .................................................8 3.5) Urina ....................................................................................................................................5 3.6) Sêmen .................................................................................................................................9 3.7) Espermatozóides...............................................................................................................10 3.8) Membrana Plasmática.......................................................................................................11 3.9. Fatores do meio que agem sobre os espermatozóides.....................................................13 3.10) Análise do sêmen ............................................................................................................18

4. Material e Métodos......................................................................................................20 4.1. Animais: .............................................................................................................................20 4.2. Avaliações seminais ..........................................................................................................20 4.2.1. Motilidade: .........................................................................................................21 4.2.2. Morfologia espermática: ....................................................................................21 4.2.3. Integridade de membrana:.................................................................................21 4.3. Procedimentos experimentais ...........................................................................................22 Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas.22 Experimento II - Efeitos de diferentes pH sobre as células espermáticas...................25 Experimento III - Efeitos de diferentes concentrações de uréia...................................27 4.4. Modelo estatístico..............................................................................................................29

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................30 Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas .............30 Experimento II – Comparação dos efeitos da urina com os efeitos de soluções com diferentes pH..............................................................................................................................................35 Experimento III – Efeitos da urina comparado aos efeitos de diferentes concentrações de uréia..................................................................................................................................................40

6. CONCLUSÕES...........................................................................................................46 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................47

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LISTA DE ABREVIAÇÕES

PKA – Proteína Kinase A

CASA – Computer-assisted semen analysis

µL – microlitro

µm/s – micrômetros por segundos

mM – milimolar

mOsmol/l – miliosmóis por litro

VAP – Velocidade do trajeto

VSL – Velocidade progressiva

VCL – Velocidade curvilinear

ALH – Amplitude lateral da cabeça

BCF – Freqüência dos batimentos da cauda

STR – Retilinearidade

LIN – Linearidade

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RESUMO

SANTOS, Israel Pereira dos. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro; março de 2007; Avaliação dos efeitos da osmolaridade, pH, uréia e urina sobre

o espermatozóide canino; Professora orientadora: Professora Isabel Candia Nunes da

Cunha. Professor conselheiro: Edésio Tenório de Melo.

A obtenção e a criopreservação de gametas são importantes ferramentas para a

conservação das espécies em extinção. Durante a coleta de sêmen dos canídeos pela

eletro-ejaculação observa-se a contaminação por urina, seja pela micção ou pela

ejaculação retrógrada. O sêmen contaminado com urina é de baixa qualidade e

dificilmente pode ser usado para criopreservação. Com o objetivo de avaliar a origem

da toxicidade da urina ao espermatozóide canino foram utilizados ejaculados e

amostras de urina de 4 cães, sendo o estudo dividido em três experimentos: I -

comparação do efeito da urina com o efeito causado pela alteração de osmolaridade

que variou de 300-1000mOsmol/l, II – comparação do efeito da urina com o da variação

de pH (5-9) e III - comparação do efeito da urina com o da uréia que variou de 3,5-14

mg/100ml de NaCl (150mM). Em todos os experimentos foram avaliados: movimentos

espermáticos (método computadorizado), morfologia espermática, integridade de

membrana espermática e integridade acrossomal, imediatamente após a adição das

soluções e após 60 minutos de incubação a 37ºC. Os resultados encontrados indicaram

que a redução na motilidade espermática causada pela urina está relacionada à

hiperosmolaridade, que o pH da urina é semelhante ao do sêmen e não é um fator

prejudicial ao espermatozóide canino e que as diferentes concentrações de uréia não

influenciaram as variáveis espermáticas avaliadas.

ix

ABSTRACT

SANTOS, Israel Pereira dos. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro; March 2007; Evaluation of the effect of the osmolaridade, pH, urea and urine on

the canine spermatozoon; Orienting teacher: Teacher Isabel Candia Nunes da Cunha.

Advising professor: Edésio Tenório de Melo.

Attainment and cryopreservation of gametes are important tools for the conservation of

endangerous species. During the semen collection of canids through eletroejaculation, it

is observed contamination by urine, either by micturition during ejaculation or by the

retrograde ejaculation. The semen contaminated with urine is of low quality and usually

can not be used for cryopreservation. With the objective of evaluating the origin of the

urine toxicity to the canine spermatozoa, semen and urine samples from 4 dogs were

used. The study was divided into three experiments: I - comparison between the effect

of urine and the effect caused by the osmolarity alteration, which varied from 300 to

1000mOsmol/l, II - comparison between the effect of urine and the one of pH variation

(5-9) and III - comparison between the effect of urine and the one of the urea, which

varied from 3,5 to 14 mg/100ml of NaCl (150mM). In all experiments it was evaluated:

spermatozoa motility (computerized method), morphology, membrane integrity and

acrossomal integrity, immediately after the addition of the solutions and after incubation

at 37 ºC during 60 minutes. The results indicated that the reduction in the spermatic

motility caused by urine is related to the high osmolarity, the urine pH value similar to the

semen is not a harmful factor to the canine spermatozoon and the different urea

concentrations had no influence on the evaluated parameters.

1

1. INTRODUÇÃO

A obtenção e conservação de gametas têm sido utilizadas para reproduzir

artificialmente animais de produção, companhia e selvagens. Entre os animais

selvagens, os canídeos ocupam uma posição de grande importância por serem

predadores, estarem no topo da cadeia alimentar e poderem servir de parâmetro na

avaliação da integridade de um habitat, pois segundo Rodrigues (2005), o equilíbrio da

população de predadores de uma região indica que a fauna e a flora daquele habitat

estão em equilíbrio.

O isolamento de populações ocasionado pelo desmatamento, leva ao

acasalamento entre animais com parentesco muito próximo – endogamia. Ainda que

algumas espécies possam viver bem com uma baixa diversidade genética, a perda da

heterozigose em algumas populações pode ter conseqüências desastrosas, se

refletindo na diminuição da viabilidade espermática; desenvolvimento de doenças como

a osteocondrose, paralisia laringotraqueal, neoplasias, doenças auto-imunes e alergias

alimentares (RODRIGUES, 2005).

Para aumentar a variabilidade genética nas populações isoladas é necessária a

criação de bancos genéticos, que por sua vez requerem a obtenção e criopreservação

de gametas (WATSON e HOLT 2001).

Cada espécie tem sua particularidade quanto à obtenção e congelamento de

gametas. Nos canídeos é relatada a contaminação por urina, seja pela emissão de

urina junto com o sêmen (urospermia), ou pela ejaculação em direção a bexiga

(ejaculação retrógrada), que pode ocorrer tanto na monta natural, na coleta por

2

estimulação peniana ou quanto durante a eletro-ejaculação (ROMAGNOLI, 1999;

WATSON e HOLT, 2001; SILVA et al., 2004; CAZES, 2006). Com destaque para o

lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), em que a ejaculação retrógrada ocorre com

elevada freqüência durante as coletas de sêmen por eletro-ejaculação (CUNHA e

MORATO1, comunicação pessoal).

Os protocolos utilizados para evitar os efeitos da contaminação do sêmen com

urina durante as coletas incluem: lavagem do sêmen em meio diluidor por meio da

centrifugação logo após a coleta (MAKLER et al., 1981; GRIGGERS et al., 2001), uso

de simpatomiméticos agonistas-α2 para fechar o colo da bexiga no momento da

ejaculação (ROMAGNOLI, 1999) e introdução de uma quantidade de tampão dentro da

bexiga suficiente para neutralizar o efeito deletério da urina sobre o sêmen

(BRASSESCO et al., 1988; RANIERI et al., 1995).

Os autores que trabalharam tentando solucionar o problema da contaminação

do sêmen pela urina, como Makler et al. (1981) e Tsai et al. (1990), observaram uma

drástica redução na motilidade espermática, mas não esclareceram se haviam

alterações morfológicas, lesões das membranas plasmáticas ou mitocondrial ou

qualquer outra alteração ultra-estrutural.

Há também relatos de retorno à motilidade espermática dos espermatozóides

paralisados pela urina após a correção da osmolaridade e do pH (principais fatores

responsabilizados pela redução da motilidade), com diluidores à base de leite

(GRIGGERS et al., 2001; SANTOS et al., 2005).

Quando se trabalha com animais em vias de extinção todas as amostras de

sêmen, obtidas durante o processo de eletro-ejaculação devem ser aproveitadas,

mesmo que haja contaminação por urina. Para a utilização do sêmen que foi obtido em

condições aquém do ideal é preciso neutralizar os efeitos deletérios causados pela

urina. Sendo assim, é necessário um estudo de base para entender qual o fator da

urina é o mais deletério ao espermatozóide de canídeos.

1 Cunha, I.C.N. Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal – UENF /RJ-Brasil. Morato, R.G. Pró-carnívoros/ CENAp-IBAMA / SP-Brasil.

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2. OBJETIVOS

Objetivo geral:

Avaliar os efeitos deletérios da urina sobre o espermatozóide canino, com o

intuito de dar base aos estudos de criopreservação do sêmen do lobo-guará.

Objetivos específicos: Avaliar os efeitos da osmolaridade, pH, uréia e urina, separadamente para

tentar entender os efeitos causados por cada fator da urina sobre o espermatozóide

canino.

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3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1) Coleta do sêmen

O sêmen canino pode ser obtido pelo estímulo manual do bulbo peniano,

vagina artificial ou eletro-ejaculação (JOHNSON, 2001; SILVA et al., 2004). O estímulo

manual do bulbo peniano tem destaque para os cães, pois requer um curto período de

condicionamento e não precisa de equipamentos sofisticados, usam-se apenas luvas,

funil e tubo coletor. A vagina artificial tem o inconveniente de necessitar de tamanhos

variados, devido aos diferentes tamanhos de cães, de acordo com suas raças.

A eletro-ejaculação é o método de eleição quando se trabalha com animais

selvagens, pois não é necessário o condicionamento do animal. O protocolo de eletro-

ejaculação preconizado para os canídeos é aquele descrito por Platz e Singer, em 1978

(GOODROWE et al., 1998, SILVA et al., 2004).

Apesar do sucesso na coleta de sêmen pelo método da eletro-ejaculação em

Canis rufus por Goodrowe (1998), este método tem como contra ponto a contaminação

por urina quando utilizado em outros canídeos como o cão doméstico, Canis familiaris

(OHL et al., 1994, CAZES, 2006) e no lobo-guará: Chrysocyon brachyurus (Cunha e

Morato, comunicação pessoal).

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3.2) Contaminação do sêmen por urina

A estreita relação do sistema urinário com o sistema reprodutor permite que o

sêmen entre em contato com a urina em algumas ocasiões como resultado de

mecanismos fisiológicos, patológicos ou pela técnica de coleta de sêmen. Tanto a

micção, quanto a ejaculação retrógrada são importantes eventos que ocorrem durante o

processo de eletro-ejaculação nos canídeos (OHL et al., 1994; GOODROWE, 1998.

ROMAGNOLI, 1999; CAZES, 2006).

A contaminação por urina também ocorre no homem por causas patológicas ou

durante a eletro-ejaculação em paraplégicos. Os avanços no desenvolvimento de

técnicas para a utilização do sêmen humano contaminado com urina foram feitos a

partir dos estudos de Crich e Jequier (1978) e Makler et al. (1981) quando avaliaram

métodos de lavagem do sêmen para utilização nos processos de inseminação artificial.

3.3) Urina

A urina é formada para manter a composição dos líquidos extracelulares

constante e geralmente a maioria das substâncias que estão presentes no fluido

extracelular também está presente na urina (REECE, 1996). O volume diário da urina

de um cão adulto é 17±9mL/kg de peso corporal (LAROUTE et al., 2005).

O urobilinogênio quando oxidado é conhecido como urobilina e é o maior

responsável pela cor amarela da urina (REECE, 1996; REINE et al., 2005). O odor é

característico de cada espécie e denominado suis generis (COLES, 1986). A

consistência da urina na maioria das espécies é aquosa, mas nos eqüinos pode ser um

pouco espessa e viscosa por causa da secreção de muco pelas glândulas na pélvis

renal (REECE, 1996).

A glicose presente no filtrado glomerular é quase toda absorvida pelo túbulo

proximal. Está presente na urina principalmente nos casos patológicos como no

diabetes melito, estresse, necrose tubular ou pielonefrites (REINE e LANGSTON,2005).

O principal componente nitrogenado encontrado na urina é a uréia, uma vez

que a maioria das proteínas não atravessam o aparelho de filtração glomerular. A uréia,

formada no fígado, é relativamente não-tóxica, pequena não-iônica, produto da

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metabolização da amônia (REECE, 1996). A concentração da uréia na urina pode variar

de 7-16 mg por 100mL (KOLB, 1987).

As cetonas mais encontradas na urina dos pequenos animais são ácido

acético, acetona e ácido β-hidroxibutírico. Estas cetonas são resultantes do

metabolismo dos ácidos graxos, pobremente controlado no diabetes melito, são

encontradas nos cães com dietas ricas em proteínas e pobre em carboidratos (REINE e

LANGSTON, 2005).

A maioria dos eletrólitos encontrada no filtrado glomerular é reabsorvida ao

longo do néfron, sendo os principais Na+, K+, Ca2+, Mg2+ e fosfato. A reabsorção destes

é dependente de energia e envolve mecanismos como a bomba Na-K ATPase. A

maioria do Ca2+ está ligado à albumina, citrato ou fosfato e cerca de 25% do Mg2+ está

ligado às proteínas (REECE, 1996). Entretanto alguns destes íons são excretados e

0,17±0,082% de sódio, 8,1±3,83% de potássio, 0,26±0,127% de cloreto, 0,099±0,060%

de cálcio e 18,4±7,01% de fósforo fazem parte da composição final da urina (LAROUTE

et al., 2005).

A concentração normal de íons hidrogênio na urina é dependente do tipo de

dieta. Animais herbívoros tendem a ter uma urina alcalina, enquanto os carnívoros

tendem à acidez. Os valores normais do pH da urina dos bovinos estão entre 7,4-8,4

enquanto no cão estão entre 6-7 (COLES, 1986) ou 5-9 (REINE e LANGSTON, 2005).

A gravidade específica da urina (USG) é um parâmetro utilizado na clínica para

indicar se os rins do paciente são capazes de concentrar ou diluir o filtrado glomerular.

Os parâmetros utilizados para a medir a USG, diferente da osmolaridade, levam em

consideração a comparação entre o peso de um determinado volume de urina,

comparado com o peso de um mesmo volume de água destilada e pode ser medido

com um refratômetro. Os valores normais de USG para o cão são >1.030. Quando os

rins do cão não conseguem concentrar o filtrado glomerular, diz-se que o animal está

com isostenúria, ou seja, a osmolaridade da urina é a mesma do plasma sanguíneo.

Neste caso a USG varia entre 1.007 e 1.012 (REINE e LANGSTON, 2005). Entretanto

as gravidades específicas e a osmolaridade nem sempre podem estar relacionadas

diretamente, pois há diferenças entre animais, grau de hidratação e período do dia em

que a urina é coletada (VAN VONDEREN, 1997).

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Quanto à osmolaridade, embora esta permaneça constante no sangue, na

urina é variável e depende do estado de hidratação e da função renal. Com a função

renal normal, a osmolaridade pode atingir 3000 mOsmol/l, como também pode estar tão

baixa quanto 50 mOsmol/l em indivíduos com poliúria e função renal anormal (COLES,

1986). Laroute et al. (2005) e Santos et al. (2005) obtiveram urina com osmolaridades

de 1241±248mOsmol/l para cães adultos da raça Beagle e 949-1273 mOsmol/l para

cães adultos da raça Rottweiler, respectivamente.

Há ainda alguns componentes que podem ser encontrados na urina do cão em

casos patológicos como, por exemplo, proteínas (em concentrações que variam de 30-

1000mg/dL, ou 1+ até 4+, respectivamente), cilindros, cristais, hemácias, bactérias

(algumas destas secretam nitritos) e leucócitos (REINE e LANGSTON, 2005).

3.4) Efeitos da urina sobre o sêmen

Desde os primeiros experimentos realizados à procura de um diluidor para o

sêmen em 1856, na tentativa de manter a fertilidade do mesmo por algum tempo in

vitro, é conhecida a ação deletéria da urina sobre os espermatozóides (PEREZ, 1994).

Crich et al. (1978) atribuíram à diferença de pH e de osmolaridade entre o

sêmen e a urina à redução da motilidade dos espermatozóides humanos. Estes autores

verificaram que mesmo após a correção do pH o contato com a urina ainda reduzia a

motilidade do sêmen, e concluíram que a elevada osmolaridade da urina poderia ser

um outro fator que alterava a motilidade do sêmen obtido pela coleta manual e pela

eletro-ejaculação.

Em experimentos in vitro, observando-se o comportamento dos

espermatozóides de humanos (MAKLER et al., 1981), de eqüinos (GRIGGERS et al.,

2001) e do cão (SANTOS et al, 2005) misturados com urina, há consenso que a

redução da motilidade pode ser revertida por até uma hora quando é adicionado um

diluidor a base de leite. Entretanto, o tempo de sobrevivência após a adição do diluidor

não é satisfatório e nestes trabalhos não foi avaliada a fertilidade do sêmen por testes

biológicos como a penetração oocitária e inseminação artificial.

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3.5) Como evitar os efeitos deletérios da urina sobre o sêmen

Os controles da ejaculação e da micção são feitos pelo sistema nervoso

vegetativo e o fechamento do colo da bexiga é dependente da ação do sistema nervoso

simpático sobre os receptores α2-adrenérgicos (REECE, 1996). A ereção e o

relaxamento do colo da bexiga são controlados pelo sistema nervoso parassimpático e

no momento da ejaculação pode haver fluxo de sêmen em direção à bexiga (REECE,

1996; ROMAGNOLI, 1999).

Tendo conhecimento dos mecanismos que controlam a ejaculação e a micção,

foi sugerido o uso de agonistas α2-adrenérgicos para fechar o colo da bexiga e impedir

a ejaculação retrógrada no homem (BRASSESCO et al., 1988) e em cães

(ROMAGNOLI, 1999). Entretanto um dos possíveis efeitos indesejados dos agonistas

α2-adrenérgicos como a Xilazina é o bloqueio átrio-ventricular (BOOTH, 1992;

TÁRRAGA, 2002).

Quando não for possível atingir uma ejaculação antrógrada, deve-se pensar em

reduzir a toxicidade da urina sobre os espermatozóides. Crich et al. (1978) já haviam

sugerido que apenas a correção do pH da urina não é suficiente para evitar a morte dos

espermatozóides no sêmen contaminado com urina e que a osmolaridade deveria

também ser corrigida. Makler et al. (1981) também sugeriram que a reversão da

hiperosmolaridade é crucial para solucionar a toxicidade da urina.

Brassesco et al. (1988) utilizaram uma solução de Bicarbonato de Sódio via

oral em seus pacientes humanos com ejaculação retrógrada e quando a urina deles

atingia a osmolaridade 300-500 mOsmol/l e pH entre 6,5 e 8,0 o sêmen era coletado.

Com este procedimento, estes autores conseguiram sucesso em todos os casos que

trataram.

Ranieri et al. (1995) introduziram uma solução salina tamponada com 0,25 mM

de HEPES na bexiga de pacientes humanos antes da coleta de sêmen e utilizaram o

conteúdo vesical para a inseminação artificial em uma mulher que foi submetida ao

protocolo de superovulação e deste processo foi gerado apenas um bebê. Já Nikolettos

et al. (1999) utilizaram os espermatozóides de homens com ejaculação retrógrada,

encontrados na urina logo após a masturbação, centrifugação e seleção dos

espermatozóides pelo método swim-up, para fertilizar oócitos por meio da injeção

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intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) e obtiveram uma taxa de fertilização de

51,2%.

Métodos baseados apenas na lavagem do sêmen pela centrifugação seguida

da diluição do precipitado em solução específica também têm sido sugeridos. As

soluções de lavagem podem ser constituídas de solução salina tamponada, adicionada

de glicose (TSAI et al., 1990) ou podem conter albumina sérica humana (SCAMMELL et

al., 1982), sendo que a albumina pode induzir a capacitação espermática, inviabilizando

os espermatozóides ao processo de congelamento (GADELLA et al., 2001). Griggers et

al. (2001) conseguiram bons resultados quando utilizaram um diluidor à base de leite

para recuperar a motilidade dos espermatozóides eqüinos após a paralisação induzida

pela urina e o mesmo foi confirmado por Santos et al. (2005) em cães.

3.6) Sêmen

O sêmen canino é ejaculado em três frações. A primeira é composta por

algumas gotas de um líquido claro, provavelmente da próstata. Alguns cães podem

ejacular vários mililitros destas frações.

A segunda é rica em espermatozóide e seu volume varia de 0,5 a 5 ml,

dependendo do tamanho do testículo e de cada indivíduo, aparecendo esbranquiçada e

opalescente. Normalmente não se tenta separar as duas primeiras frações (JOHNSON,

2001).

A terceira fração e maior fração é o líquido prostático, podendo chegar a 30ml

(JOHNSON, 2001).

O sêmen canino pode ser manipulado em temperatura ambiente por 15 a 30

minutos sem que ocorram efeitos adversos, porém no menor tempo possível. A amostra

deve ser protegida de alterações súbitas de temperatura. As lâminas devem ser

mantidas a 37°C (JOHNSON, 2001).

O pH do sêmen canino tem variações de 6,3 a 7 no plasma seminal e até 6 a

7,4 no líquido prostático (JOHNSON, 2001).

A osmolaridade média do sêmen canino pode ser medida de acordo com a

variação do ponto crioscópico é de 300 mOsmol/L, o que equivale ao ponto de

congelamento de aproximadamente –0,55ºC (SALISBURY et al., 1978).

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3.7) Espermatozóides

Os espermatozóides são células haplóides formadas dentro dos túbulos

seminíferos do testículo. São células complexas, transformadas e especializadas para

fertilizar o oócito. O sucesso da fertilização, quando apenas um espermatozóide entre

milhões ou bilhões depositados no trato reprodutivo da fêmea penetra o oócito,

depende não só dos fatores ligados à formação do espermatozóide. Diversos fatores

externos vão influenciar na capacidade do espermatozóide fertilizar um oócito, como o

pH, osmolaridade, viscosidade, temperatura, disponibilidade de energia e proteínas. O

que determina se estes fatores vão levar a uma alteração fisiológica reversível ou não é

a membrana plasmática, pois a comunicação entre o espermatozóide e o meio externo

é feita por mecanismos biomoleculares controlados pela membrana plasmática

(HAFEZ, 1995; GADELA et al., 2001).

As diversas espécies de mamíferos têm particularidades quanto à forma,

tamanho e composição dos espermatozóides, mas basicamente o espermatozóide é

composto de cabeça, peça intermediária e cauda. Sendo a cabeça subdividida em

região acrossomal, equatorial e pós-acrossomal. Na cabeça encontra-se o núcleo

contendo a metade do material genético necessário à formação de um novo indivíduo

na forma de cromatina condensada (HOLT, 1984; HAFEZ, 1995). A cauda tem uma

região onde se concentram as mitocôndrias, que geram energia na forma de ATP pela

quebra de monossacarídeos como a lactose, frutose e glicose que passam através da

membrana plasmática, já que durante a espermatogênese o espermatozóide perde

muitas organelas e não tem energia armazenada no citoplasma. Além das mitocôndrias,

a cauda tem nove pares de microtúbulos organizados ao redor de um par central,

denominado axonema, que impulsionam o espermatozóide pelo deslizamento entre os

microtúbulos dependente de ATP (MORTIMER, 1997).

A célula espermática canina tem 61,4±0,3µm de comprimento, tendo a cabeça

6,1±0,04µm, com largura de 3,8±0,2µm. A peça intermediária mede 10,1±0,7µm e a

cauda em torno de 50µm (DAHLBOM et al., 1997). Entretanto existem diferenças entre

indivíduos, com relação à morfometria de espermatozóides, na espécie canina

(DAHLBOM et al., 1997; PEÑA, 2004).

11

3.8) Membrana Plasmática

Segundo Henderson e Stroud (2004), as membranas celulares são essenciais

para a vida da célula. A membrana plasmática envolve a célula, define seus limites e

mantém as diferenças entre o citossol e o meio extracelular. Além da membrana

plasmática, o espermatozóide contém outras membranas celulares como a acrossomal,

nuclear e mitocondrial.

A membrana plasmática do espermatozóide ou plasmalema tem estrutura

comum àquela encontrada nas células somáticas. Em sua constituição estão os

fosfolipídios, com propriedades anfipáticas, que interagem entre si através de ligações

não-covalentes, talvez elétricas, e proteínas associadas à bicamada lipídica de forma

integral ou não. Os quatro fosfolipídios principais que predominam na membrana

plasmática são: fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina.

Sendo que estes dois últimos estão localizadas na face interna da membrana (SINGER,

1972).

A característica anfipática dos fosfolipídios, isto é, ter uma parte que interage

com o meio aquoso e outra que não interage, forma uma camada que impede a maioria

das moléculas hidrossolúveis de penetrar no citossol. A passagem de moléculas como

a da água e íons só é possível graças aos canais específicos formados por proteínas

inseridas na membrana (DARSZON et al., 1999; HENDERSON e STROUD, 2004). A

regulação dos processos biológicos que ocorrem dentro da célula é feita pela

separação entre o citossol e o meio externo.

A organização da membrana é heterogênea no que se refere à distribuição

lateral dos lipídios. Estes, como as proteínas, também estão agrupados em

microdomínios formados pelos lipid rafts (canoas ou plataformas lipídicas). Os lipid rafts

são lipídios insolúveis em Triton X-100 a 4°C, que se encontram em regiões restritas da

membrana plasmática e tem dimensões inferiores a dez nanômetros (SIMONS e

IKONEN, 1997; VERB et al., 2003). Esta porção de lipídios resistente à ação de

detergentes, quando submetida a um processo de separação por centrifugação, flutua

por ser de baixa densidade e rica em esfingolipídios e colesterol (SIMONS, 2004). A

posição dos lipid rafts na membrana plasmática é garantida pelo citoesqueleto, pois os

12

estes lipídios podem estar trafegando livres dentro de um domínio ou ancorados a

alguma proteína (EDDIN, 2003).

Os lipid rafts como o CD-59, que é Glicosil fosfatidil inusitol (GPI) ancorado a

uma proteína de 18-25 kda, desempenha um papel de interação entre os

espermatozóides e os oócitos humanos durante a fecundação (CROSS, 2004).

Christova et al. (2004) observaram que a membrana plasmática do

espermatozóide do cão tem a permeabilidade aumentada na região acrossomal durante

o processo de maturação. A reorganização dos lipídios é o ponto chave para o aumento

da permeabilidade da membrana plasmática o que permitirá a entrada de cálcio para

participar dos processos que levam à capacitação.

As variações de pH e osmolaridade entre as diferentes regiões do epidídimo do

camundongo não foram suficientes para alterar a distribuição dos lipídios, como

observado durante os processos de resfriamento e congelamento dos

espermatozóides. Sendo assim, é possível que os lipid rafts não participem na

regulação da osmolaridade e do pH intracelular (CHRISTOVA et al.2002).

As proteínas de membrana têm capacidade de se mover através da

membrana. Mas este movimento não é aleatório, como proposto por Singer em 1972,

no modelo do mosaico fluido. As proteínas têm seu movimento restrito a determinadas

regiões ou domínios que podem ser determinados pelo citoesqueleto ou por interações

entre as proteínas de membrana (JACOBSON et al., 1995).

Recobrindo a superfície celular está o Glicocálix constituído por carboidratos

que interagem com as proteínas da membrana por ligações covalentes. Entre outras

funções, o Glicocálix protege a célula de alterações de pH do meio externo e participa

na interação do espermatozóide com o oócito (HENDERSON e STROUD, 2004).

Proteínas descobertas recentemente também têm o papel de proteger o

espermatozóide no epidídimo e no trato genital feminino. A forma como estas proteínas

se ligam à membrana plasmática após a espermiação é desconhecida, mas supõe-se

que haja interações iônicas, ou sejam integradas à membrana após proteólise (GATTI

et al., 2004).

13

3.9) Fatores do meio que agem sobre os espermatozóides a) Osmolaridade

A osmose é o processo de difusão do solvente através de uma membrana

semipermeável a partir de uma solução de maior concentração para uma de menor

concentração de solvente (REECE, 1996). A concentração do solvente como a água é

relativa à concentração do soluto. Quando duas soluções com concentrações diferentes

de solutos estão separadas por uma membrana biológica, que impeça a passagem do

soluto, a água se moverá para o lado com a maior quantidade de soluto, por causa da

pressão osmótica (SHAW, 1975).

A importância da manutenção da osmolaridade está relacionada à regulação

do volume celular, que mantém a funcionalidade da célula e porque as biomoléculas

polares das células vivas existem e reagem fundamentalmente em um ambiente aquoso

(RODWELL, 2004). A existência da vida na Terra depende criticamente da capacidade

da água dissolver uma notável gama de moléculas polares, que servem de fonte de

energia, catalisadores e portadores de informação. No entanto a excelência da água

como solvente gera um problema, porque enfraquece as interações entre moléculas

polares. Os sistemas biológicos resolveram esse problema criando micro-ambientes

livres de água onde as interações polares têm força específica máxima (STRYER,

1996).

Do ponto de vista fisiológico, a quantidade de água dentro da célula irá manter

o equilíbrio homeostático, regulando o tamanho da célula e as reações físico-químicas

que ocorrem no meio intracelular. Uma solução isotônica é aquela que tem a mesma

pressão osmótica do plasma sanguíneo, isto é, 300 mOsmol/l. A homeostasia é a

manutenção da quantidade de água necessária à manutenção dos processos

fisiológicos dentro de certos limites (REECE, 1996).

A osmolaridade é a medida do número de partículas em uma solução e tem

como unidade de medida o Osmol (mais comumente utilizado na fração de 1/1000

como mOsmol/l para os processos biológicos). O prefixo os é usado para indicar que

houve uma hidrólise de uma solução molar. Quando trabalhamos com moléculas que

não se dissociam (como a glicose), 1 mol é igual a 1 Osmol. Quando trabalhamos com

14

uma molécula totalmente dissociável, como o NaCl, multiplicamos o número de mols

pelo número de partículas (ex. 1 mol de NaCl tem 2 Osmol). Em um terceiro caso, dos

solutos que se dissociam parcialmente, é necessário saber o coeficiente de dissociação

de cada elemento químico para chegar a osmolaridade final daquela solução. Uma

solução de um molar é aquela feita com o mesmo peso molecular do reagente.

Exemplo: uma solução de 1 molar de NaCl tem 58,44g de NaCl dissolvidos em 1 litro de

água (HENEINE, 2000).

Para medir a osmolaridade de uma solução utiliza-se a propriedade coligativa,

ou seja, alteração do ponto de ebulição, abaixamento da pressão de vapor ou

abaixamento do ponto de congelamento. Destas, a mais usada é o abaixamento do

ponto de congelamento. Uma solução de 1 Osmol, tem o ponto de congelamento

1,858°C menor que uma solução de água livre de soluto, ou seja, uma solução de 300

mOsmol/l tem o ponto de congelamento 0,56°C menor que a água (REECE, 1996).

No trânsito do espermatozóide pelos túbulos seminíferos, epidídimo e

chegando à uretra onde a mistura com as secreções das glândulas acessórias forma o

sêmen, há uma redução na osmolaridade, tirando o espermatozóide do seu estado de

quiescência e ativando a motilidade. A osmolaridade do plasma seminal (± 300

mOsmol/l) continua a reduzir quando o espermatozóide chega ao trato reprodutivo da

fêmea, onde há influxo de Ca2+ e a remoção dos agentes que impedem a capacitação

depositados sobre a superfície do espermatozóide (ROSSATO et al., 2002).

As alterações de osmolaridade do meio fazem a água passar através da

membrana de maneira passiva sempre no sentido hipertônico. A entrada e saída de

água aumentam ou diminuem o volume celular causando alterações morfológicas no

espermatozóide como o inchaço e enrolamento da cauda. O controle de íons dentro da

célula é importante para a manutenção da homeostase e é feito por canais iônicos às

custas de gasto de energia pela bomba Na/K ATPase (DARSZON et al., 1999,

MEYERS, 2005).

Makler et al. (1981) e Griggers et al. (2001) concordam que meios

hiperosmóticos são menos agressivos à funcionalidade do espermatozóide que os

hiposmóticos, talvez pela alteração de volume que a entrada ou a saída de água

causam na célula.

15

A velocidade com que a água passa através da membrana ou a condutividade

hidráulica podem ser fundamentais para entender a capacidade da célula resistir às

alterações de osmolaridade (MEYERS, 2005).

O conhecimento da relação do espermatozóide de cada espécie com as

variações de osmolaridade é fundamental para a elaboração de um diluidor adequado

aos processos de resfriamento e congelamento de sêmen em todas as espécies

(MEYERS, 2005).

Os limites de tolerância de osmolaridade foram determinados para o carneiro,

camundongo, homem e cavalo. No eqüino, por exemplo, sabe-se que alterações de

100mOsmol/l partindo de condições isosmóticas não causam alterações significativas

na motilidade e viabilidade espermáticas (MEYERS, 2005). As alterações ocorridas em

condições de hiperosmolaridade são facilmente revertidas quando o espermatozóide é

colocado em solução isosmótica ± 300 mOsmol/l (MAKLER et al., 1981; GRIGGERS et

al. 2001).

b) pH

A disponibilidade de prótons intra e extracelulares dadas pelo potencial

hidrogeniônico (pH) agem dentro e fora da membrana plasmática, já que existem

interações moleculares que podem ser alteradas por um próton livre ou um radical

hidroxila (HENDERSON e STROUD, 2004). A membrana plasmática regula o pH

interno por um transporte de Na+, Cl-, e HCO3- dependente de ATP. O pH 6,6 já havia

sido determinado como o melhor para a manutenção da motilidade do espermatozóide

canino, em 1963 (FOOTE; LEONARD, 1963). A margem de variação de pH que o

espermatozóide suporta é estreita, mas o efeito de uma solução levemente ácida sobre

a motilidade do espermatozóide, é mais facilmente revertido quando o pH é corrigido

em relação aos efeitos do pH básico (MARKLER et al., 1981; GRIGGERS et al., 2001).

O efeito imediato observado quando o sêmen é colocado em um meio com o pH

inadequado é a perda da motilidade. Os meios com o pH básico podem induzir a

capacitação espermática, pois o HCO3- ativa a adenilato ciclase e inicia uma seqüência

de eventos como o efluxo de colesterol, alteração da permeabilidade da membrana,

influxo de Ca2+ e reação acrossômica (GADELLA et al., 2001).

16

c) Energia

Durante o processo de formação do espermatozóide há perda de muitas

organelas, mas permanecem no citoplasma enzimas necessárias para a ativação de

mecanismos fisiológicos como a frutólise, gerando ATP. O açúcar mais utilizado na

nutrição das espermátides pela célula de Sertoli é a lactose, mas no plasma seminal, o

monossacarídeo responsável por fornecer energia aos espermatozóides na maioria das

espécies domésticas é a frutose, pois este é o principal açúcar animal. A quebra da

frutose para a obtenção de ATP gera ácido lático e piruvato na ausência de oxigênio.

Em ambientes aeróbicos as mitocôndrias podem utilizar o ácido lático e o piruvato para

gerar ATP, tendo como sub-produto CO2 e água (HAFEZ, 1995).

As células precisam de nutrientes externos para a sua sobrevivência. Nas

células somáticas, estes nutrientes são transportados pela corrente sanguínea e

chegam à célula em questão por interações celulares. O espermatozóide não é

diferente quanto à dependência do meio externo para a sua sobrevivência e os

nutrientes estão disponíveis no plasma seminal (HAFEZ, 1995).

Rigau et al. (2001) demonstraram a importância das hexoses na manutenção

da motilidade do espermatozóide canino, quando compararam a motilidade do

espermatozóide em um meio com o outro sem açúcar. A linearidade do movimento

espermático, que está correlacionada com a capacidade fertilizante do espermatozóide,

foi maior nos meios enriquecidos com frutose que naqueles enriquecidos com glicose.

As concentrações de frutose, glicose, manose e sorbitol também foram determinadas

pelo Cobas Bio Autoanalyzer nas 3 frações do ejaculado do cão (Tabela 1).

17

Tabela 1. Concentações de hexoses nas frações separadas do plasma seminal.

Hexose Primeira fração Segunda fração Terceira fração

Frutose (mM¹) 0,01±0,01 0,06±0,01 0,00±0,00

Glicose (mM¹) 0,01±0,01 0,01±0,01 0,04±0,01

Manose (mM¹) 0,00±0,00 0,01±0,01 0,01±0,01

Sorbitol (mM¹) 0,01±0,01 0,01±0,01 0,01±0,01

*os resultados são as médias de 25 ejaculados, onde as três frações do sêmen foram coletadas em tubos separados por estímulo manual do pênis. **adaptados de RIGAL et al. 2001. ¹ milimolar d) Viscosidade

A resistência mecânica que o meio oferece ao deslocamento do

espermatozóide influencia na velocidade e requer um gasto maior de energia, quanto

maior for a viscosidade. Para aumentar a viscosidade do meio, alguns autores

utilizaram carboximetilcelulose, metilcelulose ou gema de ovo e concluíram que a

viscosidade diminui a velocidade média dos espermatozóides, mas não altera a

linearidade (HIRAIS et al.,1997).

e) Oxigênio

Os espermatozóides de mamíferos estão sujeitos ao estresse oxidativo, por

causa do alto nível de ácidos graxos e baixa concentração de anti-oxidantes naturais

que se encarregam da defesa. O espermatozóide irá entrar em contato com radicais

livres durante sua passagem até chegar ao oócito, pois células brancas, como os

neutrófilos no plasma seminal, liberam radicais livres chamados “espécies reativas ao

oxigênio” (ROS), que a princípio destruiriam agentes patogênicos, mas também agem

sobre os espermatozóides. O ataque oxidativo resulta em duas alterações: a primeira é

benéfica, pois uma média oxidação ativa a PKA levando a uma cascata de reações que

resulta na capacitação espermática, tornando o espermatozóide pronto para a fertilizar

18

o oócito. E a segunda, que é deletéria, pela excessiva peroxidação, resulta na

deteriorização do espermatozóide (GADELLA et al., 2001).

3.10) Análise do sêmen A fertilidade do sêmen pode ser avaliada por métodos que indiquem se há

alguma alteração morfológica ou funcional da célula espermática. As análises que

indicam a fertilidade do sêmen incluem as alterações da motilidade, morfologia,

integridade da membrana plasmática e integridade de acrossoma (PEÑA, 2004).

A motilidade e vigor são avaliados pela estimação visual com microscópio nos

aumentos de 100x ou 400x, onde o resultado da motilidade é dado pela percentagem

de células móveis (0-100%) e o vigor é classificado de 0-5, de acordo com a

intensidade do movimento dos espermatozóides (CBRA, 1998). Outro modo de avaliar

a motilidade é pelo método computadorizado e este tem a vantagem sobre os descritos

anteriormente por descrever os padrões de movimento (ELLINGTON et al., 1993;

IGUER-OUADA e VERSTEGEN, 2001).

A morfologia do espermatozóide pode ser alterada pela manipulação do sêmen

nos processos como a criopreservação (OÉTTLE, 1986) e as alterações de

osmolaridade, influenciam no volume do espermatozóide, levando ao enrolamento da

cauda quando o espermatozóide é colocado em uma solução hiposmótica (KUMI-

DIAKA, 1993).

As alterações da membrana plasmática podem ser avaliadas por corantes

vitais, sondas fluorescentes, pelo teste hiposmótico (PEÑA, 2004) ou por observação

de alterações ultra-estruturais sob microscopia eletrônica (PLUMMER e WATSON,

1988). A Eosina Amarela, um corante vital, na concentração final de 0,5% permite

diferenciar as células com a membrana plasmática íntegra (não coradas) daquelas com

a membrana lesada (coradas em vermelho), como descrito por VERHEYEN et al.

(1997).

O acrossoma é um importante componente do espermatozóide, pois carrega

enzimas necessárias ao processo de penetração durante a fecundação do oócito. A

integridade acrossomal pode ser avaliada com técnicas de coloração como o Giemsa, e

recentemente o uso de lectinas conjugadas com o isotiocianato de fluoresceína permitiu

19

o melhor contraste para a avaliação da integridade acrossomal. O PSA (Pisum

sativum), que é uma das lectinas utilizadas permite classificar em três categorias:

íntegro, lesado e semilesado (RIJSSELAERE et al., 2005).

20

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1) Animais

Foram utilizados ejaculados de quatro cães (2 da raça Pastor Canadense, 1

Cocker Spaniel e um mestiço), com idade entre 3-5 anos e saudáveis residentes em

criatórios particulares. As coletas foram realizadas por meio de estimulo manual do

pênis (JOHNSON, 2001). As segundas e terceiras frações dos ejaculados foram

coletadas em tubos separados. Amostras de urina foram obtidas pela micção

espontânea dos cães, com auxílio de funil e tubos para centrífuga de 15,0ml, após as

coletas de sêmen.

4.2) Avaliações seminais

Os ejaculados foram avaliados no sub-setor de tecnologia de sêmen do

Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal. O tempo entre a coleta o

início das avaliações foi sempre inferior a 30 minutos.

Foram realizadas avaliações macro e microscópicas do sêmen imediatamente

após a exposição do sêmen ao meio a ser testado e após incubação de 60 minutos em

banho-Maria a 37°C, em todos os experimentos propostos: Experimento I: comparação

dos efeitos da urina com o efeitos de soluções com diferentes osmolaridades;

Experimento II: comparação dos efeitos da urina com os efeitos de soluções com

diferentes pH; Experimento III: comparação dos efeitos da urina com os efeitos

21

causados por diferentes concentrações de uréia. Para a obtenção do plasma seminal a

terceira fração do ejaculado foi centrifugada a 800 x g por 10 minutos.

4.2.1) Motilidade

As avaliações da motilidade foram feitas pelo método computadorizado

utilizando o equipamento Hamilton Thorne Research IVOS 10 (CASA). Para as leituras

foram colocados 5µL de sêmen dentro da câmara com 20µm de altura, que

permaneceu aquecida a 38ºC durante toda a leitura. Foi utilizado o setup para sêmen

de cão descrito por Iguer-Ouada e Verstegen (2001). Para descrever os movimentos

dos espermatozóides, o computador foi programado para captar 30 imagens

seqüenciais e foram anotados os valores referentes a Motilidade (%); Motilidade

Progressiva (%); Velocidade do Trajeto (VAP, µm/s); Velocidade Progressiva (VSL,

µm/s); Velocidade Curvilinear (VCL, µm/s); Amplitude Lateral da Cabeça (ALH, µm);

Freqüência de Batimentos (BCF, Hz); Retilinearidade (STR, %) e Linearidade (LIN, %). 4.2.2) Morfologia espermática

Após 60 minutos de contato do sêmen com as diferentes soluções

(osmolaridade, pH, uréia e urina), foi acrescentada uma solução de formalina + solução

de NaCl (com osmolaridade correspondente à amostra da qual o sêmen foi retirado) na

proporção de 1:10, com o objetivo de fixar os espermatozóides. Logo após a fixação,

foram avaliados 200 espermatozóides por lâmina, no aumento de 1000x (JOHSON,

2001) em microscópio com contraste de fase, modelo Nikon Eclipse 80i. As alterações

morfológicas foram classificadas como maiores ou menores, conforme o padrão

adotado pelo CBRA (1998).

4.2.3) Integridade de membrana

A integridade de membrana foi testada com uma solução do corante vital

Eosina Amarela, suspensão de 1% em solução salina (com osmolaridade

correspondente à amostra da qual o sêmen foi retirado). Uma gota de sêmen foi

22

misturada à uma gota do corante e após 1 minuto foi confeccionado um esfregaço onde

foram contadas 200 células. Foram considerados com a membrana íntegra, os

espermatozóides que não foram corados e com a membrana lesada, aqueles corados

em vermelho (VERHEYEN et al., 1997).

4.2.4) Avaliação da integridade de acrossoma

Para integridade de acrossoma foram utilizadas as sondas fluorescentes FITC-

PSA (Pisum Sativum agglutinin) e o Iodeto de Propídio e avaliadas 200 células, sob

microscopia de epifluorescência e classificadas como possuindo: acrossoma intacto,

acrossoma lesado e acrossoma balloon (semilesado) como descrito por Goodrowe et al.

(2001).

4.3) Procedimentos experimentais

Imediatamente após o contato dos espermatozóides com as diferentes

soluções foi avaliada a motilidade. Após 60 minutos de incubação, foram avaliadas as

variáveis de motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossoma e

morfologia espermática.

Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas

Foram utilizados ejaculados de 03 cães num total de 07 ejaculados (02 cães da raça

Pastor Canadense dos quais foram coletados três ejaculados de cada um e 01 cão

mestiço apenas um ejaculado). De cada ejaculado foram retiradas 05 alíquotas de

100µL nas quais foram acrescidas de 900µL as soluções de diferentes osmolaridades,

em minitubos para centrífuga, perfazendo os grupos:

• GCONT - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de plasma seminal

• G300 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de 150mM

de NaCl (≅ 300 mOsmol/l);

23





• GU - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de urina autóloga.

O Experimento I está representado por um diagrama na Figura 1.

24

Figura 1 – Diagrama do experimento I - Efeitos de diferentes osmolaridades sobre os espermatozóides caninos

GCONT

100µL de sêmen

+

900µL de

Plasma Seminal

G 300

100µL de

sêmen

+

900µL de

300mOsmol/l de NaCl

G 600

100µL de

sêmen

+

900µL de

600mOsmol/l de NaCl

G 1000

100µL de

sêmen

+

900µL de

1000mOsmol/l de NaCl

G U

100µL de

sêmen

+

900µL de

Urina autóloga

2,0 ml de sêmen (2ª fração)

Avaliado: 1. motilidade (CASA) 2. integridade de membrana 3. integridade de acrossoma 4. morfologia

Avaliou-se 1. motilidade* 2. integridade de membrana* 3. integridade de acrossoma* 4. morfologia* ** a motilidade foi avaliada imediatamente após o contato do sêmen com assoluções e após 60 minutos de incubação nas respectivas soluções, foramavaliadas: motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossomae morfologia.

25

Experimento II - Efeitos de diferentes pH sobre as células espermáticas

Foram utilizados 05 ejaculados de 03 cães diferentes (02 pastores canadenses e 01

mestiço). Foram coletados dois ejaculados de dois cães e apenas um ejaculado de um

cão. De cada ejaculado retiraram-se 07 alíquotas de 100µL as quais foram acrescidas

900µL de soluções de NaCl 300mOsmol/l com 05 diferentes pH, obtidos pela adição de

NaOH 0,1N ou HCl 0,1N divididos em 07 grupos:

• GCONT - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de plasma seminal;

• GA1 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL uma solução de NaCl

300mOsmol/l e pH 5;

• GA2 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de uma solução de

NaCl 300mOsmol/l e pH 6;

• GN - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl

300mOsmol/l e pH 7;

• GB1 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl

300mOsmol/l e pH 8;

• GB2 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl

300mOsmol/l e pH 9;

• GU - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de urina autóloga.

O Experimento II está representado no diagrama da Figura 2.

26

Figura 2. Diagrama do experimento II - Efeitos de diferentes pH sobre os

espermatozóides caninos.

Avaliado: 1. motilidade* 2. integridade de membrana* 3. integridade de acrossoma* 4. morfologia* ** a motilidade foi avaliada imediatamente após o contato do sêmen com assoluções e após 60 minutos de incubação nas respectivas soluções, foramavaliadas: motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossomae morfologia.


GA1

100µL de sêmen

+

900µL de

300mOsmol/l de NaCl,

pH 5

GA2

100µL de sêmen

+

900µL de

300mOsmol/l de NaCl

pH 6

Avaliado: 1. motilidade (CASA) 2. integridade de membrana 3. morfologia 4. morfometria

GN

100µL de sêmen

+

900µL de

300mOsmol/l de NaCl

pH 7

GB1

100µL de sêmen

+

900µL de

300mOsmol/l de NaCl

pH 8

GB2

100µL de sêmen

+

900µL de

300mOsmol/l de NaCl

pH 9

G U

100µL de sêmen

+

900µL de

Urina autóloga

GCONT

100µL de sêmen

+

900µL de

Plasma Seminal

27

Experimento III - Efeitos de diferentes concentrações de uréia sobre as células

espermáticas

Foram utilizados ejaculados de 03 cães diferentes (01 Cocker Spaniel, 01

Pastor Canadense e 01 mestiço). Foram coletados 04 ejaculados no total sendo que de

um cão foram coletados dois ejaculados e dos outros cães apenas um ejaculado de

cada. De cada ejaculado foram retiradas 05 alíquotas de 100µL nas quais foram

acrescidas 900µL de soluções de NaCl 300mOsmol/l com diferentes concentrações de

uréia, divididos em 04 grupos:

• GCONT - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de plasma seminal;

• GR1 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL uma solução de NaCl

300mOsmol/l e 3,5mg de uréia por 100ml;

• GR2 - 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de uma solução de

NaCl 300mOsmol/l e 7,0mg de uréia por 100ml;

• GR3 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl

300mOsmol/l de 10,5 mg de uréia por 100ml;

• GR4 - 100µL de sêmen, acrescidos a 900µL de uma solução de NaCl

300mOsmol/l e 14,0 mg de uréia por 100ml;

• GU- 100µL de sêmen foram acrescidos de 900µL de urina autóloga.

28

Figura 3. Diagrama do Experimento III - Efeitos de diferentes concentrações de uréia sobre os espermatozóides caninos.

Avaliado: 1. motilidade* 2. integridade de membrana* 3. integridade de acrossoma* 4. morfologia* * a motilidade foi avaliada imediatamente após o contato do sêmen com assoluções e após 60 minutos de incubação nas respectivas soluções, foramavaliadas: motilidade, integridade de membrana, integridade de acrossomae morfologia. ** a uréia foi diluída em 100ml de NaCl 150mM


GR2

100µL de sêmen

+

900µL de NaCl

300mOsmol/l +

3,5mg de uréia**

GR3

100µL de sêmen

+

900µL de NaCl

300mOsmol/l +

7,0 mg de uréia**

Avaliado: 1. motilidade 2. integridade de membrana 3. integridade de acrossoma 4. morfologia

GR4

100µL de sêmen

+

900µL de NaCl

300mOsmol/l +

10,5 mg de uréia**

GR5

100µL de sêmen

+

900µL de NaCl

300mOsmol/l +

14,0 mg de uréia**

G U

100µL de sêmen

+

900µL de

Urina

G U

100µL de sêmen

+

900µL de

Plasma Seminal

GR1

100µL de sêmen

+

900µL de NaCl

300mOsmol/l

29

4.4) Modelo estatístico

Os efeitos causados pelas soluções utilizadas nos 3 experimentos

(osmolaridade, pH e uréia) foram comparados por um teste de médias.

Hipótese: nem todos os agentes (pH, osmolaridade ou uréia) têm o mesmo

efeito ou algum efeito sobre o sêmen semelhante ao da urina.

Delineamento: Foi utilizado o Delineamento de Blocos Casualizados, sendo os

tratamentos cada um dos gradientes utilizados e cada ejaculado considerado um bloco.

Depois realizada a análise de variância, os tratamentos que mostraram diferença

significativa, sendo α=0,05, foram comparados pelo teste de Tukey ao nível de

significância de 5%. Todos os dados foram processados pelo programa SAEG versão

9.0 – DEMO da Universidade Federal de Viçosa.

30

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Experimento I – Efeitos de diferentes osmolaridades sobre as células espermáticas

O efeito causado pela urina sobre a motilidade foi semelhante aquele

observado nas soluções de 600 e 1000mOsmol/l, em todos as variáveis de motilidade

avaliados pelo CASA, imediatamente após o contato do sêmen com as soluções, com

exceção do ALH e LIN onde a urina também teve resultados semelhantes a outras

soluções como a controle NaCl 300mOsmol/l (Tabela 2).

Após 1 hora de incubação a 37°C em banho-maria, a motilidade espermática

foi reduzida a zero tanto nos espermatozóides que entraram em contato com a urina,

quanto naqueles que estavam em soluções hipertônicas (600 e 1000mOsmol/l)

conforme observado na Tabela 2.

31

Tabela 2 – Valores médios e desvios padrões das variáveis indicativas de qualidade do movimento espermático imediatamente após o contato do sêmen canino com urina e com soluções de diferentes osmolaridades e após a incubação por 1h a 370C nas mesmas soluções.

Momento avaliado Imediatamente após a exposição Após 1h de incubação

Soluções

Variáveis1 Controle 300

mOsmol/l 600

mOsmol/l 1000

mOsmol/l Urina Controle 300 mOsmol/l

600 mOsmol/l

1000 mOsmol/l Urina

MT (%) 83±5ª 75±14ª 11±18b 0b 15±32b 71±19a 72±10a 0b 0b 0b

MP (%) 60±13ª 39±16b 0c 0c 4±11c 34±15a 23±13a 0b 0b 0b

VAP (µm/s) 104,1±24,9a 80,1±20,0a 18,4±18,4b 0b 14,4±27,0b 70,0±23,7 a 58,8±20,6 a 0b 0b 0b

VSL (µm/s) 95,7±22,9a 69,7±20,3a 13,77±13,55b 0b 12,7±24,1b 64,1±23,9 a 46,4±14,5 a 0b 0b 0b

VCL (µm/s) 131,1±27,2a 119,8±28,5a 33,5±33,4b 0b 23,2±40,2b 91,7±21,9 a 106,6±39,3 a 0b 0b 0b ALH (µm) 4,9±1,2a,b 5,9±1,3a 4,9±5,5a,b 0c 1,0±2,6b,c 4,7±1,2 b 7,4±0,9 a 0c 0c 0c BCF (Hz) 24±3a 24±3a 17±17a 0b 10±15a,b 29,3±2,8 a 19,2±9,6 a 0b 0b 0b STR (%) 90±1a 85±7a 44±42b 0c 14±34b,c 87±6 a 79±6 a 0b 0b 0b LIN (%) 70±6a 58±13a,b 26±26c 0c 29±34b,c 66±12 a 47±7 b 0c 0c 0c

Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha e em um mesmo momento indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= motilidade total; MP = motilidade progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade.

32

Os resultados de motilidade observados tanto imediatamente após o começo

dos tratamentos, quanto após 1 hora de incubação a 37°C, indicam que a redução da

motilidade espermática no sêmen contaminado experimentalmente com a urina foi

causada pela alta osmolaridade encontrada na urina.

Observa-se que as variáveis de motilidade foram iguais nos grupos das

soluções de NaCl 600mOsmol/l, NaCl 1000mOsmol/l e grupo urina, os quais têm a

osmolaridade acima do fisiológico (300 mOsmol/l). Os resultados do presente trabalho

corroboram com aqueles encontrados por Crich et al. (1978) quando observaram uma

motilidade média de 10% após 5 minutos e de 0% após 20 minutos de contato do

sêmen humano com uma solução de urina com água e osmolaridade de 548 mOsmol/l.

Makler et al. (1981) também observaram a redução da motilidade dos espermatozóides

humanos que foram tratados com soluções de osmolaridade acima do fisiológico. Tanto

Crich et al.(1978), quanto Makler et al. (1981) concordam que um dos fatores que levam

à redução da motilidade espermática quando o sêmen é contaminado por urina é a

hiperosmolaridade.

A redução da motilidade também foi observada no sêmen contaminado por

urina. Griggers et al. (2001), encontraram resultados de motilidade em soluções de 668

mOsmol/l igual a zero tanto imediatamente após o começo do tratamento, quanto após

uma hora de incubação do sêmen em uma solução de urina e água com esta

osmolaridade.

A grande variação dos valores de motilidade observada entre as amostras

contaminadas com urina, levando a um alto desvio padrão (Tabela 2), encontrado neste

trabalho se deve a um resultado inesperado, pois o sêmen de um mesmo cão

apresentou a motilidade de 68% em uma coleta e de 0% em outras coletas. Resultados

semelhantes foram encontrados por Nikolettos et al. (1999) que trabalharam com

sêmen humano e tiveram uma média de 9% de motilidade inicial com variações de 0-

34% e desvio padrão de 10% em 16 pacientes, com ejaculação retrógrada. A

osmolaridade da urina autóloga pode apresentar variação até em um mesmo dia,

dependendo do grau de hidratação, alimentação e até estresse do animal (COLES,

1986), sendo assim, pode-se aqui especular que os resultados diferentes para um

mesmo cão se devem à variação na composição da urina autóloga em diferentes

repetições para o mesmo cão.

33

Os resultados da morfologia espermática demonstram que não houve diferença

entre os grupos. Tanto a urina como a elevação da osmolaridade não provocou

alterações morfológicas das células espermáticas (Tabela 3). Crich (1978), Makler et al.

(1981) e Griggers et al. (2001), que trabalharam com o mesmo tema, não avaliaram as

alterações morfológica dos espermatozóides.

Tabela 3 – Valores médios e desvios padrões das porcentagens de espermatozóides caninos apresentando membrana plasmática integra, acrossoma íntegro e morfologia normal após 1 hora de incubação do sêmen canino com urina e com soluções com diferentes osmolaridades.

Soluções Variáveis1

Controle 300 mOsmol/l

600 mOsmol/l

1000 mOsmol/l Urina

MPI (%) 91±8 a 56±26a,b 55±22a,b 36±30 a,b 0c AI (%) 98±18a 47±54a,b 38±44a,b 39,5±48a,b 0b

MN (%) 87±6 a 84±14 a 83±14 a 80±12 a 81±14 a Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha e em um mesmo momento indicam diferença estatística com 5% de significância; 1 MPI = Membrana plasmática íntegra, AI = Acrossoma íntegro, MN = Morfologia normal.

As porcentagens médias de espermatozóides com membrana plasmática

íntegra nos tratamentos com osmolaridade de 600 e 1000 mOsmol/l foram semelhantes

àquelas encontradas para o controle, demonstrando que as altas osmolaridades não

causaram lesões de membrana com a mesma intensidade que a urina. A semelhança

entre resultados dos tratamentos em soluções hiperosmóticas encontrados no presente

trabalho estão de acordo com os resultados de Pommer et al. (2002) que encontraram

99,47% de espermatozóides com a membrana plasmática íntegra em meio TALP de

osmolaridade 600mOsmol/l e 96,96% para o meio TALP com osmolaridade de 900

mOsmol/l. A porcentagem de espermatozóides íntegros encontrados por Pommer et al.

(2002) em eqüinos foram bem maiores que os resultados encontrados em nossos

experimentos, mas o tempo de incubação foi de apenas 10 minutos em uma solução

tamponada, onde a proteção sobre a membrana é maior e o tempo de incubação foi

bem menor que o utilizado neste experimento. Rutlant et al. (2003), trabalhando com

sêmen de macaco Rhesus, em soluções com osmolaridade semelhante ao presente

trabalho, obtiveram resultados semelhantes aos de Pommer et al. (2002) quanto à

34

integridade de membrana do espermatozóide em soluções com 600 e 900 mOsmol/l,

mas também trabalharam com TALP e o tempo de incubação foi de apenas 10 minutos.

Quanto à integridade de acrossoma, o efeito causado pela urina foi agrupado

como sendo semelhante aquele causado pelas diferentes soluções de NaCl (diferentes

osmolaridades), mas a média de espermatozóides com acrossoma intacto no grupo da

urina é zero e somente foi semelhante aos outros grupos, em virtude dos desvios

padrões terem sido muito altos. Sendo assim não é possível afirmar que o efeito da

urina sobre a integridade acrossomal é semelhante ao causados pelas soluções de

NaCl utilizadas no experimento (Tabela 3).

Os valores encontrados para o grupo controle e o grupo em solução de

300mOsmol/l vem confirmar que a osmolaridade do sêmen tem um valor próximo de

300mOsmol/l, embora no presente experimento os valores da osmolaridade não

tenham sido aferidos a cada repetição pela falta de um osmômetro. Em um estudo

preliminar, onde foi possível medir a osmolaridade do sêmen e da urina de três cães, os

valores da osmolaridade do plasma seminal variaram de 243-302 mOsmol/l e da urina

de 934-1273 mOsmol/l (SANTOS et al., 2005) e ainda outros dados da literatura

afirmam que a osmolaridade média do sêmen do cão é de 300mOsmol/l (JOHNSON,

2001) e da urina é de 50-1000mOsmol/l (COLES, 1986).

35

Experimento II – Comparação dos efeitos da urina com os efeitos de soluções com diferentes pH sobre as células espermáticas

Os valores médios de pH encontrados nas amostras de sêmen e urina

utilizadas durante todos os 3 experimentos deste trabalho (Tabela 4) sugerem que não

há diferença significativa de pH entre a urina e o sêmen canino. O pH médio do sêmen

foi 6,5±0,3 e da urina 6,9±0,3 e coincidem com os descritos por Coles (1986) que

afirmou que a urina do cão tem valores de pH entre 6-7.

Os valores médios de pH do líquido seminal dos cães que participaram deste

experimento foi 6,5±0,3 e também estão de acordo com Johnson (2001), onde foi

relatado que o pH sêmen canino tem variações de 6,3 a 7 no plasma seminal até 6 a

7,4 no líquido prostático.

Comparando os resultados encontrados nos diferentes pH, em que o sêmen foi

submetido desde 5-9, não é possível afirmar que o pH da urina seja o responsável

pelas alterações de motilidade espermáticas encontradas quando colocamos o sêmen

em contato com a urina (Tabela 4).

36

Tabela 4 - Valores médios e desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático imediatamente após contato do sêmen canino com urina e com soluções de NaCl 300mOsmol/l e diferentes pH.

Soluções Variáveis1

Controle pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 Urina

MT (%) 79±12a 67±20 a 71±15 a 85±11 a 79±10 a 82±11 a 4±7b

MP (%) 62±21a 49±21a 43±21a,b 52±25a 51±23a 52±32a 0b

VAP (µm/s) 103,8±25,4 a 86±24,9 a 73,9±22,3 a,b 82,6±40,2 a 89,0±26,3 a 93,2±44,5 a 17,1±26,8 b

VSL (µm/s) 105,9±24,3a 87,7±24,4a 67,5±21,1a,b 77,2±38a 75,1±34,0a,b 75,5±39,6a,b 15,3±24,9b

VCL (µm/s) 135,3±31,0 a 108,5±24,7 a 105,0±27,0 a 124,6±32,4 a 112,7±23,8 a 112,9±37,9 a 26,2±37,4 b

ALH (µm) 4,4±1,1 a 5,1±0,5 a 4,9±0,8 a 5,5±1,0 a 5,0±1,2 a 5,3±0,6 a 3,9±5,6 a BCF (Hz) 24,0±5,1 a 24,0±3,3 a 26,0±3,8 a 23,2±2,1 a 23,1±4,6 a 23,1±3,0 a 13,3±19,3 a STR (%) 92±1 a 90±2 a 89±1 a 87±4 a 86±11 a 88±5 a 21±42 b LIN (%) 75±3 a 66±6 a 62±6 a 60±13 a 64±16 a 64±11 a 13±24 b

Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MT= Motilidade Total; MP= Motilidade Progressiva; VAP= Velocidade do trajeto; VSL = Velocidade progressiva; VCL = Velocidade curvilinear; ALH = Amplitude lateral da cabeça; BCF = Freqüência dos batimentos da cauda; STR = Retilinearidade; LIN = Linearidade;

37

As únicas variáveis que estiveram próximas às encontradas nas amostras que

tiveram contato com urina foram VAP e VSL no pH 6 (Tabela 4), mas esta semelhança

entre os resultados aconteceu por causa do alto desvio padrão em torno da média das

amostras utilizadas. Makler et al. (1981), trabalhando com sêmen humano em um

gradiente de pH que variou de 5,5-9,5, não encontraram diferença entre os tratamentos

imediatamente após o contato do sêmen com a urina. Para eqüinos, o pH encontrado

no plasma seminal influenciou a motilidade dos espermatozóides no gradiente de pH e

também foi observado que o espermatozóide eqüino suporta apenas uma estreita faixa

de pH de 7,4 - 7,9, excedendo esta faixa, a motilidade do espermatozóide eqüino é

reduzida drasticamente (GRIGGERS et al., 2001). Nossos resultados indicam que para

o cão há maior tolerância quanto à variação do pH que para os eqüinos e que a

motilidade do espermatozóide canino está mais próximo ao do ser humano para esta

característica.

38

Tabela 5 – Valores médios e desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático após 1 hora de incubação do sêmen canino com urina e com soluções de NaCl 300mOsmol/l e diferentes pH.

Soluções Variáveis1 Controle pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 Urina

MT (%) 62,2±35,9 a 44,6±40,9 a 53,6±30,7 a 63,4±21,0 a 46,6±25,7 a 33,4±35,8 a 0 b

MP (%) 32,4±23,5 a 16,2±14,8 a,b 7,2±6,7 a,b 26,0±7,9 a,b 14,4±17,3 a,b 16,0±17,2 a,b 0 b

VAP (µm/s) 55,0±36,8 a 49,7±5,0 a 37,9±11,8 a 44,3±12,5 a 47,0±11,9 a 48,9±13,7 a 0 b VSL (µm/s) 50,8±35,3 a 39,1±5,0 a 28,6±5,6 a,b 35,9±11,1 a 37,9±14,1 a 38,1±13,8 a 0 b

VCL (µm/s) 73,7±46,2 a 91,6±11,9 a 72,8±26,0 a,b 82,0±21,9 a 85,1±19,1 a 87,6±22,9 a 0 b

ALH (µm) 3,4±2,2 b 6,8±0,8 a 6,4±1,3 a 6,8±0,4 a 6,1±1,4 a 7,6±1,3 a 0 c BCF (Hz) 25,3±14,4 a 24,0±5,3 a 30,9±7,3 a 26,4±6,3 a 30,6±6,5 a 25,6±5,2 a 0 b STR (%) 71±29 a 79±4 a 78±10 a 81±6 a 80±6 a 79±6 a 0 b LIN (%) 51±30 a 44±7 a 42±7 a 44±6 a 46±7 a 45±5 a 0 b


39

Os valores da motilidade após 1 hora de incubação encontrados para a urina

foram todos iguais a zero (Tabela 5). A semelhança estatística entre as variáveis de

motilidade progressiva aconteceu pelo alto desvio padrão, o que indica que estes

resultados aconteceram por fatores não controláveis e por isso não se pode afirmar que

a urina teve efeito igual a nenhum dos tratamentos aqui propostos. Makler et al. (1981)

encontraram redução de 30% na velocidade dos espermatozóides humanos incubados

em pH alcalino por 2h.

Tabela 6 – Valores médios e os desvios padrões das porcentagens de espermatozóides caninos apresentando membrana plasmática integra, acrossoma íntegro e morfologia normal após 1 hora de incubação com urina e com soluções de NaCl 300mOsmol/l e diferentes pH

Soluções Variáveis1 Controle pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 Urina

MPI (%) 93±12 a 90±22 b 84±47 b 51±28 b 50±13 b 60±23 a,b 0 c

AI (%) 96±5 a 95±2 a 92±7 a 88±5 a 92±10 a 96±1 a 35±36 a

MN (%) 92±0 a 86±4 a 94±1 a 91±5 a 69±42 a 93±1 a 93±5 a

Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância 1 MPI= Membrana plasmática íntegra; AI= Acrossoma íntegro; MN= Morfologia normal.

Os valores encontrados para a integridade de membrana, avaliados com o

corante vital Eosina Amarela mostram que a urina induziu a lesão da membrana

plasmática de uma maneira mais intensa que as soluções com diferentes pH. Quando

se trata da urina não estamos avaliando o efeito do pH isoladamente, mas de todos os

fatores da urina que agem sobre a membrana plasmática, incluindo a alta

osmolaridade. Nenhum dos autores que avaliaram o efeito do pH sobre o

espermatozóide verificaram a integridade da membrana (CRICH et al., 1978, MAKLER

et al., 1981 e GRIGGERS et al., 2001).

A pouca diferença entre as porcentagens de espermatozóides com membrana

plasmática integra e a manutenção da morfologia espermática em pH aparentemente

40

nocivos (5, 6, 8 e 9) pode ser explicada pela proteção que o Glicocálix exerce sobre a

membrana plasmática, como proposto por Henderson e Stroud (2004).

As porcentagens de espermatozóides apresentando acrossoma integro não foi

diferente para as diferentes soluções utilizadas, discordando do proposto por Gadela et

al. (2001), quando os autores se referem a influencia do pH alcalino sobre a

capacitação espermática. Em seu experimento os autores utilizam o Bicarbonato de

Sódio para produzir soluções com pH alcalino e neste foram utilizadas soluções de

300mOsmol/l de NaCl com pH alcalino produzido adicionando-se Hidróxido de Sódio

(NaOH 0,1N), provavelmente não somente o pH alcalino induza a capacitação

espermática, como também a ação do Bicarbonato de Sódio sobre a Adenilato Ciclase

que leva a ativação de uma cascata de eventos que resulta na capacitação.

Experimento III – Efeitos da urina comparado aos efeitos de diferentes concentrações de uréia sobre as células espermáticas

A motilidade espermática não foi alterada quando se adicionou uréia a uma

solução de NaCl 300mOsmol/l, no tempo zero, como demonstrado na Tabela 7.

41

Tabela 7 - Valores médios e desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático imediatamente após contato do sêmen canino com urina e em soluções com diferentes concentrações de uréia (mg/100ml de NaCl 300mOsmol/l).

Soluções

Variáveis1 Controle 0 3,5 7 10,5 14 Urina

MT (%) 78±12a 81±7 a 83±5 a 74±16 a 76±15 a 73±11 a 0 b

MP (%) 65±9 a 55±10 a 52±22 a 52±13 a 54±14 a 55±10 a 0 b

VAP (µm/s) 113,7±14,5 a 76,3±8,9 b 83,5±11,7 a,b 83,7±11,8 a,b 81,2±23,1 b 80,6±11,5 b 0 c

VSL (µm/s) 108,4±12,3 a 73,5±14,4 b 65,6±19,5 b 77,9±10,1 a,b 74,2±16,6 b 78,1±20,5 a,b 0 c

VCL (µm/s) 133,4±16,3 a 121,0±19,2 a 117,0±10,7 a 114,0±20,4 a 113,4±21,8 a 112,5±23,3 a 0 b

ALH (µm) 3,5±0,7 a 5,3±1,7 a 5,9±2,7 a 4,6±1,2 a 4,6±1,2 a 4,2±1,4 a 0 b BCF (Hz) 32,7±5,2 a 25,5±6,4 a 26,4±7,7 a 28,1±5,0 a 29,2±4,7 a 27,2±4,4 a 0 b STR (%) 94±1 a 86±9 a 84±11 a 90±5 a 89±3 a 90±4 a 0 b LIN (%) 79±3 a 60±15 a 56±18 a 67±10 a 65±10 a 68±12 a 0 b


42

A motilidade total após 1 hora não diferiu entre os grupos com solução

salina e uréia e o grupo controle e para a motilidade progressiva. Nenhum dos

grupos diferiram estatisticamente do grupo da urina para a motilidade progressiva,

entretanto a motilidade no grupo da urina foi sempre zero, como demonstrado na

Tabela 8.

43

Tabela 8 – Valores médios e os desvios padrões de variáveis indicativas da qualidade do movimento espermático após 1 hora de incubação a 37°C do sêmen canino com urina em soluções com diferentes concentrações de uréia (mg/100ml de NaCL 150mM).

Soluções


MT (%) 82±6a 73 ±15 a 81±11 a 78±14 a 75±9 a 67±32 a 0 b

MP (%) 59±24 a 35±31 a 42±27 a 41±29 a 35±26 a 47±26 a 0 a

VAP (µm/s) 95,5±33,0 a 60,7±31,1 a,b 64,9±25,9 a,b 70,2±35,5 a,b 59,0±28,2 a,b 68,2±25,1 a,b 0 b

VSL (µm/s) 89,9±32,4 a 50,9±31,0 a,b 54,0±24,6 a,b 59,4±35,6 a,b 50,3±27,3 a,b 58,8±25,3 a,b 0 b

VCL (µm/s) 118,1±30,8 a 100,5±38,5 a 115,5±33,0 a 114,2±48,1 a 86,6±48,9 a 112,7±30,1 a 0 b

ALH (µm) 4,5±1,6 b 6,7±0,6 a 7,0±1,0 a 6,3±0,5 a,b 6,6±0,9 a 5,9±0,6 a,b 0 c BCF (Hz) 31,5±4,8 a 25,7±4,3 a 25,4±4,4 a 26,4±5,0 a 26,5±2,1 a 26,6±5,4 a 0 b STR (%) 91±3 a 83±8 a 80±7 a 82±6 a 82±6 a 83±6 a 0 b LIN (%) 68±12 a 52±10 b 45±11 b 53±9 a,b 48±9 b 50±10 a,b 0 c


44

Para as variáveis de velocidade VAP e VSL, o grupo da urina foi

estaticamente igual aos grupos que foram tratados com a uréia, mas isto é explicado

pelo alto desvio padrão em torno da média encontrada nas amostras obtida, devido

a fatores não controláveis. Entretanto os grupos que receberam 3,5/7/10,5/14 mg de

uréia não diferiram estatisticamente do grupo que foi submetido à solução de

150mM de NaCl, ou seja, a uréia não influenciou a viabilidade dos espermatozóides.

A confirmação que a uréia não teve qualquer efeito sobre os espermatozóides é

dada pelas outras variáveis de motilidade que não foram diferentes entre o grupo

que não recebeu uréia e os outros. Os resultados do efeito da uréia sobre o

espermatozóide canino indicam que, diferentemente do que acontece com o

espermatozóide humano, a uréia não auxilia nos processos de capacitação

espermática, proposta por Rosseli et al. (1987), quando foi observado o aumento do

número de espermatozóides humanos encontrados dentro dos oócitos de hamsters

desnudados pela adição de uréia ao meio de fertilização in vitro.

Os resultados de integridade de membrana, integridade de acrossoma e

morfologia espermática, também não foram diferentes entre os grupos que

receberam uréia e o grupo que foi submetido apenas à solução de NaCl de

300mOsmol/l . E estão demonstrados na Tabela 9, observando que há um alto

desvio padrão encontrado para as amostras, devido a fatores não controláveis.

Tabela 9 – Valores médios e os desvios padrões das porcentagens de espermatozóides caninos apresentando membrana plasmática integra, acrossoma íntegro e morfologia normal após 1 hora de incubação em soluções com diferentes concentrações de uréia (mg/100ml de NaCL 300mOsmol/l)

Soluções


MPI (%) 67±35 a 34±28 a 30±30 a 37±35 a 31±37 a 33±38 a 1±2 a AI (%) 96±4 a 89±2 a,b 91±5 a,b 81±26 a,b 83±18 a,b 90±5 a,b 45±42 b MN (%) 83±4 a 85±4 a 88±3 a 90±2 a 87±3 a 86±4 a 93±1 a

Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística com 5% de significância. 1 MPI= Membrana plasmática íntegra; AI= Acrossoma íntegro; MN= Morfologia normal.

Em resumo, pode-se dizer que as diferentes osmolaridades nas soluções

com diferentes concentrações de NaCl, revelaram que o efeito causado pela urina

45

está relacionado às altas osmolaridades encontradas nas amostras de urina dos

cães que participaram do Experimento I. Quando se compara os resultados

encontrados para o sêmen canino com aqueles encontrados para o sêmen humano

(CRICH et al., 1979, MAKLER et al., 1981), para o sêmen eqüino (GRIGGERS et al.,

2001, POMMER et al., 2003) e para o macaco Rhesus (RUTLANT et al., 2003), há

um consenso que a motilidade espermática é reduzida quando em contato com a

urina, pois a osmolaridade da urina geralmente encontra-se acima dos valores

fisiológicos do sêmen. Quanto ao pH, os espermatozóides caninos suportaram uma

ampla faixa de variação de pH, diferindo dos resultados encontrados para o sêmen

humano, eqüino e do macaco Rhesus, que permitiram estreitas faixas de variação

de pH. Os resultados encontrados quando os espermatozóides foram submetidos a

diferentes pH são importantes, mas não houve diferença significativa entre o pH do

sêmen canino e da urina, como encontramos também no nosso trabalho preliminar

(SANTOS et al., 2005) e segundo o padrão da espécie também não há diferença

entre o pH destes dois líquidos corporais (JOHNSON, 2001).

As diferentes concentrações de uréia não ajudaram a esclarecer o efeito da

urina sobre o sêmen, pois não detectamos quaisquer alterações significativas nos

espermatozóides submetidos às soluções que tiveram concentrações de uréia

variando de 3,5-14mg de uréia por 100 ml. Estes resultados encontrados no

concordam com Reece (1996) que diz ser a uréia relativamente não tóxica.

Os resultados da integridade de membrana e integridade de acrossoma

baixos encontrados em espermatozóides expostos à ação da urina podem ser

explicados pela interação dos fatores estudados ou pela ação de outros

componentes da urina que não foram avaliados no presente trabalho.

46

6. CONCLUSÕES

O efeito da urina sobre a motilidade espermática foi semelhante aquele

observado quando submetemos o sêmen canino a soluções de 600 e 1000mOsmol/l

de NaCl, onde foram observadas drásticas reduções da motilidade logo após o

contato dos espermatozóides com as soluções hiperosmóticas ou com a urina.

As soluções de 600 e 1000 mOsmol/l de NaCl, assim como a urina, não

causaram a alterações morfológicas nos espermatozóides.

O espermatozóide canino demonstrou ser pouco sensível às variações de

pH nas soluções que variaram de 5-9.

Não houve diferença entre o pH do sêmen e da urina nos cães deste

trabalho.

A uréia nas concentrações utilizadas, não causou qualquer efeito deletério

sobre o espermatozóide canino.

O trabalho conseguiu esclarecer o efeito da osmolaridade, pH e

concentração de Uréia sobre o espermatozóide canino, mas o efeito deletério da

urina sobre a membrana plasmática foi mais intenso que qualquer outro destes

fatores isoladamente. São necessários mais estudos sobre o tema, pois existem as

interações entre os fatores estudados e ainda encontramos na urina outros íons que

agem sobre as interações moleculares.

47

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOOTH, N.H. (1992). Analgésicos não-narcóticos. In: Booth, N.H.; McDonald, L.E. Farmacologia e terapêutica veterinária. 6ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 997. BRASSESCO, M., VISCASILLAS, P., BURREL, L., CALAF, J., RAJMIL, O., SERRA, J.M.P., FARGAS, F.M. (1988) Sperm recuperation and cervical insemination in retrograde ejaculation. Fertility and Sterility, 5:923-924. CAZES, L. B. Avaliação da eficiência de métodos de recuperação de gameta masculino em cão doméstico. 2006. p. 82. Dissertação (Mestrado em Produção Animal) - Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes. CBRA: COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. 2.ed. Belo Horizonte: CBRA, 1998. 49p. CHRISTOVA, Y.T., JAMES, P.S., COOPER, T.G., JONES, R. (2002) Lipid diffusion in the plasma membrane of mouse spermatozoa. Changes during epididymal maturation, effects of pH, osmotic pressure and knockout of the c-ros gene. J. Androl., 23 (3), 384–392. CRICH, J.P., JEQUIER, A.M. (1978) Infertility in men with retrograde ejaculation: the action of urine on sperm motility, a simple method for achieving antegrade ejaculation. Fertility and Sterility, 5:572-576. COLES, E.H. (1986) Renal Function Tests. In: Autor Veterinary Clinical Pathology. Ed. Philadelphia. pp. 178-179. CROSS, N.L., Reorganization of Lipid Rafts During Capacitation of Human Sperm. Biology of Reproduction 71, 1367–1373 (2004) DAHLBOM, M., ANDERSSON, M., VIERULA, M., ALANKO, M. (1997) Morphometry of normal and teratozoospermic canine sperm heads using an image analyzer: work in progress. Theriogenology, 48:687-698. DARSZON, A., LABARCA, P., NISHIGAKI, T., ESPINOSA, F. (1999) Ions Channels in Sperm Physiology. Physiological Reviews, 79(2):481-510. EDDIN, M. (2003) The state of lipid raft: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32:257–83.

48

ELLINGTON, J., SCARLETT, J., MEYERS-WALLEN, V., MOHAMED, H.O., SURMAN, V. (1993) Computer-assisted sperm analysis motility measurements. Theriogenology, 40:725-733. FOOTE, RH., LEONARD, EP.(1963) The influence of pH, osmotic pressure, glycine e glycerol on survival of dog sperm in buffeded-yolk extender. Cornell Vet. 53:78-89. GADELLA, B.M., RATHI, R., BROUWERS, J.F.H.M., STOUT, T.A.E., COLENBRANDR, B. (2001) Capacitation and acrossome reaction in equine sperm. Animal Reproduction Science, 68 : 249-265. GATTI, J-L. CASTELLA,S., DACHEUX, F., ECROYD,H., MÉTAYER;S., THIMON,V., DACHEUX,J-L.. (2004) Post-testicular sperm enviroment and fertility. Animal Reproduction Science. v. 82-83:321-339. GOODROWE, K.L.; HAY, M.A.; PLATZ, C.C.; BEHRNS, S.K.; JONES, M.H.; WADDELL, W.T. (1998) Characteristics of fresh and frozen-thawed red wolf (Canis rufus) spermatozoa. Animal Reproduction Science, 53:299-308. GRIGGERS, S., PACCAMONTI, D.L., THOMPSON, R.A., EILTS, B.E. (2001). The effects of pH, osmolarity and urine contamination on equine spermatozoal motility. Theriogenology, 56:613-622. HAFEZ, E.S.E. (1995) Reprodução animal. São Paulo: Manole, p. 59-94. HAY, MA. Canine gametes – evaluation of oocyte maturation and penetrating potencial of spermatozoa pre-freeze and post-thaw. 1996. Thesis of Doctor Philosophy, The faculty of fraduate studies of The University of Guelph, Canada. p.182. HENDERSON, R., STROUD, R. (2004) Estrutura de Membrana. In: Alberts, B. Biologia Molecular da Célula. 4ª edição. Porto Alegre: Artmed. Porto Alegre. p. 1463. HENEINE, I.F. (2000) Soluções em biologia. In: Biofísica básica. São Paulo: Atheneu, p. 391. HIRAIS,M., ARBITO,W.A., WIJAYAGUNAWARDANE, M.P.B., BRAUN, J., LEIDL, W., OHOSAKI,K., MATSTSUZAWA, T., MIYAZAWA; SATO, K.. (1997) The effect of viscosity of semen diluents on motility of bull spermatozoa. Theriogenology, 47:1463-1478. HOLT, W.V. (1984). Membrane Heterogeneity in the Mammalian spermatozoon. International Review of Cytology, 87:159:194. IGUER-OUADA M., VERSTEGEN J.P. (2001) Evaluation of the "Hamilton Thorn computer-based automated system" for dog semen analysis. Theriogenology, 55(3):733-49. JACOBSON, K., SHEETS, E.D., SIMSON, R. (1995) Revisiting the mosaic model of membranes. Science, 268(5216):1441-1442. JOHNSON, C.A. (2001) Distúrbios reprodutivos. In: Nelson, R.W., Couto, C.G. Medicina Interna de Pequenos Animais. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2ª edição. P.1084. KOLB, E. (1987) Fisiologia Veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 4ª edição. p. 612. KUMI-DIAKA, J. (1993) Subjecting canine semen to the hypo-osmotic test. Theriogenology, 39:1279-89.

49

LAROUTE, V., CHETBOUL, V., ROCHE, L., MAUREY, C., COSTES, G., POUCHELON, J.-L., DE LA FARGE, F., BOUSSOUF, M., LEFEBVRE, H.P. (2005) Quantitative evaluation of renal function in healthy Beagle puppies and mature dogs. Research in Veterinary Science, 79:161 –167 MAKLER, A., DAVID, R., BLUMENFELD, Z., BETTER, O.S.(1981) Factors affecting sperm motility. VII. Sperm viability as affected by change of pH and osmolarity of urine specimens. Fertility and Sterility, 4:507-511. MEYERS, S.A. (2005) Spermatozoa response to osmotic stress. Animal Reprodution Science, 89 :57-64. MORTIMER, S.T. (1997) A critical review of the physiological importance and analysis of sperm movement in mammals. Human Reproduction Update. 3(5):403-439. NIKOLETTOS, N., AL-HASANI, S., BAUKLOK, V., SCHÖPPER, B., DEMIREL, L.C., BABAN, N., STURM, R., RUDOLF, K., TOMALAK, K., TINNEBERG, H.R., DIEDRICH, K. (1999) The outcome of intracytoplasmic sperm injection in patients with retrograde ejaculation. Human reproduction, 14:2293-2296. OETTLÉ, E.E. (1986) Changes in acrossome morphology during cooling and freezing of dog semen. Animal Reproduction Science, 12:145-50. OHL, D.A., DENIL, J., CUMMINS, A.C.M., SEAGER, S.W.J. (1994) Eletroejaculation does not impair sperm motility in the beagle dog: a comparative study of electroejaculation and collection by artificial vagina. The Journal of Urology, 152:1034-1037. PEÑA, A.I.(2004) Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Animal Reproduction Science. 82-83 :208-224. PÉREZ, F. P. (1994) Diluizione dello sperma. In. Riproduzione Animale: Inseminazione Artificiale e Trapianto Embrionale. ed. Piccin. p 217-230. PLUMMER, J.M.; WATSON, P.F. (1988) The quantitative ultrastrutural assessment of head membrane damage in boar spermatozoa subject to varyng degrees of cold shock. Animal Reproduction Science, 16:265-275. POMMER, A.C., RUTLLANT, J., MEYERS, S.A. (2002) The role osmotic resistance on equine spermatozoal function. Theriogenology, 58:1373-1384. RANIERI, D.M., SIMONETTI, S., VICINO, M., CORMIO, L., SELVAGGI, L. (1995) Successful establishment of pregnancy by superovulation and intrauterine insemination with sperm recovered by a modified Hotchkiss procedure from pacient with retrograde ejaculation. Fertility and Sterility, 5:1039-1042. REECE, W.O. (1996) Equilíbrio hídrico excreção. In: Dukes Fisiologia dos animais domésticos. 11ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p.856. REINE, N.J., LANGSTON, C.E.(2005) Urinalysis Interpretation: How to Squeeze Out the Maximum Information from a Small Sample. Clinical Techniques in small animal practice. p. 2-8. RIGAU, T., FARRÉ, M., BALLESTR, J., MOGAS, T., PEÑA, A., PRDRIGUES-GIL, J.L. (2001) Effects of glucose and fructose on motility patterns of dog spermatozoa from fresh ejaculates. Theriogenology, 56:801-815.

50

RIJSSELAERE, T, VAN SOOM, A., TANGHE, S., CORYN, M., MAES, D., KRUIF, A. (2005) New techniques for the assessment of canine semen quality: A review. Theriogenology, 64:706-719. ROBERTSHAW, D. (1996). Controle Viceromotor. In: SWENSON, M.J.; REECE,W.O. In: Dukes Fisiologia dos animais domésticos. 11ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p.856. RODRIGUES, F.H. Conservação do lobo-guará: avaliação dos problemas e perspectivas.http://64.233.161.104/search?q=cache:Yy0lhe7r59wJ:www.icb.ufmg.br/~beds/arquivos/loboguara.doc+plano+de+manejo+do+lobo-guar%C3%A1&hl=pt-BR, acessado em 19 de julho de 2005. RODWELL, V.W (2004). Água e pH. In: Murray, R.K.; Granner, D.K.; Mayes,P.A.; Rodwell, V.W. Harper: Bioquímica. 9ª edição. São Paulo: Atheneu. p. 919. ROMAGNOLI, S. Retrograde ejaculation in the dog. WSAVA CONGRESS. 1999. ROSSATO, M., BALERCIA, G., LUCARELE, G., FORESTA, G., MANTERO, F. (2002) Role of seminal osmolarity in the regulation of human sperm motility. International Journal of Andrology, 25:230-235. ROSSELI, M., ROATTI, A., MARCHINI, M., CAMPANA, A., BALERNA, M. (1987) Effect of urea and detergents on the ability human spermatozoa to penetrate zona-free hamster oocytes. Andrologia, 5:570-578. RUTLLANT, J., POMMER, A.C., MEYERS, S.A. (2003) Osmotic tolerance limits and properties of Rhesus monkey (Macaca mulata) spermatozoa. Journal of Andrology, 24(4):534-541. SALISBURY, G.W., VANDEMARK, N.L., LODGE, J.R. (1978) Principles and techniques of freezing spermatozoa. Physiology of reproduction and artificial insemination of cattle. 2.ed. São Francisco: Freeman and Company, 494-554. SANTOS, I.P., CUNHA, I.C.N., LOPES, B.V., ROCHA, A.A. Efeito da urina sobre o sêmen canino: resultados preliminares. XVI Congresso Brasileiro de Reprodução Animal. Goiânia, 2005. SCAMMELL G.E., STEDRONSKA J., DEMPSEY A. (1982) Successful pregnancies using human serum albumin following retrograde ejaculation: a case report. Fertility and Sterility, 37:277-279. SHAW, D.J. (1975) Introdução à química dos colóides e de superfícies. São Paula: Universidade de São Paulo. p. 23. SILVA, A.R.; MORATO, R.G.; SILVA, L.D.M. (2004) The potential for gamete recovery from non-domestic canids and felids. Animal Reproduction Science, 81:159-175. SIMONS, K. (2004) Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 33:269–95. SIMONS, K.; IKONEN, E., Functional rafts in cell membranes. Nature 1997. 387: 569–572. SINGER, S.J., NICOLSON, G.L. (1972) The fluid mosaic model of structure of cell membranes, Science, 175(4023): 720-731.

51

STRYER, L.B. (1996) Prelúdio. In: Bioquímica. 4ª edição. Ed. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro,. p. 1000. TÁRRAGA, K.M. (2002) Medicamentos antiarrítmicos. In: SPINOSA, H.S.; GÓNIAK, S.L.; BERNARDI, M.M. Farmacologia aplicada à medicina veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 3ª edição, p.752. TSAI, T.C., LIN, M.C., CHENG, C.J. (1990) A New Sperm Collection Method for treatment of Retrograde Ejaculation. J. Formosan Med. Assoc., 89:484-486. VAN VONDEREN, I.K., KOOISTRA, H.S., RIJNBERK, A. (1997) Intra- and interindividual variation in urine osmolality and urine specific gravity in healthy pet dogs of various ages. Journal of Veterinary Internal Medicine, 11: 30-35. VEREB G., SZÖLLÖSI J., MATKÓ J., NAGY P., FARKAS T., VÍGH L., MÁTYUS L., WALDMANN T. A. , DAMJANOVICH, S. (2003) Dynamic, yet structured: The cell membrane three decades after the Singer–Nicolson model. PNAS vol. 100, no. 14, p. 8053–8058. VERHEYEN, G., JORIS, H., CRITS, K., NAGY, Z., TOURNAYE, H., VAN STEIRTEGHEM, A. (1997) Comparison of different hypo-osmotic swelling solutions to select viable immotile spermatozoa for potencial use in intracytoplasmic sperm. Human Reproduction Update, 3(3)195-203. WATSON, P.F., HOLT, W.V (2001). Cryobanking the Genetic Resource – Wildlife Conservation for the future. Cryopreservation of Gametes and embryos of Canidae and Felidae. London: Taylor & Francis. pp. 363. YONKA CHRISTOVA, A., PETER JAMES, A., ALAN MACKIE, B., TREVOR, G., COOPER C., ROY JONES, A. (2004) Molecular diffusion in sperm plasma membranes during epididymal maturation Molecular and Cellular Endocrinology 216 41–46.

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