AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA … · diários e por tornarem o Laboratório...
-
Upload
phungkhanh -
Category
Documents
-
view
213 -
download
0
Transcript of AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA … · diários e por tornarem o Laboratório...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA
SOBRE A Leptospira interrogans E OÓCITOS BOVINOS
Denize Silva Brazil
Orientador: Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza
GOIÂNIA
2017
iii
DENIZE SILVA BRAZIL
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA
SOBRE A Leptospira interrogans E OÓCITOS BOVINOS
Dissertação apresentada para a obtenção do título
de Mestra em Ciência Animal ao Programa de
Pós-graduação em Ciência Animal da Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal
de Goiás.
Área de concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de
Alimentos
Linha de pesquisa:
Etiopatogenia, epidemiologia, diagnóstico e
controle das doenças infecciosas dos animais
Orientador:
Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza – PPGCA/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dra. Valéria de Sá Jayme – PPGCA/UFG
Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares– PPGCA/UFG
GOIÂNIA
2017
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.
CDU 639.09
Brazil, Denize Silva AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA SOBREA Leptospira interrogans E OÓCITOS BOVINOS [manuscrito] / DenizeSilva Brazil, Guilherme Rocha Lino de Souza, Valéria de Sá Jayme . - 2017. LXV, 65 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza; coorientadora Dra. Valéria de Sá Jayme ; co-orientador Dr. GuidoFontgalland Coelho Linhares. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Escolade Veterinária e Zootecnia (EVZ), Programa de Pós-Graduação emCiência Animal, Goiânia, 2017. Bibliografia. Anexos. Apêndice. Inclui siglas, fotografias, abreviaturas, gráfico, tabelas, lista defiguras, lista de tabelas.
1. fotossensibilizador. 2. leptospirose. 3. oócito. 4. PDI. I. Souza,Guilherme Rocha Lino de . II. Jayme , Valéria de Sá . III. Souza,Guilherme Rocha Lino de, orient. IV. Jayme , Valéria de Sá , coorient. V. Título.
vii
Dedico aos meus espelhos, meus pais,
Byron Brazil
Aldenice Araújo Silva
E à minha amiga e querida irmã
Cynthia Silva Brazil.
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço hoje e sempre ao Senhor, Reis dos Exércitos, por me encher de
esperança e me permitir tentar ser uma pessoa melhor a cada nascer do sol, crendo fielmente
que a batalha já foi vencida.
Ao meu mais novo amigo e orientador, Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza,
por acreditar em mim e se disponibilizar por inteiro na realização deste trabalho, um de vários
que ainda irão por vir.
À minha coorientadora Valéria de Sá Jayme, bem como à técnica Lurdes e toda a
equipe do Laboratório de Diagnóstico de Leptospirose, pela paciência e grande ajuda durante
todo o experimento.
Aos professores Luiz Artur, toda a sua equipe, e Ivan Nicolau, pelos ensinamentos
diários e por tornarem o Laboratório de Bioquímica e Engenharia Genética um ambiente
familiar no qual há gosto de se trabalhar.
Aos professores Pablo José Gonçalves e Rodrigo Costa e Silva, pelos
ensinamentos de física e química, compartilhamento de ideias e por todo auxílio.
À minha colega e amiga Aline Barichello, por caminhar junto comigo; ao amigo
Bruno Gonzaga, por me incentivar a voltar às pesquisas e aos estudos acadêmicos; e ao meu
colega e amigo Tiago Diesel, por se disponibilizar e fazer parte deste trabalho.
À “dona Eleuza”, “Sr. Edson” e familiares da minha eterna amiga irmã Cinira
Leopoldina Batista dos Santos (in memorian), por me acolherem em seus corações. O meu
infindável agradecimento.
Aos meus pais, irmã e familiares, por serem o meu orgulho e o meu alicerce. Não
há palavras tamanhas para a demonstração do meu amor por vocês.
À toda equipe do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal
(PPGCA/EVZ/UFG) por todo profissionalismo, competência e dedicação para com todos os
integrantes do programa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudos, permitindo dedicar-me de forma integral e plena aos meus
estudos.
À todos que conviveram e convivem comigo, contribuindo de alguma forma ao
meu crescimento profissional e pessoal. Os meus sinceros agradecimentos.
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 3
2.1. Leptospira spp. ................................................................................................................................. 3
2.1.1. Classificação ................................................................................................................................. 3
2.1.2. Biologia das leptospiras ................................................................................................................ 4
2.1.3. Enfermidade causada pelas leptospiras patogênicas ..................................................................... 5
2.2. Terapia Fotodinâmica (PDT) ........................................................................................................... 6
2.2.1. Histórico ........................................................................................................................................ 6
2.2.2. Princípios da Inativação Fotodinâmica (PDI) ............................................................................... 7
2.2.3. Fontes de luz para a PDI ............................................................................................................... 9
2.2.4. Fotossensibilizadores (PS) .......................................................................................................... 10
3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 12
3.1. Objetivos gerais .............................................................................................................................. 12
3.2. Objetivos específicos...................................................................................................................... 12
4. HIPÓTESES ........................................................................................................................ 13
5. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 14
5.1. Local de desenvolvimento .............................................................................................................. 14
5.2. Cultivo e manutenção da Leptospira .............................................................................................. 14
5.3. Preparo das soluções de PSs ........................................................................................................... 14
5.4. Inativação Fotodinâmica da Leptospira ......................................................................................... 14
5.5. Soluções e composição de meios para a PIVE .............................................................................. 15
5.6. Composição dos meios para PIVE ................................................................................................ 15
5.6.1. Meio de maturação - MIV ........................................................................................................... 15
5.6.2. Meio de maturação de bancada – MIV t ..................................................................................... 16
5.6.3. Meio de fecundação .................................................................................................................... 16
5.6.4. Meio CAP ................................................................................................................................... 16
5.6.5. Meio de cultivo ........................................................................................................................... 16
5.6.6. Meio LAV de bancada ................................................................................................................ 16
5.7. Inativação Fotodinâmica de oócitos ............................................................................................... 16
5.7.1. Colheita de oócitos ...................................................................................................................... 17
5.7.2. PDI de CCO´s imaturos............................................................................................................... 17
5.7.3. PDI de CCO´s maturados ............................................................................................................ 19
5.8. Análise estatística ........................................................................................................................... 20
x
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 21
6.1. Inativação fotodinâmica da Leptospira .......................................................................................... 21
6.2. Inativação Fotodinâmica de CCO´s imaturos ................................................................................ 33
6.3. Inativação Fotodinâmica de CCO´s maturados .............................................................................. 37
7. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 41
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Classificação taxonômica de espiroquetas de importância médica. ...................... 3
FIGURA 2 - Leptospira biflexa observada em iluminação unilateral em campo escuro.
Nota-se sua extremidade anterior em forma espiralada (S-end), o cilindro
protoplasmático (PC) e sua extremidade posterior em forma de gancho (H-
end). ....................................................................................................................... 5
FIGURA 3 – Leptospiras (setas) em embrião bovino (A a D) e suíno (E). (A) L.
borgpetersenii sorovar hardjo na membrana celular e no citoplasma. Bar =
0,40 µM; (B) L. borgpetersenii sorovar hardjo na matriz da ZP. Bar = 0,33
µM; (C) L. borgpetersenii sorovar hardjo no espaço intercelular. Bar = 0,44
µM; (D) L. borgpetersenii sorovar hardjo na superfície da ZP. Note a
estrutura da ZP com inúmeros poros que podem ser penetrados pela
Leptospira. Bar = 0,53 µM; (E) Aderência da Leptospira na superfície da ZP.
1300x. .................................................................................................................... 6
FIGURA 4 - Diagrama de Jablonski modificado – processos de ativação
fotoquímica/fotofísica. (S0) estado fundamental, (Sn) estado excitado
singleto, (S1) primeiro estado excitado singleto, (A) absorção de um fóton,
(RV) relaxamento vibracional, (CI) cruzamento interno, (CIS) cruzamento
intersistemas, (T1) estado excitado tripleto de menor energia, (F)
Fluorescência, (P) Fosforescência, (PS) Fotossensibilizador. ............................... 8
FIGURA 5 - Propagação da luz através dos tecidos ................................................................ 10
FIGURA 6 – Estruturas moleculares. A) porfirina; B) clorina; C) ftalocianina; D)
fenotiazínico azul de metileno. ............................................................................ 11
FIGURA 7 - Relação das DOs entre os tratamentos controle pré (dia do experimento) e pós
(sete dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa). ........ 21
FIGURA 8 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
TMPP irradiado por 30 min. ............................................................................... 23
xii
FIGURA 9 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
ZnTMPP irradiado por 30 min. ........................................................................... 24
FIGURA 10 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS HP
irradiado por 30 min. ........................................................................................... 25
FIGURA 11 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias após a manutenção da
cultura de Leptospira hardjo em estufa) das porfirinas TMPP, ZnTMPP e HP
irradiadas por 30 min. .......................................................................................... 27
FIGURA 12 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) dos PSs
ZnPc (em A) e AlPc (em B) irradiados por 30 min. ........................................... 28
FIGURA 13 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
ZnTMPP irradiado por 60 min. ........................................................................... 30
FIGURA 14 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
ZnTMPP irradiado por 30 e 60 min. ................................................................... 31
FIGURA 15 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete
dias após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS MB
irradiado por 60 min. ........................................................................................... 32
FIGURA 16 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias após a manutenção da
cultura de Leptospira hardjo em estufa) da ZnTMPP e MB irradiadas por 60
min. ...................................................................................................................... 33
xiii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Grupos de CCO´s imaturos, tratamentos e dias de suas avaliações em
estereomicroscópio. .......................................................................................... 19
QUADRO 2 - Grupos de CCO´s maturados, tratamentos e dias de suas avaliações em
estereomicroscópio. .......................................................................................... 20
QUADRO 3 - Grupos de CCO´s imaturos e os dias de suas avaliações em
estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e
percentuais de clivagem e embriões por grupo. ................................................ 35
QUADRO 4 - Grupos de CCO´s maturados e os dias de suas avaliações em
estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e
percentuais de clivagem e embriões por grupo. ................................................ 38
xiv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
µM - micromolar
µl - microlitro
nm - nanômetro
mW - miliwatt
AlPC - Ftalocianina metalada com alumínio
CCO´s - complexos cumulus-ovócitos
DO - densidade óptica
J - joule
HP - Hematoporfirina
MB - Azul de metileno
PDI - inativação fotodinâmica
PIVE - produção de embriões in vitro
PS - fotossensibilizador
ROS - espécies reativas de oxigênio
TMPP - porfirina meso-tetrametilpiridil
ZnPC - Ftalocianina metalada com zinco
ZnTMPP - porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco
ZP - zona pelúcida
xv
RESUMO
A leptospirose é uma importante zoonose e traz consideráveis perdas econômicas em
decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade e queda da produção de leite em rebanhos
acometidos. A doença pode ser disseminada pela urina, água, solos contaminados, via
venérea, transplacentária e há risco de transmissão pela manipulação de embriões in vitro.
Dessa forma, com o avanço das biotécnicas reprodutivas, a preocupação com a sanidade de
animais ou rebanhos frente a qualquer enfermidade também transmitida por sêmen ou
embriões tem aumentado. Como alternativa para a inativação de agentes infecciosos, a técnica
de inativação fotodinâmica (PDI) vem ganhando destaque por não causar resistência
microbiana natural. O método consiste na combinação de um fotossensibilizador (PS), luz e
oxigênio molecular, resultando na formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que em
altos níveis induzem a morte celular. Neste trabalho, com o objetivo de inativar a Leptospira
interrogans in vitro, seis PSs foram testados na concentração de 10 µM e em tempos de
irradiações de 30 e ou 60 min. As Porfirinas TMPP e ZnTMPP mostraram-se eficientes, a
primeira na irradiação de 30 min, a segunda em ambos os tempos de irradiação testados. O
Azul de Metileno (MB) demonstrou uma inativação satisfatória quando irradiado por 60 min.
Hematoporfirina e Ftalocianinas testadas não demostraram eficiência na inativação das
leptospiras nos parâmetros experimentais analisados. Ao avaliar a ação da ZnTMPP e do MB
sobre a viabilidade dos oócitos, ambos demonstraram ser inócuos aos complexos cumulus-
ovócitos (CCO’s) maturados no tempo de 30 min, o que os torna potenciais candidatos à
utilização para a desinfecção de materiais biológicos ou subprodutos de origem animal em
substituição aos antibióticos, conhecidamente causadores de resistência bacteriana.
Palavras-chave: fotossensibilizador, leptospirose, oócito, PDI.
xvi
ABSTRACT
Leptospirosis is an important zoonosis and it causes economic losses due to abortion, mastitis,
infertility, and drop in milk production in affected herds. The disease may be disseminated
through urine, water, contaminated soils, venereal and transplacental routes, and there is a risk
of transmission by in vitro embryo manipulation. Thus, with the advancement of reproductive
biotechnology, the concern with the sanity of animals or herds in the face of any disease also
transmitted by semen or embryos has increased. As an alternative for the inactivation of
infectious agents, the technique of photodynamic inactivation (PDI) has became prominent as
it does not cause natural microbial resistance. The method consists in the combination of a
photosensitizer (PS), light, and molecular oxygen, resulting in the formation of reactive
oxygen species (ROS) that at high levels induce cell death. In this study, in order to inactivate
in vitro Leptospira interrogans, six PSs were tested at a concentration of 10 μM and at the
irradiation times of 30 and or 60 min. The TMPP and ZnTMPP porphyrins were efficient, the
first one in the 30 min irradiation, the second one in both irradiation times. Methylene Blue
(MB) demonstrated satisfactory inactivation when irradiated for 60 min. Hematoporphyrin
and phthalocyanines did not demonstrate efficiency in the inactivation of leptospires in the
experimental parameters used. When evaluating the action of ZnTMPP and MB on oocyte
viability, both demonstrated to be innocuous to cumulus-oocyte (CCOs) complexes matured
in the 30 min, which makes them potential candidates for the disinfection of biological
materials or by-products of animal origin in place of antibiotics, known to cause bacterial
resistance.
Key words: photosensitizer, leptospirosis, oocyte, PDI.
1. INTRODUÇÃO
A resistência microbiana aos antibióticos é uma preocupação mundial. Entretanto, o
uso desses fármacos vem crescendo a cada década com a finalidade de combater as numerosas
doenças existentes, tanto humanas quanto animais. Além disso, os antibióticos são utilizados
também com o objetivo de promover desinfecções de materiais biológicos, dentre eles o sêmen
e embriões bovinos.
É fato que as biotécnicas reprodutivas têm contribuído de forma significativa ao
desenvolvimento técnico-científico e econômico das nações1. As técnicas de inseminação
artificial, a produção de embriões in vitro (PIVE) e a transferência de embriões têm
impulsionado o melhoramento genético e a eficiência produtiva de rebanhos bovinos em todo o
mundo2,3
, inclusive no Brasil4. Contudo, são infundados os investimentos de tais tecnologias
em rebanhos ou em animais com problemas sanitários, como enfermidades que podem ser
transmitidas por sêmen ou embriões, e que provocam, entre outros males, abortamentos,
repetição de cio, infertilidade e esterilidade5.
Para que haja controle sanitário dos embriões e oócitos na PIVE, a International
Embryo Transfer Society (IETS) desenvolveu um manual de procedimentos, com instruções de
tratamentos celulares com tripsina ou antibióticos em lavagens alternadas com meio de cultura
e, também, lavagens sequenciais, com a finalidade de inativar ou remover agentes infecciosos
que podem interferir no produto final6.
Dentre os agentes que podem acometer os embriões a Leptospira sp. merece
destaque7. A bactéria é aeróbia, do tipo espiroqueta, Gram-negativa e causadora de uma
enfermidade da esfera reprodutiva, a leptospirose. A doença causa consideráveis perdas
econômicas em decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade8, repetições de cio,
nascimento de bezerros fracos ou prematuros, natimortos9 e queda da produção de leite nos
bovinos10
. Além de assumir um papel relevante na área da saúde animal, destaca-se também do
ponto de vista da Saúde Pública, uma vez que se trata de uma importante zoonose9.
A leptospirose tem como agente a L. interrogans que dentre as duas espécies
conhecidas de Leptospira spp., é a considerada patogênica9. Ela é de distribuição cosmopolita,
sendo mais comum em regiões de clima tropical, e possui inúmeros sorovares10
. No estado de
Goiás, a enfermidade é considerada endêmica, bem como na microrregião de Goiânia11
.
Os bovinos, uma vez infectados, podem eliminar a leptospira na urina por até mais
de um ano12,13
. São considerados reservatórios do sorovar hardjo, e podem transmitir a doença
2
pelo modo indireto - contato com água e solos contaminados; e modo direto - via venérea14
e
transplacentária15
. Foi confirmada a transmissão por meio do sêmen contaminado, durante a
monta natural e a inseminação artificial16
. Há também o favorecimento do risco da transmissão
de doenças pela manipulação de embriões in vitro17
.
Diante do exposto, este trabalho sugeriu o uso da inativação fotodinâmica (PDI)
sobre a Leptospira interrogans sorovar hardjo in vitro e oócitos bovinos, uma vez que a técnica
é destacada por não causar resistência microbiana natural18
.
A PDI consiste na combinação sinérgica de um composto fotossensibilizador (PS),
luz (a um comprimento de onda adequado) e oxigênio molecular, resultando na formação de
espécies reativas de oxigênio (ROS)19
. As ROS são subprodutos do metabolismo normal do
oxigênio e desempenham importante função nos processos de sinalização e homeostase celular.
Contudo, em altos níveis provocam danos às estruturas celulares induzindo a morte celular,
demonstrando sua eficácia para inativar patógenos infecciosos20-23
.
Os PSs mais utilizados na terapia fotodinâmica são as porfirinas, clorinas e
ftalocianinas. Eles possuem propriedades fotofísicas semelhantes, porém, apresentam estruturas
moleculares diferentes e características específicas. Isso resulta em divergências em relação à
eficácia da PDI24
. Outra classe utilizada é a dos fenotiazínicos, dentre eles destaca-se o azul de
toluidina e o azul de metileno25
.
Neste trabalho foram utilizados seis fotossensibilizadores - porfirina meso-
tetrametilpiridil (TMPP), porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco (ZnTMPP),
Hematoporfirina (HP), Ftalocianina metalada com zinco (ZnPC), Ftalocianina metalada com
alumínio (AlPC) e Azul de metileno (MB) - para a avaliação da PDI in vitro da L. interrogans
sorovar hardjo e em oócitos bovinos.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Leptospira spp.
2.1.1. Classificação
Leptospira spp. são bactérias que compõem a ordem Spirochaetales e a família
Leptospiraceae. Podem ser classificadas de duas maneiras: patogênicas ou saprófitas, baseada
em técnicas moleculares (gênicas) ou a determinantes antigênicos (forma sorológica)26
.
A classificação genotípica, após demonstrações da heterogeneidade genética de
espécies agrupadas num mesmo sorovar, vem ganhando destaque27
. O gênero Leptospira pode
ser agrupado em: subgrupo patogênico, saprofítico e intermediário28,29
. No subgrupo
patogênico estão classificadas as espécies consideradas de importância médica: L. interrogans,
L. kirschneri, L. noguchii, L. borgpetersenii, L.weilii, L. santarosai, L. alexanderi e L. alstoni
(Figura 1). No saprofítico as espécies consideradas ambientais: L. biflexa, L. wolbachii, L.
kmetyi, L. meyeri, L. vanthielii, L. terpstrae e L. yanagawae. E no intermediário as espécies L.
inadai, L. broomii, L. fainei, L. wolffii e L. licerasiae30
.
FIGURA 1 - Classificação taxonômica de espiroquetas de importância médica.
Fonte: Siqueira31
.
Apesar de análises filogenéticas dos genes RNAs ribossomais 16S dividirem as
espécies de leptospiras nesses três grupos32,33
, a classificação sorológica ainda é a base
taxonômica para as leptospiras. Portanto, esse gênero é tradicionalmente dividido em duas
4
espécies: não-patogênicas ou saprófitas, cujo destaque dar-se-á para a L. biflexa; e patogênicas,
das quais se sobressai a L. interrogans32
.
2.1.2. Biologia das leptospiras
Bactérias do gênero Leptospira são microrganismos móveis flagelados
denominados espiroquetas34
. Possuem o formato alongado, fino e helicoidal, exibindo espiras
curtas e regulares para o lado direito, e tamanho de 0,1 a 0,15 µm de diâmetro por 6,0 a 12,0
µm de comprimento33
. Crescem otimamente em temperaturas de 28 a 30°C, pH de 7,2 a 7,6 e o
tempo de crescimento é lento (aproximadamente 20h)35
.
O agente é aeróbico obrigatório34
e não pode ser observado em microscópio ótico
comum, e sim em microscópio de campo escuro ou contraste de fase33
. A maioria não é corada
pela coloração de Gram, mas todas podem ser coradas por impregnação por sais de prata.
Apesar de ser classificado como Gram-negativo, possui características atípicas e
comuns a de Gram-positivos. A parede celular desta bactéria é composta por uma membrana
interna, peptidoglicano, dois flagelos periplasmáticos e membrana externa. A presença de duas
membranas na parede celular e a presença de lipopolissacarídeo (LPS) na membrana externa
são características comuns a bactérias Gram-negativas, no entanto, o fato de o peptidoglicano
estar ancorado na membrana interna é comum a bactérias Gram-positivas36
.
Os dois flagelos periplasmáticos axiais apresentam-se ancorados em ambas as
extremidades da célula, características únicas entre as bactérias, e sua mobilidade se dá por
rotação, impulsionada pelos flagelos. A extremidade anterior tem uma forma espiral longa (S-
end) e a extremidade posterior é em forma de gancho (H-end). Ligando as extremidades têm-se
o cilindro protoplasmático (PC) (Figura 2). Há três tipos de movimentação possíveis: rotação
sobre um eixo central, movimento progressivo (reto) e movimentação circular37
. A S-end,
juntamente com o PC, está correlacionada à velocidade de natação e a H-end às mudanças da
taxa de rotação38
.
5
FIGURA 2 - Leptospira biflexa observada em iluminação unilateral em
campo escuro. Nota-se sua extremidade anterior em forma
espiralada (S-end), o cilindro protoplasmático (PC) e sua
extremidade posterior em forma de gancho (H-end).
Fonte: Nakamura et al.38
.
2.1.3. Enfermidade causada pelas leptospiras patogênicas
As espécies patogênicas possuem grande importância na área da saúde, uma vez
que podem levar à leptospirose - uma importante zoonose de curso agudo a crônico35
que
acomete, além do homem, espécies silvestres e as principais espécies domésticas como: cães,
suínos, caprinos, ovinos, equinos e bovinos39
. A doença é de distribuição cosmopolita, sendo
mais comum em regiões de clima tropical40
e causa perdas econômicas significativas em
decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade35
, repetições de cio, nascimento de
bezerros fracos ou prematuros, natimortos39
e queda da produção de leite nos bovinos40
.
A Leptospira pode persistir no trato reprodutivo por meses ou até anos após a
infecção41
. Apesar da zona pelúcida (ZP) do oócito servir tanto de barreira mecânica quanto
fisiológica, sabe-se que alguns patógenos, mesmo não penetrando através da ZP, podem estar
firmemente aderidos à sua superfície externa42
. Em estudo realizado com mórulas expostas por
altas concentrações de Leptospira via in vitro, a micrografia eletrônica (ME) mostrou que essa
espiroqueta pode penetrar os canais da ZP e invadir a matriz, os espaços perivitelino e
intercelular dessas células embrionárias. Apesar desse achado, não se sabe qual a concentração
de leptospira pode ser encontrada no trato reprodutivo de animais naturalmente infectados7
(Figura 3).
6
FIGURA 3 – Leptospiras (setas) em embrião bovino (A a D) e suíno (E). (A) L. borgpetersenii
sorovar hardjo na membrana celular e no citoplasma. Bar = 0,40 µM; (B) L.
borgpetersenii sorovar hardjo na matriz da ZP. Bar = 0,33 µM; (C) L. borgpetersenii
sorovar hardjo no espaço intercelular. Bar = 0,44 µM; (D) L. borgpetersenii sorovar
hardjo na superfície da ZP. Note a estrutura da ZP com inúmeros poros que podem ser
penetrados pela Leptospira. Bar = 0,53 µM; (E) Aderência da Leptospira na superfície
da ZP. 1300x.
Fonte: Adaptado de Bielanski et al.7 e Shisong et al.
43
No estado de Goiás, a leptospirose é considerada endêmica, predominando as
coaglutinações, os sorovares wolffi, hardjo, grippotyphosa e shermani, nesta ordem44
. Bem
como na microrregião de Goiânia, cujos destaques são os sorovares wolffi e hardjo, também
nesta ordem de prevalência11
.
2.2. Terapia Fotodinâmica (PDT)
2.2.1. Histórico
A PDT teve início há quatro mil anos no Egito antigo onde se tratava vitiligo
combinando-se a ingestão de plantas e a exposição à luz solar45
. Além do Egito, na China e na
7
Índia também se utilizavam o método46
. Contudo, as pesquisas foram iniciadas apenas no
século XIX.
A partir de 1900, os efeitos fotodinâmicos de compostos químicos são estudados na
inativação de microrganismos. Oscar Raab foi o primeiro a publicar que a combinação de luz
com o corante acridina era tóxico para o protozoário Paramecium caudatum. Em 1903, a
descoberta da necessidade da presença do oxigênio em associação a luz para que a reação
funcionasse, denominada de “efeito fotodinâmico”, foi de seu orientador Herman von
Tappeiner18,47
.
Vinte anos depois (1924), Policard A. publicou as primeiras observações clínicas.
Em seu estudo, tumores malignos apresentavam uma fluorescência vermelho tijolo e descobriu-
se que o acúmulo de porfirinas produzidas por bactérias hemolíticas que proporcionava esta
cor. Esses compostos eram atóxicos no escuro, contudo na presença de oxigênio e de luz
visível, se tornavam prejudiciais ao tecido celular48
.
No fim da década de 60, Lipson et al.49
, utilizaram um novo fármaco no tratamento
de câncer de mama. Esse fármaco era sintetizado a partir da purificação da hematoporfirina
(Hp) e chamado de derivado da hematoporfirina (HPD).
O reconhecimento da PDT como terapia alternativa para o tratamento do câncer
deu-se na década de 70, a partir dos trabalhos de Thomas Dougherty et al. e inspirou outras
modalidades de fototerapia, como a inativação fotodinâmica (PDI) para eliminação de
microrganismos patogênicos, e o fotodiagnóstico50-52
.
2.2.2. Princípios da Inativação Fotodinâmica (PDI)
A PDI provém da PDT e é baseada nos mesmos princípios. O objetivo de ambas é a
indução da morte celular. Esta última é utilizada em tratamentos de tumores neoplásicos e
benignos e tem como principais alvos (em células de mamíferos) os lisossomos, mitocôndrias e
membranas plasmáticas. A primeira tem como foco a eliminação de microrganismos
patogênicos, tais como fungos, vírus e bactérias18
.
Os dois métodos utilizam-se basicamente de um composto químico atóxico, em sua
maioria pigmentado e sem toxicidade no escuro, chamado fotossensibilizador (PS). Esse
composto ao ser irradiado, por uma fonte de luz em um determinado comprimento de onda em
um determinado tempo, absorve o fóton e sofre uma série de processos fotoquímicos e
fotofísicos. Na presença de oxigênio, essa reação gera espécies reativas de oxigênio (ROS) e
oxigênio singleto (1O2), que induz a toxicidade
19,53,54. Quando os produtos da
8
fotossensibilização danificam a membrana plasmática e a mitocôndria, levam à necrose e
quando as doses são mais baixas e subletais, levam à apoptose55
.
Ao interagir com as moléculas de oxigênio, a luz pode ser dispersa, refletida ou
absorvida obtendo, portanto, a fluorescência, fosforescência ou transferência de energia não
radiativa56-58
. O diagrama de Jablonski (Figura 4) ilustra o processo responsável pela
luminescência. As moléculas, ao absorverem a radiação, são promovidas do estado eletrônico
fundamental (S0) para um estado excitado singleto (Sn). Elas então, por efeito de conversão
interna (CI), se desativam por relaxamento vibracional (RV) até atingir o primeiro nível
vibracional do estado eletrônico de menor energia (S1). Neste estágio a molécula pode seguir
diferentes caminhos quanto à utilização da energia: 1) ela perde energia para o solvente e
retorna ao estado S0, por efeito de CI; 2) ela emite luz visível através do processo de
fluorescência (F); ou 3) ela passa para o estado excitado tripleto de menor energia (T1), por
efeito de cruzamento intersistemas (CIS) onde há a passagem de singleto para tripleto com
inversão do spin59,60
.
FIGURA 4 - Diagrama de Jablonski modificado – processos de ativação
fotoquímica/fotofísica. (S0) estado fundamental, (Sn) estado excitado
singleto, (S1) primeiro estado excitado singleto, (A) absorção de um fóton,
(RV) relaxamento vibracional, (CI) cruzamento interno, (CIS) cruzamento
intersistemas, (T1) estado excitado tripleto de menor energia, (F)
Fluorescência, (P) Fosforescência, (PS) Fotossensibilizador.
Fonte: Adaptado de Frackowiak61
.
Do estado T1 a molécula pode seguir por dois caminhos: 1) emitir luz visível, a
fosforescência (P), e voltar para S0; ou 2) transferir energia para o oxigênio molecular (O2).
Esse último mecanismo pode se dar de duas formas, o tipo I e o tipo II. No primeiro há uma
9
transferência de elétrons entre o PS e os componentes do sistema, resultando na formação de
radicais livres (OH) ou peróxido de hidrogênio (H2O2). Esses por sua vez podem levar à
formação de ROS19,53,60
. As ROS desempenham normalmente importante função nos processos
de sinalização e homeostase celular. Contudo, em altos níveis provocam danos irreversíveis às
membranas celulares incluindo a citoplasmática, a mitocondrial, a lisossomal e a nuclear, além
de causarem alterações protéicas62,63
induzindo a morte celular19,21-23
.
No segundo mecanismo há uma transferência de energia do PS para O2 que se
encontra em seu estado excitado tripleto (3O2), formando o oxigênio singleto (
1O2). O
1O2
possui alta reatividade para o ataque de biomoléculas e, por possuir tempo de vida muito curto,
leva à destruição somente de células vizinhas. Por isso, torna o alvo de destruição celular mais
específico e localizado64
. Essa molécula necessita do PS como precursor do estado tripleto, que
possui tempo de vida mais longo19,53,60
.
Os dois mecanismos geram ROS, mas na PDI, as produzidas pelo mecanismo do
tipo II (oxigênio singleto) são as mais expressivas60,65,66
. Ambos podem ocorrer
simultaneamente, contudo a proporção entre eles dependerá da presença de oxigênio, da
concentração do substrato e do PS utilizado.
2.2.3. Fontes de luz para a PDI
A luz é necessária para que ocorra a reação e a intensidade de irradiação, dose e
tempo de exposição ao agente, dependerá do PS utilizado, bem como do próprio
microrganismo que se deseja inativar. Existem diversos tipos de fontes de luz, elas se agrupam
em coerentes e não coerentes.
As fontes de luz coerentes produzem um comprimento de onda monocromático que
permite o fácil cálculo da dosimetria e irradiação em um comprimento de onda específico para
cada PS67
. Como exemplo tem-se os lasers que podem ser focados, transmitidos por uma fibra
óptica ou diretamente entregues ao local alvo68
.
As fontes de luz não coerentes liberam um amplo espectro de comprimentos de
onda, portanto há uma dificuldade no controle da intensidade da luz. Além disso, possuem
outras desvantagens como efeitos térmicos e baixa intensidade de luz68
. No entanto, são mais
seguras, fáceis de utilizar e possuem baixo custo. Como exemplo tem-se as lâmpadas
convencionais69
.
Apesar das diferenças entre os tipos de fontes de luz, as coerentes e as não
coerentes apresentam eficácias semelhantes70
. Portanto, a escolha da melhor fonte de luz deve
ser baseada na escolha do PS, ou seja, aquela que tem a habilidade de excitar o PS escolhido,
10
em seu comprimento de onda específico, sem provocar efeitos adversos nas células não alvo;
da localização do patógeno (profundidade no tecido e acessibilidade); e custo71
.
A profundidade que a luz irá penetrar no tecido está relacionada com, o
comprimento de onda72
. As luzes ideais para a PDI são as que atendem a chamada “janela
terapêutica”, cujo comprimento de onda se estende da faixa de 600 à 800nm. As que possuem
comprimentos de ondas abaixo de 600nm não penetram nas profundidades desejadas e as que
possuem comprimentos de ondas acima de 800nm não possuem energia suficiente para gerar
1O2 e iniciar uma reação
73.
A luz azul penetra menos eficientemente através do tecido porque possui um menor
comprimento de onda, enquanto que as radiações vermelha e infravermelha penetram mais
profundamente por possuírem um maior comprimento de onda72,73
(Figura 5).
FIGURA 5 - Propagação da luz através dos tecidos
Fonte: Adaptado de Agostinis et al.72
2.2.4. Fotossensibilizadores (PS)
PS são compostos químicos atóxicos capazes de absorver a energia da luz irradiada
e gerar fluorescência ou ROS74
. Podem ser administrados por via tópica, intralesional e
sistêmica75
e geralmente, pertencem às famílias das porfirinas, clorinas e ftalocianinas24
.
Entretanto, alguns fenotiazínicos também estão sendo utilizados25
(Figura 6).
11
As porfirinas são pigmentos fortemente corados e que apresentam a cor púrpura76
.
Elas conferem a cor vermelha característica nos animais e cor verde nas plantas uma vez que
são unidades centrais de moléculas como a clorofila, vitamina B12 e hemoglobina77
. Possuem
vinte átomos de carbono ao redor de um anel central com quatro átomos de nitrogênio. E são
moléculas que absorvem luz na região do vermelho (500-650nm)59,76
. Porfirina meso-
tetrametilpiridil (TMPP), porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco (ZnTMPP) e
Hematoporfirina (HP) são alguns exemplos de porfirinas e os PS análogos comercialmente
mais utilizados são: Photofrin® (Canadá), Photosan® (Alemanha) e Photogem® (Rússia)18
.
As clorinas se diferem das porfirinas por apresentarem uma dupla ligação na
periferia do sistema macrocíclico. Isso permite que absorvam fortemente na região do azul e do
vermelho (650-800nm), bem como confere a elas maior tempo de vida no estado tripleto78
. No
mercado estão disponíveis: Foscan®, Photochlor®, Photoditazine®, Radaclorina® e
Visudyne™18
.
As ftalocianinas já possuem quatro núcleos benzoindólicos unidos por pontes de
nitrogênio. São corantes sintéticos, cuja coloração é a azulada e podem se ligar com vários
tipos de metais, principalmente ao alumínio (Ftalocianina Alumínio - AlFC) e zinco
(Ftalocianina Zinco - ZnFC) em sua região central, conferindo-lhes características fotofísicas
específicas. A banda de absorção se encontra na região de 600-800nm79-81
. Comercialmente há
o Photosense®82
.
Os fenotiazínicos são corantes aromáticos heterocíclicos solúveis em água ou em
álcool, relativamente lipofílicos e possuem carga positiva. Isso garante a permeabilidade em
membranas e também acúmulo em mitocôndrias devido ao potencial negativo da matriz
mitocondrial. Exibem intensa absorção na região de 600-660 nm18
e os mais utilizados são azul
de toluidina e azul de metileno25
.
FIGURA 6 – Estruturas moleculares. A) porfirina; B) clorina; C) ftalocianina; D)
fenotiazínico azul de metileno.
12
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos gerais
Inativar pelo método da PDI a L. interrogans sorovar hardjo e avaliar a ação dos
fotossensibilizadores sobre a viabilidade de oócitos bovinos.
3.2. Objetivos específicos
1. Testar diferentes classes de fotossensibilizadores para a inativação fotodinâmica da L.
interrogans sorovar hardjo.
2. Avaliar diferentes tempos de irradiação na inativação fotodinâmica da Leptospira em uma
concentração de 10 µM de cada fotossensibilizador.
3. Avaliar diferentes tempos de irradiação na inativação fotodinâmica de oócitos bovinos
utilizando o fotossensibilizador de escolha.
4. Avaliar a integridade dos oócitos pós-inativação fotodinâmica.
5. Analisar a quantidade de estruturas clivadas e a produção de embriões pós-inativação
fotodinâmica.
13
4. HIPÓTESES
A Inativação Fotodinâmica pode ser utilizada para a eliminação de Leptospira
interrogans.
A Inativação Fotodinâmica pode ser utilizada em oócitos bovinos.
14
5. MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi submetido e aprovado pelo comitê de ética no uso de animais
(CEUA/UFG – protocolo N. 086/2016) (Anexo).
5.1. Local de desenvolvimento
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Engenharia Genética
(LBEG) no Instituto de Ciências Biológicas II (ICB II) da Universidade Federal de Goiás
(UFG), em Goiânia, no Laboratório de Diagnóstico de Leptospirose (LDL) e no Laboratório de
Reprodução da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da mesma instituição.
5.2. Cultivo e manutenção da Leptospira
Os procedimentos de multiplicação e manutenção da Leptospira foram realizados
no Laboratório de Diagnóstico de Leptospirose (LDL) da Escola de Veterinária e Zootecnia
(EVZ/UFG). As amostras de bactéria foram multiplicadas em meio Ellinghausen-McCullough-
Johnson-Harris (EMJH) e repicadas de sete em sete dias até o término do experimento.
5.3. Preparo das soluções de PSs
Os PSs foram preparados no Laboratório de Biofísica do Instituto de Física da
Universidade Federal de Goiás e suas concentrações determinadas pelo espectrofotômetro
LAMBDA 1050 UV/Vis/NIR spectrophotometer - PerkinElmer Inc. (Waltham, Massachusetts
02451, USA). Posteriormente as amostras foram diluídas em tampão fosfato-salino (PBS) pH
7.4 1x autoclavado para obtenção de 2-4 ml.
5.4. Inativação Fotodinâmica da Leptospira
Nesta etapa foram testados cinco PSs: porfirina meso-tetrametilpiridil (TMPP),
porfirina meso-tetrametilpiridil metalada com zinco (ZnTMPP), Hematoporfirina (HP),
Ftalocianina metalada com zinco (ZnPC) e Ftalocianina metalada com alumínio (AlPC).
Para a realização da Inativação Fotodinâmica (PDI) da Leptospira, 800 µl de
cultura foram incubados à temperatura ambiente por 1 h ao abrigo da luz juntamente com cada
PS, separadamente, na concentração final de 10 µM (concentração testada anteriormente com
outros microrganismos pela equipe laboratorial) em um microtubo de 2 ml. Após a incubação,
250 µl da solução foram diluídos em 1 ml de meio EMJH e desta, 1 ml foi utilizado para a
leitura da quantidade inicial de bactérias em espectrofotômetro Bel Photonics® S-05, em uma
15
DO de 600 nm. Posteriormente, as amostras foram colocadas em uma placa de microtitulação,
em duplicata, e irradiadas a 5 cm de distância da fonte, durante 30 min, por um sistema de
irradiação constituído por uma lâmpada halógena (500 W), de baixo custo, emitindo em toda a
região do visível do espectro eletromagnético, de 470 a 750 nm, conforme descrito por Almeida
et al.19
. Todas as amostras foram irradiadas numa intensidade de 180 mW/cm2.
Para evitar o aquecimento da amostra foi usado um filtro de água acoplado à saída
da fonte. Como controle, para avaliar o crescimento de forma natural da bactéria, foi utilizada a
cultura bacteriana sem a presença de PS e sem irradiação. Para a avaliação apenas da ação da
luz sobre o patógeno, foi utilizada a cultura bacteriana sem a presença de PS e com irradiação.
E para a avaliação apenas da ação do PS sobre o patógeno, outro controle foi realizado com a
cultura bacteriana juntamente com o PS e sem irradiação.
Em seguida, 250 µl de cada amostra e suas duplicatas foram adicionadas
separadamente a tubos de ensaio de vidro contendo 1 ml de meio EMJH para avaliar o
crescimento da cultura em estufa com temperatura controlada a 29,3º C, durante sete dias. Após
esse período, uma alíquota de cada amostra foi plaqueada em meio LB Ágar para identificação
de possível contaminação com outro microrganismo, caso houvesse contaminação, a amostra
era descartada e refeita; para a avaliação da eficiência da PDI, 30 µl das amostras foram
submetidas à microscopia de campo escuro; e 1ml das amostras foram lidas em
espectrofotômetro utilizando uma DO 600nm.
Com o PS considerado mais eficiente, isto é, àquele que inativou grande parte das
bactérias, foi realizado o experimento novamente, com o tempo de 60 min de irradiação para a
avaliação do efeito do tempo de irradiação sobre a viabilidade das bactérias. Testou-se também
nesse tempo outro PS chamado azul de metileno (MB). Os melhores PSs identificados para a
inativação fotodinâmica da Leptospira foram utilizados posteriormente para os ensaios com os
oócitos selecionados.
5.5. Soluções e composição de meios para a PIVE
Os meios de maturação, fecundação, CAP e cultivo utilizados foram adquiridos da
empresa Progest Biotecnologia em Reprodução e Saúde Animal Ltda, previamente testados
com ovários de abatedouro. As demais soluções foram preparadas no laboratório.
5.6. Composição dos meios para PIVE
5.6.1. Meio de maturação - MIV
16
Meio TCM 199 com sais Earle e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand
Island, NY, USA) suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v), 0,2 mM piruvato, 5 mg/ml
hormônio luteinizante (Lutropin-V®, Bioniche Co., Belleville, ON, Canada), 1 mg/ml
hormônio folículo estimulante (Folltropin®, Bioniche Co., Belleville, ON, Canada), 75 µg/ml
amicacina e 1 mM cistamina.
5.6.2. Meio de maturação de bancada – MIV t
Meio TCM 199 com sais de Hank´s e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand
Island, NY, USA) tamponado com Hepes e suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v), 0,2
mM piruvato, 5 mg/ml hormônio luteinizante (Lutropin-V®, Bioniche Co., Belleville, ON,
Canada), 1 mg/ml hormônio folículo estimulante (Folltropin®, Bioniche Co., Belleville, ON,
Canada), 75 µg/ml amicacina e 1 mM cistamina.
5.6.3. Meio de fecundação
TALP-FIV suplementado com 6 mg/mL albumina sérica bovina livre de ácido
graxo, 0,2 mM piruvato, 30 µg/ml heparina, 20 µM penicilamina, 10 µM hipotaurina, 1,0 µM
epinefrina e 75 µg/ml amicacina.
5.6.4. Meio CAP
Meio tamponado Tyrode's HEPES, suplementado com 0,2 mM piruvato e 75 µg/ml
amicacina.
5.6.5. Meio de cultivo
SOFaa83
suplementado com 2,7 mM mio-inositol, 0,2 mM piruvato, 2,5% soro fetal
bovino (v/v), 5 mg/mL albumina sérica bovina livre de ácido graxo, 75 µg/ml amicacina.
5.6.6. Meio LAV de bancada
Meio TCM 199 com sais Hank´s e L-glutamina (Gibco®, Invitrogen Co, Grand
Island, NY, USA) suplementado com 10% soro fetal bovino (v/v).
5.7. Inativação Fotodinâmica de oócitos
17
5.7.1. Colheita de oócitos
As amostras de ovários de vacas mestiças (Bos indicus x Bos taurus) foram doadas
por frigorífico sob Serviço de Inspeção Federal (SIF), localizado na microrregião de Goiânia.
Os ovários foram colhidos no momento do abate e armazenados em garrafa térmica
contendo aproximadamente 500 ml de solução salina esterilizada (0,9%) pré-aquecida à
temperatura média de 35°C, e mantidos à mesma temperatura por um período máximo de
quatro horas até o momento da aspiração dos folículos para retirada do líquido folicular e
seleção dos oócitos.
As aspirações dos folículos com 3 a 8 mm de diâmetro ocorreram manualmente,
empregando-se seringa de 10 ml e agulha 40x1,2 mm, ambas descartáveis, para a retirada dos
complexos cumulus-ovócitos (CCO´s), também chamados de oócitos. Estes foram
armazenados em tubos cônicos e mantidos em banho-maria a 36 °C por 10 min até a
decantação.
Os CCO´s foram classificados segundo Stojkovic et al.84
e separados com
qualidade grau 1 e 2 em grupos de 15-20, também em duplicata (G1 a G8).
A colheita foi realizada em dois momentos, a primeira para a realização do
experimento na qual a inativação fotodinâmica fora realizada em CCO´s imaturos, e a segunda
para a realização do experimento na qual a inativação fotodinâmica fora realizada em CCO´s já
maturados.
5.7.2. PDI de CCO´s imaturos
Este experimento foi realizado concomitantemente à parte final da PDI das
leptospiras e a PDI dos CCO´s foi realizada no mesmo dia da coleta, dia chamado de DC.
Posteriormente à classificação e avaliação morfológica em estereomicroscópio (Av
1), o grupo G1 e G2 foram transferidos para uma placa de petri contendo gotas de 150 μl de
meio de maturação (MIV) e incubados em estufa a 38,5 °C em atmosfera de 5% de CO2 e
umidade relativa saturada sem condensação. Uma vez que os CCO´s destes grupos não se
submeteram a nenhum tipo de tratamento, os grupos G1 e G2 foram chamados de Controle da
estufa (Cont estufa).
Os grupos G3 a G8 foram avaliados em estereomicroscópio (Av 1) e levados em
meio de maturação de bancada (MIV t) ao tratamento de PDI por 60 min, com mesma distância
e fonte de luz utilizada no experimento realizado com as leptospiras. As amostras foram
colocadas em uma placa de microtitulação num volume final de 250 µl, e posteriormente
também transferidas à placa de petri contendo meio de maturação e incubadas por iguais
18
condições aos grupos G1 e G2. Os grupos G3 e G4 foram tratados somente com a luz, por isso
foram chamados de Controle da luz (Cont luz); os grupos G5 e G6 foram tratados com MB
numa concentração final de 10 µM e irradiados, denominados assim de Tratados MB (Trat
MB); e os grupos G7 e G8 foram tratados com ZnTMPP também numa concentração final de
10 µM e irradiados, chamados portanto de Tratados ZnTMPP (Trat ZnTMPP).
Após as irradiações, os grupos tratados (G3 a G8) foram avaliados novamente (Av
2), lavados em dez gotas de meio LAV de bancada e posteriormente transferidos para uma
placa de petri contendo gotas de 150 μl de meio de maturação e incubados em estufa a 38,5 °C
em atmosfera de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação.
Após 22 horas, dia chamado de D0, realizou-se mais uma avaliação (Av 3 para
tratados e Av 2 para não tratados) e todos os grupos (G1 a G8) foram transferidos para gotas de
150 µl de meio de fecundação cobertas com óleo mineral.
O sêmen utilizado foi o de um touro holandês de fertilidade conhecida. O material
foi descongelado a 37 °C por 30 s, depositado sobre coluna de gradiente Percoll 45-90%85
e
centrifugado a 700 g por 5 min. O sedimento de espermatozóides foi ressuspendido em 1,0 ml
de meio CAP e centrifugado a 700 g por 3 min. O pellet formado foi diluído em 100 μl de meio
de fecundação. Após observação da motilidade e do vigor, cada gota foi fertilizada com uma
concentração final de 1,0 x 106 espermatozoides vivos/ml. As placas foram incubadas a 38,5 °C
em atmosfera de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação por 18 h, sendo o
dia da inseminação in vitro considerado o D0.
Os possíveis zigotos foram parcialmente desnudados, lavados e transferidos para
gotas de 200 μl de meio de cultivo sob óleo mineral por sete dias (D7) a 38,5 °C em atmosfera
de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação. Durante os sete dias, no D3 foi
realizada mais uma avaliação em estereomicroscópio quanto à clivagem (Av 4 para os tratados
e Av 3 para não tratados), posteriormente procedeu-se com a suplementação do meio de cultivo
(feeding) substituindo-se 50% do volume de cada gota e no D7 foram avaliados pela última
vez quanto a taxa de mórula e blastocisto (Av 5 para tratados e Av 4 para não tratados). A
síntese dos grupos, os tratamentos e dias das avaliações estão demonstrados no Quadro 1.
19
QUADRO 1 - Grupos de CCO´s imaturos, tratamentos e dias de suas avaliações em estereomicroscópio.
Grupo Denominação Tratamento
PS
Tratamento
Luz
DC
após
seleção
DC
após
PDI
D0 D3 D7
G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 NÃO Av 2 Av 3 Av 4
G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 NÃO Av 2 Av 3 Av 4
G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G4 Cont luz NÃO SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G5 Trat MB SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G6 Trat MB SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G8 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
5.7.3. PDI de CCO´s maturados
Este experimento foi realizado após a PDI dos CCO´s imaturos e a irradiação das
amostras foi feita um dia após a coleta, dia chamado de D0.
Posteriormente à classificação e avaliação morfológica em estereomicroscópio (Av
1), os grupos (G1 a G8) foram transferidos para uma placa de petri contendo gotas de 150 μl de
meio MIV e incubados em estufa de igual forma aos CCO´s imaturos. Após 22h de incubados,
dia chamado de D0, avaliou-se novamente todos os grupos (Av 2) e os grupos G3 a G8 (exceto
G1 e G2 - Cont estufa) foram levados em meio MIV t ao tratamento de PDI, desta vez por 30
min. A metodologia para a irradiação dos grupos foi a mesma realizada com os CCO´s
imaturos (G3 e G4 – Cont luz; G5 e G6 – Trat MB; G7 e G8 – Trat ZnTMPP).
Após as irradiações, os grupos tratados (G3 a G8) foram avaliados novamente (Av
3), lavados em dez gotas de meio LAV de bancada e posteriormente transferidos, juntamente
com os grupos G1 e G2, para gotas de 150 µl de meio de fecundação cobertas com óleo
mineral.
O sêmen, a metodologia de descongelamento, a avaliação do material e a
inseminação in vitro foram idênticos ao experimento anterior.
Os possíveis zigotos foram parcialmente desnudados, lavados e transferidos para
gotas de 200 μl de meio de cultivo sob óleo mineral por sete dias (D7) a 38,5 °C em atmosfera
de 5% de CO2 e umidade relativa saturada sem condensação. Durante os sete dias, no D3 foi
realizada mais uma avaliação em estereomicroscópio quanto à clivagem (Av 4 para os tratados
e Av 3 para não tratados), posteriormente procedeu-se com a suplementação do meio de cultivo
(feeding) e no D7 foram avaliados pela última vez quanto a taxa de mórula e blastocisto (Av 5
20
para tratados e Av 4 para não tratados). A demonstração dos grupos, os tratamentos e dias das
avaliações estão sintetizados no Quadro 2.
QUADRO 2 - Grupos de CCO´s maturados, tratamentos e dias de suas avaliações em
estereomicroscópio.
Grupo Denominação Tratamento
PS
Tratamento
Luz
DC
após
seleção
D0
antes
da
PDI
D0
após
a PDI
D3 D7
G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 Av 2 NÃO Av 3 Av 4
G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 Av 2 NÃO Av 3 Av 4
G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G4 Cont luz NÃO SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G5 Trat MB SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G6 Trat MB SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
G8 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 Av 2 Av 3 Av 4 Av 5
5.8. Análise estatística
Todos os ensaios foram realizados em duplicata. Nos testes realizados com as
bactérias, os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (SD) e para analisar a
diferença entre os tratamentos com as bactérias foi utilizada a Análise de variância (ANOVA),
seguido de teste de Tukey. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente
significativos. Os testes com os oócitos foram analisados de forma descritiva.
21
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Inativação fotodinâmica da Leptospira
Os tratamentos controle da cultura bacteriana, da luz e dos PSs, estão demonstrados
na Figura 7.
FIGURA 7 - Relação das DOs entre os tratamentos controle pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção da cultura de
Leptospira hardjo em estufa).
Legenda: Ct Cult – controle da cultura (sem PS, sem luz); Ct Luz –
controle da luz (sem PS, com luz); Ct ZnTMPP - controle do PS
ZnTMPP (com PS, sem luz); Ct TMPP - controle do PS TMPP
(com PS, sem luz); Ct HP - controle do PS HP (com PS, sem luz);
Ct ZnPc - controle do PS ZnPc (com PS, sem luz); Ct AlPc -
controle do PS AlPc (com PS, sem luz); Ct MB - controle do PS
MB (com PS, sem luz); Pré – DO avaliada no dia do tratamento,
após incubação de 1h da cultura em temperatura ambiente; Pós –
DO avaliada sete dias após a manutenção da cultura em estufa; * –
significativo; ns – não significativo.
Os controles da cultura (Apêndice A – Figura 1A) e da luz cresceram de forma
esperada. Além de atestar a viabilidade da cultura bacteriana, esses resultados indicam que a
irradiação na ausência do PS, não afetou o crescimento bacteriano. De igual forma, Wainwright
et al.86
verificaram que a aplicação isolada da luz não afetou o crescimento das amostras de
22
Staphylococcus aureus quando expostas à luz não coerente (Exal light Box), no comprimento
de onda entre 350 e 800 nm, taxa de fluência de 1,7 mW/cm2 por uma hora.
Não houve diferença significativa entre os controles tratados com PSs, exceto o
controle MB, após sete dias de incubação em estufa. Esse dado corrobora com vários
autores52,87-90
que afirmam ser necessária a absorção da luz pelo PS para que se iniciem as
reações fotoquímicas e fotofísicas para a produção de compostos fototóxicos. Contudo, ao
analisar o controle ZnTMPP pôde-se observar que houve uma diferença significativa de
crescimento bacteriano quando comparado ao crescimento do controle da luz. Apesar do
cuidado de se realizar toda esta etapa com a lâmpada do fluxo desligada e os eppendorfs terem
sido envolvidos por papel laminado, neste caso provavelmente pode ter havido entrada de luz
ao pipetar as soluções fazendo com que o PS ZnTMPP fosse ativado realizando a PDI em
algumas bactérias, que por sua vez, podem ter sofrido morte celular.
No gráfico observa-se também uma diferença significativa do controle MB frente
aos outros controles com PSs. Usacheva et al.91
constataram que a permanência do MB por
uma hora, nas concentrações de 4 e 200 µM, sem aplicação da luz, apresentou efeito
bactericida contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O mesmo efeito foi observado
nas concentrações de 44 a 230 µM. Isso se deve ao fato desse corante ser naturalmente
hidrofílico e poder passar através dos canais de proteína, que são preenchidos por água, da
membrana externa das bactérias. O baixo peso molecular, a carga positiva e a hidrofilia do MB
permitem a este penetrar com sucesso a membrana plasmática bacteriana.
Quando avaliada a ação dos PSs irradiados sobre as bactérias in vitro, podemos
observar que as bactérias do controle TMPP cresceram de forma esperada, ou seja, o PS não
apresentou nenhuma toxicidade no escuro (Figura 8).
23
FIGURA 8 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção da
cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS TMPP
irradiado por 30 min.
Legenda: Ct TMPP - controle do PS TMPP (com PS,
sem luz); TMPP – tratamento com TMPP (com PS,
com luz); Pré – DO avaliada no dia do tratamento,
após incubação de 1h da cultura em temperatura
ambiente; Pós – DO avaliada sete dias após a
manutenção da cultura em estufa; * – significativo.
Observa-se também que o tratamento com TMPP, na irradiação de 30 min, foi
eficaz na diminuição da carga microbiana. As meso-porfirinas tem se mostrado bastante
eficientes na PDI de vários patógenos e a TMPP é uma delas92,93
. Devido à substituição de
carbonos na posição meso, as meso-porfirinas passam a ter cargas e a ter um caráter mais
lipofílico, isto faz com que haja uma maior interação entre o PS e as membranas dos patógenos,
visto que são lipoproteicas, melhorando a eficácia da fotoinativação94,95
.
A TMPP tem carga positiva e os PSs catiônicos têm se mostrado mais eficientes no
controle de bactérias Gram-negativas devido à interação eletrostática que ocorre entre eles e os
grupos funcionais carregados negativamente, característicos dos fosfolipídeos presentes na
superfície celular96
. Essa interação foi também referida por Casteel et al.97
que avaliaram a
eficácia da TMPP, numa concentração de 0,01 µM e taxa de fluência de 2,2 mW/cm2 contra o
vírus da Hepatite A (RNA, fita simples, não envelopado). Os autores atribuíram o ótimo
24
resultado do tratamento à atração eletrostática entre as porfirinas catiônicas e os capsídeos
virais carregados negativamente.
O tratamento com ZnTMPP, na irradiação de 30 min, foi tão eficiente na
diminuição da carga microbiana que houve uma diferença significativa à de DO de entrada. A
alta intensidade da ação fotodinâmica pode ter levado à uma desagregação das moléculas da
bactéria, diminuindo a absorção da luz no comprimento de onda utilizado (Figura 9).
FIGURA 9 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção
da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
ZnTMPP irradiado por 30 min.
Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP
(com PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com
ZnTMPP (com PS, com luz); Pré – DO avaliada
no dia do tratamento, após incubação de 1h da
cultura em temperatura ambiente; Pós – DO
avaliada sete dias após a manutenção da cultura
em estufa; * – significativo.
Esse tratamento culminou na destruição de grande quantidade de bactérias,
observado em microscopia de campo escuro (Apêndice A – Figura 1B).
Pavani et al.98
constataram que as porfirinas metaladas apresentam melhores
resultados quando comparadas com as porfirinas de base livre, uma vez que o metal no anel
central da porfirina diminuiu a ligação com a mitocôndria celular e aumentou as interações com
a membrana. Em síntese, a metalização aumenta a eficiência fotodinâmica.
25
Nas amostras tratadas com a HP, podemos observar um aumento da DO do controle
e do tratado. Apesar de haver diferença significativa entre elas, os dados demonstram a
ineficiência do tratamento desse PS na cultura testada. Tal fato fora também observado em
microscopia de campo escuro (dados não demonstrados) (Figura 10).
FIGURA 10 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção
da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
HP irradiado por 30 min.
Legenda: Ct HP - controle do PS HP (com PS, sem
luz); HP – tratamento com HP (com PS, com luz);
Pré – DO avaliada no dia do tratamento, após
incubação de 1h da cultura em temperatura
ambiente; Pós – DO avaliada sete dias após a
manutenção da cultura em estufa; * – significativo.
A HP utilizada em nosso experimento foi um derivado da HP (HPD). Esse
composto é uma mistura e foi criada no intuito de se obter uma substância mais refinada, de
maneira a conseguir resultados mais reprodutíveis e confiáveis99
.
Eaglesome et al.100
, no intuito de obterem um PS que pudesse desinfectar sêmen
bovino, testaram o tratamento da HP e da HPD em algumas culturas de microrganismos, dentre
elas a de Leptospira pomona e de Leptospira hardjo. Ambas foram incubadas, separadamente,
com as culturas por 15 min e irradiadas posteriormente com luz de laser hélio/neon
(comprimento de onda 632,8 nm) com potência de 7,3 mW até atingir a taxa de fluência de
0,068 J/cm2. Os autores verificaram que tanto a HP quanto a HPD não foram eficazes de
26
eliminar estes microrganismos. Entretanto, neste mesmo estudo, tais porfirinas foram testadas
também em outros microrganismos como o BHV- 1, BVDV, M. bovigenitalium, M. canadense,
e U. diversum, porém em outras condições, e verificaram que esses compostos obtiveram
sucesso em reduzir os microrganismos a níveis não detectáveis.
Diferentes porfirinas têm diferentes propriedades fotossensibilizadoras. É de
considerável interesse separar os componentes da HPD para identificá-los quimicamente e
conhecer suas propriedades físicas, possibilitando assim a determinação de suas propriedades
individuais. Todavia, apesar de numerosos estudos no sentido de identificar todos os
componentes da mistura HPD, ainda há uma quantidade de impurezas, pequena em
porcentagem, mas não identificadas. Acredita-se que os componentes desta mistura ultrapassem
de 100 porfirinas.
Diante do exposto, a impureza do composto, a concentração de HP utilizada e o
tempo de irradiação, bem como a fonte de luz podem ter influenciado para o insucesso da
técnica, nestas condições. Mantareva et al.101
relataram que a dose de luz e concentração do PS
são essenciais na PDI, uma vez que foi observada variações entre diferentes microrganismos.
Em nosso estudo foi utilizada a concentração de 10 µM do PS e taxa de influência de 180
mW/cm2.
Em resumo, dentre as porfirinas irradiadas por 30 min, destacaram-se a TMPP e a
ZnTMPP na diminuição da carga microbiana (Figura 11). Apesar de ambas não terem
diferenças significativas em seus resultados, o tratamento com ZnTMPP obteve uma melhor
destruição celular (dados observados em microscopia de campo escuro, porém não
demonstrados). E o tratamento com a HP não foi eficiente na diminuição da carga microbiana.
27
FIGURA 11 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias
após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em
estufa) das porfirinas TMPP, ZnTMPP e HP
irradiadas por 30 min.
Legenda: TMPP – tratamento com TMPP (com PS,
com luz); ZnTMPP – tratamento com ZnTMPP (com
PS, com luz); HP – tratamento com HP (com PS, com
luz); Pós – DO avaliada sete dias após a manutenção
da cultura em estufa; * – significativo; ns – não
significativo.
Além das porfirinas, outro grupo de PSs foram também avaliados na irradiação de
30 min, os resultados dos testes com as ftalocianinas ZnPc e AlPc estão demonstrados na
Figura 12.
28
FIGURA 12 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do experimento) e pós (sete dias
após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em estufa) dos PSs ZnPc (em
A) e AlPc (em B) irradiados por 30 min.
Legenda: Ct ZnPc - controle do PS ZnPc (com PS, sem luz); ZnPc – tratamento
com ZnPc (com PS, com luz); Ct AlPc - controle do PS AlPc (com PS, sem luz);
AlPc – tratamento com AlPc (com PS, com luz); Pré – DO avaliada no dia do
tratamento, após incubação de 1h da cultura em temperatura ambiente; Pós – DO
avaliada sete dias após a manutenção da cultura em estufa; * – significativo; ns –
não significativo.
As bactérias dos controles das duas ftalocianinas cresceram de forma esperada. E
ao analisar os gráficos, observa-se que ambos os tratamentos não foram eficazes. As amostras
tratadas foram levadas à microscopia de campo escuro, onde pôde-se observar ainda uma alta
motilidade das bactérias no meio de cultura (dados não demonstrados).
A ZnPc e a AlPc utilizadas neste experimento foram as zinco-
tetracarboxiftalocianina (ZnTcPc) e alumínio-tetracarboxiftalocianina (AlTcPc). Ambas
possuem carga negativa, então uma hipótese seria a ineficiência da interação eletrostática que
ocorreria entre os PSs e os grupos funcionais também carregados negativamente presentes na
superfície celular de bactérias Gram-negativas96
.
As substâncias podem também ter sofrido agregação, uma vez que as ftalocianinas
são compostos sintéticos que podem se ligar a várias moléculas, inclusive aos metais zinco e
alumínio, e serem substituídas por diferentes componentes na periferia. A substituição
periférica do anel da ftalocianina (sulfonação) determina a solubilidade do corante, a
lipofílicidade, a quantidade de cargas periféricas, o tamanho da molécula e, por conseguinte, a
captação e a retenção celular79,80
. Em síntese, quanto maior o número de sulfonados, menor
será sua lipofilicidade, não permitindo uma penetração celular suficiente e consequentemente
um menor poder fotossensibilizador102
.
29
Ademais, a depender do pH do meio, alguns complexos de metalo-ftalocianinas,
podem sofrer agregação devido às interações entre os orbitais de moléculas adjacentes. As
agregações, por sua vez diminuem a quantidade de oxigênio singleto, um dos responsáveis pela
destruição celular103
. Souza et al.103
observaram que a ZnTcPc apresentou-se em estado
desagregado em pH 3 e 4, e agregado nos demais. Já a AlTcPc apresentou-se em estado
desagregado apenas em pH 14. Além disso, se mostrou insolúvel na faixa de pH de 3 a 5.
Alguns solventes são capazes de afetar o processo de agregação nesses complexos.
Solventes orgânicos, por exemplo, são responsáveis por reduzir o processo de agregação,
enquanto, solventes aquosos conduzem a complexos altamente agregados104,105
. O meio EMJH
possui pH final de 7,5 ± 0,2, podendo provavelmente favorecer a agregação desses corantes,
aumentando a ineficiência da PDI.
No intuito de garantir a destruição total das células bacterianas, foi testado o PS que
obteve a melhor eficiência, irradiado por um período mais longo. Neste caso a irradiação da
ZnTMPP foi avaliada por um período de 60 min (Figura 13), uma vez que no tratamento com
30 min algumas bactérias foram ainda visualizadas em microscopia de campo escuro com uma
baixa motilidade.
30
FIGURA 13 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção
da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
ZnTMPP irradiado por 60 min.
Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP
(com PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com
ZnTMPP (com PS, com luz); Pré – DO avaliada no
dia do tratamento, após incubação de 1h da cultura
em temperatura ambiente; Pós – DO avaliada sete
dias após a manutenção da cultura em estufa; * –
significativo.
Assim, como no teste com irradiação de 30 min, o tratamento com ZnTMPP
irradiado por 60 min, foi bastante eficiente na diminuição da carga microbiana havendo
também uma diferença significativa em relação a DO de entrada. O tratamento culminou na
destruição de grande quantidade de bactérias, da mesma forma de quando irradiado por 30 min,
não havendo portanto, diferença significativa nos resultados da ZnTMPP irradiada por 30 e 60
min. As bactérias do controle ZnTMPP, mais uma vez cresceram de forma esperada (Figura
14).
31
FIGURA 14 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção da
cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS ZnTMPP
irradiado por 30 e 60 min.
Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP (com
PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com ZnTMPP
(com PS, com luz); Pré – DO avaliada no dia do
tratamento, após incubação de 1h da cultura em
temperatura ambiente; Pós – DO avaliada sete dias após
a manutenção da cultura em estufa; ns – não
significativo.
Apesar de ter conseguido os parâmetros adequados utilizando com o PS ZnTMPP e
o tempo de 30 min para a fotoinativação da Leptospira interrogans sorovar hardjo, resolveu-se
avaliar também um sexto PS por 60 min de irradiação, o fenotiazínico MB. Isso porque, o PS
em questão possui uma acessibilidade maior e menor custo, quando comparado aos demais PSs
testados neste estudo (Figura 15).
32
FIGURA 15 - Relação das DOs entre os tratamentos pré (dia do
experimento) e pós (sete dias após a manutenção
da cultura de Leptospira hardjo em estufa) do PS
MB irradiado por 60 min.
Legenda: Ct MB - controle do PS MB (com PS,
sem luz); MB – tratamento com MB (com PS,
com luz); Pré – DO avaliada no dia do
tratamento, após incubação de 1h da cultura em
temperatura ambiente; Pós – DO avaliada sete
dias após a manutenção da cultura em estufa; * –
significativo; ns – não significativo.
Mesmo havendo uma diferença significativa do controle MB frente aos outros
controles com PSs (dados anteriormente demonstrados e discutidos – Figura 7), ainda pôde-se
observar um crescimento bacteriano. Apesar de não ter havido diferença significativa em
relação à DO de entrada controle pré, na amostra tratada com MB foi verificado um decréscimo
da carga bacteriana (dados observados também por microscopia de campo escuro - Apêndice A
– Figura 1C) em relação ao Ct MB Pós. A motilidade das bactérias foi comparada ao
tratamento pós da ZnTMPP.
O MB é um composto positivo. Por ser uma molécula catiônica, o MB pode ter se
ligado aos fosfolipídeos constituintes das paredes celulares. Os danos aumentam a
permeabilidade das membranas e facilita a penetração do PS para o interior das células
bacterianas ocasionando destruição do conteúdo interno106
. Quanto maior a habilidade do PS
difundir-se através da membrana, maior será o grau de destruição bacteriana.
A Figura 16 demonstra a eficiência dos tratamentos com a ZnTMPP e o MB, ambos
irradiados por 60 min.
33
FIGURA 16 - Relação das DOs entre os tratamentos pós (sete dias
após a manutenção da cultura de Leptospira hardjo em
estufa) da ZnTMPP e MB irradiadas por 60 min.
Legenda: Ct ZnTMPP - controle do PS ZnTMPP (com
PS, sem luz); ZnTMPP – tratamento com ZnTMPP
(com PS, com luz); Ct MB - controle do PS MB (com
PS, sem luz); MB – tratamento com MB (com PS,
com luz); Pré – DO avaliada no dia do tratamento,
após incubação de 1h da cultura em temperatura
ambiente; Pós – DO avaliada sete dias após a
manutenção da cultura em estufa; * – significativo; ns
– não significativo.
A DO de entrada dos controles de ambos PSs foram equivalentes. A carga
bacteriana dos controles de ambos cresceu de forma esperada após sete dias, todavia há
destaque de um menor crescimento do controle MB indicando seu efeito bactericida mesmo
sem a presença de luz91
. Apesar dos dois tratamentos terem sido eficientes, o tratamento com
ZnTMPP foi mais efetivo (dado comprovado em microscopia de campo escuro) (Apêndice A –
Figura 1).
6.2. Inativação Fotodinâmica de CCO´s imaturos
Denominamos CCO´s imaturos os CCO´s que não atingiram o estágio da metáfase
II. In vivo, a maturação meiótica do oócito ocorre próxima à ovulação, quando o folículo atinge
o seu diâmetro folicular máximo, mas in vitro a maturação meiótica inicia-se imediatamente
34
após a remoção do oócito do interior do folículo42
. Autores confirmam que a maioria dos
oócitos atingem a metáfase II, estágio da maturação nuclear, somente após 16-20 h de iniciado
a meiose107,108
. Cerca de 80 a 90% dos oócitos completam a maturação nuclear in vitro109
.
Neste estudo, a PDI das amostras dos grupos foi realizada seis horas após iniciada a aspiração
dos CCO´s.
Não houve diferenças morfológicas visualizadas em estereomicroscópio em
nenhum grupo tratado, quando comparados aos grupos controles. As figuras Av 1 a Av 5 de
cada grupo podem ser observadas no Apêndice B.
Considerando como parâmetros médios para PIVE o percentual de clivagem de 85
a 90% e percentual de produção de embriões de 32,9 a 41,2%4(dados de PIVE com sêmen
convencional e CCO’s provindos de Aspiração folicular guiada por ultrassom - OPU), os
percentuais de clivagem dos controles foram satisfatórios (80 a 100%) e o de produção de
embriões (20-33%) levemente abaixo do considerável médio para a técnica (Quadro 3).
35
QUADRO 3 - Grupos de CCO´s imaturos e os dias de suas avaliações em estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e
percentuais de clivagem e embriões por grupo.
% clivada – clivados/total incub.; % embriões – prod. embrião/total incub.
Grupo Denominação Trat.
PS
Trat.
Luz
DC
após
seleção
Total
selec.
DC
após
PDI
Total
incub.
D0 D3 Total
cliv.
%
cliv.
D7 Total
prod.
emb.
%
emb.
G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 15 NÃO 15 Av 2 Av 3 13 86% Av 4 5 33%
G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 15 NÃO 15 Av 2 Av 3 15 100% Av 4 5 33%
G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 15 Av 2 15 Av 3 Av 4 12 80% Av 5 3 20%
G4 Cont luz NÃO SIM Av 1 15 Av 2 15 Av 3 Av 4 14 93% Av 5 5 33%
G5 Trat MB SIM SIM Av 1 15 Av 2 14 Av 3 Av 4 12 85% Av 5 0 0%
G6 Trat MB SIM SIM Av 1 15 Av 2 13 Av 3 Av 4 9 69% Av 5 2 15%
G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 15 Av 2 15 Av 3 Av 4 10 66% Av 5 0 0%
G8 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 15 Av 2 14 Av 3 Av 4 10 71% Av 5 0 0%
36
Apesar de ter sido realizada a classificação dos CCO’s para posteriormente levá-los
ao cultivo in vitro, acredita-se que estas células possam ter vindo com qualidade intrínseca
inferior, culminando na baixa produção dos grupos controles.
Dentre as várias diferenças existentes entre os embriões produzidos in vitro e os
produzidos in vivo (em relação ao metabolismo, à morfologia, à densidade, ao número de
células e às características de ZP), a qualidade dos produzidos in vitro é inferior109
. Há uma
relação estrita entre a qualidade do embrião gerado e a qualidade do oócito que o produziu.
A qualidade da população de CCO’s é determinada pela técnica de coleta de
oócitos utilizada. No caso da OPU, a maioria dos CCO’s são provindos de folículos crescentes
e saudáveis110
, bem como de animais previamente selecionados com idades111,112
e escores
ideais109
. Todavia, os CCO’s aspirados de ovários provindos de abatedouro podem vir de todos
os estádios possíveis do folículo (em fase de dominância, em sua regressão, ou atrésica de
desenvolvimento), uma vez que as doadoras se encontram em diferentes escores, idades e
ciclos estrais110
.
Entretanto, ao comparar os percentuais de clivagem (66 a 85%) e de produção de
embriões dos grupos controles com os grupos tratados (0 a 15%), percebemos um considerável
decréscimo dos números destes últimos. Neste caso, além da qualidade inferior dos oócitos, a
baixa produção de embriões provavelmente baseia-se no déficit de maturação das células, uma
vez que está bem estabelecido que a taxa de produção de embriões se relaciona, além da
qualidade intrínseca do oócito, às condições de maturação113,114
.
A PDI pode ter ocasionado modificações (bioquímicas e microestruturais) de
grande parte das células do cumulus que envolvem os CCO´s, que por sua vez, são células
somáticas cuja participação é ativa no mecanismo de crescimento e maturação dos oócitos.
Apesar das células do cumulus não serem essenciais para a maturação nuclear dos oócitos, a
maturação citoplasmática é bastante comprometida na ausência desse tipo celular42
, que por sua
vez é de fundamental importância para o desenvolvimento embrionário115
.
Outro fator analisado foi o tempo de exposição das amostras à irradiação. Talvez
em irradiações mais curtas que 60min os percentuais de embriões tivessem sido melhores.
Os dados deste estudo comprovam que a PDI diminuiu a percentagem de estruturas
clivadas, bem como a percentagem de embriões viáveis nos grupos tratados com MB e
ZnTMPP. Apesar de não ter havido diferenças morfológicas em ambos os grupos tratados, o
MB e o ZnTMPP foram prejudiciais, nas condições experimentais utilizadas, para os CCO´s
imaturos.
37
6.3. Inativação Fotodinâmica de CCO´s maturados
Neste estudo, a PDI foi realizada quando os CCO´s já haviam atingido o estágio da
metáfase II.
Assim como no estudo anterior, não houve diferenças morfológicas visualizadas em
estereomicroscópio em nenhum grupo tratado, em relação aos grupos controles. As figuras Av
1 a Av 5 de cada grupo podem ser observadas no Apêndice C.
Pôde-se observar (Quadro 4), que todos os grupos, exceto o G5, tiveram bons
índices de clivagem (80 a 95%). Entretanto, todos os grupos tratados, inclusive o G5, obtiveram
percentuais de produção de embriões (36 a 61%) dentro dos parâmetros consideráveis médios
para a técnica.
38
QUADRO 4 - Grupos de CCO´s maturados e os dias de suas avaliações em estereomicroscópio (AV1 a AV5); totais selecionados e incubados; totais e
percentuais de clivagem e embriões por grupo.
Grupo Denominação Trat.
PS
Trat.
Luz
DC
após
seleção
Total
selec.
D0
antes
da
PDI
D0
após
a PDI
Total
incub.
D3 Total
cliv.
%
cliv.
D7 Total
prod.
emb.
%
emb.
G1 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 20 Av 2 NÃO 20 Av 3 19 95% Av 4 5 25%
G2 Cont estufa NÃO NÃO Av 1 20 Av 2 NÃO 19 Av 3 18 94% Av 4 6 31%
G3 Cont luz NÃO SIM Av 1 21 Av 2 Av 3 21 Av 4 19 90% Av 5 18 85%
G4 Cont luz NÃO SIM Av 1 22 Av 2 Av 3 22 Av 4 20 90% Av 5 10 45%
G5 Trat MB SIM SIM Av 1 20 Av 2 Av 3 19 Av 4 13 68% Av 5 7 36%
G6 Trat MB SIM SIM Av 1 22 Av 2 Av 3 21 Av 4 20 95% Av 5 13 61%
G7 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 22 Av 2 Av 3 22 Av 4 20 90% Av 5 10 45%
G8 Trat ZnTMPP SIM SIM Av 1 21 Av 2 Av 3 21 Av 4 17 80% Av 5 8 38%
% clivada – clivados/total incub.; % embriões – prod. embrião/total incub.
39
Os percentuais de produção de embriões do controle luz (45 a 85%) também estão
dentro dos parâmetros esperados indicando que a luz não interfere na qualidade e viabilidade
dos embriões.
Somente os grupos Controle estufa tiveram produção abaixo de 32,9%.
Provavelmente, pode ter havido um atraso da FIV nesses grupos, uma vez que ao aguardar a
irradiação dos outros grupos, para então se iniciar o procedimento, os grupos Controle estufa
foram deixados incubados por mais tempo aumentando, portanto, a duração da maturação.
Gasparrini et al.116
observaram que as taxas de clivagem e de blastocistos
diminuem linearmente com o aumento da duração da maturação in vitro, constatando que o
atraso da FIV tem significante comprometimento no desenvolvimento embrionário.
Os dados deste estudo, portanto, nos indicam que a PDI não afetou a percentagem
de estruturas clivadas, e nem mesmo a percentagem de embriões viáveis nos grupos tratados
com MB e ZnTMPP. Tanto o MB quanto o ZnTMPP não foram prejudiciais para CCO´s
maturados, nas condições experimentais. A irradiação por apenas 30 min também pode ter sido
relevante para o sucesso da técnica.
40
7. CONCLUSÃO
A inativação fotodinâmica da Leptospira interrogans sorovar hardjo se apresentou
eficiente para três dos seis fotossensibilizadores testados neste estudo: TMPP, ZnTMPP e MB,
e dentre eles, a porfirina metalada foi a que obteve melhores resultados.
Os tempos de irradiação de 30 min e de 60 min foram eficazes na inativação
fotodinâmica das leptospiras com ZnTMPP.
Apesar de não ter havido diferenças morfológicas nos CCO´s imaturos pós-
tratamento, os fotossensibilizadores MB e ZnTMPP foram prejudiciais para as estruturas
celulares diminuindo a produção de embriões.
Não houve diferenças morfológicas nos CCO´s maturados pós-tratamento. Tanto o
MB quanto o ZnTMPP não foram prejudiciais para as estruturas celulares evidenciada pela
produção de embriões esperada.
Acredita-se que a técnica poderá vir a ser um potencial método para o controle de
microrganismos em oócitos. Isso poderia evitar o uso de antibióticos na PIVE e
consequentemente a resistência microbiana.
41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Figueiredo JR. Bioética: repensando o uso das biotécnic. Ciência Veterinária nos
Trópicos. 11(1):116-18.
2. Reichenbach H, Moraes J, Neves J, Gonçalves P, Figueiredo J, Freitas V. Tecnologia do
Sêmen e Inseminação Artificial em Bovinos. In:. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução
Animal. 2 ed. São Paulo: Roca; 2008. p. 57-82.
3. Reichenbach H, Oliveira M, Lima P, Santos Filho A, Andrade J. Transferência e
criopreservação de embriões bovinos. In:. Biotécnicas aplicadas a reprodução animal. 2
ed. São Paulo: Roca; 2002. p. 127-78.
4. Viana J, Siqueira L, Palhao M, Camargo L. Features and perspectives of the Brazilian in
vitro embryo industry. Anim Reprod. 2012;9:12-18.
5. Magajevski FS. Leptospira spp. e Brucella spp. em fetos e oócitos colhidos de vacas no
momento do abate. Jaboticabal: Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias; 2007. Disponível em:
http://livros01.livrosgratis.com.br/cp035945.pdf.
6. Stringfellow DA, Lauerman LH, Nasti KB, Galik PK. Trypsin treatment of bovine
embryos after in vitro exposure to infectious bovine rhinotracheitis virus or bovine
herpesvirus-4. Theriogenology. 1990;33(1):331.
7. Bielanski AB, Surujballi O. Leptospira borgpetersenii serovar hardjo type hardjobovis
in bovine embryos fertilized in vitro. Canadian Journal of Veterinary Research.
1998;62(3):234-36.
8. Riet-Correa F, Schild AL, Lemos RAA, Borges JRJ. Doenças de Ruminantes e
Equídeos. 3 ed. Santa Maria: Pallotti; 2007. p. 331-42.
9. Colville JL, Berryhill DL. Handbook of Zoonoses: identification and prevention
Missouri: Mosby Elsevier; 2007. p. 103-07.
10. Radostits OM, Gay CC, Blood DC, Hinchcliff KW. Clínica Veterinária: Um Tratado de
Doenças dos Bovinos, Ovinos, Suínos, Caprinos e Eqüinos. 9 ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan; 2002. p. 1116-118.
11. de Campos Jr ACP, Freneau GE, Juliano RS, Acypreste CS, de Carvalho Dias Filho F,
Martins ME. Prevalência de anticorpos antileptospira em machos bovinos na
microrregião de Goiânia. Ciência Animal Brasileira. 2006;7(4):439-46.
12. Hanson LE. Leptospirosis in domestic animals: the public health perspective. J Am Vet
Med Assoc. 1982;181(12):1505-9. eng.
13. Thiermann AB. Leptospirosis: current developments and trends. J Am Vet Med Assoc.
1984;184(6):722-5.
42
14. Amatredjo A, Campbell RSF, Path MRC. Bovine leptospirosis. Veterinary Bulletin.
1975;45(12):875-91.
15. BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Centro Nacional de
Epidemiologia. Coordenação de controle de zoonoses e animais peçonhentos. Manual
de Leptospirose. 2. ed. Brasília, 1995. 98p.
16. Roberts S. A study of leptospirosis in large artificial insemination stud. The Cornell
veterinarian. 1958;48(4):363.
17. Sleight S, Williams J. Transmission of bovine leptospirosis by coition and artificial
insemination-A preliminary report. J Am Vet Med Assoc. 1961;138(3):151-&.
18. Perussi JR. Inativação fotodinâmica de microrganismos. Química Nova.
2007;30(4):988.
19. Almeida LM, Zanoelo FF, Castro KP, Borissevitch IE, Soares CM, Goncalves PJ. Cell
survival and altered gene expression following photodynamic inactivation of
Paracoccidioides brasiliensis. Photochem Photobiol. 2012;88(4):992-1000.
20. Hu Y, Huang X, Lu S, Hamblin MR, Mylonakis E, Zhang J, Xi L. Photodynamic
therapy combined with terbinafine against chromoblastomycosis and the effect of PDT
on Fonsecaea monophora in vitro. Mycopathologia. 2015;179(1-2):103-9.
21. Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy
of tumours. J Photochem Photobiol B. 1997;39(1):1-18.
22. Hillemanns P, Einstein MH, Iversen OE. Topical hexaminolevulinate photodynamic
therapy for the treatment of persistent human papilloma virus infections and cervical
intraepithelial neoplasia. Expert Opin Investig Drugs. 2015;24(2):273-81.
23. De Sordi L, Butt MA, Pye H, Kohoutova D, Mosse CA, Yahioglu G, Stamati I,
Deonarain M, Battah S, Ready D, Allan E, Mullany P, Lovat LB. Development of
Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for clostridium difficile. PLoS.
2015;10(8).
24. Senge MO. mTHPC--a drug on its way from second to third generation photosensitizer?
Photodiagnosis Photodyn Ther. 2012;9(2):170-9.
25. Junqueira MV, Borghi-Pangoni FB, Ferreira SB, Rabello BR, Hioka N, Bruschi ML.
Functional Polymeric Systems as Delivery Vehicles for Methylene Blue in
Photodynamic Therapy. Langmuir. 2016;32(1):19-27.
26. Vieira ML. Análise da expressão de proteínas de Leptospira interrogans virulentas e
avirulentas pela proteômica. [Dissertação]. São Paulo: Universidade de São Paulo,
Biotecnologia; 2008. [acesso 29-10-2015]. Disponível em:
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-03032009-182638/.
27. Brenner DJ, Kaufmann AF, Sulzer KR, Steigerwalt AG, Rogers FC, Weyant RS.
Further determination of DNA relatedness between serogroups and serovars in the
43
family Leptospiraceae with a proposal for Leptospira alexanderi sp. nov. and four new
Leptospira genomospecies. Int J Syst Bacteriol. 1999;49 Pt 2:839-58.
28. Levett PN, Morey RE, Galloway RL, Steigerwalt AG. Leptospira broomii sp. nov.,
isolated from humans with leptospirosis. Int J Syst Evol Microbiol. 2006;56(Pt 3):671-
3.
29. Perolat P, Chappel RJ, Adler B, Baranton G, Bulach DM, Billinghurst ML, Letocart M,
Merien F, Serrano MS. Leptospira fainei sp. nov., isolated from pigs in Australia. Int J
Syst Bacteriol. 1998;48 Pt 3:851-8.
30. Ko AI, Goarant C, Picardeau M. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for
an emerging zoonotic pathogen. Nat Rev Microbiol. 2009;7(10):736-47.
31. Siqueira GH. Envolvimento de proteínas de membrana de Leptospira interrogans nos
mecanismos de evasão e invasão do hospedeiro. [Tese]. São Paulo: USP; 2014.
32. Evangelista KV, Coburn J. Leptospira as an emerging pathogen: a review of its biology,
pathogenesis and host immune responses. Future Microbiol. 2010;5(9):1413-25.
33. Faine S. Leptospira and leptospirosis. Melbourne, Australia: MediSci, 1999. [acesso
Disponível em: http://books.google.com/books?id=MU1WAAAAYAAJ.
34. Haake DA. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 2000;146 ( Pt
7):1491-504.
35. Levett PN. Leptospirosis. Clin Microbiol Rev. 2001;14(2):296-326.
36. Holt SC. Anatomy and chemistry of spirochetes. Microbiol Rev. 1978;42(1):114-60.
37. Bharti AR, Nally JE, Ricaldi JN, Matthias MA, Diaz MM, Lovett MA, Levett PN,
Gilman RH, Willig MR, Gotuzzo E, Vinetz JM, Peru-United States Leptospirosis C.
Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lancet Infect Dis.
2003;3(12):757-71.
38. Nakamura S, Leshansky A, Magariyama Y, Namba K, Kudo S. Direct measurement of
helical cell motion of the spirochete leptospira. Biophys J. 2014;106(1):47-54.
39. Adler B, de la Peña Moctezuma A. Leptospira and leptospirosis. Vet Microbiol.
2010;140(3–4):287-96.
40. de la Pena-Moctezuma A, Bulach DM, Kalambaheti T, Adler B. Comparative analysis
of the LPS biosynthetic loci of the genetic subtypes of serovar Hardjo: Leptospira
interrogans subtype Hardjoprajitno and Leptospira borgpetersenii subtype Hardjobovis.
FEMS Microbiol Lett. 1999;177(2):319-26.
41. Ellis W, Thiermann A. Isolation of leptospires from the genital tracts of Iowa cows. Am
J Vet Res. 1986;47(8):1694-96.
44
42. Gonçalves PBD, de Figueiredo JR, de Figueiredo Freitas VJ. Biotécnicas aplicadas à
reprodução animal. Editora Roca; 2008. p.
43. Shisong C, Wrathall A. The importance of the zona pellucida for disease control in
livestock by embryo transfer. British Veterinary Journal. 1989;145(2):129-40.
44. Marques AE, Rocha WV, Brito WMEDde, Fiorava nti MCS, Parreira IM, VdeS. J.
Prevalência de anticorpos anti-leptospira spp. e aspectos epidemiológicos da infecção
em bovinos do estado de Goiás. Ciência Animal Brasileira. 2010;11(3):607-17.
45. da Silva ER, dos Santos EP, Ricci-Júnior E. Terapia fotodinâmica no tratamento do
câncer de pele: conceitos, utilizações e limitações. Rev Bras Farm. 2009;90(3):211-17.
46. Oniszczuk A, Wojtunik-Kulesza KA, Oniszczuk T, Kasprzak K. The potential of
photodynamic therapy (PDT)—Experimental investigations and clinical use.
Biomedicine & Pharmacotherapy. 2016;83:912-29.
47. Issa MCA, Manela-Azulay M. Terapia fotodinâmica: revisão da literatura e
documentação iconográfica. Anais Brasileiros de Dermatologia. 2010;85(4):501-11.
48. Policard A. Etude sur les aspects offerts par des tumeurs experimentales examinees a la
lumiere de Wood. CR Soc Biol. 1924;91(1423):4.
49. Lipson RL, Baldes EJ, Gray MJ. Hematoporphyrin derivative for detection and
management of cancer. Cancer. 1967;20(12):2255-57.
50. Valeur B. Principles of Steady‐State and Time‐Resolved Fluorometric Techniques.
Molecular Fluorescence: Principles and Applications. 2001:155-99.
51. Macdonald IJ, Dougherty TJ. Basic principles of photodynamic therapy. Journal of
Porphyrins and Phthalocyanines. 2001;5(02):105-29.
52. Dougherty TJ, Kaufman JE, Goldfarb A, Weishaupt KR, Boyle D, Mittleman A.
Photoradiation therapy for the treatment of malignant tumors. Cancer Res.
1978;38(8):2628-35.
53. Weishaupt KR, Gomer CJ, Dougherty TJ. Identification of singlet oxygen as the
cytotoxic agent in photo-inactivation of a murine tumor. Cancer Res. 1976;36(7 Part
1):2326-29.
54. Castano AP, Demidova TN, Hamblin MR. Mechanisms in photodynamic therapy: part
one—photosensitizers, photochemistry and cellular localization. Photodiagnosis
Photodyn Ther. 2004;1(4):279-93.
55. Fickweiler S, Abels C, Karrer S, Bäumler W, Landthaler M, Hofstädter F, Szeimies R-
M. Photosensitization of human skin cell lines by ATMPn (9-acetoxy-2, 7, 12, 17-
tetrakis-(β-methoxyethyl)-porphycene) in vitro: mechanism of action. Journal of
Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1999;48(1):27-35.
45
56. Kallaway C, Almond LM, Barr H, Wood J, Hutchings J, Kendall C, Stone N. Advances
in the clinical application of Raman spectroscopy for cancer diagnostics.
Photodiagnosis Photodyn Ther. 2013;10(3):207-19.
57. Guyon L, Ascencio M, Collinet P, Mordon S. Photodiagnosis and photodynamic
therapy of peritoneal metastasis of ovarian cancer. Photodiagnosis Photodyn Ther.
2012;9(1):16-31.
58. Inoue Y, Tanaka R, Komeda K, Hirokawa F, Hayashi M, Uchiyama K. Fluorescence
detection of malignant liver tumors using 5-aminolevulinic acid-mediated
photodynamic diagnosis: principles, technique, and clinical experience. World journal
of surgery. 2014;38(7):1786-94.
59. Nelson DL, Lehninger AL, Cox MM. Lehninger principles of biochemistry. Macmillan;
2008. p.
60. Lackowicz JR. Principles of fluorescence spectroscopy. Plenum Press,(New York,
1983) Chapter. 1983;5:111-50.
61. Frackowiak D. The jablonski diagram. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. 1988;2(3):399.
62. Ferguson J. Photosensitivity due to drugs. Photodermatol Photoimmunol Photomed.
2002;18(5):262-69.
63. Konan YN, Gurny R, Allémann E. State of the art in the delivery of photosensitizers for
photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology.
2002;66(2):89-106.
64. Castano AP, Demidova TN, Hamblin MR. Mechanisms in photodynamic therapy: part
three—photosensitizer pharmacokinetics, biodistribution, tumor localization and modes
of tumor destruction. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2005;2(2):91-106.
65. Tetard M-C, Vermandel M, Mordon S, Lejeune J-P, Reyns N. Experimental use of
photodynamic therapy in high grade gliomas: a review focused on 5-aminolevulinic
acid. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2014;11(3):319-30.
66. Hönigsmann H. History of phototherapy in dermatology. Photochemical &
photobiological sciences. 2013;12(1):16-21.
67. Calin MA, Parasca S. Light sources for photodynamic inactivation of bacteria. Lasers
Med Sci. 2009;24(3):453-60.
68. Schmidt MH, Bajic DM, Reichert KW, Martin TS, Meyer GA, Whelan HT. Light-
emitting diodes as a light source for intraoperative photodynamic therapy.
Neurosurgery. 1996;38(3):552-57.
69. Huang Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in cancer
research & treatment. 2005;4(3):283-93.
46
70. Soler AM, Angell-Petersen E, Warloe T, Tausjø J, Steen HB, Moan J, Giercksky K-E.
Photodynamic therapy of superficial basal cell carcinoma with 5-aminolevulinic acid
with dimethylsulfoxide and ethylendiaminetetraacetic acid: a comparison of two light
sources. Photochem Photobiol. 2000;71(6):724-29.
71. Plaetzer K, Krammer B, Berlanda J, Berr F, Kiesslich T. Photophysics and
photochemistry of photodynamic therapy: fundamental aspects. Lasers Med Sci.
2009;24(2):259-68.
72. Agostinis P, Berg K, Cengel KA, Foster TH, Girotti AW, Gollnick SO, Hahn SM,
Hamblin MR, Juzeniene A, Kessel D. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA:
a cancer journal for clinicians. 2011;61(4):250-81.
73. Juzeniene A, Nielsen KP, Moan J. Biophysical aspects of photodynamic therapy.
Journal of environmental pathology, toxicology and oncology. 2006;25(1-2).
74. Allison R, Mota H, Bagnato VS, Sibata C. Bio-nanotechnology and photodynamic
therapy—state of the art review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2008;5(1):19-28.
75. Orth K, Beck G, Genze F, Rück A. Methylene blue mediated photodynamic therapy in
experimental colorectal tumors in mice. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. 2000;57(2):186-92.
76. Milgrom LR. The colours of life: an introduction to the chemistry of porphyrins and
related compounds. 1997.
77. O’Connor AE, Gallagher WM, Byrne AT. Porphyrin and nonporphyrin photosensitizers
in oncology: preclinical and clinical advances in photodynamic therapy. Photochem
Photobiol. 2009;85(5):1053-74.
78. Bose B, Dube A. Photodynamic efficacy of chlorin p6: A pH dependent study in
aqueous and lipid environment. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. 2008;93(1):32-35.
79. Spikes JD. Phthalocyanines as photosensitizers in biological systems and for the
photodynamic therapy of tumors. Photochem Photobiol. 1986;43(6):691-99.
80. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers. Photochem Photobiol.
1991;53(6):859-70.
81. Carvalho V, Melo C, Bagnato V, Perussi J. Comparison of the effects of cationic and
anionic porphyrins in tumor cells under illumination of argon ion laser. LASER
PHYSICS-LAWRENCE-. 2002;12(10):1314-19.
82. Jiang Z, Shao J, Yang T, Wang J, Jia L. Pharmaceutical development, composition and
quantitative analysis of phthalocyanine as the photosensitizer for cancer photodynamic
therapy. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 2014;87:98-104.
83. Holm P, Booth PJ, Schmidt MH, Greve T, Callesen H. High bovine blastocyst
development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented
47
with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins. Theriogenology.
1999;52(4):683-700.
84. Stojkovic M, Machado SA, Stojkovic P, Zakhartchenko V, Hutzler P, Gonçalves PB,
Wolf E. Mitochondrial Distribution and Adenosine Triphosphate Content of Bovine
Oocytes Before and After In Vitro Maturation: Correlation with Morphological Criteria
and Developmental Capacity After In Vitro Fertilization and Culture 1. Biol Reprod.
2001;64(3):904-09.
85. Parrish J, Krogenaes A, Susko-Parrish J. Effect of bovine sperm separation by either
swim-up or Percoll method on success of in vitro fertilization and early embryonic
development. Theriogenology. 1995;44(6):859-69.
86. Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of
antimicrobial chemotherapy. 1998;42(1):13-28.
87. Girotti AW. New trends in photobiology: Photosensitized oxidation of cholesterol in
biological systems: Reaction pathways, cytotoxic effects and defense mechanisms.
Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1992;13(2):105-18.
88. Nonell S, Redmond R. On the determination of quantum yields for singlet molecular
oxygen photosensitization. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology.
1994;22(2):171-72.
89. Girotti AW. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. Photochem
Photobiol. 1990;51(4):497-509.
90. Reddi E, Jori G. Steady-state and time-resolved spectroscopic studies of photodynamic
sensitizers: porphyrins and phthalocyanines. Reviews of chemical intermediates.
1988;10(3):241-68.
91. Usacheva MN, Teichert MC, Biel MA. Comparison of the methylene blue and toluidine
blue photobactericidal efficacy against gram‐positive and gram‐negative
microorganisms. Lasers in surgery and medicine. 2001;29(2):165-73.
92. Quiroga ED, Alvarez MG, Durantini EN. Susceptibility of Candida albicans to
photodynamic action of 5, 10, 15, 20-tetra (4-N-methylpyridyl) porphyrin in different
media. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2010;60(2):123-31.
93. Feese E, Ghiladi RA. Highly efficient in vitro photodynamic inactivation of
Mycobacterium smegmatis. Journal of antimicrobial chemotherapy. 2009;64(4):782-85.
94. Alves E, Costa L, Carvalho CM, Tomé JP, Faustino MA, Neves MG, Tomé AC,
Cavaleiro JA, Cunha Â, Almeida A. Charge effect on the photoinactivation of Gram-
negative and Gram-positive bacteria by cationic meso-substituted porphyrins. BMC
Microbiol. 2009;9(1):70.
95. Trannoy L, Roelen D, Koekkoek K, Brand A. Impact of Photodynamic Treatment with
Meso‐substituted Porphyrin on the Immunomodulatory Capacity of White Blood
Cell‐containing Red Blood Cell Products. Photochem Photobiol. 2010;86(1):223-30.
48
96. Ragàs X, Agut M, Nonell S. Singlet oxygen in Escherichia coli: new insights for
antimicrobial photodynamic therapy. Free Radical Biology and Medicine.
2010;49(5):770-76.
97. Casteel MJ, Jayaraj K, Gold A, Ball LM, Sobsey MD. Photoinactivation of hepatitis A
virus by synthetic porphyrins. Photochem Photobiol. 2004;80(2):294-300.
98. Pavani C, Uchoa AF, Oliveira CS, Iamamoto Y, Baptista MS. Effect of zinc insertion
and hydrophobicity on the membrane interactions and PDT activity of porphyrin
photosensitizers. Photochemical & photobiological sciences. 2009;8(2):233-40.
99. Lipson RL, EJ B. The photodynamic properties of a particular hematoporphyrin
derivative. Arch Dermatol. 1960;82(4):508-16.
100. Eaglesome M, Bielanski A, Hare W, Ruhnke H. Studies on inactivation of pathogenic
microorganisms in culture media and in bovine semen by photosensitive agents. Vet
Microbiol. 1994;38(3):277-84.
101. Mantareva V, Kussovski V, Angelov I, Borisova E, Avramov L, Schnurpfeil G, Wöhrle
D. Photodynamic activity of water-soluble phthalocyanine zinc (II) complexes against
pathogenic microorganisms. Bioorg Med Chem. 2007;15(14):4829-35.
102. Ben-Hur E, Hoeben R, Van Ormondt H, Dubbelman T, Van Steveninck J.
Photodynamic inactivation of retroviruses by phthalocyanines: the effects of
sulphonation, metal ligand and fluoride. Journal of Photochemistry and Photobiology B:
Biology. 1992;13(2):145-52.
103. Souza TFM, Ramos AA, AO R. Agregação de derivados de ftalocianina em função do
pH e N-metil-glucamina. 34a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química; 2001:
104. Maree SE, Nyokong T. Syntheses and photochemical properties of octasubstituted
phthalocyaninato zinc complexes. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines.
2001;5(11):782-92.
105. Somashekarappa M, Keshavayya J. Synthesis and Spectroscopic Investigation of
Tetranitro-, Tetraamino-, Tetrahydroxy-, and Tetracyanophthalocyanineiron (III)
Chloride. Synthesis and Reactivity in Inorganic and Metal-Organic Chemistry.
2001;31(5):811-27.
106. Spesia MB, Durantini EN. Photodynamic inactivation mechanism of Streptococcus
mitis sensitized by zinc (II) 2, 9, 16, 23-tetrakis [2-(N, N, N-trimethylamino) ethoxy]
phthalocyanine. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology.
2013;125:179-87.
107. Lequarre A-S, Vigneron C, Ribaucour F, Holm P, Donnay I, Dalbiès-Tran R, Callesen
H, Mermillod P. Influence of antral follicle size on oocyte characteristics and embryo
development in the bovine. Theriogenology. 2005;63(3):841-59.
49
108. Agung B, Wongsrikeao P, Murakami M, Watari H, Otoi T. 275 the effects of
maturation culture period on the sex ratio of bovine ivf embryos. Reproduction, Fertility
and Development. 2004;17(2):287-88.
109. Palhano H, Jesus V, Trés J, Jacob J, Alves P. Reprodução em Bovinos: Fisiopatologia,
terapêutica, manejo e biotecnologia. São Paulo: Schering-plough. 2003.
110. Merton J, de Roos A, Koenen E, Roelen B, Vos P, Mullaart E, Knijn H. Bovine
OPU‐Derived Oocytes can be Matured In Vitro for 16–28 h with Similar
Developmental Capacity. Reproduction in domestic animals. 2012;47(6):1037-42.
111. Snijders S, Dillon P, O'Callaghan D, Boland M. Effect of genetic merit, milk yield,
body condition and lactation number on in vitro oocyte development in dairy cows.
Theriogenology. 2000;53(4):981-89.
112. Armstrong D. Effects of maternal age on oocyte developmental competence.
Theriogenology. 2001;55(6):1303-22.
113. Merton J, De Roos A, Mullaart E, De Ruigh L, Kaal L, Vos P, Dieleman S. Factors
affecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies
in the cattle breeding industry. Theriogenology. 2003;59(2):651-74.
114. Lonergan P, Fair T, Corcoran D, Evans A. Effect of culture environment on gene
expression and developmental characteristics in IVF-derived embryos. Theriogenology.
2006;65(1):137-52.
115. Ferreira E, Vireque A, Adona P, Meirelles F, Ferriani R, Navarro P. Maturação
citoplasmática de oócitos bovinos: aquisição de competência para o desenvolvimento.
Rev Bras Reprod Anim. 2008;32:172-81.
116. Gasparrini B, De Rosa A, Attanasio L, Boccia L, Di Palo R, Campanile G, Zicarelli L.
Influence of the duration of in vitro maturation and gamete co-incubation on the
efficiency of in vitro embryo development in Italian Mediterranean buffalo (Bubalus
bubalis). Anim Reprod Sci. 2008;105(3–4):354-64.
APÊNDICE A - Teste com a Leptospira interrogans sorovar hardjo. Controle da cultura e Tratados com ZnTMPP e MB.
FIGURA 1 – Teste PDI em Leptospira interrogans sorovar hardjo. Resultados observados em microscopia de campo escuro após sete dias de incubação em
estufa. A) Controle da cultura sem PS e sem irradiação. 10x; B) Tratamento com ZnTMPP por 30 min. 20x; C) Tratamento com MB por 60 min.
20x.
APÊNDICE B - Grupos de CCO´s imaturos e suas avaliações em estereomicroscópio (AV1 a
AV5).
APÊNDICE C - Grupos de CCO´s maturados e suas avaliações em estereomicroscópio (AV1
a AV5).
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS/CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais/CEUA
Pró-Reitoria de Pesquisa e Inovação/PRPI-UFG, Caixa Postal: 131, Prédio da Reitoria, Piso 1, Campus Samambaia (Campus II) -
CEP:74001-970, Goiânia – Goiás, Fone: (55-62) 3521-1876.
Email: [email protected]
Goiânia, 19 de dezembro de 2016.
PARECER CONSUBSTANCIADO REFERENTE AO PROJETO DE PESQUISA DO
PROTOCOLO N. 086/2016
I - Finalidade do projeto de pesquisa: Mestrado
II - Identificação:
Data de apresentação a CEUA: 03/10/16
Título do projeto: Avaliação do efeito da inativação fotodinâmica sobre a Leptospira interrogans em
oócitos bovinos artificialmente infectados
Pesquisador Coordenador no SAP: Guilherme Rocha Lino de Souza
Pesquisador Responsável/ Unidade: Guilherme Rocha Lino de Souza/ Instituto de Ciências Biológicas
(ICB/UFG)
Pesquisadores Participantes: Denize Silva Brazil e Valéria de Sá Jayme
Médico Veterinário/CRMV: Denize Silva Brazil/4188
Unidade onde será realizado: Instituto de Ciências Biológicas (ICB/UFG)
III - Objetivos e justificativa do projeto:
Objetivos gerais Inativar pelo método da PDI a L. interrogans sorovar hardjo emoócitos bovinos infectados
artificialmente. Objetivos específicos 1. Testar diferentes classes de fotossensibilizadores para a inativação fotodinâmica da L. interrogans sorovar hardjo.
2. Avaliar diferentes tempos de irradiação na inativação fotodinâmica da Leptospira em uma concentração de 10 μM
de cada fotossensibilizador.
3. Realizar a infecção experimental de oócitos bovinos com diferentes concentrações de cultura bacteriana.
4. Realizar a inativação fotodinâmica com o fotossensibilizador e o tempo de escolha em oócitos artificialmente
infectados.
5. Avaliar a integridade dos oócitos pós-inativação fotodinâmica.
De acordo com os autores, entre as enfermidades da esfera reprodutiva, a leptospirose merece destaque. A doença
causa consideráveis perdas econômicas em decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade, repetições de cio,
nascimento de bezerros fracos ou prematuros, natimortos e queda da produção de leite nos bovinos. Além de assumir
um papel relevante na área da saúde animal, destaca-se também do ponto de vista da Saúde Pública, uma vez que se
trata de uma importante zoonose. A doença pode ser transmitida, dentre outros meios, por FIV quando transferidos
embriões infectados. Portanto a atenção ao sêmen e oócitos deve ser redobrada nesta técnica. Usualmente costuma-se
utilizar antibióticos de amplo espectro para eliminação de patógenos nestes materiais, contudo há uma preocupação
mundial quanto ao desenvolvimento da resistência aos antibióticos pelos microrganismos. Portanto, a PDI pode vir
como substituição ao uso de antibióticos por conseguir eliminar vários tipos de patógenos e por, seguramente, não
desenvolver nenhum tipo de resistência. Além disso, ao utilizar PSs de baixo custo a técnica torna-se totalmente
viável.
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS/CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais/CEUA
Pró-Reitoria de Pesquisa e Inovação/PRPI-UFG, Caixa Postal: 131, Prédio da Reitoria, Piso 1, Campus Samambaia (Campus II) -
CEP:74001-970, Goiânia – Goiás, Fone: (55-62) 3521-1876.
Email: [email protected]
IV - Sumário do projeto:
Discussão sobre a possibilidade de métodos alternativos e necessidade do número de animais:
Não se aplica.
Prevê Projeto Piloto: Não
Espécie animal utilizada/ número total de animais/ Número de animais por tratamento ou grupo
experimental:
Ovários de 50 fêmeas Bos tauros-indicus coletados em frigorífico.
Descrição do animal utilizado (Explicitar: espécie/ linhagem/ sexo (informar número por sexo)/
peso e/ou idade etc): ovários de 50 fêmeas Bostauros-indicus, pesando aproximadamente 350kg e com
idades entre 24 a 48 meses.
Fonte de obtenção do animal: Frigorífico JBS - Goiânia
Descrição das instalações utilizadas e número de animais/área/qualidade do ambiente (ar,
temperatura, umidade), alimentação/hidratação: Não se aplica.
Utilização de agente infeccioso/gravidade da infecção a ser observada e análise dos riscos aos
pesquisadores/alunos: Incubação de Leptospira Interrogans, sorovar: Hardjo, nas concentrações de 10,
10-2 e 10-4.
Procedimentos experimentais do projeto de pesquisa: Colheita dos ovários no frigorífico, aspiração
dos oócitos e manutenção in vitro, cultivo da L. interrogans, incubação do cultivo de L. interrogans com
os oócitos em diferentes concentrações, utilização dos fotossensibilizadores em diferentes tempos de
irradiação, avaliação da estrutura dos oócitos após inoculação e uso de fotossensibilizadores.
Métodos utilizados para minimizar o sofrimento e aumentar o bem-estar dos animais antes,
durante e após a pesquisa. Pontos Finais Humanitários: Não se aplica
Grau de invasividade: G1
Material utilizado em outros projetos: Não se aplica
Método de eutanásia: Não se aplica, visto que o material a ser utilizado será proveniente da rotina do
abate de bovinos em frigoríficos.
Destino do animal: Os ovários utilizados serão congelados e posteriormente incinerados por empresa
contratada para essa finalidade.
V – Comentários do relator frente às orientações da CEUA:
Quanto aos documentos exigidos pela CEUA/UFG:
O protocolo é composto pela Ficha de Protocolo do Projeto, Certidão de ata, Termo de responsabilidade
por todos os pesquisadores e CD com os itens do protocolo físico gravados em mídia digital.
Quanto aos cuidados e manejo dos animais e riscos aos pesquisadores:
Os animais doadores dos ovários são animais da linha de abate do Frigorífico JBS-Goiânia, que possui
profissionais capacitados na realização do manejo e cuidados dos animais.
Os pesquisadores utilizarão de equipamento de proteção individual quando da manipulação do agente
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E INOVAÇÃO
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS/CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais/CEUA
Pró-Reitoria de Pesquisa e Inovação/PRPI-UFG, Caixa Postal: 131, Prédio da Reitoria, Piso 1, Campus Samambaia (Campus II) -
CEP:74001-970, Goiânia – Goiás, Fone: (55-62) 3521-1876.
Email: [email protected]
infeccioso.
VI - Parecer da CEUA:
De acordo com a documentação apresentada à CEUA, consideramos o projeto APROVADO.
Informação aos pesquisadores:
Reiteramos a importância deste Parecer Consubstanciado, e lembramos que a pesquisadora responsável
deverá encaminhar à CEUA-PRPI-UFG o Relatório Final baseado na conclusão do estudo e na incidência de
publicações decorrentes deste, de acordo com o disposto na Lei nº. 11.794 de 08/10/2008, e Resolução
Normativa nº. 01, de 09/07/2010 do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal-CONCEA.
O prazo para entrega do Relatório é de até 30 dias após o encerramento da pesquisa, a qual está prevista para
finalizar suas ações até março de 2017.
VII - Data da reunião: 19/12/2016.
Dra. Marina Pacheco Miguel
Coordenadora da CEUA/PRPI/UFG