AVALIAÇÃO DE ARCABOUÇOS TRIDIMENSIONAIS DE...
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AVALIAÇÃO DE ARCABOUÇOS TRIDIMENSIONAIS DE ALGINATO, FIBROÍNA E HIDROXIAPATITA PARA REGENERAÇÃO TECIDUAL ÓSSEA.
G. C. Carvalho1, J. R. Lopes1 D. S. Tavares2, L. E. Almeida1 1Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais /Universidade Federal de Sergipe,
São Cristóvão (SE), Brasil 2Departamento de Educação em Saúde / Universidade Federal de Sergipe, Lagarto (SE), Brasil
Rua I, nº 12, Conj. Valadares Estância-SE 49200-000 E-mail: [email protected]
Resumo: Pesquisas recentes na bioengenharia permitem a produção de arcabouços tridimensionais biodegradáveis, para atuarem como suporte temporário na regeneração tecidual óssea. Cerâmicas bioativas como a hidroxiapatita (HA) e biopolímeros a exemplos do alginato de sódio (ALG) e da fibroína da seda (SF) presentes neste estudo têm sido amplamente utilizados na produção de compósitos para esta finalidade. Nessa perspectiva, este estudo propôs a síntese de arcabouços tridimensionais à base de alginato, fibroína e hidroxiapatita para aplicação na engenharia tecidual óssea. A hidroxiapatita foi sintetizada com sucesso através do método de precipitação por via úmida e a comparação do difratograma obtido com o padrão JCPDS confirmou a presença de fase única da HA. A mistura física da hidroxiapatita pura com os biopolímeros alginato de sódio e fibroína da seda, para produção dos arcabouços, foi dividida em quatro grupos distintos com diferentes proporções de cada material, mantendo a concentração total em massa dos componentes em 6%. Através da técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR- ATR), confirmaram-se os grupos funcionais relativos à hidroxiapatita, alginato e fibroína. Os arcabouços apresentaram morfologia superficial porosa, visualizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foi demonstrado por análises térmicas (TG e DSC) que os biopolímeros dos arcabouços não sofrem decomposição até 250ºC. Observou-se variação de perda de massa, porém os arcabouços se mantiveram estáveis após 21 dias de imersão em solução salina tamponada (PBS). Ensaios de citotoxicidade com células L929 revelaram que todos os arcabouços produzidos são biocompatíveis e não apresentam citotoxicidade considerável a estas células. Palavras-chave: Arcabouços tridimensionais, Biocompatibilidade, Biodegradabilidade, Regeneração óssea. 1. INTRODUÇÃO
Os defeitos ósseos ainda constituem um grande desafio para
bioengenharia tecidual, pois se estima que até o ano de 2020,
aproximadamente 6,6 milhões de cirurgias ósseas serão realizadas
anualmente. Porém, são crescentes as preocupações sobre as complicações
com autoenxerto e aloenxerto e suas limitações (1).
Nessa perspectiva, atuais avanços na bioengenharia permitem a
produção de arcabouços tridimensionais biodegradáveis, para atuarem como
suporte temporário na regeneração tecidual óssea. Cerâmicas bioativas e
biopolímeros têm sido amplamente desenvolvidos e analisados em compósitos
para esta finalidade (2). Em bioengenharia tecidual óssea (BTE), o arcabouço
utilizado como suporte temporário, tem que cumprir alguns requisitos básicos,
incluindo excelente biocompatibilidade, biodegradabilidade controlável,
propriedades de superfície necessárias como não citotoxicidade e
osteocondutividade (3).
A degradação, também desempenha papel importante na BTE, visto
que, os biomateriais devem degradar a uma taxa controlada para suportar a
formação do novo tecido. Faz-se necessário, portanto, a compreensão e
manipulação controlada das taxas de degradação do biomaterial utilizado (4).
Dessa forma, objetivou-se sintetizar arcabouços (scaffolds) tridimensionais
biodegradáveis a partir de polímeros naturais, como o alginato de sódio e a
fibroína da seda incorporados juntamente com a hidroxiapatita para aplicação
na engenharia tecidual óssea.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Síntese da Hidroxiapatita (HA)
A hidroxiapatita (HA) foi sintetizada por via úmida a partir das soluções
de hidróxido de cálcio (Dinâmica Química Contemporânea Ltda) e ácido
fosfórico (85% U.S.P. - N.F./F.C.C. – Synth).
As concentrações das soluções utilizadas foram ajustadas para
obtenção de uma HA com razão cálcio/fósforo de 1,67. Para garantir a
formação da HA como única fase precipitada do fosfato de cálcio, a solução de
ácido fosfórico foi misturada gota a gota à solução de hidróxido de cálcio sob
constante agitação em um balão de vidro a 60ºC. O pH do meio foi mantido em
torno de 10 com a adição de KOH. Após a adição do ácido, o meio reacional
ficou sob agitação por mais 24h. Em seguida, o pó obtido foi filtrado, lavado
várias vezes com água destilada até neutralizar o meio, seco em estufa a
100ºC. Depois, o produto obtido foi macerado e peneirada para obtenção do pó
com uma granulometria ≤ 100nm. O pó assim produzido foi caracterizado por
difração de raios X (DRX) utilizando um difratômetro modelo XRD-6000
(Shimadzu) com radiação monocromática CuK(λ = 1,5418 Å), operando com
uma voltagem de 40 kV de corrente de 30 mA. Os difratogramas foram obtidos
no modo step scan variando 2θ de 5º a 80º.
2.2 Produção dos Arcabouços
Os arcabouços foram produzidos a partir da mistura física da
hidroxiapatita sintetizada, do alginato de sódio de média viscosidade, obtido de
algas marrom Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich) e da fibroína da seda obtida
do Bombyx mori (Huzhou Xintiansi Bio-tech Co Ltd). Os arcabouços foram
divididos em quatro grupos distintos com diferentes proporções de cada
material conforme mostrado na tabela 1. A concentração total em massa das
soluções dos materiais utilizados foi mantida em 6%.
As proporções correspondentes a cada grupo foram colocadas em um
béquer contendo 100 mL de H2O e mantidas sob agitação por 1h para
homogeneização dos componentes. Em seguida foram colocados em moldes
cilíndricos, congelados em um ultra freezer a -80º C por 24h e liofilizadas. Após
a liofilização houve a necessidade de reticular os arcabouços numa solução
contendo 0,1 mol/L de CaCl2, lavou-se com água ultrapura, foram novamente
congelados por 24h e reliofilizados.
TABELA 1: Composição em massa dos arcabouços produzidos.
2.3 Caracterização dos Arcabouços Produzidos
A caracterização dos arcabouços foi realizada por espectroscopia no
Infravermelho com Transformada de Fourier usando o modo de refletância total
atenuada (FTIR-ATR) utilizando um espectrômetro modelo Varian 640-IR
AMOSTRA PROPORÇÃO EM MASSA
GRUPO I / CONTROLE 100% ALGINATO
GRUPO II 50% HA 25% ALG 25% SF
GRUPO III 25% HA 50% ALG 25% SF
GRUPO IV 30% HA 35% ALG 35% SF
operando em um intervalo de 2000 – 800 cm-1, com resolução de 4 cm-1. Por
microscopia eletrônica de varredura (MEV) JSM-6460LV (JEOL), operando de
5 KV a 15 KV para caracterização morfológica, topográfica e de microestrutura.
As propriedades térmicas dos arcabouços foram determinadas por análise
termogravimétricas (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC). A TG foi
realizada no equipamento modelo STA 449 F3 JUPITER (NETZSCH),
operando na faixa de 25°C a 1000°C com uma taxa de aquecimento de
10°C/min e a DSC no analisador modelo DSC 200 F3 (NETZSCH) operando
em uma faixa de temperatura de 0 a 250°C e taxa de aquecimento de
10°C/min. Testes de porosidade foram realizados em triplicata usando o
método de deslocamento de líquido (hexano) (5). Os arcabouços foram
imersos num volume conhecido (V1) de hexano em um cilindro graduado por 5
minutos. O total do hexano mais o material impregnado com esse líquido foram
chamados de V2. O material impregnado foi removido do cilindro e o volume
residual do hexano foi denominado V3. Assim, a percentagem de porosidade
das amostras foi calculada como:
P (%) = (V1 – V3) / (V2 – V3) x 100. (A)
V1 = volume inicial de hexano
V2 = volume do hexano mais o arcabouço
V3 = volume residual do hexano
2.4. Ensaios in vitro com os Arcabouços
Inicialmente os arcabouços foram esterilizados no laboratório de
Instrumentação Nuclear (LIN) da UFRJ por processo de irradiação gama
(cobalto 60) com dose de 25 KGy/min e tempo de irradiação de 718 min, de
acordo com (6).
O ensaio in vitro de degradação dos arcabouços foi realizada em um
meio de cultura DMEM com soro fetal bovino. Todas as amostras foram
imersas no meio e incubadas a 37ºC durante intervalos de 1, 7, 14 e 21 dias.
Os arcabouços foram pesados antes da imersão no meio e, após cada período,
foram lavados com água bidestilada, congelados, liofilizados e finalmente
repesados. A degradação foi calculada utilizando a seguinte fórmula: D% = (Pº -
Pf) / Pº x 100 (B) D% = percentagem de degradação
Pº = peso inicial
Pf = peso final
O ensaio de citotoxidade foi realizado seguindo os padrões (7) e (8),
para avaliação biológica de dispositivos médicos. Foram utilizadas células
fibroblásticas de rato (L929) cedidas pela Universidade Federal Fluminense
proveniente do Banco de Células do estado do Rio de Janeiro. Para o ensaio,
as células foram cultivadas com meio de cultura DMEM suplementado com
10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina e 1% de
estreptomicina (Sigma–Aldrich), mantidas a 37ºC em estufa com 5% de CO2. A
viabilidade celular foi obtida em triplicata pelo método colorimétrico do MTT - 3-
(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina. Antes do ensaio, o
biomaterial ficou imerso em 10mL de DMEM por 24h, distribuído em placa de
24 poços. Foram colocadas 5x105 células na superfície dos arcabouços e em
seguida foi adicionado 2000 µL do meio com soro. O controle negativo foi feito
com a mesma quantidade de células cultivadas diretamente na placa de
cultutra e o positivo foi feito utilizando o meio com 10% de DMSO. As placas
foram incubadas em estufa de CO2 por 24h. Após a incubação, o meio foi
descartado e, em cada poço da placa foi adicionado 800 µL de MTT e colocado
em estufa a 37ºC por 3h. Após a retirada dessa solução, foi adicionado 800 µL
de isopropanol ácido por 10 minutos. A absorbância foi lida em 570nm pelo
leitor de placa Elisa – Rayto RT-6500 (Microplate Reader).
2.5. Análise Estatística
Todos os resultados foram coletados a partir de testes em triplicata e
expressos como média ± desvio padrão calculados através do software Origin.
A significância estatística dos dados foi avaliada pela análise de variância
ANOVA (one-way) seguida do teste Tukey e os valores de
probabilidade p inferiores a 0,05 foram considerados significativos (ρ <0,05).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O difratograma do pó da hidroxiapatita sintetizada é mostrado na figura
1. Os picos principais do difratograma apresentado foram comparados ao
padrão (JCPDS card: 09-0432) e correspondem aos planos (002), (211), (112),
(300) em valores de 2θ igual a: 26,1º; 31,9º; 32,2º; 33,2º respectivamente.
Todos os picos foram indexados no sistema hexagonal sem presença de fases
secundárias tais como α-TCP e β-TCP demonstrando que a síntese foi bem-
sucedida através do método de precipitação por via úmida. Esse resultado foi
similar ao encontrado por (9) e essa metodologia de síntese da HA está bem
estabelecida na literatura.
Position [°2Theta]
10 20 30 40 50 60 70 80
Counts
0
100
400
HA.ASC
09-0432
Figura 1. Difratograma do pó da hidroxiapatita sintetizada e esquemas comparativos usando os padrões JCPDS.
Os espectros de FTIR-ATR obtidos dos arcabouços são apresentados
na Figura 2. Observa-se no espectro do arcabouço controle, a banda
característica em 1026 cm -1, associada a vibrações de deformação
assimétricas e simétricas de grupos carboxilatos do alginato. Nos demais
arcabouços, essas bandas podem ser causadas tanto por COO- do alginato
quanto pelo PO4 3- da hidroxiapatita. No grupo controle, observamos bandas de
absorção em 1416 cm-1 referente ao estiramento simétrico do alginato, nos
demais arcabouços, de acordo com (3), é devido a inserção da fibroína nesses
arcabouços a qual possui bandas a 1442 cm-1 associadas com as vibrações
na região da amida II o que também causou um leve deslocamento dessa
banda, ocasionado segundo esse mesmo autor, por ligações físicas tais como:
interações eletrostáticas entre os grupos amino e carboxílicos ou ligações de
hidrogênio. Em 1625 cm-1 observou-se no grupo controle banda de absorção
referente ao alongamento assimétrico do grupo carboxílico. Nos demais
arcabouços essa banda pode também ser atribuídas ao estiramento C=O da
amida I da fibroína da seda. A banda apresentada em 3326 cm-1 é referente à
vibração de alongamento do OH- do alginato de sódio. Esses dados
corroboram aos encontrados por (3).
4000 3600 3200 18001600 1400 1200 1000 800
Numero de Onda, cm-1
Grupo I
Grupo II
Grupo III
Grupo IV
% Tr
ansm
itânc
ia
Figura 2. Espectros de transmitância no infravermelho (FTIR-ATR), dos grupos de arcabouços produzidos e
reticulados.
A estrutura porosa dos arcabouços foi conseguida pelo método de
precipitação por via úmida, como também fazendo uso da técnica de
congelamento e liofilização em alto vácuo. Segundo (10), quanto maior o
número de interconexões melhor a permeabilidade do material o que facilitará a
vascularização, suas trocas gasosas e o transporte de nutrientes para as
células, aumentando assim à possibilidade de sucesso na regeneração
tecidual. Observou-se no grupo controle (a) uma porosidade de 98% exibida
em toda a superfície, apresentando uma morfologia ondulatória característica
dos géis de alginato, porém esse tipo de estrutura de acordo com relatos na
literatura pode favorecer a proliferação celular. No grupo II (b), evidenciamos
uma diminuição na porosidade (66,6%) que pode ser justificado devido esse
grupo conter um maior teor de hidroxiapatita. Segundo (11), o tamanho de
poros diminui com o aumento acima de 30% em peso de hidroxiapatita, e
eventualmente, ocorre aglomerações na estrutura de poros. No entanto no
grupo III (c) em que houve aumento no teor de alginato ocorreu uma elevação
na porosidade (85%), apresentando poros anisotrópicos, porém bem evidentes,
já no grupo IV (d), foi observado porosidade de 67%, devido a contribuição do
alginato e equilíbrio do teor de cada material respectivamente. De acordo com
(12), a porosidade afeta a capacidade de ligação e crescimento celular e,
portanto, influencia na eficácia da regeneração óssea.
Figura 3. Micrografias da área de superfície dos arcabouços reticulados: a) Grupo controle, b) Grupo II, c) Grupo III, d) Grupo IV.
Foram realizadas as curvas de TG/DTG dos arcabouços reticulados
mostrados na figura 4, as quais apresentaram a mesma tendência: o peso de
todas as amostras diminuiu gradualmente desde a temperatura ambiente até
100ºC que segundo (12), pode ser atribuído a evaporação da água e a
decomposição de oligossacarídeos. Na faixa entre 200 – 300ºC houve uma
diminuição acentuada do peso que podemos atribuir à decomposição dos
biopolímeros. Porém, notamos uma perda de massa no grupo controle a
700ºC, que segundo (13), o alginato de sódio quando reticulado com cálcio
apresenta decomposição em três estágios: o primeiro evento atribuído a
evaporação de água, o segundo devido à formação de carbonato de sódio e o
terceiro devido à carbonização das cadeias poliméricas. O restante do
biomaterial resistiu a temperaturas acima de 1000ºC. Esses resultados
a)
c) b) d)
mostram que os arcabouços produzidos estão termicamente de acordo com os
relatados na literatura.
0 200 400 600 800 1000-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
% Pe
so
Temperatura(°C)
Grupo II Grupo IIIGrupo IVControle
Figura 4. Análise termogravimétrica mostrando as curvas de perda de massa dos arcabouços.
As curvas de DSC (figura 9) nos forneceram um entendimento dos
possíveis eventos térmicos ocorridos. Observamos picos endotérmicos nas
amostras variando entre 90ºC a 120ºC, que se pode atribuir à saída de água
dos arcabouços que não foi totalmente removida, mesmo depois das amostras
terem sido secadas em estufa a vácuo a 60º C após liofilização.
O resultado observado por DSC está de acordo com os apresentados
por TG/DTG e corroboram com os encontrados por (14). A análise por DSC
também mostrou que todas as amostras não apresentaram transição térmica
até a temperatura de 250ºC, resultado considerado importante para um
biomaterial, pois demonstra que até essa faixa de temperatura não ocorre
decomposição, corroborando com os estudos relatados na literatura que
mostram a decomposição de biopolímeros entre 280º C e 300º C
aproximadamente.
0 50 100 150 200 250
Temperatura (°C)
Endo
/Exo
Grupo II Grupo III Grupo IV Controle
Figura 5. Termograma de DSC dos grupos de arcabouços produzidos e reticulados.
A variação de perda de massa dos arcabouços reticulados, imersos em
PBS é mostrada na figura 1. Como pode ser observada, a degradação ocorreu
lentamente em todos os compósitos, de forma que, após 21 dias observou–se
nos grupos controle e III, degradação de aproximadamente 38% e 37%
respectivamente, provavelmente devido esses arcabouços possuírem maior
teor de alginato. Já nos grupos II e IV, compósitos com maior teor de
hidroxiapatita a degradação não ultrapassou 33%. Segundo (15), a
hidroxiapatita dissolve lentamente in vitro devido sua forte interação com base
polimérica, o que pode ter contribuído nesses compósitos além da fibroína,
para uma menor percentagem na perda de massa. Portanto, pode-se concluir
que a taxa de degradação pode ser controlada ajustando o teor de HA na
matriz do polímero.
1 dias 7 dias 14dias 21 dias0
5
10
15
20
25
30
35
40
Perd
a de
mas
sa(%
)
Tempo (dias)
GrupoII GrupoIII GrupoIV Controle
Figura 6. Variação da perda de massa dos arcabouços em função do tempo de imersão na solução de PBS, durante 1,
7,14 e 21 dias.
Em bioengenharia tecidual óssea (BTE), o arcabouço utilizado como
suporte temporário, tem que cumprir alguns requisitos básicos, incluindo
excelente biocompatibilidade, propriedades de superfície necessárias como
não citotoxicidade e osteocondutividade (16).
O ensaio de citotoxicidade foi realizado com células fibroblásticas de rato
L929 através do método de MTT que é um método desenvolvido para avaliar
possíveis efeitos citotóxicos em células.
A viabilidade celular observada nas amostras após 24h de análise foi
comparada com o controle positivo e negativo para citotoxicidade. No controle
positivo notamos um decréscimo na absorbância o que caracteriza morte
celular, o que não foi evidenciado nos grupos em estudo, indicando, que não
há efeito citotóxico sobre a sobrevivência e adesão das células nos arcabouços
reticulados. Como observado, o resultado demonstra que não existe diferenças
estatísticas entre os grupos e o controle negativo. Dessa forma, os resultados
indicam que os materiais escolhidos neste estudo são biocompatíveis e podem
ser utilizados na regeneração tecidual óssea.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Controle -Controle+ Grupo IVGrupo IIIGrupo II
Abso
rbânc
ia(57
0nm)
Scaffolds
p< 0,05
Grupo I
∗
Figura 7. Ensaio de citotoxicidade dos grupos I, II, III e IV com células fibroblásticas de rato (L929), através do método
colorimétrico – MTT (*estatisticamente diferente, p<0,05).
4. CONCLUSÕES
• Foi observado nas análises de TG e DSC que os arcabouços produzidos
estão termicamente de acordo com os relatos da literatura e não
apresentaram transição térmica até a temperatura de 250ºC.
• Observou-se que os arcabouços porosos se mantiveram estáveis até 21
dias em meio de cultura;
• Os compostos sintetizados são biocompatíveis e não citotóxicos.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer a CAPES pelo incentivo e a
Universidade Federal de Sergipe.
REFERÊNCIAS
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SCAFFOLDS ASSESSMENT DIMENSIONAL ALGINATE, FIBROIN AND HYDROXYAPATITE FOR REGENERATION BONE TISSUE.
G. C. Carvalho1, J. R. Lopes1, D. S. Tavares1, L. E. Almeida1
1 Graduate Program in Materials Science and Engineering / Federal University of Sergipe (SE), Brazil
E-mail: [email protected] Abstract: Recent research in bioengineering allow the production of biodegradable three-dimensional scaffolds to act as temporary support in bone tissue regeneration. bioactive ceramics such as hydroxyapatite (HA) and biopolymers examples of sodium alginate (ALG), and silk fibroin (SF) used in this study have been widely used in the production of composites for this purpose. In this perspective, this study proposed the synthesis of three-dimensional scaffolds based on alginate, fibroin and hydroxyapatite for use in bone tissue engineering. The hydroxyapatite was successfully synthesized by a wet precipitation method and comparison of the diffractogram obtained with the standard JCPDS confirmed the presence of only the HA phase. The physical mixture of pure hydroxyapatite with sodium alginate biopolymers and silk fibroin, for the production of scaffolds was divided into four separate groups with different proportions of each material while keeping the total mass concentration of the components at 6%. Through Spectroscopy Infrared Fourier Transform Spectroscopy (ATR FTIR-) were confirmed functional groups on hydroxyapatite, fibroin and alginate. The scaffolds showed porous surface morphology, visualized by scanning electron microscopy (SEM). It was demonstrated by thermal analysis (TG and DSC) that biopolymers of the frameworks do not suffer decomposition to 250 ° C. Observed mass loss variation, but the scaffolds were stable after 21 days immersion in phosphate buffered saline (PBS). Cytotoxicity assays with L929 cells revealed that all of the frameworks are produced biocompatible and do not exhibit significant cytotoxicity to these cells. Keywords: three-dimensional Frameworks, Biocompatibility And Biodegradation, bone regeneration.