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AVALIAÇÃO DE ARCABOUÇOS TRIDIMENSIONAIS DE ALGINATO, FIBROÍNA E HIDROXIAPATITA PARA REGENERAÇÃO TECIDUAL ÓSSEA.

G. C. Carvalho1, J. R. Lopes1 D. S. Tavares2, L. E. Almeida1

1Programa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Materiais /Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão (SE), Brasil

2Departamento de Educação em Saúde / Universidade Federal de Sergipe, Lagarto (SE), Brasil Rua I, nº 12, Conj. Valadares Estância-SE 49200-000 E-mail: [email protected]

Resumo: Pesquisas recentes na bioengenharia permitem a produção de arcabouços tridimensionais biodegradáveis, para atuarem como suporte temporário na regeneração tecidual óssea. Cerâmicas bioativas como a hidroxiapatita (HA) e biopolímeros a exemplos do alginato de sódio (ALG) e da fibroína da seda (SF) presentes neste estudo têm sido amplamente utilizados na produção de compósitos para esta finalidade. Nessa perspectiva, este estudo propôs a síntese de arcabouços tridimensionais à base de alginato, fibroína e hidroxiapatita para aplicação na engenharia tecidual óssea. A hidroxiapatita foi sintetizada com sucesso através do método de precipitação por via úmida e a comparação do difratograma obtido com o padrão JCPDS confirmou a presença de fase única da HA. A mistura física da hidroxiapatita pura com os biopolímeros alginato de sódio e fibroína da seda, para produção dos arcabouços, foi dividida em quatro grupos distintos com diferentes proporções de cada material, mantendo a concentração total em massa dos componentes em 6%. Através da técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR- ATR), confirmaram-se os grupos funcionais relativos à hidroxiapatita, alginato e fibroína. Os arcabouços apresentaram morfologia superficial porosa, visualizados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foi demonstrado por análises térmicas (TG e DSC) que os biopolímeros dos arcabouços não sofrem decomposição até 250ºC. Observou-se variação de perda de massa, porém os arcabouços se mantiveram estáveis após 21 dias de imersão em solução salina tamponada (PBS). Ensaios de citotoxicidade com células L929 revelaram que todos os arcabouços produzidos são biocompatíveis e não apresentam citotoxicidade considerável a estas células.

Palavras-chave: Arcabouços tridimensionais, Biocompatibilidade, Biodegradabilidade, Regeneração óssea.

1. INTRODUÇÃO Os defeitos ósseos ainda constituem um grande desafio para

bioengenharia tecidual, pois se estima que até o ano de 2020,

aproximadamente 6,6 milhões de cirurgias ósseas serão realizadas

anualmente. Porém, são crescentes as preocupações sobre as complicações

com autoenxerto e aloenxerto e suas limitações (1).

Nessa perspectiva, atuais avanços na bioengenharia permitem a

produção de arcabouços tridimensionais biodegradáveis, para atuarem como

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO

24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR

624

suporte temporário na regeneração tecidual óssea. Cerâmicas bioativas e

biopolímeros têm sido amplamente desenvolvidos e analisados em compósitos

para esta finalidade (2). Em bioengenharia tecidual óssea (BTE), o arcabouço

utilizado como suporte temporário, tem que cumprir alguns requisitos básicos,

incluindo excelente biocompatibilidade, biodegradabilidade controlável,

propriedades de superfície necessárias como não citotoxicidade e

osteocondutividade (3).

A degradação, também desempenha papel importante na BTE, visto

que, os biomateriais devem degradar a uma taxa controlada para suportar a

formação do novo tecido. Faz-se necessário, portanto, a compreensão e

manipulação controlada das taxas de degradação do biomaterial utilizado (4).

Dessa forma, objetivou-se sintetizar arcabouços (scaffolds) tridimensionais

biodegradáveis a partir de polímeros naturais, como o alginato de sódio e a

fibroína da seda incorporados juntamente com a hidroxiapatita para aplicação

na engenharia tecidual óssea.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Síntese da Hidroxiapatita (HA)

A hidroxiapatita (HA) foi sintetizada por via úmida a partir das soluções

de hidróxido de cálcio (Dinâmica Química Contemporânea Ltda) e ácido

fosfórico (85% U.S.P. - N.F./F.C.C. – Synth).

As concentrações das soluções utilizadas foram ajustadas para

obtenção de uma HA com razão cálcio/fósforo de 1,67. Para garantir a

formação da HA como única fase precipitada do fosfato de cálcio, a solução de

ácido fosfórico foi misturada gota a gota à solução de hidróxido de cálcio sob

constante agitação em um balão de vidro a 60ºC. O pH do meio foi mantido em

torno de 10 com a adição de KOH. Após a adição do ácido, o meio reacional

ficou sob agitação por mais 24h. Em seguida, o pó obtido foi filtrado, lavado

várias vezes com água destilada até neutralizar o meio, seco em estufa a

100ºC. Depois, o produto obtido foi macerado e peneirada para obtenção do pó

com uma granulometria ≤ 100nm. O pó assim produzido foi caracterizado por

difração de raios X (DRX) utilizando um difratômetro modelo XRD-6000

(Shimadzu) com radiação monocromática CuK(λ = 1,5418 Å), operando com



625

uma voltagem de 40 kV de corrente de 30 mA. Os difratogramas foram obtidos

no modo step scan variando 2 de 5º a 80º.

2.2 Produção dos Arcabouços

Os arcabouços foram produzidos a partir da mistura física da

hidroxiapatita sintetizada, do alginato de sódio de média viscosidade, obtido de

algas marrom Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich) e da fibroína da seda obtida

do Bombyx mori (Huzhou Xintiansi Bio-tech Co Ltd). Os arcabouços foram

divididos em quatro grupos distintos com diferentes proporções de cada

material conforme mostrado na tabela 1. A concentração total em massa das

soluções dos materiais utilizados foi mantida em 6%.

As proporções correspondentes a cada grupo foram colocadas em um

béquer contendo 100 mL de H2O e mantidas sob agitação por 1h para

homogeneização dos componentes. Em seguida foram colocados em moldes

cilíndricos, congelados em um ultra freezer a -80º C por 24h e liofilizadas. Após

a liofilização houve a necessidade de reticular os arcabouços numa solução

contendo 0,1 mol/L de CaCl2, lavou-se com água ultrapura, foram novamente

congelados por 24h e reliofilizados.

TABELA 1: Composição em massa dos arcabouços produzidos.

2.3 Caracterização dos Arcabouços Produzidos

A caracterização dos arcabouços foi realizada por espectroscopia no

Infravermelho com Transformada de Fourier usando o modo de refletância total

atenuada (FTIR-ATR) utilizando um espectrômetro modelo Varian 640-IR

operando em um intervalo de 2000 – 800 cm-1, com resolução de 4 cm-1. Por

microscopia eletrônica de varredura (MEV) JSM-6460LV (JEOL), operando de

5 KV a 15 KV para caracterização morfológica, topográfica e de microestrutura.

AMOSTRA PROPORÇÃO EM MASSA

GRUPO I / CONTROLE 100% ALGINATO

GRUPO II 50% HA 25% ALG 25% SF

GRUPO III 25% HA 50% ALG 25% SF

GRUPO IV 30% HA 35% ALG 35% SF



626

As propriedades térmicas dos arcabouços foram determinadas por análise

termogravimétricas (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC). A TG foi

realizada no equipamento modelo STA 449 F3 JUPITER (NETZSCH),

operando na faixa de 25°C a 1000°C com uma taxa de aquecimento de

10°C/min e a DSC no analisador modelo DSC 200 F3 (NETZSCH) operando

em uma faixa de temperatura de 0 a 250°C e taxa de aquecimento de

10°C/min. Testes de porosidade foram realizados em triplicata usando o

método de deslocamento de líquido (hexano) (5). Os arcabouços foram

imersos num volume conhecido (V1) de hexano em um cilindro graduado por 5

minutos. O total do hexano mais o material impregnado com esse líquido foram

chamados de V2. O material impregnado foi removido do cilindro e o volume

residual do hexano foi denominado V3. Assim, a percentagem de porosidade

das amostras foi calculada como:

P (%) = (V1 – V3) / (V2 – V3) x 100. (A)

V1 = volume inicial de hexano

V2 = volume do hexano mais o arcabouço

V3 = volume residual do hexano

2.4. Ensaios in vitro com os Arcabouços

Inicialmente os arcabouços foram esterilizados no laboratório de

Instrumentação Nuclear (LIN) da UFRJ por processo de irradiação gama

(cobalto 60) com dose de 25 KGy/min e tempo de irradiação de 718 min, de

acordo com (6).

O ensaio in vitro de degradação dos arcabouços foi realizada em um

meio de cultura DMEM com soro fetal bovino. Todas as amostras foram

imersas no meio e incubadas a 37ºC durante intervalos de 1, 7, 14 e 21 dias.

Os arcabouços foram pesados antes da imersão no meio e, após cada período,

foram lavados com água bidestilada, congelados, liofilizados e finalmente

repesados. A degradação foi calculada utilizando a seguinte fórmula: D% = (Pº -

Pf) / Pº x 100 (B)

D% = percentagem de degradação

Pº = peso inicial

Pf = peso final



627

O ensaio de citotoxidade foi realizado seguindo os padrões (7) e (8),

para avaliação biológica de dispositivos médicos. Foram utilizadas células

fibroblásticas de rato (L929) cedidas pela Universidade Federal Fluminense

proveniente do Banco de Células do estado do Rio de Janeiro. Para o ensaio,

as células foram cultivadas com meio de cultura DMEM suplementado com

10% de soro fetal bovino, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina e 1% de

estreptomicina (Sigma–Aldrich), mantidas a 37ºC em estufa com 5% de CO2. A

viabilidade celular foi obtida em triplicata pelo método colorimétrico do MTT - 3-

(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina. Antes do ensaio, o

biomaterial ficou imerso em 10mL de DMEM por 24h, distribuído em placa de

24 poços. Foram colocadas 5x105 células na superfície dos arcabouços e em

seguida foi adicionado 2000 µL do meio com soro. O controle negativo foi feito

com a mesma quantidade de células cultivadas diretamente na placa de

cultutra e o positivo foi feito utilizando o meio com 10% de DMSO. As placas

foram incubadas em estufa de CO2 por 24h. Após a incubação, o meio foi

descartado e, em cada poço da placa foi adicionado 800 µL de MTT e colocado

em estufa a 37ºC por 3h. Após a retirada dessa solução, foi adicionado 800 µL

de isopropanol ácido por 10 minutos. A absorbância foi lida em 570nm pelo

leitor de placa Elisa – Rayto RT-6500 (Microplate Reader).

2.5. Análise Estatística

Todos os resultados foram coletados a partir de testes em triplicata e

expressos como média ± desvio padrão calculados através do software Origin.

A significância estatística dos dados foi avaliada pela análise de variância

ANOVA (one-way) seguida do teste Tukey e os valores de

probabilidade p inferiores a 0,05 foram considerados significativos (ρ <0,05).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O difratograma do pó da hidroxiapatita sintetizada é mostrado na figura

1. Os picos principais do difratograma apresentado foram comparados ao

padrão (JCPDS card: 09-0432) e correspondem aos planos (002), (211), (112),

(300) em valores de 2θ igual a: 26,1º; 31,9º; 32,2º; 33,2º respectivamente.



628

Todos os picos foram indexados no sistema hexagonal sem presença de fases

secundárias tais como α-TCP e β-TCP demonstrando que a síntese foi bem-

sucedida através do método de precipitação por via úmida. Esse resultado foi

similar ao encontrado por (9) e essa metodologia de síntese da HA está bem

estabelecida na literatura.

Position [°2Theta]

10 20 30 40 50 60 70 80

Counts

0

100

400

HA.ASC

Position [°2Theta]

10 20 30 40 50 60 70 80

Peak List

09-0432

Figura 1. Difratograma do pó da hidroxiapatita sintetizada e esquemas comparativos usando os padrões JCPDS.

Os espectros de FTIR-ATR obtidos dos arcabouços são apresentados

na Figura 2. Observa-se no espectro do arcabouço controle, a banda

característica em 1026 cm -1, associada a vibrações de deformação

assimétricas e simétricas de grupos carboxilatos do alginato. Nos demais

arcabouços, essas bandas podem ser causadas tanto por COO- do alginato

quanto pelo PO4 3- da hidroxiapatita. No grupo controle, observamos bandas de

absorção em 1416 cm-1 referente ao estiramento simétrico do alginato, nos

demais arcabouços, de acordo com (3), é devido a inserção da fibroína nesses

arcabouços a qual possui bandas a 1442 cm-1 associadas com as vibrações

na região da amida II o que também causou um leve deslocamento dessa

banda, ocasionado segundo esse mesmo autor, por ligações físicas tais como:

interações eletrostáticas entre os grupos amino e carboxílicos ou ligações de

hidrogênio. Em 1625 cm-1 observou-se no grupo controle banda de absorção

referente ao alongamento assimétrico do grupo carboxílico. Nos demais

arcabouços essa banda pode também ser atribuídas ao estiramento C=O da

amida I da fibroína da seda. A banda apresentada em 3326 cm-1 é referente à

vibração de alongamento do OH- do alginato de sódio. Esses dados

corroboram aos encontrados por (3).



629

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928493115000478#f0020

4000 3600 3200 1800 1600 1400 1200 1000 800

Numero de Onda, cm-1

Grupo I

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

% T

rans

mitâ

ncia

Figura 2. Espectros de transmitância no infravermelho (FTIR-ATR), dos grupos de arcabouços produzidos e

reticulados.

A estrutura porosa dos arcabouços foi conseguida pelo método de

precipitação por via úmida, como também fazendo uso da técnica de

congelamento e liofilização em alto vácuo. Segundo (10), quanto maior o

número de interconexões melhor a permeabilidade do material o que facilitará a

vascularização, suas trocas gasosas e o transporte de nutrientes para as

células, aumentando assim à possibilidade de sucesso na regeneração

tecidual. Observou-se no grupo controle (a) uma porosidade de 98% exibida

em toda a superfície, apresentando uma morfologia ondulatória característica

dos géis de alginato, porém esse tipo de estrutura de acordo com relatos na

literatura pode favorecer a proliferação celular. No grupo II (b), evidenciamos

uma diminuição na porosidade (66,6%) que pode ser justificado devido esse

grupo conter um maior teor de hidroxiapatita. Segundo (11), o tamanho de

poros diminui com o aumento acima de 30% em peso de hidroxiapatita, e

eventualmente, ocorre aglomerações na estrutura de poros. No entanto no

grupo III (c) em que houve aumento no teor de alginato ocorreu uma elevação

na porosidade (85%), apresentando poros anisotrópicos, porém bem evidentes,

já no grupo IV (d), foi observado porosidade de 67%, devido a contribuição do

alginato e equilíbrio do teor de cada material respectivamente. De acordo com

(12), a porosidade afeta a capacidade de ligação e crescimento celular e,

portanto, influencia na eficácia da regeneração óssea.



630

Figura 3. Micrografias da área de superfície dos arcabouços reticulados: a) Grupo controle, b) Grupo II, c) Grupo III, d) Grupo IV.

Foram realizadas as curvas de TG/DTG dos arcabouços reticulados

mostrados na figura 4, as quais apresentaram a mesma tendência: o peso de

todas as amostras diminuiu gradualmente desde a temperatura ambiente até

100ºC que segundo (12), pode ser atribuído a evaporação da água e a

decomposição de oligossacarídeos. Na faixa entre 200 – 300ºC houve uma

diminuição acentuada do peso que podemos atribuir à decomposição dos

biopolímeros. Porém, notamos uma perda de massa no grupo controle a

700ºC, que segundo (13), o alginato de sódio quando reticulado com cálcio

apresenta decomposição em três estágios: o primeiro evento atribuído a

evaporação de água, o segundo devido à formação de carbonato de sódio e o

terceiro devido à carbonização das cadeias poliméricas. O restante do

biomaterial resistiu a temperaturas acima de 1000ºC. Esses resultados

mostram que os arcabouços produzidos estão termicamente de acordo com os

relatados na literatura.

0 200 400 600 800 1000

-4,0

-3,5

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

% P

eso

Temperatura(°C)

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

Controle

Figura 4. Análise termogravimétrica mostrando as curvas de perda de massa dos arcabouços.

As curvas de DSC (figura 9) nos forneceram um entendimento dos

possíveis eventos térmicos ocorridos. Observamos picos endotérmicos nas

amostras variando entre 90ºC a 120ºC, que se pode atribuir à saída de água

a)

)

c) b) d)



631

dos arcabouços que não foi totalmente removida, mesmo depois das amostras

terem sido secadas em estufa a vácuo a 60º C após liofilização.

O resultado observado por DSC está de acordo com os apresentados

por TG/DTG e corroboram com os encontrados por (14). A análise por DSC

também mostrou que todas as amostras não apresentaram transição térmica

até a temperatura de 250ºC, resultado considerado importante para um

biomaterial, pois demonstra que até essa faixa de temperatura não ocorre

decomposição, corroborando com os estudos relatados na literatura que

mostram a decomposição de biopolímeros entre 280º C e 300º C

aproximadamente.

Figura 5. Termograma de DSC dos grupos de arcabouços produzidos e reticulados.

A variação de perda de massa dos arcabouços reticulados, imersos em

PBS é mostrada na figura 1. Como pode ser observada, a degradação ocorreu

lentamente em todos os compósitos, de forma que, após 21 dias observou–se

nos grupos controle e III, degradação de aproximadamente 38% e 37%

respectivamente, provavelmente devido esses arcabouços possuírem maior

teor de alginato. Já nos grupos II e IV, compósitos com maior teor de

hidroxiapatita a degradação não ultrapassou 33%. Segundo (15), a

hidroxiapatita dissolve lentamente in vitro devido sua forte interação com base

polimérica, o que pode ter contribuído nesses compósitos além da fibroína,

para uma menor percentagem na perda de massa. Portanto, pode-se concluir

que a taxa de degradação pode ser controlada ajustando o teor de HA na

matriz do polímero.

0 50 100 150 200 250

Temperatura (°C)

End

o/E

xo

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

Controle



632

1 dias 7 dias 14dias 21 dias

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Pe

rda

de

ma

ssa

(%)

Tempo (dias)

GrupoII

GrupoIII

GrupoIV

Controle

Figura 6. Variação da perda de massa dos arcabouços em função do tempo de imersão na solução de PBS, durante 1,

7,14 e 21 dias.

Em bioengenharia tecidual óssea (BTE), o arcabouço utilizado como

suporte temporário, tem que cumprir alguns requisitos básicos, incluindo

excelente biocompatibilidade, propriedades de superfície necessárias como

não citotoxicidade e osteocondutividade (16).

O ensaio de citotoxicidade foi realizado com células fibroblásticas de rato

L929 através do método de MTT que é um método desenvolvido para avaliar

possíveis efeitos citotóxicos em células.

A viabilidade celular observada nas amostras após 24h de análise foi

comparada com o controle positivo e negativo para citotoxicidade. No controle

positivo notamos um decréscimo na absorbância o que caracteriza morte

celular, o que não foi evidenciado nos grupos em estudo, indicando, que não

há efeito citotóxico sobre a sobrevivência e adesão das células nos arcabouços

reticulados. Como observado, o resultado demonstra que não existe diferenças

estatísticas entre os grupos e o controle negativo. Dessa forma, os resultados

indicam que os materiais escolhidos neste estudo são biocompatíveis e podem

ser utilizados na regeneração tecidual óssea.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Controle -Controle+ Grupo IVGrupo IIIGrupo II

Abs

orbâ

ncia

(570

nm)

Scaffolds

p 0,05

Grupo I



633

Figura 7. Ensaio de citotoxicidade dos grupos I, II, III e IV com células fibroblásticas de rato (L929), através do método

colorimétrico – MTT (*estatisticamente diferente, p<0,05).

4. CONCLUSÕES

Foi observado nas análises de TG e DSC que os arcabouços produzidos

estão termicamente de acordo com os relatos da literatura e não

apresentaram transição térmica até a temperatura de 250ºC.

Observou-se que os arcabouços porosos se mantiveram estáveis até 21

dias em meio de cultura;

Os compostos sintetizados são biocompatíveis e não citotóxicos.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer a CAPES pelo incentivo e a

Universidade Federal de Sergipe.

REFERÊNCIAS

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SCAFFOLDS ASSESSMENT DIMENSIONAL ALGINATE, FIBROIN AND HYDROXYAPATITE FOR REGENERATION BONE TISSUE.

G. C. Carvalho1, J. R. Lopes1, D. S. Tavares1, L. E. Almeida1

1 Graduate Program in Materials Science and Engineering / Federal University of Sergipe (SE), Brazil

E-mail: [email protected]

Abstract: Recent research in bioengineering allow the production of biodegradable three-dimensional scaffolds to act as temporary support in bone tissue regeneration. bioactive ceramics such as hydroxyapatite (HA) and biopolymers examples of sodium alginate (ALG), and silk fibroin (SF) used in this study have been widely used in the production of composites for this purpose. In this perspective, this study proposed the synthesis of three-dimensional scaffolds based on alginate, fibroin and hydroxyapatite for use in bone tissue engineering. The hydroxyapatite was successfully synthesized by a wet precipitation method and comparison of the diffractogram obtained with the standard JCPDS confirmed the presence of only the HA phase. The physical mixture of pure hydroxyapatite with sodium alginate biopolymers and silk fibroin, for the production of scaffolds was divided into four separate groups with different proportions of each material while keeping the total mass concentration of the components at 6%. Through Spectroscopy Infrared Fourier Transform Spectroscopy (ATR FTIR-) were confirmed functional groups on hydroxyapatite, fibroin and alginate. The scaffolds showed porous surface morphology, visualized by scanning electron microscopy (SEM). It was demonstrated by thermal analysis (TG and DSC) that biopolymers of the frameworks do not suffer decomposition to 250 ° C. Observed mass loss variation, but the scaffolds were stable after 21 days immersion in phosphate buffered saline (PBS). Cytotoxicity assays with L929 cells revealed that all of the frameworks are produced biocompatible and do not exhibit significant cytotoxicity to these cells. Keywords: three-dimensional Frameworks, Biocompatibility And Biodegradation, bone regeneration.



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http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961211003966

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961211003966

AVALIAÇÃO DE ARCABOUÇOS TRIDIMENSIONAIS DE … · de hidróxido de cálcio (Dinâmica Química...

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