Aula Pirogenio 2015-2 FINAL

7/26/2019 Aula Pirogenio 2015-2 FINAL

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Controle Biolgico e Microbiolgico de Qualidadede Medicamentos

ProfaGiselle Fazzioni Passos

Ensaios de pirognio in vivo e in vitro


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Substncias que induzem febre so chamadas pirognios. A

palavra pirognio relacionada palavra gregapyro, que

significa ardente ou fogo, uma descrio adequada parasubstncias que produzem elevao da temperatura do

corpo.

Pirognios


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Os pirognios so divididos em duas classes:

- Pirognios exgenos (originados fora do organismo)- Pirognios endgenos (produzidos pelo organismo em

resposta aos exgenos)

Embora a endotoxina (lipopolissacardeo) seja o maispresente e importante pirognio exgeno, h outros deconstituio qumica diversa, que causam elevao detemperatura quando injetados sob condies especficas.

Classes gerais de pirognios exgenos incluem bactria,fungos e vrus, como tambm pirognios no microbianos,por exemplo, alguns frmacos, esterides, e fraes doplasma.

Classificao dos Pirognios


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Exemplos de pirognios exgenos:

Produtos bacterianos, toxinas ou microorganismos inteiros.! Bactrias Gram- (vivas ou inativadas por calor)

! Bactrias Gram+

! Endotoxina - lipopolissacardeo (LPS) de Gram-

! Toxinas bacterianas (enterotoxina de S. aureus)

! Componentes de manana e glucana de fungos (C. albicans);

! Componentes virais, como ds-RNA.


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LPS induo de resposta febril

Estimula centro termorregulador (hipotlamo)

Vasoconstrico perifrica,!calor


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Mecanismo da febre

Resposta febril mediada por molculas endgenas (pirogniosendgenos) que so liberadas por leuccitos a partir de estmulos depirognios exgenos.

PEs citocinas: TNF, IL-1, IL-6 e INFs. Atuam no SNC induzindo sntese de PG.


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Vantagens do aumento da temperatura corporal

durante uma infeco:! Inibio do crescimento bacteriano;

! Aumento da ao bactericida de neutrfilos emacrfagos;

! Sonolncia.


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!

Os nveis de pirognio tornaram-se cruciais na liberao de produtosfarmacuticos.

! Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetveis,bem como os acessrios para transfuso, infuso e todos osdispositivos implantveis ou descartveis empregados em terapiaparenteral devem oferecer segurana ao paciente, sob o ponto devista de contaminantes pirognicos. Produtos injetveis de grandevolume e de pequeno volume, assim como produtos na forma deaerossol, para uso respiratrio devem ser analisados.

! O potencial de periculosidade maior quando se trata de injetvel deuso exclusivo por via intravenosa. O risco ser ainda maior quando setrata de produto com inoculao intratecal, em que a experinciademonstrou ser a endotoxina 1000 vezes mais potente que na viaintravenosa (utilizar teste in vitro).

Controle de Qualidade x Niveis dePirognios


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! Endotoxinas so complexos de alto peso molecular associados membrana externa de bactrias Gram-negativas, sejam elas patognicas

ou no, e se constituem na mais significante fonte de pirognio para aindstria farmacutica.

!

Apesar de a maior parte da endotoxina permanecer associada paredecelular at a desintegrao da bactria, quantidades nfimas deendotoxinas so liberadas, na forma solvel, por culturas de bactrias

jovens ou tambm por bactrias Gram-negativas como E.coli, Salmonella,Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus e outros agentespatognicos, em crescimento.

!

Endotoxinas no purificadas podem conter lipdeos, carboidratos eprotenas. Como podem ser encontradas unidades no purificadas nasfases em processo ou nos produtos farmacuticos terminados, prefere-se

utilizar a terminologia endotoxina. A denominao de lipopolissacardeo(LPS) aplicada endotoxina purificada, para enfatizar a sua naturezaqumica.

Controle de Qualidade x Niveis de Pirognios


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As endotoxinas so txicas maioria dos mamferos.

Estudos tm demonstrado que a injeo de bactriasGram-negativas vivas ou mortas, ou LPS purificadocausa uma srie de reaes:

! febre! mudana na contagem de leuccitos (leucopenia seguida por

leucocitose)! coagulao intravascular disseminada! hipotenso! choque! morte

Por isso, de vital importncia aos pacientes a deteco e aeliminao de pirognios em injetveis, equipos de transfuso,infuso e todos os dispositivos implantveis ou de uso nico

empregados na terapia parenteral.

Controle de Qualidade x Niveis de Pirognios


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Mtodos Oficiais - Ensaio de Pirogniopelo Mtodo in vivo

Objetivo: avaliar o risco de reaes febris no homem apsadministrao por via i.v.

Atividade pirognica: capacidade de elevar a temperatura.

1-10ng/kg "resposta pirognica "febre


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Pirognio in vivo

1 Mtodo (USPXII 1942) 3 coelhos adultos, sadios (M ou F) sistema

termorregulador semelhante ao humano Peso mnimo "1,5 kg (equivalncia relacionada idade)

Termmetro clnico ou termoeltrico "preciso 0,1oC Temperatura !39,8oC Reutilizao: 48h ou 2 semanas (se resultado for +) Material: despirogenizado (30min 250oC ou 1h a 200oC) Volume injeo 10mL/kg tempo mximo 4 min Sesso de treino anterior ao ensaio


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Teste de pirognio in vivo

Metodologia:

Imobilizar em gaiola de conteno 03 coelhos adultossadios;

Introduzir termmetro no reto de cada animal; Registrar TC1 30 min e TC2 60 min aps introduo do

termmetro;

TC= (TC1+TC2)/2 Aps 30 min da obteno da TC, injeta-se a amostra

atravs da veia marginal da orelha do animal;

Aquecer amostra a 37 2oC antes da injeo; Registrar a Tcorprea de cada animal, 1, 2 e 3 h aps a

administrao da amostra (ou registro contnuo); Calcular diferena de temperatura de cada animal.


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! Ensaio aplicado aos produtos que podem ser tolerados pelo animalem uma dose mxima de 10 mL por kg e envolve a medida doaumento na temperatura em coelhos aps a injeo intravenosade uma soluo. So utilizados coelhos adultos e saudveis,acomodados individualmente em uma rea com temperaturauniforme entre 20 e 23 C e livre de distrbios que possamexcita"-los.

! Pelo critrio de interpretao atualmente empregado em paseseuropeus, cada amostra deve ser avaliada em um grupo de trsanimais e quando a soma das elevaes trmicas individuaismximas for inferior a 1,15 C a amostra ser aprovada e casoseja superior a 2,65 C ser rejeitada. Quando o valor da

somatria estiver entre estes valores, a amostra ser injetada emoutros trs animais (mximo mais dois retestes = 12 coelhos mx 6,6 C).

Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo


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! Pelo critrio adotado pela USP e FB, se nenhum coelho apresentar umaumento individual de temperatura de 0,5 C ou mais, acima darespectiva temperatura de controle, o produto atende aos requisitospara ausncia de pirognio.

! Se o aumento individual for 0,5 C ou mais, o ensaio deve serrepetido em outros cinco coelhos. Se no mximo trs dos oito coelhosmostrarem aumentos individuais de temperatura de 0,5 C ou mais,e se a soma dos oito aumentos mximos individuais no exceder3,3 C, o produto atende aos requisitos para ausncia de pirognio.

! O ensaio de pirognio em coelhos, embora seja utilizado quando ametodologia in vitro no aplicada, ainda mantido porque tem aseu favor a situao do envolvimento de toda a reao fisiolgica doanimal, constituindo um teste de segurana para os produtosinjetveis, lquidos para infuso e perfuso, materiais cirrgicos edescartveis em geral. DETECTA TODO O TIPO DE PIROGNIO

Ensaio de Pirognio pelo Mtodo in vivo


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Imunoterpicos: elevao permitida maior

Nos EUA: rejeio quando mais da metade dos animaisapresentar Tcrtica !0,6oC

No Brasil: Tcrtica 1,1oC (permitida para 1/3 dos animais) evalor limite para #DT (8) #5,5 oC, ao invs de 3,3 oC.


Avaliao dos resultados: os dados obtidos soconfrontados com a monografia adotada, possibilitando aclassificao final APIROGNICO, PIROGNICO ou

DUVIDOSO.


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Amostras:

Para controle de qualidade" Injetveis (de grande ou pequeno volume);"

Material para infuso e transfuso;"

Todos os dispositivos implantveis ou descartveisempregados em terapia parenteral;

Limitaes do ensaio:

"

Produtos que contenham frmacos que atuem sobre ossistema termorregulador;

" Hipnticos, anestsicos, gluconato de clcio, esterides,quimioterpicos, alguns antibiticos, radiofrmacos (provocam

!natural na TC).



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Desvantagens:

#Teste-limite no permite determinao quantitativa;#Sensibilidade insuficiente de coelhos na deteco da presena de

endotoxinas (limite: 0,5 UE/ml) importante limitao paraprodutos de uso intratecal;# Tolerncia endotoxina;# Nem todos os produtos farmacuticos podem ser avaliados neste

ensaio;# Estresse e/ou condies de sade;# Tempo;# Recursos humanos;# 3 Rs.

Vantagens:# Possibilidade de deteco de outras substancias pirognicas alm

das endotoxinas# Segurana, envolve toda a reao fisiolgica do animal(similar humana).



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Determinao de Endotoxinas Bacterianas peloMtodo in vitro

Limulus polyphemus: lmulo ou caranguejo-ferradura, quehabita alguns locais na costa do Oceano Atlntico dos Estados

Unidos at o Golfo do Mxico.


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! Simples e amplamente utilizado.

! O mtodo se baseia na reao entre os amebcitos e aendotoxina, produzindo um gel opaco facilmente reconhecido.

! Utiliza o reagente de LAL (lisado do amebcito do Limulus) que um extrato aquoso dos amebcitos, que so as clulassanguneas da hemolinfa azul da espcie de caranguejoferradura Limulus polyphemus, composto de enzimas quereagem em presena de pequenas quantidades de endotoxina

(reao concentrao-dependente).



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Limulus Amebocyte Lysate Test- LAL

Mtodo laboratorial utilizado para deteco de endotoxinaspirognicas e como uma alternativa ao teste de pirognios emcoelhos.

HISTRICO:

Infeco do L. polyphemus por Gram (-) resultava em coagulaointravascular extensiva e morte (Bang, 1956);

Levin e Bang (1964) demonstraram que a coagulao extracelular da

hemolinfa do Limulusera causada por uma reao entre endotoxinas euma protena coagulativa em amebcitos circulantes na hemolinfa docaranguejo;

Levin e cols. (1970) desenvolveram um ensaio sensvel para deteco deendotoxinas em plasma humano utilizando o material lisado dosamebcitos do Limulus;

Young, Levin e Prendergast (1993) isolaram, purificaram e descreverama protena coagulativa do LAL e provaram que a reao entre o lisado ea endotoxina apresenta natureza enzimtica.

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Teste de endotoxinas bacterianas LAL(Lisado do amebcito do Limulus)

Endotoxina catalisa a ativao da pr-enzima no lisado (LAL). A coagulaseativada hidrolisa ligaes especificas em uma protena coagulante(coagulognio) tambm presente no LAL.

Determinao de Endotoxinas Bacterianas pelo Mtodoin vitro

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Classificao legislativa do LAL:

Na edio da EP (Eur. Pharm., 3rd 1996) e no suplemento2001 o teste de LAL mencionado como sendo de igualvalor ao ensaio in vivo, em coelhos.

O teste LAL classificado no mesmo nvel em outrasfarmacopeias, como a USP XXIV (USP 24, 2000), a BP(1999) e outras.


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Mtodo farmacopeico oficialLAL6 mtodos oficiais descritos na EP:

A: Gel-clot method: limit testB: Gel-clot method: semi-quantitative testC: Turbidimetric kinetic methodD: Chromogenic kinetic methodE: Chromogenic end-point methodF: Turbidimetric end-point method

Mtodo cromognico: uso de substrato colorido, clivado com a ativao dosistema enzimtico para produo de cor.

Farmacopeia brasileira: admite os mtodos acima. Necessriorealizar validao para o mtodo de gelificao (teste desensibilidade do LAL utilizando padro de referncia de endotoxina(PRE). Includo na 4 Edio da Farmacopeia (1996).


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PROTOCOLO:

Volumes iguais de reagente LAL, da soluo a ser analisada oucontrole (endotoxina padro) so transferidos a tubos deensaio.

A mistura homogeneizada incubada em banho de gua a37C/ 1h.

O ponto final da reao facilmente verificado pela remoodos tubos e inverso a 180.

A presena do gel que se mantm slido durante a inverso considerada positiva para endotoxinas.

O ensaio se constitui em teste limite, levando-se emconsiderao a sensibilidade do LAL empregado, que varia de

0,25 a 0,015 UE/mL. (UE = Unidade de Endotoxina ). 1 UE igual a 1 UI (unidade internacional).


Precaues:Qualidade do material, assepsia, pH (6,5 a 8,0)

Metodologia


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MetodologiaPreparo dos controlesControles positivosgua: soluo a 0,05 mg/mL de endotoxina padro em gua BET;Amostra: soluo a 0,05 mg/mL de endotoxina padro em gua BET, contendo a

amostra.Padro de Referncia de Endotoxina (10.000 UI/ampola). Um ng de endotoxina deE.coli 055:B5 similar em potncia a 5 UE.

Controle negativogua BET (Bacterial Endotoxins Test): obtida por destilao tripla ou filtrao emmembrana.

Preparo do Reagente Pirogente: Reconstituir o lisado de amebcitos liofilizado(kit) em 5,2 mL gua BET e dispensar 0,1mL em tubos de ensaio estreis.Incubar com a amostra teste (0,1mL) e controles positivo e negativo.Incubar a 37oC por 60min;

O resultado POSITIVOquando h formao de um gel firme capaz de se manter

ntegro quando o tubo invertido a 180;

O resultado NEGATIVOquando no h formao de um gel firme ou aindaquando h formao de um gel viscoso que no se mantm preso ao tubo quandoinvertido.

Ponto final de gelificao


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Ponto final de gelificao

Ensaio turbidimtrico


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Ensaio turbidimtrico

Mtodo cromognico


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Mtodo cromognico


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Sensibilidade maior: 0,005 UE/ml,versus 0,25 a 0,015 UE/mL do teste de

gelificao

Curvas padro com mnimo de 3 concentraeslog (5; 0,5; 0,05 UE/mL), e controle positivo

com concentrao mdia da curva.


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# $ a sensibilidade declarada do reagente LAL em UE/mL# So utilizadas 4 diluies do Padro de Referncia de Endotoxina

em quadruplicata, e incluir controles negativos.# Os resultados so considerados em conformidade se a mdiageomtrica da concentrao do ponto final for !0,5$e < 2$.

# Pode-se fazer a comprovao tambm utilizando ensaiosturbidimtrico e cromognico.


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Teste de inibio e exacerbao da amostra

A maioria dos medicamentos requer diluio para evitar interfernciascaracterizadas pela inibio (falha na recuperao do controle positivo) ou

por potencializao (recuperao do controle positivo maior que a esperada).


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Caso seja detectada interferncia do produto no teste, deve-se calcular mxima diluio vlida (MDV).


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Substituio do ensaio in vivo pelo LAL:


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Limites para endotoxina bacteriana (FDA): Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL; Drogas intratecais:0,2 UE/mL; gua para injeo, gua estril para injeo e gua estril

para irrigao: 0,25 UE/mL; gua bacteriosttica para injeo e gua estril para inalao:0,5 UE/mL (USP - Suplemento 4a - 1984).

Drogas intratecais:0,2 UE/mL; Correlatos at 0,5 UE/mL e correlatos intratecais 0,06 UE/mL.

Substituio do ensaio in vivopelo LAL:

Possvel quando o limite de endotoxina definido para o material emconsiderao.

VantagensxDesvantagens do LAL


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Vantagens:

"

$quantidade de amostra;" Varias amostras podem ser testadas por dia;" 1 operador treinado para realizar os testes;" Enconomia;"sensibilidade;" Metodologia padronizada;"

Rapidez.

Desvantagens do LAL:

" Reao pode ser inibida pela amostra (tensoativos, metaispesados);"

Quelantes de ctions divalentes (EDTA);" S detecta endotoxinas de bactrias gram negativas;" pH fora da faixa 6,5 a 8,0.

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D i i


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Despirogenizao

Diversas metodologias, mas importante ter produto final

apirognico ou com baixos nveis de endotoxina.

Por inativao da Endotoxina

! Hidrlise cida ou alcalina (desativao do lipdio A) separao do lipdeo A do resto da molcula ousaponificao (materiais CIDA: HCl 0,05 N, 30 min,100 C ou cido actico glacial 1%, 2 a 3 horas, 100 C;ALCALINA: NaOH 0,25 N, 1 hora, 50 C);

! Oxidao perxido de hidrognio 5% (mecanismo?),usado em gua estril para injeo, salina e salina-dextrose, mas pode oxidar produtos susceptveis;

Despirogenizao: por inativao ou remoo das endotoxinas.

D i i


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Despirogenizao

Por inativao da Endotoxina

! Alquilao (ex. uso de xido de etileno em materiaistermolbeis);

! Processo trmico Autoclavao ineficaz.Incinerao por tratamento com calor seco (250oC/ 30),materiais termorresistentes como vidro e metal;

! Radiao ionizante 60Co, uso limitado devido aosriscos de toxicidade.

Despi ogeni ao


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Por remoo da Endotoxina

! Lavagem- gua estril para injeo USP (vidrarias, tampase dispositivos);

! Destilao mtodo mais antigo, durante a formao devapor a endotoxina separada por ter peso molecular

elevado;! Ultrafiltrao excluso por peso molecular (monmeros

de LPS de 20.000 daltons se agregam em vesculas de300.000 a 1.000.000 daltons). Uso para frmacos e soluesde baixo a mdio peso molecular filtro que retm

molculas acima de 100.000 daltons);

Despirogenizao

Despirogenizao


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Por remoo da Endotoxina! Osmose reversa membrana capaz de promover excluso

de ons ou excluso por tamanho til para produo degua estril para injeo;

! Carvo ativo adsoro de endotoxinas (adsoro deingredientes ativos uma limitao);

! Cromatografia troca inica- (etapa de purificao debiotecnolgicos).

Despirogenizao

Mtodos devem ser sempre validados teste desafio que devemostrar contaminao reduzida em pelo menos 3 nveislogartmicos (1000 UE/ml para 1 UE/ml)


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Mtodos apresentam limitaes - melhor prevenir acontaminao por pirognio do que ter que despirogenizar oproduto.

Cuidado com as matrias primas GUA.

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