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Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e verduras
consumidos no Brasil
Ana Paula Tiveron
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos
Piracicaba 2010
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Ana Paula Tiveron Bacharel em Ciências dos Alimentos
Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e verduras consumidos no Brasil
Orientador: Prof. Dr. SEVERINO MATIAS DE ALENCAR
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos
Piracicaba 2010
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Tiveron, Ana Paula Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e verduras consumidos no Brasil /
Ana Paula Tiveron. - - Piracicaba, 2010. 102 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2010. Bibliografia.
1. Antioxidantes 2. Consumo de alimentos - Brasil 3. Cromatografia a gás 4. Espectrometria dmassas 5. Hortaliças 6. Legumes 7. Química de alimentos I. Título
CDD 664.805 T623a
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus, por todas as bênçãos e oportunidades.
Aos meus pais que tanto amo, Vera e Augustinho, e que sempre me apoiaram em tudo.
À minha querida irmã Andréia, meu cunhado Paschoal e meu sobrinho Pedro.
Aos amigos e amigas de Tietê, Mirella, Juliana, Carol, Fernanda, Aline, Linaldo e Kleber.
Ao meu orientador, o professor Dr. Severino Matias de Alencar, por toda a atenção,
compreensão, disponibilidade e prontidão em ajudar.
Aos amigos da graduação Grozelha, Kurau, Kissi, Trakinas, C/pota, Sábado, Locuthor e Topo,
pelos anos maravilhosos de amizade.
Ao pessoal do laboratório, Adna, Tatiane, Ivani, Juliana, Aline, Izabela, Rosângela, Lucimara,
Luciana Mourão, Luciana Ferracini e Keityane, pela amizade e ajuda em todos os momentos.
Aos funcionários do departamento, especialmente à Beatriz Helena Giongo, Gislaine Martins
Nóbilo, Regina Célia Cardoso Marafon e Fábio Benedito Rodrigues, por toda a atenção e apoio.
À professora Solange G. C. Brazaca pela ajuda com a liofilização das amostras e com as
metodologias.
Às professoras Marisa A. B. R. d´Arce e Thaís M. F. S. Vieira, pela ajuda com as análises no
Rancimat.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro
através da bolsa de estudos.
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SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................................... 7
ABSTRACT ..................................................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 11
2 DESENVOLVIMENTO.............................................................................................. 15
2.1 Revisão bibliográfica .................................................................................. 15
2.1.1 Hortaliças no Brasil.................................................................................. 15
2.1.2 Antioxidantes........................................................................................... 18
2.1.3 Compostos fenólicos ............................................................................... 22
2.1.4 Métodos de avaliação da atividade antioxidante ..................................... 29
2.1.4.1 Método do seqüestro do radical livre DPPH......................................... 30
2.1.4.2 Atividade antioxidante pelo método do ABTS•+ .................................... 31
2.1.4.3 Atividade antioxidante total pelo método de redução do ferro - FRAP . 32
2.1.4.4 Autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico.............................. 33
2.1.4.5 Estabilidade oxidativa- Rancimat ......................................................... 34
2.2 Material e métodos..................................................................................... 35
2.2.1 Aquisição da matéria prima..................................................................... 35
2.2.2 Obtenção dos extratos ............................................................................ 35
2.2.3 Análises físico-químicas .......................................................................... 36
2.2.3.1 Espectrofotometria na região ultravioleta-visível .................................. 36
2.2.3.2 Compostos fenólicos totais................................................................... 36
2.2.4. Identificação química dos extratos das hortaliças ................................. 37
2.2.4.1 Remoção de interferentes das amostras através da técnica de SPE .. 37
2.2.4.2 Derivatização- formação de derivados do trimetilsilil (TMS)................ 37
2.2.4.3 Cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG-EM) .......... 38
2.2.5 Determinação da atividade antioxidante.................................................. 38
2.2.5.1 Atividade sequestrante do radical livre DPPH...................................... 38
2.2.5.2 Atividade antioxidante pelo método ABTS•+ ......................................... 39
2.2.5.3 Autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoleico.............................. 40
2.2.5.4 Atividade antioxidante total pelo método de redução do ferro ............. 41
6
2.2.5.5 Estabilidade oxidativa - Rancimat .........................................................41
2.2.6 Análise estatística ....................................................................................42
2.3 Resultados e Discussão .............................................................................42
2.3.1 Aquisição dos vegetais e rendimento ......................................................42
2.3.2 Análises físico-quimica das verduras e legumes .....................................44
2.3.2.1 Espectrofotometria na região ultravioleta-visível...................................44
2.3.2.2 Compostos fenólicos totais ...................................................................49
2.3.3 Determinação da atividade antioxidante ..................................................52
2.3.3.1 Atividade sequestrante do radical livre DPPH ......................................52
2.3.3.2 Atividade antioxidante pelo método ABTS............................................56
2.3.3.3. Autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico .............................58
2.3.3.4 Atividade antioxidante através da redução do ferro (FRAP) .................60
2.3.3.5. Atividade antioxidante pelo método RANCIMAT..................................62
2.3.4 Correlação do teor de compostos fenólicos com diferentes métodos .....65
2.3.5 Correlação entre os diferentes métodos de análise antioxidante ............69
2.3.6 Identificação química dos extratos etanólicos das hortaliças por CG-EM74
3 CONCLUSÕES ...........................................................................................................77
REFERÊNCIAS..............................................................................................................79
APÊNDICES...................................................................................................................91
ANEXOS ........................................................................................................................95
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RESUMO
Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e verduras consumidos no Brasil
As hortaliças são alimentos amplamente consumidos na dieta dos brasileiros. Há alguns anos, estudos sobre compostos presentes em vegetais, como os carotenóides, vitaminas, fibras e compostos fenólicos vem sendo bastante explorados devido aos seus possíveis efeitos biológicos e benefícios à saúde humana. Os compostos fenólicos são produtos do metabolismo secundário das plantas e se destacam principalmente por seu poder antioxidante. O objetivo deste trabalho foi avaliar os compostos fenólicos e a atividade antioxidante em algumas hortaliças consumidas no Brasil. Os métodos utilizados foram o do radical livre DPPH e ABTS, auto-oxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico, redução do ferro, estabilidade oxidativa em Rancimat e identificação química por meio da técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas. Extratos etanólicos foram utilizados em todas as análises. O teor de compostos fenólicos variou entre 1,2 a 16,9 mg/g, sendo que a cenoura apresentou a menor quantidade e a alface a maior. As hortaliças que apresentaram a maior atividade antioxidante foram a alface (54,9% e 0,45 µmol Fe2+/mg), nos métodos do DPPH• e FRAP , respectivamente, o açafrão (111,8µM trolox/g e 92,8%), nos métodos ABTS+• e �-caroteno, o agrião e o brócolis no método do Rancimat (fator de proteção 1,29). Além dessas, a alcachofra, espinafre, e aspargo também apresentaram atividade antioxidante considerável. Os compostos fenólicos mais frequentemente encontrados nas amostras pela técnica de CG-EM foram os ácidos ferúlico, caféico e p-cumárico. O ácido ascórbico presente também contribuiu para a atividade antioxidante de alguns vegetais. Desta forma, pode-se verificar boa atividade antioxidante de várias hortaliças, ressaltando assim a importância em uma dieta equilibrada destes vegetais.
Palavras-chave: Atividade antioxidante; Compostos fenólicos; Hortaliças; CG-EM
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ABSTRACT
Antioxidant activity and phenolic composition of vegetables consumed in Brazil
Vegetables are widely consumed foods in the diet of Brazilians. A few years ago, studies
on compounds present in vegetables such as carotenoids, vitamins, fibers and phenolic compounds have been conducted due to their biological effects and benefits to human health. Phenolic compounds are distinguished mainly by their antioxidant power. The aim of this study was to evaluate the phenolic compounds and antioxidant activity in some vegetables consumed in Brazil. The methods for evaluating the antioxidant activity used were the DPPH free radical and ABTS, �-carotene bleaching, reduction of Fe3+, oxidative stability in Rancimat, while the chemical composition used the gas chromatography - mass spectrometry technique (GC-MS). Ethanol extracts were used in all analysis. The content of phenolic compounds ranged from 1.2 to 16.9 mg / g, with carrots presenting the lowest amount and lettuce the highest. The vegetables with the highest antioxidant activity were lettuce (54.9% and 0.45 mmol Fe2+/ mg), through DPPH• and FRAP methods, respectively, saffron (111.8 mM trolox / g and 92.8%) through the ABTS•+ and �-carotene methods, watercress and broccoli through the Rancimat method (protective factor 1.29). Besides these, the artichoke, spinach, and asparagus also showed considerable antioxidant activity. Phenolic compounds most frequently found through the GC-MS technique were ferulic acid, caffeic acid and p-coumaric acid. Ascorbic acid also contributed to the antioxidant activity of some vegetables. Generally, it is confirmed the good antioxidant activity of some vegetables, emphasizing its importance in a balanced diet.
Keywords: Antioxidant activity; phenolic compounds; Vegetables; GC-MS
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1 INTRODUÇÃO
O reconhecimento da importância dos vegetais na alimentação humana é milenar, sendo a
principal fonte de energia da dieta (ANGELIS, 2001). O alto consumo está também ligado ao
fácil acesso pela população e a grande produção, a qual, entre 1980 e 2005 saltou de 8,9 mil para
17,4 mil toneladas (EMBRAPA HORTALIÇAS, 2010). Hortaliças são designadas pela ANVISA
como plantas herbáceas das quais uma ou mais partes são utilizadas como alimento na sua forma
natural. São classificadas como verduras, quando utilizadas as partes verdes, legumes, quando
utilizado o fruto ou a semente, especialmente das leguminosas e tubérculos e rizomas, quando
utilizadas as partes subterrâneas (BRASIL, 2010). Entre as hortaliças não existem limitações
importantes do ponto de vista agronômico para a produção no Brasil, sendo cultivadas
predominantemente por pequenos produtores nas regiões vizinhas aos grandes centros urbanos,
sobretudo nas regiões Sudeste e Sul (CORTEZ; HONÒRIO; MORETTI, 2002).
Os vegetais são alimentos muito explorados atualmente, principalmente por sua composição
química benéfica para a saúde. Os compostos fenólicos são comumente encontrados tanto em
plantas comestíveis como não comestíveis, os quais têm sido atribuídos vários efeitos biológicos
(KÄHKÖNEN et al.,1999; ROGINSKY ; LISSI, 2005). Dentre as propriedades biológicas
apresentadas por estes compostos podem-se destacar as atividades antialergênica,
antiarteriogênica, antiinflamatória, antimicrobiana, antitrombótica, cardioprotetora e
vasodilatadora, entretanto a principal atividade tem sido a relacionada com a sua ação
antioxidante (ANDREO; JORGE, 2006). Segundo Becker, Nissen e Skibsted, (2004), a definição
para antioxidantes em alimentos se resume em uma substância que em pequena quantidade é
capaz de prevenir ou retardar significativamente a oxidação de materiais facilmente oxidáveis,
como as gorduras. Os antioxidantes são capazes de inibir a oxidação de diversos substratos, de
moléculas simples a polímeros e biossistemas complexos, por meio de dois mecanismos: o
primeiro envolve a inibição da formação de radicais livres que possibilitam a etapa de iniciação;
o segundo abrange a eliminação de radicais importantes na etapa de propagação; como alcoxila e
peroxila, por meio da doação de átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo assim a
reação em cadeia (NAMIKI, 1990).
Nos alimentos a atividade antioxidante pode provir de nutrientes como a vitamina A, C e E ou
de não nutrientes, como os carotenóides, flavonóides, compostos fenólicos e ácido úrico
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(SAXENA et al., 2007). Portanto, os extratos crus de frutas, ervas, vegetais e cereais podem ser
capazes de retardar a degradação oxidativa dos lipídeos, apresentando grande importância na
indústria alimentícia como aditivos naturais. Aliado a isso, diversos estudos epidemiológicos
apontam para o grande benefício do consumo adequado de frutas e vegetais na redução de
doenças coronarianas e câncer, devido a sua atividade antioxidante. Em virtude dessa importância
dos vegetais na alimentação humana, nota-se tendência pela busca por parte dos consumidores e
indústrias alimentícias por alimentos funcionais com efeitos benéficos para a saúde. Dentro deste
contexto, algumas ervas se caracterizam como exemplos de vegetais com alto poder antioxidante,
como a salsa e o orégano. O feijão, milho e brócolis também demonstraram possuir alto teor de
compostos fenólicos (SILVA; ROCHA; CANIATTI BRAZACA, 2009; KÄHKÖNEN et al.,
1999).
Segundo Wojdylo, Oszmianski e Czemerys, (2007), os métodos mais comumente utilizados
para avaliar a atividade antioxidante são o do radical ABTS (2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-
ácido sulfônico)) e do DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazina). Ambos são caracterizados por sua
excelente reprodutibilidade sob condições estabelecidas, porém podem mostrar diferenças
significantes em suas respostas antioxidantes. O método de inibição de radicais DPPH baseia-se
na transferência de elétrons de um composto antioxidante para um oxidante. O radical ABTS é
gerado por meio de uma reação química, eletroquímica ou enzimática. Com esse método, pode-se
medir a atividade antioxidante de compostos tanto de natureza hidrofílica quanto lipofílica
(KUSKOSKI et al., 2005). Já o método de oxidação do �-caroteno/ácido linoléico avalia a
atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoleico.
(MARCO, 1968; MILLER, 1971, apud DUARTE-ALMEIDA, 2006). O método FRAP (Ferric
Reducing Antioxidant Power) caracteriza-se pela redução do ferro (BENZIE; STRAIN, 1996).
Por fim, o RANCIMAT é padrão para determinação da estabilidade oxidativa de óleos, gorduras
e alimentos lipídicos, e utiliza equipamentos automatizados.
A indústria de alimentos tem utilizado antioxidantes sintéticos a fim de minimizar os
problemas decorrentes de processos oxidativos. Porém, alguns destes aditivos contribuem com
sabores estranhos e outros são tóxicos, restringindo o seu emprego na alimentação ou material de
embalagem, conforme legislação em vigor (GUERRA; LAJOLO, 2005). Dessa forma, há grande
importância em se estudar outros antioxidantes, principalmente os de origem natural, como é o
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caso dos vegetais. Concomitante, estudos sobre a atividade antioxidante de legumes e verduras
ainda não são muito explorados no Brasil.
Assim, os objetivos deste trabalho foram:
-Quantificar o teor de compostos fenólicos totais em verduras e legumes;
- Comparar as diferentes metodologias para avaliação da atividade antioxidante in vitro de
verduras e legumes.
- Identificar os principais compostos fenólicos presentes pela técnica cromatográfica CG/EM;
- Correlacionar o teor de compostos fenólicos e a atividade antioxidante nas diferentes fontes.
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2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão bibliográfica
2.1.1 Hortaliças no Brasil
A produção de hortaliças se desenvolveu mais acentuadamente no Brasil durante a Segunda
Guerra Mundial, a partir do início da década de 1940, e passou de pequenas explorações
diversificadas chamadas de “cinturões verdes”, nos arredores das cidades, a explorações
especializadas em áreas maiores, com deslocamento em direção ao meio rural. Os imigrantes
europeus e a comunidade nipo-brasileira contribuíram de forma relevante para a expansão e
interiorização da olericultura (cultura de hortaliças) como agronegócio. A partir da década de
1950, a olericultura passou a receber o apoio de entidades de ensino, possibilitando o surgimento
da Sociedade de Olericultura do Brasil (FILGUEIRA, 2003). As Centrais de Abastecimento
(CEASAs) surgiram na década de 1970, beneficiando a produção por meio da racionalização da
produção (FILGUEIRA, 2003).
Devido a sua diversidade agroecológica, o Brasil tem grandes possibilidades de exportar os
produtos oleráceos, ao natural ou industrializados, principalmente para a Europa e Ásia, em
particular durante o inverno rigoroso (FILGUEIRA, 2003).
O amplo consumo de hortaliças também está ligado ao fácil acesso pela população e a grande
produção, a qual, em 2008, correspondeu a 19.302 mil toneladas (EMBRAPA HORTALIÇAS,
2010). Segundo Melo (2006), três quartos da produção de hortaliças se situam nas regiões Sul e
Sudeste, enquanto os 25% restantes se concentram nas regiões Nordeste e Centro-Oeste. Em
relação ao ponto de vista agronômico, não existem limitações importantes para a produção de
hortaliças no Brasil, sendo cultivadas predominantemente por pequenos produtores nas regiões
vizinhas aos grandes centros urbanos (CORTEZ; HONÒRIO; MORETTI, 2002). Cerca de 60%
da produção está concentrada em propriedades de concentração familiar com menos de 10
habitantes (MELO, 2006).
Apesar dessa fartura na produção, o consumo de vegetais no Brasil ainda é baixo. Jaime e
Monteiro (2003), ao analisarem o consumo de FLV (frutas, legumes e verduras) entre brasileiros
adultos, constataram que somente 41% dos mesmos consumiam frutas diariamente e que apenas
30% consumiam verduras e legumes todos os dias. Esses dados podem ser reforçados pela POF
(Pesquisa de Orçamento Familiar)-IBGE 2002-2003, a qual cita a pequena disponibilidade de
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vegetais no padrão alimentar brasileiro e, como uma provável consequência disso, a prevalência
da obesidade em todos os estratos da população (IBGE, 2010). Segundo Filgueira (2003), a dieta
dos brasileiros se caracteriza por baixo nível de ingestão de hortaliças, em comparação com
outros povos, e a evolução nos hábitos alimentares depende da rapidez das transformações
econômicas, sociais e culturais. O autor ressalta, ainda, que de modo geral, há pouca
conscientização sobre o valor nutricional das hortaliças nas variadas classes sociais, incluindo
aquelas com nível de escolaridade mais elevado.
As hortaliças constituem um grupo de plantas com mais de uma centena de espécies (MELO,
2006). São designadas por Brasil (2010) como plantas herbáceas das quais uma ou mais partes
são utilizadas como alimento na sua forma natural. São classificadas como verduras, quando
utilizadas as partes verdes, legumes, quando utilizado o fruto ou a semente, especialmente das
leguminosas, e raízes, tubérculos e rizomas, quando utilizadas as partes subterrâneas. De acordo
com Filgueira (2003), a classificação popular de verduras, legumes e temperos não é adequada.
Segundo o mesmo autor e sob uma visão mais técnica, as hortaliças podem ser reunidas em três
grandes grupos: hortaliças-fruto, das quais utilizam-se os frutos ou partes deles; hortaliças-
herbáceas, das quais as partes comerciáveis e utilizáveis localizam-se acima do solo, sendo tenras
e suculentas, como folhas, talos, hastes, flores ou inflorescências e hortaliças-tuberosas, das quais
são utilizadas as partes que se desenvolveram dentro do solo, como as raízes, tubérculos e bulbos.
A maioria das hortaliças apresentam consistência tenra, não lenhosa, ciclo biológico curto,
exigência de tratos culturais intensivos e utilização na alimentação humana, sem prévio preparo
industrial.
Estudos recentes têm mostrado a importância do consumo de vegetais para uma dieta
saudável e prevenção de doenças. As vitaminas e fitoquímicos, como ácido ascórbico,
carotenóides, compostos fenólicos e fibras, têm sido consideradas como as substâncias bioativas
de maior importância (SZETO; KWOK; BENZIE, 2004).
Em uma dieta, frutas e hortaliças devem contribuir com cerca de 9-12% da energia diária
consumida, ou seja, um total de 400 gramas ao dia (BRASIL, 2005).
De forma geral, o consumo de frutas e hortaliças está relacionado à boa qualidade da dieta,
uma vez que contribui para a redução do consumo de calorias provenientes de açúcares simples e
gorduras e ao adequado fornecimento de sais minerais e vitaminas (RANDALL et al., 1991 apud
CLARO, 2006; FILGUEIRA, 2003). Na Tabela 1 estão descritas as composições em vitaminas e
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sais minerais de várias hortaliças, segundo a tabela brasileira de composição de alimentos
(UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP 2006).
Tabela 1 - Valores nutricionais por 100g da parte comestível das hortaliças
Hortaliças Cálcio (mg)
Ferro (mg)
Sódio (mg)
Potássio (mg)
Tiamina (mg)
Riboflavina (mg)
Niacina (mg)
Vitamina C (mg)
Abóbora moranga crua (Curcubita
máxima)
* * Tr * Tr Tr *
*
Acelga crua (Beta
vulgaris) 43
0,3
1 240 0,04 Tr Tr 22,6
Agrião (Nasturtium
officinale) 133 3,1 * 218 0,11 0,23 * *
Aipo cru (Apium australe)
65 0,7 10 274 Tr Tr Tr 5,9
Alface crespa crua (Lactuca sativa)
38 0,4 3 267 0,11 0,12 * *
Almeirão cru (Cichorium intybus)
* 0,7 * 369 0,10 0,18 * *
Beterraba crua (Beta vulgaris)
18 0,3 10 375 0,04 Tr * 3,1
Brócolis cru (Brassica oleracea)
86 0,6 3 322 0,12 0,18 * *
Cebolinha cru (Allium fistolosum)
80 0,6 2 206 0,03 0,04 Tr *
Cenoura cru(Daucus carota)
23 0,2 3 315 Tr Tr * 5,1
Chicória crua (Cichorium endívia)
45 0,5 * 425 0,03 0,10 * *
Espinafre cru (Tetragonia
expansa)
98 * * 336 0,10 0,21 * *
Nabo cru (Brassica rapa)
42 0,2 2 280 0,07 Tr * 9,6
Pepino cru (Cucumis sativus)
10 0,1 Tr 154 Tr 0,03 * 5,0
Rabanete cru (Raphanus sativus)
21 0,4 11 328 0,06 0,02 * 9,6
Repolho branco cru (Brassica oleracea)
35 0,2 4 150 Tr 0,03 * *
Salsa crua
(Petroelinum
crispum)
179 3,2 2 711 0,12 0,15 * *
Vagem crua (Phaseolus vulgaris)
41 0,4 Tr 208 Tr 0,08 * *
Fonte: Tabela brasileira de composição de alimentos (UNICAMP, 2006) *as análises estão sendo reavaliadas Tr: traço
Estima-se que se a quantidade de frutas e hortaliças consumidas aumentasse para 600
gramas/dia, haveria a redução global de doenças em 1,8% e infarto cardíaco em 18%. Evidências
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demonstram uma associação inversa entre o consumo desses vegetais e a incidência de doenças
cardiovasculares (LOCK et al., 2005; LIU et al., 2000).
Lampe (1999) demonstrou que alguns componentes existentes nas frutas, legumes e verduras
podem atuar como estimuladores do sistema imune, moduladores da síntese do colesterol e na
redução da pressão sanguínea. Estudos epidemiológicos mostram que o consumo adequado de
vegetais podem contribuir na redução do risco de câncer no aparelho digestivo, e ainda estar
associado com o risco diminuido de outros tipos de câncer, como o de mama, por exemplo
(GANDINI et al., 2000). Ao revisarem o efeito protetor dos vegetais sobre o câncer, Steimetz e
Potter (1996), constataram que 85% dos estudos que analisaram vegetais crus apresentaram ação
protetora. Resultados para cenoura, vegetais verdes, crucíferas e tomates foram bastante
consistentes, e, para cada um deles, 70% ou mais dos estudos mostraram efeito protetor.
2.1.2 Antioxidantes
Os antioxidantes podem ser definidos como quaisquer substâncias que, presentes em baixas
concentrações, quando comparada a um substrato oxidável, atrasam ou inibem a oxidação desse
substrato de maneira eficaz (SIES; STHAL, 1995; HANDELMAN, 2001). O uso de
antioxidantes na indústria de alimentos e seus mecanismos de ação têm sido muito estudados,
uma vez que estes são amplamente empregados, principalmente, com a finalidade de inibir ou
retardar a oxidação lipídica de óleos, gorduras e alimentos gordurosos (RAMALHO; JORGE,
2006). A autoxidação lipídica está associada à reação do oxigênio com ácidos graxos insaturados;
é o principal mecanismo de oxidação dos óleos e gorduras e ocorre em três etapas: iniciação,
onde acontece a retirada de um hidrogênio do carbono alílico na molécula do ácido graxo e a
consequente formação de radicais livres, em condições favorecidas por luz e calor; propagação,
na qual ocorre a conversão dos radicais livres susceptíveis ao ataque do oxigênio a outros radicais
(peróxidos e hidroperóxidos), que são produtos primários da oxidação lipídica e cuja estrutura
depende da natureza dos ácidos graxos presentes. Esse processo é autocatalítico, uma vez que os
radicais formados atuam como propagadores da reação. Por fim, ocorre a etapa do término, na
qual dois radicais se combinam, formando produtos estáveis (produtos secundários da reação),
obtidos por cisão e rearranjo dos peróxidos (RAMALHO; JORGE, 2006). A figura 1 mostra o
esquema geral da oxidação lipídica.
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Figura 1 – Esquema geral do mecanismo da oxidação lipídica, onde RH- ácido graxo insaturado; R• - radical livre;
ROO• - Radical peróxido e ROOH – hidroperóxido Fonte: RAMALHO e JORGE (2006)
Bailey (1996) descreveu algumas propriedades desejáveis em antioxidantes. Dentre elas,
estão a eficácia em baixas concentrações (0,001 a 0,01%), ausência de efeitos indesejáveis na cor,
no odor, no sabor, e em outras características do alimento, estabilidade durante o processamento e
armazenamento, além de seus produtos de oxidação não poderem ser tóxicos. Segundo Reische,
Lillard e Eitenmiller (2002), os antioxidantes podem ser classificados em primários e
secundários. Alguns antioxidantes exibem mais de um mecanismo de atividade e são referidos
como antioxidantes de múltipla função.
Os antioxidantes primários ou inibidores da reação são aceptores de radicais livres e atuam
atrasando ou inibindo a iniciação ou interrompendo a propagação da autoxidação.
O principal mecanismo de ação dos antioxidantes primários é o sequestro de radicais livres. A
figura 2 representa o mecanismo de ação dos antioxidantes primários.
Figura 2- Mecanismo de ação para os antioxidantes primários, onde ROO• e R• - radicais livres; AH – antioxidante
com um átomo de hidrogênio ativo e A• - radical inerte Fonte: FRANKEL (1980)
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Os antioxidantes primários mais comumente utilizados em alimentos são compostos
sintéticos. Como exemplos, pode-se citar o BHA (butil hidroxianisol), BHT (butil
hidroxitolueno), PG (galato de propila) e TBHQ (terc-butil hidroquinona). No entanto, alguns
componentes naturais dos alimentos também agem como antioxidantes primários e são
comumente adicionados em alimentos. Tocoferóis são os antioxidantes primários mais
comumente utilizados. Os carotenóides são outro grupo de compostos naturais que agem como
antioxidantes primários, porém, por meio de mecanismos diferentes (REISCHE; LILLARD;
EITENMILLER, 2002).
Os antioxidantes secundários ou preventivos agem por meio de vários possíveis mecanismos.
Tais antioxidantes diminuem a taxa de oxidação por diferentes formas, mas não convertem
radicais livres em produtos mais estáveis. Podem quelar metais pró-oxidantes e desativá-los,
repor hidrogênio para antioxidantes primários, decompor hidroperóxidos a espécies não radicais,
desativar o oxigênio singlete, absorver radiação ultravioleta ou agir com sequestrante de
oxigênio. Os antioxidantes secundários são classificados como sinergistas, pelo fato de
promoverem a atividade dos antioxidantes primários. Pode-se citar o ácido cítrico, ácido
ascórbico e ácido tartárico como bons exemplos de sinergistas (REISCHE; LILLARD;
EITENMILLER, 2002).
Os antioxidantes sintéticos são os mais utilizados pela indústria brasileira alimentícia. São
substâncias que tiveram seu uso aprovado em alimentos após investigações que comprovaram sua
segurança dentro de um limite de ingestão diária. Dessa forma, estão sujeitas à legislações
específicas de cada país ou normas internacionais (TAKEMOTO; FILHO; GODOY, 2009).
Dentre tais antioxidantes, estão o BHA (butil hidroxianisol), BHT (butil hidroxitolueno), PG
(galato de propila) e TBHQ (terc-butil hidroquinona) (figura 3). Segundo a ANVISA, é permitida
a adição de 200mg/kg de BHA e TBHQ e 100mg/kg de BHT e galato de propila a óleos e
gorduras.
21
Figura 3 - Estrutura fenólica dos antioxidantes sintéticos BHA (butil hidroxianisol), BHT (butil hidroxitolueno), PG
(galato de propila) e TBHQ (terc-butil hidroquinona)
Fonte: RAMALHO e JORGE (2006)
Devido à sua estrutura fenólica, os antioxidantes sintéticos agem por meio da doação de um
próton a um radical livre, interrompendo o mecanismo de oxidação. Dessa maneira, os derivados
fenólicos se transformam em radicais livres, que podem se estabilizar sem promover ou propagar
reações de oxidação (BUCK, 1981).
Apesar de serem muito efetivos e estáveis, os antioxidantes sintéticos apresentam o uso
restrito em muitos países devido à possibilidade de causarem efeitos indesejáveis em enzimas de
vários órgãos humanos. Dessa forma, há grande interesse em se encontrar novos antioxidantes
que sejam seguros e provenientes de fontes naturais (NAKATANI, 1996).
Dentre os antioxidantes naturais, destacam-se a vitamina E, o ácido ascórbico, os
carotenóides e principalmente os compostos fenólicos, que são os antioxidantes mais abundantes
da dieta humana (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007).
A vitamina E faz parte da composição dos óleos vegetais e encontra-se na natureza de quatro
formas diferentes: �, �, �, �-tocoferol, sendo o �-tocoferol o antioxidante mais abundante e
distribuído nos tecidos e no plasma (BIANCHI; ANTUNES, 1999). A atividade antioxidante dos
tocoferóis acorre principalmente ao fato de doarem seus hidrogênios aos radicais lipídicos,
interrompendo a propagação em cadeia (RAMALHO; JORGE, 2006).
22
O ácido ascórbico geralmente é consumido em grande quantidade pelo ser humano, e uma de
suas funções, quando adicionado a outros produtos alimentícios, é inibir a formação de
compostos nitrosos carcinogênicos. Além disso, estudos vêm demonstrando que a vitamina C
apresenta um possível papel de proteção no desenvolvimento de tumores em seres humanos
(BIANCHI; ANTUNES, 1999; DUTHIE et al., 1996).
Carotenóides são isoprenóides geralmente formados por 8 unidades de isoprenos. São
sintetizados em plantas, amplamente distribuídos na natureza e responsáveis pela coloração de
frutas e hortaliças. O �-caroteno é o mais importante precursor da vitamina A. As xantofilas,
astaxantina, cantaxantina, luteína e zeaxantina também são representantes dos carotenóides
(CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; FRASER; BRAMLEY, 2004).
Como antioxidantes naturais, os compostos fenólicos presentes nos vegetais têm recebido
grande importância nos últimos anos. Os fenóis vegetais constituem um grupo quimicamente
heterogêneo, com aproximadamente 10.000 compostos, e, que apresentam grande variedade de
função nos vegetais. São metabólicos secundários (compostos orgânicos que parecem não ter
importância direta no crescimento e desenvolvimento da planta) que têm como função proteger a
planta contra o ataque de herbívoros e microrganismos patogênicos. Podem, ainda, agir no
suporte mecânico, como atrativo de polinizadores ou dispersores de frutos, na proteção contra a
radiação ultravioleta ou reduzindo o crescimento de plantas competidoras adjacentes (TAIZ;
ZEIGER, 2004).
2.1.3 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são caracterizados por uma estrutura aromática, com uma ou mais
hidroxilas como grupos funcionais. Estes grupos podem ser substituídos por ésteres, ésteres
metílicos e glicosídeos (MORAES-DE-SOUZA, 2007). São facilmente oxidáveis, tanto por meio
de enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais, luz, calor ou em meio alcalino,
ocasionando o escurecimento de soluções ou compostos isolados (SIMÕES, 2001). Alguns
compostos são solúveis apenas em solventes orgânicos, outros são ácidos carboxílicos e
glicosídeos solúveis em água, e existem ainda os grandes polímeros, que são totalmente
insolúveis (ROBARDS et al., 1999; TAIZ; ZEIGER, 2004). A maioria é encontrada na natureza
sob forma de ésteres e heterosídeos, sendo, portanto, solúveis em água e solventes orgânicos
polares (OLDONI, 2007). Os compostos fenólicos podem ser produzidos nas plantas por duas
23
rotas, a do ácido chiquímico, que participa na biossíntese da maioria dos fenóis vegetais e a do
ácido malônico, que é menos significativa em plantas, conforme a figura 4.
Figura 4 - Esquema das rotas de produção dos compostos fenólicos: rota do ácido chiquímico e do ácido malônico Fonte: POMPEU (2007)
A rota do ácido chiquímico converte precursores de carboidratos derivados da glicólise e da
rota da pentose fosfato em aminoácidos aromáticos (HERRMANN; WEAVER, 1999). Um dos
intermediários dessa rota é o ácido chiquímico e uma importante enzima é a fenilalanina amônio
liase (PAL), que produz o ácido cinâmico. A classe mais abundante de compostos fenólicos
secundários em plantas é derivada da fenilalanina, e por meio da eliminação de uma molécula de
amônia para formar o ácido cinâmico (figura 5) (TAIZ; ZEIGER, 2004).
24
Figura 5 - Esquema da biossíntese de compostos fenólicos a partir da fenilalanina Fonte: TAIZ & ZEIGER (2004)
25
Os compostos fenólicos são classificados de acordo com seu esqueleto principal, conforme
tabela 2.
Tabela 2 - Classificação dos compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico
Fonte: OLDONI (2007)
Segundo Ribéreau-Gayon (1968), os compostos fenólicos ainda podem ser classificados
como pouco distribuídos na natureza, polímeros e largamente distribuídos na natureza.
Os compostos classificados como pouco distribuídos se apresentam em número reduzido,
embora estes sejam encontrados com certa frequência na natureza. Dentre eles estão os fenóis
simples, o pirocatecol, a hidriquinona, o resorcinol e os aldeídos derivados dos ácidos benzóicos,
que são constituintes dos óleos essenciais.
Os polímeros são aqueles compostos fenólicos que não se apresentam de forma simples nos
tecido vegetais, e, podem ser exemplificados pelos taninos (hidrolisáveis e condensados) e as
ligninas, que são polímeros complexos de grande rigidez e resistência mecânica, sendo que sua
hidrólise alcalina libera uma grande variedade de derivados dos ácidos benzóico e cinâmico.
26
Na família dos compostos largamente distribuídos na natureza se encontram os flavonóides,
ácidos fenólicos (benzóico, cinâmico e seus derivados) e as cumarinas. Os flavonóides
constituem uma classe muito extensa de compostos naturais distribuídos no reino vegetal. São
substâncias aromáticas que contém 15 átomos de carbono no seu esqueleto básico, possuindo
estrutura básica C6-C3-C6, onde os dois anéis C6 são necessariamente aromáticos (anéis A e B),
conectados por uma ponte de três carbonos, que geralmente contém um átomo de oxigênio (anel
C) (RICE-EVANS, 2004, MANACH et al., 2004). São os compostos mais diversificados no
reino vegetal. A estrutura básica de um flavonóide pode ser observada na figura 6.
Figura 6 - Estrutura química geral de um flavonóide: dois anéis aromáticos (A e B) e um anel intermediário (C)
Os flavonóides estão presentes em todas as partes das plantas, desde as raízes, até as folhas e
frutos, sendo encontrados nos vacúolos das células. Podem ser encontrados em forma livre
(aglicona) ou ligados com açúcares (glicosídeos). São classificados como antocianidinas
(apigenina, cianidina), flavonas (crisina, apigenina, rutina, luteolina), flavonóis (canferol,
quercetina, miricetina, tamarixetina), flavanonas (naringina, naringenina, taxifolin), catequinas
(epicatequina), dihidroflavonóis (flavanonóis), chalconas e isoflavonas (genistina, genisteína,
daidzina, daidzeína). Tal diversidade ocorre devido às transformações que estes compostos
podem sofrer, como hidroxilação, metilação de grupos hidroxila ou do núcleo dos flavonóides,
dimerização (produzindo biflavonóides), glicosilação de grupos hidroxila (produzindo O-
glicosídeos) ou do núcleo dos flavonóides (produzindo C-glicosídeos) (MARKHAM, 1982).
Os flavonóides são ácidos fracos e, como são polares, ou moderadamente polares, são
solúveis em etanol, metanol, butanol e combinações de solventes com água (MARKHAM, 1982).
Absorvem radiação eletromagnética na faixa do ultravioleta (UV) e do visível, e dessa maneira
apresentam papel de defesa nas plantas frente a radiação UV da luz solar. Apresentam,
normalmente, duas bandas de absorção no UV, sendo uma compreendida entre 220-295 nm e
outra entre 300-390 nm (ROBARDS et al., 1999).
27
Segundo Reische, Lillard e Eitenmiller (2002), os flavonóides podem agir como quelantes de
metais, ou ainda como antioxidantes primários, como sequestrantes do ânion superóxido.
Os ácidos fenólicos podem ser divididos em três grupos: os ácidos benzóicos (ácido salicílico,
ácido p-hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido gálico, entre outros), que possuem sete átomos de
carbono (C6-C1) e são os ácidos fenólicos mais simples encontrados na natureza; os ácidos
cinâmicos (ácido cinâmico, ácido o-cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido sinápico, entre
outros), que possuem nove átomos de carbono (C6-C3) e as cumarinas, que são derivadas do ácido
cinâmico por ciclização da cadeia lateral do ácido o-cumárico (figura 7). Além da forma natural,
os ácidos fenólicos podem ainda se ligar entre si ou com outros compostos. Um exemplo dessas
combinações ocorre com o ácido caféico que, quando associado com um álcool – ácido cíclico,
denominado ácido quínico, origina o ácido clorogênico (RIBÉREAU-GAYON, 1968; SOARES,
2002). Os ácidos benzóicos apresentam espectro de absorção na região ultravioleta no
comprimento de onda de 270 a 280 nm. Os ácidos cinânicos e as cumarinas absorvem no
ultravioleta em duas bandas, sendo a primeira de 290 a 300 nm e 220 a 230, e a segunda 305 a
330 e 310-350, respectivamente (ROBARDS et al., 1999).
28
Figura 7 - Estrutura dos ácidos fenólicos: (A) ácidos benzóicos; (B) ácidos cinânicos; (C) cumarinas Fonte: SOARES (2002) O conteúdo de ácidos hidroxibenzóicos em plantas geralmente é muito baixo, com exceção de
algumas frutas vermelhas, rabanetes negros e cebolas. São componentes de estruturas complexas,
assim como os taninos hidrolizáveis. Pelo fato dos ácidos hidroxibenzóicos serem encontrados
em poucas plantas que fazem parte da alimentação humana, não podem ser considerados com
grande interesse nutricional (MANACH et.al., 2004).
Os ácidos hidroxicinâmicos são mais comuns que os hidroxibenzóicos, geralmente são
encontrados na forma de glicosídeos ou ligados a proteínas e a outros polímeros da parede celular
e raramente são encontrados na forma livre. O ácido cafeico, em forma livre ou esterificado, é
geralmente o ácido fenólico mais abundante e representa de 75% a 100% do conteúdo total de
ácidos hidroxicinâmicos na maioria das frutas. O grãos de cereais são os alimentos que
apresentam o maior conteúdo de ácido ferúlico, sendo as principais fontes da dieta. Este ácido
fenólico é encontrado principalmente nas partes externas do grão (MANACH et.al., 2004).
29
A atividade antioxidante desses compostos se deve principalmente às suas propriedades
redutoras e estrutura química. Tais características desempenham um papel importante na
quelação de metais de transição ou no sequestro de radicais livres, agindo nas etapas de iniciação
e propagação do processo oxidativo. Essa ação antioxidante dos fenólicos permite a formação de
intermediários relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático presente na
estrutura dessas substâncias (HASLAM, 1996; SOARES, 2002).
A hidroxila do ácido ferúlico existente na posição orto com o grupo metoxila, doador de
elétrons, é um fator que aumenta a estabilidade do radical fenoxil e aumenta a eficiência
antioxidante do composto (CUVELIER; RICHARD; BERSET, 1992). A presença de uma
segunda hidroxila na posição orto ou para, também aumenta a atividade antioxidante. O ácido
caféico, que apresenta essa característica, possui atividade antioxidante maior do que o ácido
ferúlico (CHEN; HO, 1997). O efeito sequestrante do radical hidroxil parece estar diretamente
relacionado aos grupos hidroxil localizados na posição para no anel aromático.
2.1.4 Métodos de avaliação da atividade antioxidante
Diversas técnicas têm sido utilizadas para se determinar a atividade antioxidante in vitro, de
forma a permitir rápida seleção de substâncias e/ou misturas promissoras. Nota-se aumento no
uso da avaliação da capacidade antioxidante em alimentos, produtos naturais, fármacos e
cosméticos. Este interesse começou a se expandir a partir da década de 90, quando começou a ser
constatada a influência benéfica de muitos produtos naturais na saúde humana (TOMEI;
SALVADOR, 2007). Da mesma forma, tornou-se também crescente a busca e a validação de
metodologias para a avaliação da atividade antioxidante em matrizes complexas, como alimentos,
produtos naturais e fluidos biológicos (SANCHEZ-MORENO, 2002; ROGINSKI; LISSI, 2005).
Dentre os métodos utilizados para se estimar a capacidade antioxidante estão o ORAC (Oxygen
Radical Absorbance Capacity), desenvolvido originalmente por Cao, Alessio & Cutler (1993),
que mede a capacidade do antioxidante em sequestrar radicais peroxil gerados por uma fonte
radicalar; a autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico, que atua como gerador de radicais
livres, os quais interagirão com o �-caroteno ocasionando o decaimento da sua absorbância
(MELO et al., 2006; JAYPRAKASHA et al., 2007; OLDONI, 2007); teste de redução do radical
DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil), que é baseado na capacidade do DPPH• reagir com doadores
de hidrogênio (MELO et al., 2006; CARDOSO et al., 2005; STRATIL; KLEJDUS; KUBAN,
30
2006; JAYAPRAKASHA et al., 2007; HUKKANEN et al., 2006); FRAP (Ferric Reducing
Antioxidant Power), que está baseado na capacidade dos fenóis em reduzir o Fe3+ em Fe2+
(BENZIE; STRAIN, 1996; STRATIL; KLEJDUS; KUBAN, 2006; HUKKANEN et al., 2006);
ABTS•+ (2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), que consiste em se monitorar o
decaimento do cátion-radical ABTS produzido pela oxidação do ABTS•+, quando amostra
contendo antioxidantes é adicionada (RE et al., 1999; STRATIL; KLEJDUS; KUBAN, 2006) e o
Rancimat, que determina a estabilidade oxidativa da amostra, por meio da detecção de ácidos
voláteis a 110°C (AOCS, 2003; GARCIA et al., 2006).
Essas metodologias vêm sendo bastante utilizadas na determinação da atividade antioxidante
de alimentos e produtos naturais devido a sua relativa simplicidade, principalmente os métodos
indiretos (reação de oxi-redução entre o oxidante e o antioxidante) como o DPPH•, o ABTS•+ e o
FRAP, que propicia a aplicação em rotinas de laboratório (TOMEI; SALVADOR, 2007).
Existem muitos métodos de análise da atividade antioxidante, com fundamentos, mecanismos
de ação, maneiras de expressar resultados e aplicações muito diferentes. Por isso, torna-se difícil
escolher os métodos mais apropriados. A comparação de dados a partir de diferentes estudos
também é difícil, e é preferível analisar uma bateria de ensaios com medida de diferentes
aspectos químicos dos antioxidantes e compará-los com antioxidantes sintéticos consagrados,
como o BHT. Dessa forma, é possível gerar um perfil antioxidante completo. Deve-se escolher os
métodos mais comumente aceitos, validados e padronizados, com informações acumuladas na
literatura (OLIVEIRA; VALENTIM; GOULART, 2009).
2.1.4.1 Método do sequestro do radical livre DPPH
O método de sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazina) foi sugerido
primeiramente em meados da década de 50, originalmente para descobrir doadores de hidrogênio
em produtos naturais, e, mais tarde para determinar o potencial antioxidante em fenólicos
individuais e alimentos (ROGINSKY; LISSI, 2005). Atualmente, é um dos métodos mais
utilizados para verificação da atividade antioxidante. A figura 8 ilustra a reação do radical DPPH
com o antioxidante sintético BHT.
31
Figura 8 - Reação química entre o BHT e o radical DPPH Fonte: Adaptado (OLIVEIRA, VALENTIM, GOULART, 2009)
O decaimento e a absorbância encontrados pela quantidade remanescente do radical DPPH
variam significativamente com os diferentes tipos e concentrações de antioxidantes. Atualmente,
utiliza-se muito a técnica do EC 50, que foi proposta para determinar a eficiência antirradical por
meio da quantidade de antioxidante necessária para cair em 50% a concentração inicial do radical
DPPH e o tempo necessário para alcançar a estabilidade na concentração do mesmo (SANCHEZ-
MORENO; LARRAURI; SAURA-CALIXTO, 1998). Esta metodologia é limitada pelo fato dos
radicais DPPH interagirem com outros radicais (alquil), e, a curva de resposta em tempo para
atingir o estado estacionário não ser linear, com diferentes relações de antioxidante/DPPH•.
2.1.4.2 Atividade antioxidante pelo método do ABTS•+
O método indireto do sequestro do radical ABTS 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfônico) também é muito utilizado, e foi primeiramente sugerido por Miller et al. (1993) em
testes de amostras biológicas. Assim como o DPPH•, o ABTS•+ apresenta excelente estabilidade
em determinadas condições de análise. Porém, estes radicais apresentam algumas diferenças
importantes. O radical DPPH• já vem pronto para uso e é solúvel em solventes orgânicos,
enquanto o ABTS•+ necessita ser gerado antes por reações químicas (como o perssulfato de
potássio) ou enzimáticas, e, é solúvel tanto em água como em solventes orgânicos, permitindo a
análise tanto de amostras hidrofílicas como lipofílicas (ARNAO, 2000).
Por meio da adição do perssulfato de potássio, ocorre a formação do radical ABTS, que
apresenta cor esverdeada. Na medida em que o antioxidante é misturado com esse radical, ocorre
a redução do ABTS•+ a ABTS, provocando a perda da coloração do meio reacional. Os resultados
são expressos em função do Trolox, um padrão antioxidante submetido às mesmas condições de
32
análise. A figura 9 representa a reação. O ABTS•+ apresenta forte absorção no intervalo de 600-
750nm e pode ser facilmente determinado espectrofotometricamente, sendo um radical estável na
ausência de antioxidantes.
Uma das vantagens do método é sua relativa simplicidade, o que permite sua aplicação em
análises rotineiras de laboratórios. Além disso, oferece vários máximos de absorção e uma boa
solubilidade (ROGINSKI; LISSI, 2005; KUSKOSKI et al., 2005).
Figura 9 - Redução do ABTS•+ por um antioxidante e sua formação pelo perssulfato de potássio Fonte: HUANG; OU; PRIOR, (2005)
2.1.4.3 Atividade antioxidante total pelo método de redução do ferro - FRAP
O método do FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) também se baseia em reações de
transferência de elétrons. Segundo Pulido, Brava e Saura-Calixto (2000), esta metodologia foi
desenvolvida como alternativa para análise de fluidos biológicos e soluções aquosas de
compostos puros e pode ser aplicada tanto para estudos da atividade antioxidante em alimentos e
bebidas, como em substâncias puras, com resultados comparáveis àqueles obtidos com outras
metodologias.
A reação ocorre pela formação de um complexo TPTZ (2,4,6-Tris(2-piridil)-s-triazina) com o
Fe (III), de cor amarelada. Na presença de um antioxidante, o ferro presente é reduzido, dando
origem ao [Fe(II)(TPTZ)2]3+, de colocação azul escura, conforme demonstrado na figura 10. A
reação acontece em pH de 3,6 e a absorbância máxima é de 593 nm. Os valores de pH tem efeito
importante na redução da capacidade de antioxidantes. Em condições ácidas, a redução da
capacidade pode ser suprimida devido à protonação com compostos antioxidantes, enquanto que
em meio básico, ocorre a dissociação de prótons de compostos fenólicos que pode aumentar a
capacidade de reduzir uma amostra (HUANG; OU; PRIOR, 2005).
33
Figura 10 - Redução do Fe(III) a Fe(II) pela adição de um antioxidante Fonte: HUANG; OU; PRIOR, (2005)
Uma das críticas aos métodos indiretos, como este, consiste no fato de que a capacidade de
redução obtida não reflete necessariamente na atividade antioxidante da amostra. Como o método
não inclui um substrato oxidável, ou seja, uma degradação oxidativa real, não há informações
fornecidas sobre as propriedades dos antioxidantes (FRANKEL; MEYER, 2000, ROGINSKY;
LISSI, 2005).
2.1.4.4 Autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico
A análise do �-caroteno/ácido linoléico é considerada como um método direto, uma vez que é
baseada no estudo de alimentos contendo antioxidantes na oxidação degradativa de um sistema
em teste. O substrato da oxidação pode ser lipídios individuais, mistura de lipídios (óleos),
proteínas, DNA, entre outros. A peroxidação lipídica é a mais conveniente e utilizada para este
fim (ROGINSKY; LISSI, 2005).
No ensaio da oxidação acoplada do �-caroteno/ácido linoléico, o sistema modelo ao ser
submetido em condições de oxidação, gera um radical livre a partir da oxidação do ácido
linoléico, que irá abstrair o hidrogênio da molécula insaturada do �-caroteno. Como resultado da
oxidação desta molécula, o sistema perde a coloração alaranjada característica, que é monitorada
espectrofotometricamente de modo a quantificar o grau de inibição da oxidação pelo antioxidante
a ser testado (ABIDILLE et al., 2005; MOLYNEUX, 2003).
Dependendo dos lipídios utilizados, a atividade de diferentes tipos de antioxidantes pode
variar significativamente. A atividade é fortemente afetada de acordo com a composição física do
sistema testado e as diferentes polaridades dos antioxidantes. Observa-se que antioxidantes
polares são mais reativos em sistemas contendo somente óleo, enquanto os não polares atuam
mais em sistemas lipídicos suspensos em água. A explicação para isso são as diferentes
34
afinidades que os antioxidantes hidrofílicos e lipofílicos apresentam em relação ao ar, água e
óleo, assim como a interface. Em sistemas contendo somente óleo, os antioxidantes hidrofílicos
atuam mais efetivamente na interface óleo-ar, onde eles protegem contra a oxidação lipídica. Ao
contrário, em sistemas de emulsão óleo em água, antioxidantes hidrofóbicos estão localizados na
interface óleo-água, onde são mais protetores em relação aos antioxidantes hidrofílicos
(FRANKEL; MEYER, 2000).
2.1.4.5 Estabilidade oxidativa- Rancimat
A oxidação lipídica é a maior causa de deterioração de óleos e gorduras, acarretando em
perdas de qualidade e valor nutricional, e desenvolvimento de sabores e odores não desejáveis.
Como consequência da oxidação lipídica ocorre diminuição da vida de prateleira do produto, e
este é um grande problema para a indústria de alimentos (VELASCO; ANDERSEN; SKIBSTED,
2004; ARAIN et al., 2009).
O método Rancimat permite que a estabilidade oxidativa seja determinada automaticamente,
sob condições padronizadas. É muito utilizado na indústria de óleos e gorduras, sendo um dos
parâmetros mais importantes para a avaliação da qualidade (VELASCO; ANDERSEN;
SKIBSTED, 2004; KOWALSKI et al., 2004) .
A análise consiste em aumento de ácidos voláteis gerados de amostras de óleo aquecidas em
altas temperaturas e sob aeração constante. Esses compostos ficam presos na água deionizada,
alterando e aumentando sua condutividade. Dessa forma, é possível obter o tempo em que ocorre
a oxidação máxima do óleo (tempo de indução) (VELASCO; ANDERSEN; SKIBSTED, 2004;
FARHOOSH, 2007).
A figura 11 representa o esquema de funcionamento do Rancimat.
Figura 11 - Esquema do funcionamento do Rancimat Fonte: SILVA; BORGES; FERREIRA (1999)
35
2.2 Material e Métodos
2.2.1 Aquisição da matéria prima
A maioria das verduras e legumes utilizados nesse trabalho foram adquiridos no comércio da
cidade de Piracicaba, com exceção do aspargo, rabanete, açafrão e agrião, que foram obtidos no
CEAGESP em São Paulo, na forma in natura conforme descritos a seguir: 1) Açafrão (Curcuma
longa L.); 2) Aipo (Apium graveolens L.); 3) Cebolinha verde (Allium fistolosum L.); 4) Alho-
poró (Allium porrum L.); 5) Agrião (Nasturtium officinale sp.); 6) Alcachofra (Cynara scolymus
L.); 7) Aspargo (Aspargus officinalis L.); 8) Acelga (Beta vulgaris L. var. cicla); 9) Rabanete
(Raphanus sativus L.); 10) Almeirão (Cichorium intybus L.); 11) Chicória (Cichorium endívia
L.); 12) Espinafre (Tetragonia expansa L.); 13) Abóbora, moranga (Cucurbita máxima Duch.);
14) Brócolis (Brassica oleracea L. var. itálica Plenck); 15) Nabo (Brassica rapa L.); 16) Salsa
(Petroselinum crispum (Mill.) Nym.); 17) Beterraba (Beta vulgaris L.); 18) Repolho verde
(Brassica oleracea L. var. capitata); 19) Pepino (Cucumis sativus L.); 20) Rúcula (Eruca sativa
L.); 21) Alface crespa (Lactuca sativa L.), 22) Cenoura (Daucus carota L.) e 23) Vagem
(Phaseolus vulgaris L.). Todas as hortaliças foram adquiridas no ano de 2009. A beterraba,
alface, pepino, abóbora e cenoura no mês de Janeiro; espinafre, vagem e rúcula em Abril;
cebolinha, salsa, chicória, repolho, acelga e almeirão em Junho; brócolis, alho-poró, nabo,
alcachofra e aipo em Agosto; agrião, açafrão, aspargo e rabanete em Outubro.
2.2.2 Obtenção dos extratos
A extração das amostras vegetais foi feita de acordo com o método descrito por Kähkönen et
al. (1999), com algumas modificações. As amostras foram primeiramente congeladas a -18º C e
posteriormente liofilizadas. Em seguida, o material foi triturado e pesado 1g de cada vegetal na
forma de pó, em tubos Falcon de 50ml. Na sequencia, uma alíquota de 20 mL de etanol 80%
(v/v) foi adicionada e os tubos agitados cuidadosamente. Posteriormente, os tubos foram
sonicados por 5 minutos e centrifugados por 15 minutos a 5000xg, e, os sobrenadantes coletados
para análise. Todas as amostras foram extraídas em triplicata. A figura 13 apresenta o fluxograma
das análises realizadas desde a aquisição das hortaliças.
36
Figura 13: Fluxograma do estudo feito desde a aquisição das hortaliças até as análises realizadas
2.2.3 Análises físico-químicas
2.2.3.1 Espectrofotometria na região ultravioleta-visível
Os espectros de absorção foram obtidos de acordo com o método descrito por Alencar et al.
(2005), com algumas modificações. Os extratos dos vegetais, obtidos de acordo com o item 2.2.2,
foram diluídos em etanol P.A., na razão 1:5 para os extratos de beterraba, abóbora (moranga),
cenoura, pepino, acelga, repolho, nabo, alho-poró, aipo e rabanete, e na razão 1:50 para os demais
extratos. Os espectros de absorção na região UV-visível foram determinados na faixa de
comprimento de onda de 200 a 500nm, porém a faixa considerada foi de 220 a 350, na qual os
compostos de interesse absorvem luz.
2.2.3.2 Compostos fenólicos totais
37
A análise de compostos fenólicos totais dos extratos dos vegetais foi feita de acordo com o
método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau descrito por Singleton, Orthofer e Lamuela,
(1999), utilizando ácido gálico como padrão. O reagente de Folin-Ciocalteau é uma solução
complexa de íons poliméricos formados a partir de heteropoliácidos fosfomolibdicos e
fosfotungsticos. Esse reagente oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos a um complexo azul Mo-
W. A leitura foi feita em espectrofotômetro a 740nm. Os extratos obtidos foram diluídos e, uma
alíquota de 0,5mL da amostra diluída foi transferida para um tubo e adicionado 2,5mL do
reagente Folin Ciocalteau, diluído em água 1:10. A mistura permaneceu em repouso de 3 a 8
minutos. Em seguida foi adicionado 2mL de carbonato de sódio 4% e os tubos deixados em
repouso por 2 horas, ao abrigo da luz. A absorbância foi medida em espectrofotômetro UV-mini
1240 (Shimadzu-Co) a 740nm. Uma amostra em branco foi conduzida nas mesmas condições e
os resultados dos compostos fenólicos totais foram expressos em equivalente de ácido gálico,
com base em uma curva de calibração de ácido gálico com concentrações variando de 5 a
80µg/mL (apêndice A).
2.2.4. Composição química dos extratos das hortaliças
2.2.4.1 Remoção de interferentes das amostras através da técnica de SPE (Solid Phase
Extraction)
A técnica de remoção de interferentes SPE foi empregada para a remoção de açúcares, que
poderiam mascarar compostos de interesse. É uma técnica cada vez mais utilizada, pois é rápida,
eficaz e utiliza poucos volumes de amostra e solventes.
Os cartuchos SPE-LC18 (Supelco, 2 gramas) foram condicionados por meio de várias
lavagens com metanol e água ácida (pH=2), respectivamente. Posteriormente, 4 mL de cada
extrato etanólico rotaevaporado a temperatura de 45°C e redissolvido na mesma quantidade de
água foram acrescentados aos respectivos cartuchos. Quando o extrato passou inteiramente pela
coluna, acrescentou-se água ácida suficiente para a retirada dos açúcares. Em seguida foi
adicionado metanol para a eluição dos compostos de interesse. A eluição das bandas de interesses
foram acompanhadas por meio de luz UV, sendo recolhidas em vials de vidro silanizado.
2.2.4.2 Derivatização - formação de derivados do trimetilsilil (TMS)
38
Antes da realização das análises por cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de
massas (CG-EM), as amostras passaram por uma etapa imprescindível, chamada derivatização. A
cromatografia gasosa só é útil para analisar gases, substâncias voláteis e termicamente estáveis.
Quando a amostra não apresenta esse perfil, sendo constituída principalmente por compostos de
alta massa molar e/ou grupos funcionais fortemente polares, há necessidade de derivatização,
reação que transforma as substâncias de interesse em derivados com características adequadas à
análise (BONATO, 2006). Dessa forma, a derivatização química é usualmente utilizada para
reduzir a polaridade de grupos funcionais e facilitar sua separação no cromatógrafo gasoso.
Às frações obtidas na purificação adicionaram-se 100 µL do reagente derivatizante N-metil-
N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA). A mistura foi homogeneizada e levada em estufa à
70 ºC durante 10 minutos para reação. Em seguida, o reagente foi evaporado sob fluxo de gás
nitrogênio e o produto da derivatização (derivados do trimetilsilil – TMS) rediluído em hexano
(800 µL). Após homogeneização, o sobrenadante foi transferido a outro vial para injeção no CG-
EM.
2.2.4.3 Cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG-EM)
As análises por CG-EM dos extratos foram conduzidas em cromatógrafo gasoso Shimadzu
GC 2010 acoplado ao espectrômetro de massas Shimadzu QP 2010 Plus. As amostras foram
separadas em coluna capilar (RTX5MS 30m x 0,25mm x 0,25 µm). A programação de
temperatura iniciou em 80ºC (1 minuto), a taxa de aquecimento de 20 ºC/minuto alcançou 250 ºC
(1 minuto), passou a 300 ºC (5 minutos) a taxa de 6 ºC/minuto, a 310 ºC (5 minutos) a taxa de 15
ºC/minuto, a 320 ºC (10 minutos) a taxa de 20 ºC/minuto, totalizando 40 minutos de análise.
Hélio foi utilizado como gás de arraste. A temperatura do injetor foi de 280 ºC e o volume de
injeção foi de 0,5 µL no modo “splitless”. A interface foi mantida a 280 ºC e o detector operou no
modo “scanning” (m/z 40-800). A integração foi feita por meio do software LabSolutions-
GCMS. Flavonóides, ácidos fenólicos e derivados foram identificados por comparação com os
dados obtidos do CG-EM (tempo de retenção e fragmentação iônica) de padrões autênticos
silanizados e eluídos nas mesmas condições e com a biblioteca Wiley 8.
2.2.5 Determinação da atividade antioxidante
2.2.5.1 Atividade sequestrante do radical livre DPPH
39
A medida da capacidade sequestrante a ser deteminada pelo método DPPH• baseia-se no
princípio de que o DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazina), sendo um radical estável de coloração
violeta, aceita um elétron ou um radical hidrogênio para tornar-se uma molécula estável, sendo
reduzido na presença de um antioxidante e adquirindo coloração amarela. Na forma de radical, o
DPPH• possui uma absorção característica a 517nm, que desaparece à medida que ele vai sendo
reduzido pelo hidrogênio doado por um composto antioxidante (MENSOR et al., 2001).
Foram utilizados padrões de alfa-tocoferol e BHT numa concentração de 200 ppm. A mistura
de reação foi constituída pela adição de 0,5 mL dos padrões ou extratos dos vegetais, 3,0mL de
etanol puro e 0,3 mL do radical DPPH em solução de etanol 0,5mM e incubada por 45 minutos,
em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. A atividade anti-radical foi determinada na forma de
atividade antioxidante (AA), pela equação (1):
Onde:
Aa = absorbância da amostra, Ab = absorbância do branco, Ac = absorbância do controle
negativo
O controle negativo foi feito substituindo-se o volume do extrato por igual volume do
solvente utilizado na extração. O branco foi preparado substituindo o volume da solução de
DPPH• por igual volume de solvente.
Uma das maneiras de se expressar a atividade antioxidante pelo método do sequestro do
radical livre DPPH, também muito utilizada em trabalhos que envolvem o estudo da atividade
antioxidante é por meio do EC50, ou seja, a concentração mínima necessária para o antioxidante
reduzir em 50% o radical DPPH inicial da reação.
Os valores do EC50 foram calculados por regressão linear de gráficos em que o eixo das
abcissas representou a concentração dos extratos e o eixo das ordenadas a atividade antioxidante
(%), calculada segundo a equação (1).
A cinética dos extratos das hortaliças foi determinada por meio do monitoramento, a cada
20 minutos, por 140 e 160 minutos, dependendo da amostra, do declínio da absorbância da
solução de DPPH• a 517 nm. As concentrações utilizadas na reação foram calculadas a partir do
extrato bruto 5% (1 g da hortaliça/20ml solvente) e submetidas à reação.
2.2.5.2 Atividade antioxidante pelo método ABTS•+
(1)
40
A atividade antioxidante pelo método ABTS•+ [2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonic acid)] foi feita conforme a metodologia descrita pela EMBRAPA (2007). O radical
ABTS foi formado pela reação da solução ABTS•+ 7mM com a solução de persulfato de potássio
140mM, incubados à temperatura de 25°C e no escuro, durante 12-16h. Uma vez formado, o
radical foi diluído com etanol P.A. até a obtenção do valor de absorbância de 0,700 ± 0,020 a 734
nm. A partir do extrato de cada hortaliça, obtido no item 2.2.2., foram preparadas três diluições
diferentes, em triplicata. Em ambiente escuro transferiu-se uma alíquota de 30µL de cada
diluição do extrato para tubos de ensaio com 3,0mL do radical ABTS. A leitura foi feita após 6
minutos da reação a 734nm, e o etanol foi utilizado como branco. Como referência, utilizou-se o
Trolox, um antioxidante sintético análogo à vitamina E, nas concentrações de 100-2000 µM
(apêndice B). Os resultados da atividade antioxidante foram expressos em µM trolox/g amostra
(atividade antioxidante equivalente ao Trolox).
2.2.5.3 Autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico
A medida da atividade antioxidante pela oxidação acoplada do � -caroteno e do ácido
linoléico, foi realizada de acordo com o método de Emmons, Peterson e Paul (1999), com
algumas modificações. Foram pesados 10mg de �-caroteno, os quais foram dissolvidos em
100mL de clorofórmio. Alíquotas de 3mL da emulsão clorofórmio/�-caroteno foram adicionadas
a 40mg de ácido linoléico e 400 mg de Tween 40. Em seguida, o clorofórmio foi removido com a
utilização de uma corrente de gás nitrogênio e o resíduo obtido redissolvido em 100mL de água
aerada por 30 minutos. Alíquotas de 3mL da emulsão �-caroteno/ácido linoléico foram
misturadas com 50�L dos extratos dos vegetais, e incubadas em banho-maria a 50ºC. A oxidação
da emulsão foi monitorada em espectrofotômetro a 470nm, no tempo inicial e em intervalos de
20 minutos durante 2 horas. Para a amostra controle foi utilizado solvente no lugar do extrato dos
vegetais. Foram utilizados padrões de BHT e alfa-tocoferol em concentrações de 200 ppm. A
atividade antioxidante (AA) foi expressa como percentual de inibição relativa comparada ao
controle depois de 120 minutos usando a equação (2):
Onde:
(2)
41
DRc = taxa de degradação do controle (= ln(a/b)/120), DRs = taxa de degradação na presença do
padrão ou extrato (= ln(a/b)/120)
“a“ e “b” são as absorbâncias no tempo inicial (0 min) e no tempo final (120min),
respectivamente.
2.2.5.4 Atividade antioxidante total pelo método de redução do ferro - FRAP (Ferric
Reducing Antioxidant Power)
Para a determinação da atividade antioxidante por meio da redução do ferro (FRAP) foi
utilizada a metodologia descrita por Kukic et al. (2008), com algumas modificações. Esta se
baseia na medida direta da habilidade dos antioxidantes (redutores) da amostra em reduzirem, em
meio ácido (pH 3,6), o complexo Fe3+ /tripiridiltriazina (TPTZ), para formar Fe2+, de intensa cor
azul e absorção máxima a 593 nm. O reagente FRAP foi preparado no momento da análise,
através da mistura de 25 ml de tampão acetato (300 mM, pH 3,6), 2,5ml de solução TPTZ
(10mM TPTZ em 40 mM HCl) e 2,5ml de FeCl3 (20mM) em solução aquosa. Uma alíquota de
100µl de extrato foi adicionado a 3 ml do reagente FRAP e incubado a 37°C em banho-maria por
30 minutos. As absorbâncias foram medidas após esse tempo e o espectrofotômetro foi zerado
com a solução FRAP. A curva de calibração foi feita com sulfato ferroso (100-2000µM)
(apêndice C), e os resultados foram expressos em µmol Fe2+/mg amostra (liofilizada).
2.2.5.5 Estabilidade oxidativa - Rancimat
Amostras de 5 g de óleo refinado de soja (fornecido pela empresa Cargill, sem adição de
antioxidantes) foram misturados com extratos das hortaliças na concentração de 100ppm, com
base no teor de compostos fenólicos. Em seguida, a mistura foi submetida a uma temperatura de
110±1°C sob fluxo de ar seco a taxa de 9L/h, conforme o método cd 12b-92 (AMERICAN OIL
CHEMIST´S SOCIETY, 2003), em equipamento Rancimat 743 (Metrohm AG, CH-9100 Herisau
Swatzerland). As leituras de condutividade crescente em função do acúmulo de compostos de
oxidação compuseram a curva, que traçada em função do tempo de reação, permitiu o cálculo do
período de indução (PI). Um controle preparado com óleo de soja sem antioxidante e amostras
contendo antioxidante sintético BHT na concentração de 100 ppm também foram submetidas a
essa análise.
Dessa forma, o Fator de Proteção (PF) foi calculado, através da equação (3):
42
Onde:
PIa = Período de indução do óleo com os extratos ou padrões, PIc = Período de indução do
controle (óleo sem os extratos ou padrões)
2.2.6 Análise estatística
As análises estatísticas dos resultados foram realizadas por meio do software SAS
(STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM, 2002), com a análise de variância por meio do
procedimento “GLM”. Para a comparação das médias, utilizou-se o teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
2.3 Resultados e Discussão
2.3.1 Aquisição dos vegetais e rendimento
Alguns legumes e verduras foram adquiridos em uma horta de Piracicaba, diretamente com o
produtor, enquanto que os outros foram obtidos no CEAGESP em São Paulo. As hortaliças que
apresentaram sujidades foram lavadas rapidamente, e as cascas, quando presentes, foram
retiradas. Posteriormente, foram congelados em bandejas para serem liofilizados no dia seguinte.
O método de liofilização foi escolhido para se evitar que altas temperaturas influenciassem na
perda de compostos fenólicos totais, uma vez que estes são sensíveis ao calor. Roy et al., (2007),
ao estudarem o efeito de altas temperaturas sobre diversos vegetais, verificaram que o calor
causou decaimento no teor de compostos fenólicos e no pH das amostras, demonstrando, assim,
que os compostos gerados durante o processo de aquecimento possuem características ácidas.
Esses produtos podem ser gerados devido a oxidação dos compostos fenólicos ou ainda por
reações adicionais desconhecidas.
Os aspectos dos vegetais in natura adquiridos podem ser visualizados na figura 14.
(3)
43
FIGURA 14 - Aspecto visual das amostras in natura adquiridas: 1) alface; 2) beterraba; 3) cenoura; 4) chicória; 5) rúcula; 6) almeirão; 7) acelga; 8) salsa; 9) abóbora moranga; 10) pepino; 11) espinafre; 12) repolho; 13) cebolinha; 14) açafrão; 15) agrião; 16) aipo; 17) alcachofra; 18) alho-poró; 19) aspargo; 20) brócolis; 21) nabo; 22) rabanete; 23) vagem
A tabela 3 apresenta o rendimento (porcentagem de massa) dos legumes e verduras após o
processo de liofilização. Nota-se que o vegetal que apresentou o menor rendimento (3,6%) e
maior umidade, foi o pepino, enquanto que o maior rendimento foi encontrado para o açafrão
(18,9%), seguido da alcachofra (18,7%) e brócolis (16,1%). Os resultados de todas as análises
foram expressos em base seca das amostras.
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 16
17 18 19 20
21 22 23
44
Tabela 3 - Rendimento dos legumes e verduras após o processo de liofilização
Hortaliças Rendimento (%)
Abóbora 7,1
Açafrão 18,9
Acelga 4,2
Agrião 6,5
Aipo 4,9
Alcachofra 18,7
Alface 4,2
Alho poro 10,9
Almeirão 7,2
Aspargo 6,6
Beterraba 12,5
Brócolis 16,1
Cebola 10,3
Cenoura 10
Chicória 5,7
Espinafre 5,5
Nabo 6,4
Pepino 3,6
Rabanete 5,4
Repolho 7,4
Rúcula 5,8
Salsa 8,7
Vagem 7,9
2.3.2 Análises físico-quimica das verduras e legumes
2.3.2.1 Espectrofotometria na região ultravioleta-visível
Os espectros de absorção na região UV-visível podem ser visualizados na figura 15.
Segundo Mabry, Markham e Thomas (1970) apud Oldoni (2007), a faixa do comprimento de
onda (�) na qual os compostos fenólicos absorvem luz se situa entre 220 e 350 nm. Foi por esse
motivo que não foram considerados os picos após 350nm. Markham, (1982) também destaca que
45
os flavonóides absorvem no UV-visível devido à presença das ligações duplas dos anéis
aromáticos.
A espectrometria na região ultravioleta e visível tem aplicação um tanto limitada em
análises qualitativas, porque o número de máximos e mínimos de absorção é relativamente
pequeno. Assim, a identificação não ambígua é frequentemente não possível. Ao ser escolhido
um solvente, deve-se considerar não apenas a sua transparência, mas também os seus possíveis
efeitos sobre o sistema absorvente (Owen, 1996). Geralmente solventes polares, como água,
álcoois, ésteres e cetonas, tendem a obliterar a estrutura fina espectral que se origina de efeitos
vibracionais; espectros que se aproximam aos de fases gasosa tem maior possibilidade de ser
observados em solventes não polares como hidrocarbonetos. Portanto, as posições de máximos de
absorção são influenciadas pela natureza do solvente. Evidentemente, o mesmo solvente deve ser
usado ao se comparar espectros de absorção com propósitos de comparação e identificação, como
foi feito neste trabalho.
Nota-se que a absorção máxima dos espectros das amostras variou de 234 a 336 nm. O fator
diluição das amostras foi de 1:5 para a beterraba, abóbora (moranga), cenoura, pepino, acelga,
repolho, nabo, alho poró, aipo e rabanete. Dentre estes, o vegetal que apresentou pico maior
nesta região foi o rabanete. O restante dos vegetais (alface, espinafre, almeirão, chicória, rúcula,
salsa, cebola, açafrão, agrião, aspargo, brócolis e alcachofra) foram analisados na diluição de
1:50, demonstrando assim maior concentração de compostos fenólicos. Dessa forma, e
preliminarmente, pode-se notar indício dos vegetais folhosos apresentarem maior quantidade
desses compostos.
Abóbora
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Açafrão
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Figura 15 - Espectros de absorção na região UV-visível dos extratos etanólicos das amostras
� máx=266nm � máx=234nm
46
(continua)
Acelga
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Agrião
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Aipo
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Alcachofra
0
0,5
1
1,5
200 300 400 500Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Alface
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Alho poró
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Figura 15 - Espectros de absorção na região UV-visível dos extratos etanólicos das amostras
� máx= 329nm � máx= 327nm
� máx= 329nm � máx= 323nm
� máx= 261nm
� máx= 330nm
47
(continuação)
Almeirão
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Aspargo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Beterraba
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Brócolis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Cebola
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Cenoura
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Figura 15 - Espectros de absorção na região UV-visível dos extratos etanólicos das amostras
� máx= 265nm
� máx= 328nm
� máx= 276nm
� máx= 270nm � máx= 333nm
48
(continuação)
Chicória
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Espinafre
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 250 300 350 400 450 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Nabo
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Pepino
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Rabanete
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Repolho
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Figura 15 - Espectros de absorção na região UV-visível dos extratos etanólicos das amostras
� máx= 336nm � máx= 332nm
� máx= 266nm � máx= 265nm
� máx= 268nm � máx= 278nm
49
(conclusão)
Rúcula
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Salsa
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Vagem
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
200 300 400 500
Comprimento de onda
Abs
orbâ
ncia
Figura 15 - Espectros de absorção na região UV-visível dos extratos etanólicos das amostras
2.3.2.2 Compostos fenólicos totais
A determinação do teor de compostos fenólicos totais se faz muito importante, pois vários
estudos têm demonstrado que eles são os principais responsáveis pela atividade antioxidante dos
vegetais. A tabela 4 apresenta o teor de compostos fenólicos totais encontrado nos extratos. Os
resultados foram expressos em mg de ácido gálico/g de amostra (liofilizada). Nota-se que houve
diferença significativa para a grande maioria das amostras, e dentre os melhores resultados, a
alface foi a melhor (16,9±0,19mg/g), diferindo significativamente do açafrão (12,8±0,73mg/g),
agrião (12,5±0,93mg/g), alcachofra (11,8±0,76mg/g) e espinafre (12,2 ± 0,48mg/g) . As
hortaliças que apresentaram a menor quantidade de compostos fenólicos foram a abóbora (1,6 ±
0,02mg/g), aipo (1,4±0,10mg/g), alho poró (1,7 ± 0,06mg/g), nabo (2,2 ± 0,04mg/g), pepino
� máx= 267nm � máx= 266nm
� máx= 264nm
50
(1,5±0,04mg/g), cenoura (1,2±0,05mg/g) e vagem (2,2 ± 0,31mg/g), todas estatisticamente
iguais.
Tabela 4 - Teor de compostos fenólicos totais nos extratos etanólicos das amostras
Verduras e Legumes Compostos fenólicos totais (mg/g)*
Abóbora 1,6±0,02KL
Açafrão 12,8±0,73B
Acelga 4,9±0,16GH
Agrião 12,5±0,93B
Aipo 1,4±0,10L
Alcachofra 11,8±0,76B
Alface 16,9±0,19A
Alho poró 1,7±0,06KL
Almeirão 2,7±0,2JK
Aspargo 5,2±0,21G
Beterraba 2,9±0,2IJ
Brócolis 7,9±0,25D
Cebola 5,9±0,22FG
Cenoura 1,2±0,05L
Chicória 7,2±0,13DE
Espinafre 12,2±0,48B
Nabo 2,2±0,04JKL
Pepino 1,5±0,04L
Rabanete 6,4±0,17EF
Repolho 3,9±0,02HI
Rúcula 9,8±0,42C
Salsa 7,0±0,15DEF
Vagem 2,2±0,31JKL * Valores das médias das triplicatas ± desvio padrão/ Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,05) pelo teste de Tukey
Melo et al. (2006) também encontraram resultados semelhantes aos apresentados neste
trabalho, sendo que o espinafre e alface crespa foram as que apresentaram os maiores teores de
compostos fenólicos e a cenoura a menor quantidade.
51
Segundo Gobbo-Neto e Lopes (2007), existem vários fatores que podem interferir no
conteúdo de metabólitos secundários nas plantas, dos quais os compostos fenólicos fazem parte.
Dentre estes estão a sazonalidade, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta,
adição de nutrientes, poluição atmosférica, danos mecânicos e ataque de patógenos. Llorach et al.
(2008), também destacam que diferenças nas condições agronômicas e ambientais podem afetar
o conteúdo de fenólicos presente nos vegetais, e que a informação genética (variedade) também
afeta diretamente na quantidade de tais compostos.
Hollman e Arts (2000); Manach et al. (2004) apud Llorach et al. (2008), ao analisarem o teor
de compostos fenólicos em vários tipos de alface e escarola, concluíram que estas hortaliças
folhosas possuem quantidades expressivas desses compostos, levando-se em consideração outros
vegetais que são considerados fontes importantes de polifenóis, como maçã, chá, brócolis e
cebola.
Roy et al. (2007) encontraram no espinafre grande quantidade de compostos fenólicos. Esses
autores ainda verificaram que este vegetal apresentou o dobro da quantidade de compostos
fenólicos, quando comparado com o repolho branco e o repolho chinês. Ismail, Marjan e Foong
(2004) também encontraram no espinafre grande quantidade de compostos fenólicos
(7167mg/100g de extrato vegetal, em base úmida).
Zhou e Yu (2006) constataram que o teor de fenólicos totais foi maior no brócolis e no
espinafre, em comparação com a cenoura. Já Chu et al. (2002) verificaram que o espinafre possui
maior quantidade de compostos fenólicos que o brócolis e a cenoura.
Abdullaev (2002) obteve resultados positivos ao estudar o efeito antitumoral do açafrão
(Crocus sativus L.). O autor cita, ainda, que um possível mecanismo para essa propriedade
anticâncer seja a efetiva inibição na cadeia de radicais livres por meio de seus constituintes
antioxidantes.
Wang et al. (2003) encontraram valores de 62 mg/g de compostos fenólicos em folhas de
alcachofra e 14mg/g em cabeças novas de alcachofra. Ao estudar a quantidade de compostos
fenólicos do brócolis e aspargo, Sun, Powers e Tang (2007), encontraram quantidades
semelhantes para os extratos metanólicos (4,9mg equivalentes em catequina /g em base seca). Já
para extratos aquosos, os autores encontraram resultado maior para o aspargo (4,9mg de
catequina equivalente/g em base seca) em relação ao brócolis (4,5mg de catequina equivalente/g
em base seca).
52
Hassimoto, Genovese e Lajolo (2005), ao analisarem a composição fenólica de alguns
vegetais, encontraram maiores quantidades para a alface vermelha, seguida do agrião, chicória e
repolho branco.
2.3.3 Determinação da atividade antioxidante
2.3.3.1 Atividade sequestrante do radical livre DPPH
O fator diluição utilizado nesta análise foi de 1:50 para a alface, espinafre, chicória, brócolis,
alcachofra, rabanete, açafrão, agrião e aspargo, e, 1:5 para as demais amostras, pois todos os
extratos foram preparados na mesma concentração. Nota-se, nessas condições, que a alface,
alcachofra, açafrão e espinafre apresentaram as maiores atividades antioxidantes, (54,9%),
(53,2%), (36,2%), (32,1%), respectivamente, levando-se em consideração tais extratos estavam
diluído 10 vezes em relação aos demais. Das amostras com fator de diluição menor (1:5), as que
apresentaram as melhores atividades antioxidantes foram rúcula (86%), beterraba (85,1%) e salsa
(78,4%). A atividade antioxidante pelo método sequestro do radical livre DPPH das amostras e a
dos padrões BHT e �-tocoferol, podem ser observadas na tabela 5. Melo et al. (2006) verificaram
que a alface crespa apresentou alta atividade antioxidante por esta metodologia e o vegetal que
apresentou a menor atividade foi o pepino. Concordando com a literatura, o pepino também foi o
vegetal com a menor atividade neste trabalho (12,5%).
Tabela 5 - Atividade antioxidante pelo seqüestro do radical livre DPPH nos extratos etanólicos das amostras (continua)
Verduras e Legumes Atividade Antioxidante (DPPH) (%)*
Abóbora2 39,7±0,76F
Açafrão1 36,2±2,00FG
Acelga2 64,1±1,06C
Agrião1 24,8±2,12IJK
Aipo2 25,7±2,58IJ
Alcachofra1 53,2±4,23E
Alface1 54,9±0,66DE
Alho- poró2 21,0±0,94K
Almeirão2 71,7±7,66B
Aspargo1 10,4±0,29L
53
Tabela 5 - Atividade antioxidante pelo seqüestro do radical livre DPPH nos extratos etanólicos das amostras (conclusão)
Verduras e Legumes Atividade Antioxidante (DPPH) (%)*
Beterraba2 85,1±1,06A
Brócolis1 21,8±0,76JK
Cebola2 57,8±1,26DE
Cenoura2 22±0,58JK
Chicória1 27,1±0,52HI
Espinafre1 32,1±0,25GH
Nabo2 51,4±2,63E
Pepino2 12,5±1,85L
Rabanete1 9,8±0,33L
Repolho2 59,3±2,97CD
Rúcula2 86±1,25A
Salsa2 78,4±4,06B
Vagem2 22,3±2,17JK
Padrão BHT (200ppm) 19,8±0,0003
Padrão �-tocoferol (200ppm) 96,3±0,001
* Valores das médias das triplicatas ± desvio padrão/ Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente (p<0,05) pelo teste de Tukey 1 Amostras com fator de diluição 1:50 2 Amostras com fator de diluição 1:5
Dentre as amostras com maior fator diluição (1:50), a alface (54,9±0,66%) e alcachofra
(53,2±4,23%) não diferiram significativamente na atividade antioxidante pelo método do DPPH•,
porém apresentaram diferença em relação ao açafrão (36,2±2,00%) e espinafre (32,1±0,25%). O
açafrão e a alcachofra não diferiram estatisticamente entre si. Em relação as amostras menos
diluídas (1:5), nota-se que a rúcula (86±1,25%) e a beterraba (85,1±1,06%) não diferiram
significativamente, não acontecendo o mesmo com a salsa (78,4±4,06%).
O espinafre possui atividade antioxidante superior ao brócolis, segundo Zhou e Yu, (2006).
Roy et al. (2007) também encontraram boa atividade antioxidante para o espinafre, em torno de
70 %, e bem superior aos repolhos branco e chinês.
Llorach et al. (2008), ao analisarem alfaces de variedade vermelha, variedade verde e
escarola, constataram que as primeiras apresentaram maior atividade antioxidante. Este fato pode
54
ser justificado pela grande quantidade de antocianinas (RICE-EVANS, MILLER, PAGANGA,
1997). Os autores notaram, ainda, que a escarola apresentou a menor porcentagem no sequestro
do radical DPPH.
Em 2002, Ou et al., ao avaliarem a capacidade antioxidante de 927 amostras de 13 vegetais,
verificaram que, assim como os compostos fenólicos, a atividade antioxidante é dependente da
espécie, origem geográfica, e época de colheita, e que, dos vegetais estudados, o pimentão verde,
o espinafre, a cebola roxa, o brócolis, a beterraba, rica em antocianinas, e a couve-flor
apresentaram maior potencial antioxidante.
De acordo com a tabela 5, pode-se verificar que a beterraba também apresentou boa
atividade antioxidante pelo método do DPPH (85,1%). Antocianinas presentes na beterraba
conferem as várias nuanças entre laranja, vermelho e azul, exibidas pelas frutas, hortaliças, flores,
folhas e raízes (FRANCIS, 1989). Recentemente, o interesse por pigmentos tem sido
intensificado, uma vez que pesquisas vêm demonstrando que as antocianinas e suas respectivas
formas agliconas são compostos bioativos e que, entre vários outros efeitos fisiológicos, possuem
atividade antioxidante (KÄHKÖNEN; HEINONEN, 2003), propriedade anti-inflamatória
(SEERAM; NAIR, 2002); promovem vaso-dilatação (BURNS et al., 2000), atuam na prevenção
da hiperglicemia (MATSUI et al., 2002), inibem o crescimento de células cancerígenas (MEIRES
et al., 2001), estimulam a secreção de insulina (JAYAPRAKASAM et al., 2005) e melhoram a
adaptação da visão noturna e previnem a fadiga visual (NAKAISHI et al., 2000).
Assimopoulou, Sinakos e Papageorgiou (2005) ao estudarem o açafrão produzido na Grécia
(Crocus sativus L.), obtiveram atividade antioxidante de 26,08% e 51,02% para extratos
metanólicos em concentrações de 100 e 2500 ppm, respectivamente.
A figura 16 apresenta várias curvas de cinética das amostras em várias concentrações
utilizadas para o cálculo do EC50, o qual é definido como a quantidade de antioxidante necessária
para reduzir em 50% a concentração inicial do radical livre DPPH. Para isto foi feita uma seleção
das amostras que apresentaram os melhores resultados e então calculado o EC50 das mesmas. O
tempo utilizado para a estabilização na absorbância variou de acordo com a amostra, ou seja, de
140 a 160 minutos.
55
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FIGURA 16 - Cinética de redução do radical livre DPPH dos extratos das hortaliças
Alface Açafrão
Alcachofra Espinafre
Rúcula Salsa
Chicória Brócolis
56
A hortaliça que apresentou o menor valor de concentração do extrato para reduzir em 50% a
quantidade inicial do radical DPPH foi a alface (17,07mg/ml), seguida da alcachofra
(18,14mg/ml), como demonstrado a tabela 6. A salsa foi a amostra que apresentou a maior
concentração (109,82mg/ml). Os extratos que apresentaram menores valores do EC50 podem ser
considerados melhores, uma vez que é necessária menor concentração para a redução de 50% do
radical DPPH.
Tabela 6 - Valor do EC50 (mg/ml) dos extratos das hortaliças
Verduras e Legumes EC50 (mg/ml)
Alface 17,07
Açafrão 21,14
Alcachofra 18,14
Brócolis 45,87
Chicória 32,2
Espinafre 22,87
Rúcula 104,92
Salsa 109,82
2.3.3.2 Atividade antioxidante pelo método ABTS•+
Esta metodologia está diretamente relacionada com o padrão Trolox, e, os resultados são
calculados em função do mesmo. Dentre os métodos químicos utilizados para se determinar a
atividade antioxidante pelo sequestro de radicais livres, o método ABTS•+ é um dos mais rápidos
e que oferece resultados reprodutíveis, além de outras vantagens como: oferecer vários máximos
de absorção e boa solubilidade, permitindo análise de compostos tanto de natureza lipofílica
quanto hidrofílica (KUSKOSKI et al., 2005). Na tabela 7 pode-se visualizar os resultados da
atividade antioxidante equivalente ao Trolox pelo método ABTS•+.
Os melhores resultados encontrados neste trabalho para a metodologia do ABTS•+ foram
para as amostras de açafrão (111,8±5,03 µMtrolox/g), alface (96,5±0,87 µMtrolox/g) e agrião
(79,9±0,10 µMtrolox/g), os quais foram estatisticamente diferentes entre si. As amostras que
apresentaram os piores resultados foram a cenoura (8,1±0,14 µMtrolox/g), alho-poró (6,9±1,19
µMtrolox/g), aipo (6,2±1,77 µMtrolox/g) e vagem (6,1±1,65 µMtrolox/g), as quais foram
estatisticamente iguais.
57
Tabela 7 - Atividade antioxidante equivalente ao Trolox nos extratos etanólicos das amostras pelo método do ABTS•+
Verduras e Legumes Atividade antioxidante (µMtrolox/g)*
Abóbora 12,7±0,05JK
Açafrão 111,8±5,03A
Acelga 26,2±3,3GH
Agrião 79,9±0,10C
Aipo 6,2±1,77KL
Alcachofra 61,6±2,28D
Alface 96,5±0,87B
Alho-poró 6,9±1,19KL
Almeirão 64,1±2,39D
Aspargo 33,2±0,61EF
Beterraba 11,1±1,21JKL
Brócolis 33,9±1,22E
Cebola 26±2,97FG
Cenoura 8,1±0,14KL
Chicória 28,2±4,49EFG
Espinafre 32,0±4,41EFG
Nabo 6,39±1,88KL
Pepino 9,6±1,46JKL
Rabanete 34,6±1,70E
Repolho 16,1±0,14IJ
Rúcula 18±1,7HI
Salsa 29,1±1,8EFG
Vagem 6,1±1,65KL * Valores das médias das triplicatas ± desvio padrão/ Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem
estatisticamente (p<0,05) pelo teste de Tukey
Zhou e Yu (2006) ao analisarem a atividade antioxidante de amostras de vegetais pela
metodologia do ABTS•+, verificaram que o espinafre apresentou a maior atividade antioxidante
em relação ao brócolis, e este, por sua vez, maior atividade antioxidante em relação a cenoura. É
58
possível verificar que a cenoura (8,1µMtrolox/g) não apresentou boa atividade antioxidante por
esta metodologia também, sendo uma das menores dentre todos os vegetais analisados (tabela 7).
Nilsson et al. (2005) também obtiveram resultados nos quais concluíram que a atividade
antioxidante da cenoura é bem inferior a encontrada em espinafre.
Llorach et al. (2008), encontraram valores bem maiores de atividade antioxidante para
alfaces de variedade vermelha em relação a alface de variedade verde e escarola. Maiani et al,
(2009) citam ainda que a alface, o espinafre e a cenoura são vegetais com consideráveis teores de
�-caroteno (870-2960; 3100-4810 e 4350-8840µg/100g ou 100ml (peso fresco),
respectivamente), o que pode contribuir com a atividade antioxidante.
Sun, Powers e Tang (2007) encontraram atividades antioxidantes bem próximas pelo método
do ABTS•+ para o aspargo e brócolis nos extratos metanólicos (26,4 e 26,7mmol/kg) e aquosos
(26,2 e 25,1mmol/kg). As atividades antioxidantes desses vegetais por esta metodologia também
foram semelhantes neste trabalho.
2.3.3.3. Autoxidação do sistema �-caroteno/ácido linoléico
Esta metodologia avalia a capacidade dos antioxidantes presentes na amostra analisada de
não permitir que ocorra a peroxidação do ácido linoléico. O método está fundamentado em
medidas espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do �-caroteno induzida pelos produtos
de degradação oxidativa do ácido linoléico (MARCO, 1968 apud DUARTE-ALMEIDA, 2006).
Um dos fatores que podem influenciar nesta análise é o meio onde ocorre a reação, que se
caracteriza por ser uma emulsão, apresentando regiões polares e apolares ao mesmo tempo.
Dependendo a polaridade da amostra, esta pode interagir de forma mais intensa ou menos intensa
com a emulsão.
A tabela 8 mostra os resultados da atividade antioxidante das amostras analisadas. Os ensaios
foram realizados com extrato puro, e sem diluição, para todas as amostras. O açafrão se mostrou
superior (92,8%), seguida da alface (90%), aspargo (88,3%) e espinafre (85,6%). O vegetal que
apresentou a menor atividade foi o nabo, com 3,4% de poder antioxidante. Os padrões �-
tocorefol e BHT (ambos a 200ppm) foram utilizados como controles positivos.
Estatisticamente, nota-se que várias amostras diferiram entre si. Dentre os melhores
resultados, o açafrão (92,8±1,3%), alface (90±3,0%) e aspargo (88,3±2,8%) não diferiram
estatisticamente.
59
Melo et al. (2006) verificaram que o espinafre foi o que apresentou a maior inibição da
oxidação lipídica (81,6%). A couve folha e a alface lisa também demonstraram boa atividade.
Tabela 8 - Atividade antioxidante pelo sistema �-caroteno/ácido linoléico nos extratos etanólicos das amostras
Verduras e Legumes Atividade antioxidante (%)*
Abóbora 54,3±5,3GH
Açafrão 92,8±1,3A
Acelga 65,6±3,9DEF
Agrião 70,9±4,6D
Aipo 36,2±2,2I
Alcachofra 57,7±1,3FGH
Alface 90±3,0AB
Alho-poró 9,45±0,6LM
Almeirão 82,2±4,9C
Aspargo 88,3±2,8ABC
Beterraba 15,5±9,7JK
Brócolis 54,7±2,7GH
Cebola 28,8±4,8I
Cenoura 49,5±7,5H
Chicória 82±1,9C
Espinafre 85,6±1,5BC
Nabo 3,4±1,7M
Pepino 67,6±3,0DE
Rabanete 22,2±6,0J
Repolho 16,7±4,7JK
Rúcula 54±4,2GH
Salsa 60,7±2,1EFG
Vagem 67,0±2,3DE
�-tocoferol (200ppm) 88±1,6
BHT (200ppm) 93,9±0,21 * Valores das médias das triplicatas ± desvio padrão/ Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem
estatisticamente (p<0,05) pelo teste de Tukey
60
Na figura 17 pode-se observar a cinética da porcentagem de inibição durante o tempo de 120
minutos. O acompanhamento da atividade foi feito em intervalos de 20 minutos.
Decaimento da atividade antioxidante
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
Ati
vid
ade
anti
oxid
ante
(%
)
Abóbora
Açafrão
Acelga
Agrião
Aipo
Alcachofra
Alface
Alho poró
Almeirão
Aspargo
Beterraba
Brócolis
Controle
Decaimento da atividade antioxidante
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
Ati
vid
ade
anti
oxid
ante
(%
)
Cebola
Cenoura
Chicória
Espinafre
Nabo
Pepino
Rabanete
Repolho
Rúcula
Salsa
Vagem
Controle
Figura 17 - Cinética da atividade antioxidante (%) dos extratos etanólicos das amostras
Nota-se que alguns vegetais que até então não tinham apresentado uma atividade
antioxidante destacável por outros métodos, como o pepino e a abóbora, se mostraram com uma
boa capacidade de evitar a peroxidação lipídica pelo modelo do sistema do �-caroteno/ácido
linoléico, apesar da baixa quantidade de fenólicos totais.
Ismail, Marjan e Foong (2004) notaram que o espinafre também apresentou maior atividade
antioxidante pelo sistema do ácido linoléico/�-caroteno em relação a duas variedades de repolho
analisadas.
Collins (2004) apud Neto et al. (2006) cita que as folhas de alface são ricas em folato, contém
�-caroteno, além da vitamina C, potássio e certos fitoquímicos, como os flavonóides e lactucina,
favorecendo, assim, sua notável capacidade antioxidante.
Sun, Powers e Tang (2007) encontraram atividades antioxidantes menores pelo método �-
caroteno/ácido linoléico para o aspargo, em relação ao brócolis, nos extratos metanólicos. Porém,
nos extratos aquosos, a atividade antioxidante foi bem maior para o brócolis.
2.3.3.4 Atividade antioxidante através da redução do ferro (FRAP)
A hortaliça que conseguiu reduzir maior quantidade de Fe3+ em Fe2+ foi a alface
(0,45µmolFe2+/mg), seguida do agrião (0,27 µmolFe2+/mg) e espinafre (0,27 µmolFe2+/mg),
conforme pode ser visualizado na tabela 9. Os menores resultados foram apresentados pelas
61
amostras aipo, alho poró, cenoura, nabo e vagem, todas com 0,01 µmolFe2+/mg. Nota-se que o
açafrão, que apresentou boa atividade nas demais metodologias, nesta demonstrou valor
intermediário (0,17 µmolFe2+/mg).
Tabela 9 - Atividade antioxidante pela redução do ferro (FRAP) nos extratos etanólicos das amostras
Verduras e Legumes Atividade antioxidante (µmol Fe2+/mg)*
Abóbora 0,02±0,001JK
Açafrão 0,17±0,004DE
Acelga 0,05±0,004I
Agrião 0,27±0,018B
Aipo 0,01±0,0006K
Alcachofra 0,09±0,006H
Alface 0,45±0,004A
Alho-poró 0,01±0,001K
Almeirão 0,22±0,010C
Aspargo 0,09±0,02H
Beterraba 0,04±0,004IJ
Brócolis 0,18±0,012D
Cebola 0,13±0,008FG
Cenoura 0,01±0,0009K
Chicória 0,15±0,007EF
Espinafre 0,27±0,019B
Nabo 0,01±0,0004JK
Pepino 0,016±0,001JK
Rabanete 0,09±0,011H
Repolho 0,05±0,002I
Rúcula 0,11±0,006GH
Salsa 0,10±0,001GH
Vagem 0,01±0,0012JK
Ácido Ascórbico (5ppm) 16,23±0,01 * Valores das médias das triplicatas ± desvio padrão/ Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem
estatisticamente (p<0,05) pelo teste de Tukey
62
Em relação a análise estatística, foi possível observar que a alface (0,45±0,004 µmolFe2+/mg)
diferiu significativamente das demais amostras. O agrião (0,27±0,018 µmolFe2+/mg) e o
espinafre (0,27±0,019 µmolFe2+/mg) não diferiram entre si. Dentre as amostras com os piores
resultados, a beterraba (0,04±0,004 µmolFe2+/mg), abóbora (0,02±0,001 µmolFe2+/mg) e pepino
(0,016±0,001 µmolFe2+/mg) não diferiram significativamente.
Pellegrini et al. (2003), analisaram a atividade antioxidante de várias hortaliças e observaram
as melhores atividades no espinafre e brócolis. Os mesmos autores encontraram valores bem
menores para o alho-poró, cenoura e aipo. Zitnanová et al. (2006) encontraram atividade
antioxidante menor e semelhante para o aipo, alho-poró e cenoura em comparação com o
repolho. Esses dados corroboram com os encontrados no presente trabalho.
Ao analisarem o poder antioxidante da alface e escarola, Llorach et al., (2008) encontraram
atividades bem maiores nas alfaces de variedade vermelha em relação as de variedade verde.
Dentre as verdes, a continental (323,4 TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity)) foi a única
que apresentou maior atividade em relação a escarola (132,6 TEAC). As alfaces iceberg (98,2
TEAC) e romana (114,3 TEAC) mostraram atividade antioxidante inferior a escarola pelo
método do FRAP.
A alcachofra-brava, estudada por Kukic et al. (2008), apresentou atividade de 0,35
µmolFe2+/mg em base seca para os extratos metanólicos, e, 0,34 µmolFe2+/mg para os extratos
aquosos. Neste trabalho, a alcachofra apresentou poder de redução do Fe3+ bem menor. Tal
diferença pode ter ocorrido pelas variações ambientais nas quais cada amostra foi cultivada,
como clima e solo. Além disso, a variabilidade genética entre os cultivares também pode ter
contribuído para mudança no perfil dos compostos fenólicos e, como consequencia, na atividade
antioxidante.
2.3.3.5. Atividade antioxidante pelo método Rancimat
A atividade antioxidante por esta metodologia determina a estabilidade oxidativa de óleos e
gorduras. O período de indução é caracterizado pela mudança da condutividade da água
deionizada devido aos produtos gerados da oxidação. O processo é realizado sob altas
temperaturas e constante aeração.
A atividade antioxidante pela metodologia do Rancimat foi feita adicionando-se ao óleo de
soja desprovido de conservantes uma concentração de 100 ppm do extrato (equivalentes em
63
compostos fenólicos). A análise de algumas amostras não foi realizada devido à grande
quantidade de extrato necessária para atingir tal concentração (100ppm), e, uma vez que o óleo
ficou com muita amostra, os resultados poderiam não ser confiáveis, com a possibilidade de
superestimação da atividade antioxidante.
De acordo com a tabela 10, todas as hortaliças analisadas, com exceção da chicória, tiveram
período de indução maior que o do controle (óleo de soja puro, sem adição de antioxidantes),
apresentando fator de proteção e consequente atividade antioxidante. As amostras que
apresentaram os maiores períodos de indução foram o agrião (8,7h) e o brócolis (7,6h), superando
inclusive o período de indução do padrão BHT (7,58h). Pode-se afirmar que, com exceção da
chicória, o óleo de soja adicionado dos extratos das hortaliças necessitaram de tempo maior para
a formação dos radicais livres, moléculas reativas que desencadeiam a fase de iniciação (processo
de oxidação), atrasando, assim, a fase de propagação e consequentemente a fase de terminação da
oxidação. É possível observar que as amostras que apresentaram as melhores atividades em
outras metodologias, como a alface e o açafrão, nesta não se mostraram tão eficientes.
A figura 18 apresenta o fator de proteção (relação entre o período de indução e o controle)
calculado para as amostras a partir da análise de estabilidade oxidativa do óleo de soja adicionado
aos extratos.
Tabela 10: Atividade antioxidante pelo método do Rancimat nos extratos etanólicos das amostras (continua)
Verduras e Legumes Período de indução(h)a
Abóbora -
Açafrão 6,9±0,26
Acelga 6,5±0,06
Agrião 8,7±0,10
Aipo -
Alcachofra 7,2±0,03
Alface 6,2±0,01
Alho-poró -
Almeirão -
Aspargo 6,6±0,24
64
Tabela 10: Atividade antioxidante pelo método do Rancimat nos extratos etanólicos das amostras (conclusão)
Verduras e Legumes Período de indução(h)a
Beterraba -
Brócolis 7,6±0,29
Cebola 7,3±0,20
Cenoura -
Chicória 5,9±0,06
Espinafre 7,5±0,35
Nabo -
Pepino -
Rabanete 6,9±0,10
Repolho -
Rúcula 6,7±0,33
Salsa 6,8±0,08
Vagem -
Controle 6,19±0,34
BHT 7,58±0,09 a Valor é a média ± desvio padrão - Período de indução não calculado devido à grande quantidade de amostra necessária para se atingir a concentração de 100 ppm de compostos fenólicos totais
Figura 18 - Fator de proteção obtido a partir da análise de estabilidade oxidativa (Rancimat) do óleo de soja adicionado aos extratos das hortaliças Médias das triplicatas e o desvio padrão estão indicados. Letras diferentes indicadas nas colunas diferem estatisticamente (p<0,05) pelo teste de Tukey
65
É possível observar que houve diferença significativa entre várias hortaliças. As amostras
agrião (1,29), brócolis (1,29) e cebola (1,24), que apresentaram os maiores fatores de proteção,
não diferiram estatisticamente entre si, mas diferiram das demais.
O padrão BHT (butil hidroxitolueno) foi utilizado na análise, nas mesmas condições das
amostras (concentração de 100 ppm), como forma de comparação, por ser um antioxidante
sintético amplamente empregado pela indústria brasileira no combate aos processos oxidativos
que acontecem nos alimentos.
Alguns trabalhos relatam sua utilização em extratos vegetais, como o Kowalski et al.; 2004,
que analisaram a estabilidade oxidativa em amostras de óleo de colza, girassol e soja e
encontraram valores de 7,1 a 11,4 horas para o período de indução numa temperatura de 110°C.
Broinizi et al., 2007, analisaram o efeito da adição do extrato do pedúnculo de caju. Murcia,
Jiménez, Martínez-Tome, 2001, também empregaram o método com extrato de frutas, como
manga, mamão, abacate, maracujá, abacaxi, carambola e banana, e puderam notar uma pequena
variação no fatores de proteção das mesmas. Além disso, tais autores comparam os resultados
com o padrões BHT e BHA.
Prado, 2009, encontrou valores bem próximos no fator de proteção das frutas, de 1,02 a 1,13,
e no período de indução das mesmas, variando de 7,15 a 7,94 horas.
O presente trabalho encontrou variações de 5,9 a 8,7 horas entre as hortaliças, e fator de
proteção de 0,98 a 1,29 (em torno de 30% de diferença na resistência ao ranço), ressaltando,
dessa forma, que a variação nos resultados estão coerentes com a literatura.
Dessa forma, é possível constatar que a análise antioxidante pelo método do Rancimat é
amplamente empregada e confiável, podendo ser usada como fator de proteção indicativo para a
definição da vida útil de produtos ou ainda seleção dentre vários antioxidantes.
2.3.4 Correlação do teor de compostos fenólicos com diferentes métodos de atividade
antioxidante
De acordo com a figura 19 é possível verificar, com base nas diferentes metodologias
utilizadas, que não houve correlação linear entre o teor de compostos fenólicos e a atividade
antioxidante para a maioria dos vegetais. A correlação para o método do DPPH• foi feita através
do EC50, e notou-se correlação baixa (R2= 0,34). Os vegetais que tiveram as melhores atividades
para o método do EC50 foram a alface, a alcachofra e o açafrão. A alface e o açafrão
66
apresentaram as maiores quantidades de compostos fenólicos totais. A rúcula, a salsa, a chicória e
o brócolis mostraram ter atividade antioxidante considerável, mesmo com quantidades menores
de compostos fenólicos.
Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante (EC50) R
2 = 0,34
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100 120
EC50 (concentração mg/ml)
Com
pos
tos fe
nól
icos
(m
g/g) Alface
Açafrão
Alcachofra Espinafre Rúcula
SalsaChicóriaBrócolis
Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante ( �-caroteno/ácido linoléico)
R2 = 0,2749
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100
% atividade antioxidante �-caroteno/ácido linoléico
Com
pos
tos
fenól
icos
(m
g/g)
Alface
Alcachofra
Agrião
Rúcula
Açafrão
Espinafre
Brócolis Salsa Chicória
Aspargo
Rabanete
Cebola
Nabo
Repolho Beterraba
Alho poró
Aipo Cenoura
Abóbora
Acelga
Vagem
PepinoAlmeirão
FIGURA 19 - Correlação entre compostos fenólicos totais e as diferentes metodologias antioxidantes
utilizadas: A- Compostos fenólicos e DPPH; B- Compostos fenólicos e sistema do �-caroteno/ácido linoléico; C- Compostos fenólicos e ABTS; D- Compostos fenólicos e FRAP; E- Compostos fenólicos e Rancimat
A
B
67
(conclusão)
Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante (ABTS)
R2 = 0,6319
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100 120
Atividade antioxidante (µMtrolox/g)
Com
pos
tos fe
nól
icos
(m
g/g)
EspinafreAlcachofra
Agrião
Alface
Açafrão Rúcula
Almeirão
Brócolis
Rabanete
Aspargo
Salsa
Chicória
Cebola Acelga
Repolho
AbóboraPepinoCenoura
VagemAlho poró
Aipo
Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante (FRAP) R
2 = 0,686
0
3
6
9
12
15
18
21
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
Atividade antioxidante (µmol Fe2+/mg)
Com
pos
tos fe
nólic
os (m
g/g)
Nabo Abóbora
Pepino
BeterrabaRepolho
Acelga Aspargo Rabanete
SalsaCebola
ChicóriaBrócolis
Rúcula
AçafrãoAgrião
Espinafre
Almeirão
Alface
Alcachofra
Alho poró Cenoura
Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante (Rancimat)
R2 = 0,0347
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Período de indução (horas)
Com
pos
tos fe
nól
icos
(m
g/g) Alface
Chicória
Acelga AspargoCebola Rabanete
Salsa Brócolis
Rúcula
Açafrão
Alcachofra
EspinafreAgrião
FIGURA 19 - Correlação entre compostos fenólicos totais e as diferentes metodologias antioxidantes utilizadas: A- Compostos fenólicos e DPPH; B- Compostos fenólicos e sistema do �-caroteno/ácido linoléico; C- Compostos fenólicos e ABTS; D- Compostos fenólicos e FRAP; E- Compostos fenólicos e Rancimat
C
D
E
68
Na metodologia do �-caroteno/ácido linoléico (figura 19B) observa-se que o açafrão, a alface
e o espinafre apresentaram as maiores quantidades de compostos fenólicos e atividades
antioxidantes, porém também não foi encontrada uma correlação boa (R2 = 0,2749). Nos métodos
ABTS•+ e FRAP (figura 19C e D) foram encontrados os valores de correlações de 0,6319 e 0,686,
respectivamente, sendo estas duas as metodologias, junto com o EC50, as que apresentaram as
maiores correlações com teor de compostos fenólicos. Já no método do Rancimat (figura 19E) a
correlação foi muito baixa e de apenas 0,0347. Estes resultados demonstram que a atividade
antioxidante varia de metodologia para metodologia e que nem sempre os vegetais que
apresentaram as menores quantidades de compostos fenólicos, possuem as menores atividades
antioxidantes, como no caso da beterraba, que no método do radical livre DPPH obteve atividade
considerável, mesmo com pouca quantidade de compostos fenólicos.
Segundo HUANG (2005), os ensaios antioxidantes disponíveis hoje podem ser classificados
como diretos, quando envolvem estudos de cinética química, e indiretos, quando envolvem
reações de transferência de elétrons. Os métodos diretos caracterizam-se pela presença de uma
competição entre uma sonda oxidável e o antioxidante pelos radicais livres gerados por uma fonte
de radicais livres (ROGINSKI et al., 2005). Substratos para oxidação podem ser lipídios, como
no caso da metodologia do �-caroteno/ ácido linoléico. Tomei e Salvador (2007) destacam que
cada metodologia utilizada possui vantagens e desvantagens, e que os métodos diretos são mais
adequados para a avaliação da atividade antioxidante, porém muitos deles são tempo-
dependentes, o que exige experiência em reações de cinética química. Já os métodos indiretos,
como o ABTS•+, o DPPH• e o FRAP são de mais fácil aplicabilidade e manipulação, apesar de
apresentarem baixa reprodutibilidade devido ao fato dos resultados serem altamente dependentes
da concentração de reagentes e tempo de incubação.
O método ABTS•+ é tecnicamente simples e pode ser avaliado em várias faixas de pH, o que
torna essa metodologia importante para o conhecimento do efeito do pH em mecanismos
antioxidantes. Além disso, o radical ABTS é solúvel tanto em água como em solventes orgânicos,
o que permite a determinação da atividade antioxidante tanto em amostras hidrofílicas como
lipofílicas. Porém este método vem sendo criticado pelo fato do radical ABTS não ser um
representante das biomoléculas e nem mesmo ser encontrado em nenhum sistema biológico.
Destaca-se, ainda, que termodinamicamente, qualquer componente que apresente um potencial
redox menor que o radical ABTS pode reagir com o mesmo (MAGALHÃES et al., 2008).
69
Como vantagens do método do DPPH• estão o fato deste ser um radical estável, disponível
comercialmente e não precisar ser gerado antes da análise, como é o caso do radical ABTS. É
considerado um método espectrofotométrico fácil e utilizado na medição da atividade
antioxidante de compostos puros e moléculas complexas. Por outro lado, a acessibilidade do
radical DPPH é o maior determinante da reação, uma vez que pequenas moléculas, que têm
melhor acesso ao radical, possuem relativamente maior atividade antioxidante. Muitos compostos
antioxidantes maiores que reagem rapidamente com radicais peroxil podem reagir vagarosamente
ou nem mesmo reagir neste método. Além disso, o radical DPPH ou similares a ele inexistem em
sistemas biológicos. Carotenóides ou outros compostos que absorvem no mesmo comprimento de
onda da análise podem afetar as medidas espectrofotométricas. Outra limitação desta
metodologia se dá ao fato de que esta não pode ser realizada com plasma, uma vez que as
proteínas precipitam em reações com meio alcoólico. A capacidade sequestrante contra o radical
DPPH é fortemente influenciada pelo solvente e pH da reação. (MAGALHÃES et al., 2008).
O método FRAP é considerado como simples e barato. É um indicador adicional da atividade
antioxidante. Porém, pode-se considerar algumas limitações, como a de que qualquer composto
com potencial redox menor que o do par Fe(III)/Fe(II), possa teoricamente reduzir o Fe(III) em
Fe(II), contribuindo para o valor do FRAP e induzindo a resultados maiores e falsos. O tempo de
30 minutos ou mais é necessário para que alguns compostos fenólicos, como o ácido caféico,
ácido ferúlico, quercetina e ácido tânico possam reduzir o Fe(III). Compostos que absorvem no
comprimento de onda da análise podem interferir e causar uma superestimação no valor FRAP
(MAGALHÃES et al., 2008).
Considerando as limitações apresentadas pelas metodologias antioxidantes é possível afirmar
que, para alguns vegetais, a não existência de uma correlação direta entre o teor de compostos
fenólicos se justifica pela ampla variedade química dessas amostras.
2.3.5 Correlação entre os diferentes métodos de análise antioxidante
Foi possível notar, de forma geral, que a alface obteve destaque na atividade antioxidante em
todas as metodologias, com exceção do Rancimat. O açafrão também apresentou boa atividade
para a maioria das metodologias. Porém, observou-se que nem sempre as amostras com maior
poder antioxidante foram as mesmas para todas as metodologias, ou seja, nem sempre as
amostras que se apresentaram melhores para um método, se mostraram eficientes, e, da mesma
70
maneira para os demais. Um exemplo disso é o açafrão, que demonstrou ser um bom antioxidante
nos métodos do DPPH•, ABTS+• e �-caroteno, e atingiu valores intermediários para os métodos
do FRAP e Rancimat. Pode-se, portanto, afirmar, que não houve relação direta da atividade das
amostras em relação a todas as metodologias. A figura 20 apresenta a correlação entre a atividade
das amostras nas diferentes metodologias utilizadas. De forma geral, pode-se constatar que as
correlações entre os métodos foram de muito fracas a fraca. A maior correlação (R2) foi obtida
com os métodos ABTS+• e FRAP (0,5958).
Correlação entre os métodos EC50 e ABTSR
2 = 0,3603
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
EC50 (concentração mg/ml)
AB
TS
(µ
Mtr
olox
/g)
Açafrão
Alface
Alcachofra
EspinafreSalsa
RúculaChicóriaBrócolis
Correlação entre os métodos EC50 e �-carotenoR
2 = 0,3935
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120
EC50 (concentração mg/ml)
�-c
arot
eno
(%)
Alface
Açafrão
Espinafre
Alcachofra Rúcula
Salsa
Chicória
Brócolis
Figura 20 - Correlação entre as diferentes metodologias utilizadas: A- EC50 e ABTS, B- EC50 e �-
caroteno, C- EC50 e FRAP, D- EC50 e Rancimat, E- ABTS e FRAP, F- ABTS e �-caroteno, G- ABTS e Rancimat, H- �-caroteno e FRAP, I- �-caroteno e Rancimat, J- FRAP e Rancimat
A
B
71
(continua)
Correlação entre os métodos EC50 e FRAPR
2 = 0,2422
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 20 40 60 80 100 120
EC50 (concentração mg/ml)
FR
AP
(µm
olF
e2+/m
g) Alface
Espinafre
Açafrão
Alcachofra
Rúcula
Salsa
Brócolis
Chicória
Correlação entre os métodos EC50 e Rancimat R2 = 0,0032
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120
EC50 (concentração mg/ml)
Ran
cim
at (
per
íodo
de
ind
uçã
o (h
))
Espinafre Alcachofra
Alface
Açafrão
RúculaSalsa
Chicória
Brócolis
Correlação entre os métodos ABTS e FRAPR2 = 0,5958
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 20 40 60 80 100 120
ABTS (µMtrolox/g)
FR
AP
(µ
mol
Fe2
+/m
g)
Açafrão
Alface
Agrião Almeirão
Alcachofra
Espinafre
Brócolis
Rabenete
AspargoChicória
CebolaSalsa
Acelga
Rúcula
AbóboraRepolhoBeterraba
PepinoVagem
AipoAlho po ró
Ceno ura
Figura 20 - Correlação entre as diferentes metodologias utilizadas: A- EC50 e ABTS, B- EC50 e �-caroteno, C- EC50 e FRAP, D- EC50 e Rancimat, E- ABTS e FRAP, F- ABTS e �-caroteno, G- ABTS e Rancimat, H- �-caroteno e FRAP, I- �-caroteno e Rancimat, J- FRAP e Rancimat
C
D
E
72
(continuação)
Correlação entre os métodos ABTS e �-caroteno R2 = 0,3568
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
ABTS (µMtrolox/g)
�-c
arot
eno
(%)
AçafrãoAlface
Agrião
Almeirão
Alcachofra
Rabanete
Brócolis
Aspargo
Espinafre Chicória
Salsa Acelga
Cebola
Repolho
Rúcula
Vagem Pepino
AbóboraCenoura
Aipo
BeterrabaAlho poró
Nabo
Correlação entre os métodos ABTS e RancimatR2 = 0,0254
0
2
4
6
8
10
0 20 40 60 80 100 120
ABTS (µMtrolox/g)
Ran
cim
at (
per
íod
o d
e in
du
ção
(h))
Açafrão
Alface
Agrião
Alcachofra
Rúcula
BrócolisRabanete
Aspargo
Cebola
Acelga
Chicória
Salsa
Espinafre
Correlação entre os métodos �-caroteno e FRAPR2 = 0,3407
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
�-caroteno (%)
FR
AP
(µ
mol
Fe2
+/m
g)
Alface
Agrião Espinafre
Açafrão
Aspargo
Almeirão
Chicória
Nabo Alho poróBeterraba
Repolho
RabaneteCebola
Aipo
Brócolis
Pepino Vagem Cenoura
Rúcula
Acelga
Salsa
Alcachofra
Abóbora
Figura 20 - Correlação entre as diferentes metodologias utilizadas: A- EC50 e ABTS, B- EC50 e �-
caroteno, C- EC50 e FRAP, D- EC50 e Rancimat, E- ABTS e FRAP, F- ABTS e �-caroteno, G- ABTS e Rancimat, H- �-caroteno e FRAP, I- �-caroteno e Rancimat, J- FRAP e Rancimat
F
G
H
73
(conclusão)
Correlação entre �-caroteno e RancimatR2 = 0,0448
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
�-caroteno (%)
Ran
cim
at (
per
íodo
de
indu
ção
(h))
Rabanete
Cebola
Agrião
Rúcula
Brócolis Alcachofra
Salsa Acelga
Espinafre
Chicória
Aspargo Alface
Açafrão
Correlação entre os métodos FRAP e RancimatR2 = 0,0188
0
2
4
6
8
10
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
FRAP (µmolFe2+/mg)
Ran
cim
at (
per
íod
o d
e in
du
ção
(h))
Alface
Agrião
EspinafreBrócolis
Açafrão Chicória
Cebola
Rúcula
Salsa Alcachofra Acelga Aspargo
Rabanete
Figura 20 - Correlação entre as diferentes metodologias utilizadas: A- EC50 e ABTS, B- EC50 e �-caroteno, C- EC50 e
FRAP, D- EC50 e Rancimat, E- ABTS e FRAP, F- ABTS e �-caroteno, G- ABTS e Rancimat, H- �-caroteno e FRAP, I- �-caroteno e Rancimat, J- FRAP e Rancimat
Possíveis explicações para que uma mesma amostra não seja a melhor para todas as
metodologias são: as diferentes características e mecanismo de ação dos compostos bioativos das
amostras, os reagentes, os princípios dos métodos, possíveis erros de análise (Melo et al., 2006).
Ao analisarem a atividade antioxidante de extratos de hortaliças em dois ensaios (DPPH• e �-
caroteno/ácido linoléico), Melo et al., (2006), encontraram maior atividade do tomate e couve de
folha no sequestro do radical livre DPPH, enquanto o espinafre e a couve de folha exibiram maior
atividade pelo método do �-caroteno/ácido linoléico.
Pellegrini et al. (2003), ao analisarem a atividade antioxidante em diferentes extratos de
vegetais, também observaram que a atividade antioxidante não seguiu a mesma ordem nas
metodologias do FRAP e TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity).
I
J
74
2.3.6 Composição química dos extratos etanólicos das hortaliças por CG-EM
A técnica do CG-EM é robusta e amplamente utilizada, uma vez que combina alta
sensibilidade e especificidade e vem sendo rotineiramente utilizado na análise de extratos de
plantas (HALKET et al., 2005). Consta de um cromatógrafo, usualmente com coluna capilar,
uma interface para ligação do CG com o EM, uma câmara de ionização, onde ocorre a formação
dos íons, uma câmara mantida sob vácuo, na qual acontece a separação destes, e um sistema para
detecção dos íons, acoplado a um sistema de registro com um programa para a interpretação dos
resultados obtidos. Tal equipamento permite a identificação positiva para quase todos os
compostos (COLLINS; BRAGA e BONATO, 2006).
É possível notar que os compostos fenólicos mais abundantes nas amostras foram o ácido p-
cumárico, o ácido ferúlico e ácido caféico. A amostra que apresentou a maior quantidade de ácido
caféico foi o espinafre, com uma concentração de 53,54% dentre os compostos presentes.
Para algumas amostras que apresentaram boa atividade antioxidante, como o açafrão, não foi
possível a identificação de muitos compostos. Uma possível explicação para isso é a presença de
compostos ainda desconhecidos ou que não estejam disponíveis na biblioteca do equipamento na
forma silanizada. O ácido ascórbico presente em algumas amostras também pode ter contribuído
de forma relevante na atividade antioxidante, como no caso do agrião.
Dupont et al. (2000) e Llorach et al. (2008), ao analisarem escarola (Cichorium endívia)
identificaram derivados do Kaempferol.
Em diferentes variedades de alface foram encontrados derivados de luteolina e quercetina,
variando de acordo com a cultivar (Llorach et al., 2008). Neste trabalho também foi encontrado a
presença do flavonóide quercetina na alface (2%), porém em concentração bem inferior ao ácido
caféico (26,9%), o qual também possui atividade antioxidante.
Os ácidos sinápico, ferúlico e p-cumárico são antioxidantes mais ativos do que os derivados
do ácido benzóico, tais como ácidos siríngico e vanílico. Isso se deve à dupla ligação presente na
molécula dos derivados do ácido cinâmico (-HC=CHCOOH), que participa da estabilização do
radical por ressonância de deslocamento do elétron desemparelhado, enquanto que os derivados
do ácido benzóico não apresentam essa característica (WANASUNDARA; AMAROWICZ;
SHAHIDI, 1994). As tabelas 11 e 12 apresentam a porcentagem dos compostos fenólicos e ácido
ascórbico, tempo de retenção dos mesmos e os principais íons do espectro de massas. Os
cromatogramas das hortaliças obtidos pela referida técnica podem ser visualizados no anexo A.
Tab
ela
11 -
Con
cent
raçã
o (%
) do
s co
mpo
stos
fen
ólic
os e
áci
do a
scór
bico
ide
ntif
icad
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xtra
tos
etan
ólic
os d
as h
orta
liça
s, a
nali
sado
s pe
la té
cnic
a de
GC
-EM
Áre
a (%
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77
3 CONCLUSÕES
• A quantidade de compostos fenólicos presente nas amostras não apresentou relação direta
com a atividade antioxidante para uma grande quantidade de amostras. Isso ressalta que
compostos fenólicos distintos ou outros de natureza não fenólica apresentam atividades
diferentes, e que nem sempre a presença de altos teores de determinadas classes de
compostos em hortaliças apresentará maior poder antioxidante.
• A análise antioxidante por diferentes metodologias se faz importante como uma forma de
melhor se avaliar esta propriedade biológica, já que não é possível afirmar que uma
metodologia seja melhor que outra, uma vez que todas possuem vantagens e limitações.
• As amostras não se comportaram da mesma forma para todas as metodologias, e não
houve uma ordem de atividade antioxidante definida para todas. Uma possível explicação
para isso foi a diferença na composição química das hortaliças e dos diferentes meios e
princípios das análises.
• Por meio das análises cromatográficas por CG/EM foi possível identificar vários
compostos fenólicos, com destaque para o ácido ferúlico, caféico e p-cumárico. Algumas
amostras também apresentaram vitamina C.
• A considerável atividade antioxidante e quantidade de compostos fenólicos totais
mostram que algumas amostras, como alface, açafrão, agrião, espinafre, alcachofra, entre
outras, possuem potencial e devem ser alvo de futuras pesquisas visando o isolamento de
compostos bioativos, para aplicação em sistemas in vivo e em alimentos.
78
79
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90
91
APÊNDICES
92
APÊNDICE A
�������������������
�����������
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
����������� ���
Con
cen
traç
ão (
ug/
0,5m
l)
Figura 21 - Curva de calibração do ácido gálico para o cálculo do teor de compostos fenólicos totais
93
APÊNDICE B
y = -0,0003x + 0,6721
R2 = 0,9968
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 500 1000 1500 2000 2500
Concentração Trolox (µM)
Abs
orbâ
ncia
Figura 22 – Curva de calibração do Trolox.
94
APÊNDICE C
y = 1515x + 4,8941
R2 = 0,9987
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Absorbância
Su
lfat
o fe
rros
o (µ
M)
Figura 23 – Curva de calibração do Sulfato ferroso.
95
ANEXOS
96
ANEXO A
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0(x1,000,000)
TIC
Abóbora
Açafrão
97
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0(x1,000,000)
TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
(x10,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
(x10,000,000)TIC
Acelga
Agrião
Alcachofra
Aipo
98
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
(x10,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
(x10,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0(x1,000,000)
TIC
Alface
Alho-poró
Almeirão
Aspargo
99
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5(x1,000,000)
TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
(x1,000,000)TIC
Beterraba
Brócolis
Cebolinha
Cenoura
100
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
(x10,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
(x10,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
(x1,000,000)TIC
Chicória
Espinafre
Nabo
Pepino
101
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
(x1,000,000)TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0(x1,000,000)
TIC
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25(x1,000,000)
TIC
Rabanete
Repolho
Rúcula
Salsa
102
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.00.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
(x1,000,000)TIC
Figura 24 – Cromatogramas das amostras.
Vagem