Construo de sistemas de expresso1)- LacIq pTac -> amplificado do pMAL2-c2X -> clonado para vector pHeL2- LacZ -> clonado entre SpeI e BamHI dos stios de clonagem de pHeL2-pHeL2- TL-> introduzido na estirpe N6 de H.pylori.- Mediu-se a atividade da B-galactosidase na presena de IPTG. Problemas: -produo de B- galactosidase foi baixa- observou-se atividade B- galactosidase residual sem a adio de IPTG.* Problema devido => falta de reconhecimento de promotores E.coli pela RNA polimerase da Hpylon ( diferenas entre os fatores sgima codificados por genes rpoD da E.coli e H.pylori)Resolveu-se a fuga de plasmdeo pHeL2-TL => pela adio uma 2 copia de LacIq sob o controlo do promotor amiE => gerando plasmdeo PILL2150 : h boa leitura de B-galactosidase. Logo, pode ser usado para controlar a expresso genes essenciais de H.pylori para estudar o papel fisiologico das proteinas codificantes sob condies com falta de IPTG.

2) Melhorar o nvel de produo de B-galactosidase para se poder usar os plasmdeos para controlar a produo de protena recombinante, interaes proteina-proteina ou expresso de RNAs antisense(?)Em pILL2150, apenas o 2 lacIq ficou sob o conrolo de um promotor de fora (pamiE) ento, para substituir a regio LacIq- pTac por outro promotor de fora, usou-se ureI.Criou-se os primers pureI-LacI(op)- BgLII e pureI-LacI(op)-SpeI onde foi introduzido um sitio de ligao LacI que no afetou as caixas -35 e -10 Amplificou-se o promotor ureI usando os primers (pureI-LacI(op)- BgLII e pureI-LacI(op)-SpeI) e colonaram-se ambos em pHeL2-TL e pILL2150 por substituio da regio LacI9-pTac => criando pILL2151 e pILL2153*a introduo do sitio de ligao da lacI no afetou a funcionalidade de pureI (Pill2151) ver na FIGURA1No entanto, a represso no foi eficiente o suficiente para permitir o estudo de por exemplo o efeito da expresso exagerada do crescimento de interaes protena-proteina.Na ausncia de IPTG, pILL2153 expressou razoveis actividades de b-galactosidasePortanto: decidiu-se introduzir um novo sitio de ligao de LacI. Ao mesmo tempo inverteu-se 2 nucleotidos nas posies -3 e -2 de AC para CA para restaurar o sitio de NdeI, gerando o plasmideo pILL2157.Resultou no melhoramento substancial da regulao do gene LacZ e na produo de B- galactosidase comparado com pILL2153. O plasmdeo PILL2157 continou com fugas e a actividade da B-galactosidase foi significante sem IPTG.

Portanto, PILL2157 podia ser usado para constuir mutantes condicionais de genes altamente expressos, protenas recombinantes de H.pyloi, domnios de interao protena-proteina sob condies nativas ou RNA antisense enquanto pILL2150 podia ser usada para genes expressos a baixos nveis.

Em estudos recentes, foi possvel mostrar que a actividade da protena de Hpylori podia ser titulada recorrendo concentracoes de IPTG e ao plasmdeo lisado (pILL2150 ou pILL2157)No entanto, uma limitao poderia ser: a toxicidade dos genes da Hpylori para a E.Coli explica fugas, que podem dever-se falta de reconhecimento do gene promotor amiE pelo RNA polimerase da E.Coli e consequentemente a m expresso do repressor LacI na E.Coli.

Para ultrapassar potenciais problemas de toxicidade: usa-se as estirpes de E.coli que contenham um gene repressor LacI altamente expresso.

Criao de mutantes:

Para validar o que foi feito criou-se mutantes de genes pensados ou essenciais. Selecionaram-se pbp1 e fts1 que foram comprovados como essenciais atravs de sucessivas tentativas de inactivao por uma cassete no polar de canamicina.Os genes foram clonados em pILL2150 gerando pILL2161 e pILL2163, (pbp1 e fts1, respectivamente)Os plasmdeos resultantes foram transformados na estirpe N6 e geraram estirpes com 2 cpias de cada gene seleccionado (ou pbp1 ou fts1).Para tentar inactivar a cpia cromossmica de cada gene, amplificaram-se as regies laterais 500bp de cada gene e geraram uma regio de 3 fragmentos em que cada gene de interesse foi substitudo por uma cassete no polar de canamicina.Transformaram-se os diferentes derivados de N6 que contm as duas cpias do gene pbp1 de interesse com os 3 fragmentos que contm os pbp-no correspondentes na presena ou ausncia de IPTG.

Tabela 2A seleco de clones resistentes canamicina dependia da presena de IPTG. Os poucos clones que cresceram em placas sem IPTG podem ser explicados por mutantes promotores que perderam a forte regulao por LacI9 ou Lac9-sem mutaes.

Selecionaram-se, ao acaso, 8 clones de cada mutao e confirmou-se por amplificao PCR a deleo da copia do gene cromossmico.O crescimento de clones seleccionados foi estritamente dependente da adio de IPTG.

Anlise dos fentipos morfolgicos mutantes:PBP1 e PBP3 codificados por pbp1 e fts1 so protenas de ligao de penicilina que podero estar envolvidas na juno (ligao) peptidoglicanica e morfologia bacteriana.Selecionou-se um clone representativo de mutantes pbp1 e fts1 para estudar os efeitos da sua depleo na morfologia da Hpylori.Depleo de PBP1 levou paragem prematura do crescimento aps 2 ou 3 geraes.Em contraste, a depleo de PBP3 no teve impacto no crescimento bacteriano nas culturas liquidas.Depois, fez-se scanning microscpico electrnico dos mutantes sob condies deplectivas.Depleo de PBP1 levou formao prematura de bactrias cocos enquanto a depleo de PBP3 levou formao de bactrias filamentosas (fig. 5)PBP3 = 20uM (que na estirpe N6 era 2uM)

FOLHA 3

N6 ftsI K2 PILL2163 com IPTG apresentou umas bactrias mais longas (3 a 4m) indicando que o nvel de expresso ftsI do plasmdeo pILL2163 no compensou totalmente a deleo da copia cromossimica de ftsI.A inibio da acividade dos fentipos na H.pylori por diferentes antibiticos B-lactam sugeriu um papel do PBP1 na manuteno da morfologia espiral/em roda e PBP3 na diviso celular.Juntos, formou-se o 1 mutante da H.pylori.

Transformao do pILL2150 e pILL2157 em diferentes isolados- estirpes de H.pylori tem uma alta diversidade devido recombinao e altos nveis de mutaes.Barreiras de restrio modificaes imitaram o uso de pHeL2 para algumas estirpes.Tabela 3- mostra a dificuldade de introduzir pHeL2 em 5 diferentes gentipos.Enquanto que N6 foi transformada com eficincia com pILL2150 e pILL2157, nenhuma ds ouras estirpes estava aberta a receber os 2 plasmideos.Para expandir o leque de estirpes capazes de aceitar estes vetores de expresso adaptou-se o processo de metilao in vitro.Em comparao ao plasmdeo de DNA directamente purificado da E.coli, a metilao do plasmdeo de DNA in vitro com extratos de protena de cada estirpe receptora levou a isolao consistente de clones resistentes a clorafenicol , apesar da baixa frequncia em comparao altamente transformante N6.Como se estimou a concentrao de plasmdeo intacto apos a metilao in vivtro por eletroforese em gel de agarose, a baixa frequncia de transformantes provavelmente devido a diferenas intrnsecas na eficcia na transformao de cada estirpe em relao a estirpe 6.A baixa frequncia pode tambm ser explicada pela instabilidade destes plasmdeos nas diferentes estirpes.De qualquer forma, foi possvel purificar o plasmdeo pILL2150 da estirpe B38(Figura 9) que indica que o plasmdeo pode ser mantido em outras origens genticas que no o N6.