23/05/2011

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Evolução Molecular

Reconstruções Filogenéticas e Sistemática

Professor Fabrício R Santos fsantos@icb.ufmg.br

Departamento de Biologia Geral, UFMG 2011

Sistemática e Taxonomia

• Sistemática é o estudo dos relacionamentos entre

grupos de organismos e a classificação hierárquica

em diferentes táxons – é um antigo ramo da

biologia clássica.

A Taxonomia é parte da Sistemática e se

refere à nomenclatura e identificação de espécies. Seus princípios foram inicialmente estabelecidos por Carolus Linnaeus (1707-1778).

Taxonomia e Classificação Hierárquica O sistema taxonômico desenvolvido inicialmente por Linnaeus tem duas características principais: i) a designação de um nome duplo (binômio) a cada espécie, e ii) um sistema de agrupamento destas espécies.

Um binômio (nome latino de 2 partes) é designado unicamente para cada espécie, no qual o primeiro é o nome genérico, e os dois nomes são ditos específicos.

Trichechus inunguis Homo sapiens Arabidopsis thaliana Escherichia coli Chromobacterium violaceum

O sistema de classificação das espécies segue uma hierarquia de categorias crescentes que formalizam o agrupamento de organismos, o qual deve ser feito a partir do reconhecimento da história de ancestralidade comum das espécies.

A nomenclatura binomial da espécie é a primeira

etapa no agrupamento: espécies derivadas do

mesmo ancestral comum imediato são geralmente

agrupadas no mesmo gênero.

As demais categorias são mais amplas, isto é,

agrupam táxons de acordo com ancestrais comuns

mais e mais antigos:

• Gêneros são agrupados em uma Família, pois

compartilham um ancestral comum recente.

• Famílias são agrupadas em Ordens, que se

agrupam em Classes, que são agrupadas em Filos,

que se agrupam em Reinos e um dos 3 Domínios.

A Sistemática Filogenética conecta a

diversidade biológica à história evolutiva

Filogenia = A história evolutiva de uma espécie ou grupo de espécies

relacionadas.

Filogenia é geralmente representada como árvores filogenéticas

que traçam relacionamentos evolutivos inferidos, revelando a

história de ancestralidade comum entre espécies.

Sistemática = O estudo e classificação da diversidade biológica em um

contexto evolutivo.

A diversidade biológica reflete episódios passados de especiação

e macroevolução.

Taxonomia = Identificação , nomeação e classificação de espécies; é um

componente da sistemática.

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Organismos podem ser representados em um diagrama (árvore) que ilustra seus relacionamentos evolutivos. Usando dados morfológicos e moleculares, podemos estimar os ancestrais comuns inferidos pelos pontos de divergência nas árvores filogenéticas.

Que são árvores?

Charles Darwin (1837) Anotações sobre padrões de especiação nos Tentilhões de Galápagos

OTU 1

OTU 2

OTU 3

OTU 4

OTU 5

OTU 6

Árvore Filogenética

1 5 4 3 2 6 7 8

No de diferenças

n1

n2

n3

n4

n5

n

OTU unidade taxonômica operacional - populações, espécies ou grupos

nó interno - ~ ancestral comum do passado

tempo antiga recente

raiz

Topologias equivalentes

Por quê árvores?

Por quê representamos evolução como árvore e não outro tipo de gráfico?

C A D B A B C D

Ciclo, reticulação

A

B C

D

• Evolução é divergência/cladogênese – espécies se

modificam com o tempo - Transformacionismo

Darwin: “Descendência com modificação”

• Por várias razões, reticulação torna-se um

fenômeno raro com o tempo – provavelmente no

Pré-Cambriano as reticulações devido a

transferências gênicas horizontais, fusões de

células, etc, eram muito comuns.

• Reticulações são difíceis de se representar.

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3

Sang et al., 1997

Árvores reticuladas Ex: espécies híbridas de Paeonia sp.

Grou

japonensis

americana

grus

nigrocollis

monachus

canadensis

bugeranus

virgo

paradisea

leucogeranus

antigone

rubicanda

vipio

Filogenia do grou

japonensis

americana

grus

nigrocollis

monachus

canadensis

bugeranus

virgo

paradisea

leucogeranus

antigone

rubicanda

vipio

Cladograma Árvore UPGMA

Citocromo b (Mooers et al., 1999)

Grus sp

leucogeranus antigone

rubicanda

vipio

japonensis

americana

grus

nigricollis

monachus

canadensis

Bugeranus

virgo

paradisea

japonensis

americana

grus

nigrocollis

monachus

canadensis

bugeranus

virgo

paradisea

leucogeranus

antigone

rubicanda

vipio

Filogenia do grou

Árvore UPGMA

Citocromo b (Mooers et al., 1999)

Árvore sem raiz

Árvore filogenética para os tentilhões de Galápagos Estas 13 espécies habitam as Ilhas Galápagos. Esta árvore é baseada em estudos comparativos de estruturas do corpo, especialmente forma e tamanho dos bicos, e nos estudos de campo sobre isolamento reprodutivo e comportamento alimentar.

Conexão entre classificação e filogenia A natureza da ramificação de uma árvore evolutiva reflete o arranjo hierárquico de táxons (taxa). Esta árvore sugere as afinidades genealógicas entre táxons subordinados à ordem Carnivora, ou seja, o padrão de especiação para este grupo.

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Árvores filogenéticas baseadas em sistemática Dois métodos, comparação de proteínas do sangue e hibridização DNA-DNA, foram usados para construir esta árvore de espécies de ursos e procionídeos.

Antiga controvérsia sobre afinidades entre focas, leões marinhos e morsas

A relação filogenética entre Phoecidae, Odobaenidae e Otaridae já foi extremamente discutida. Hoje a família Pinnipedia é considerada um grupo monofilético, mas focas foram previamente consideradas grupo irmão de Lontras (Mustelidae)

Qual relação entre procariotos e eucariotos? Qual a origem das mitocôndrias e dos cloroplastos?

Árvores filogenéticas podem nos dar informações sobre o passado remoto

Classificação: Reinos e Domínios

Atualmente a sistemática filogenética reconhece 3 domínios

Origem dos 3 domínios da vida no Pré-Cambriano

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outras bactérias

Archaea Eucariotos

Nature, 1998

Riq

ué

tsia

s M

ito

côn

dri

as

Rickettsia Parasita intracelular

obrigatório de eucariotos

Mitocôndria Organela intracelular

eucariótica

As mitocôndrias são relacionadas filogeneticamente às a-proteobactérias e grupo irmão das Rickettsias

Grupos irmãos de ciclídeos do Lago Tanganika na África oriental

Árvores nos informam sobre processos recentes de diversificação de populações e espécies

Árvore MP C0I (E. Michel, 1999)

Árvores filogenéticas e epidemiologia

Dentista com HIV deu origem a um surto regional nos EUA

Freeman e Herron, 1998

pac

ien

te B

-x

pac

ien

te B

-y

pac

ien

te A

-x

pac

ien

te E

-y

pac

ien

te E

-x

pac

ien

te C

-x

pac

ien

te C

-y

Den

tist

a-y

pac

ien

te A

-y

pac

ien

te G

-x

pac

ien

te G

-y

De

nti

sta

X

LC0

2-x

LC0

3-x

LC0

2-y

LC0

9

LC3

5

pac

ien

te D

-x

pac

ien

te D

-y

LC0

3-y

pac

ien

te F

-x

pac

ien

te F

-y

HIV

LI

Filogenias de agentes infecciosos permitem traçar surtos e pandemias, assim como auxiliam nas estratégias de controle de epidemias como da gripe H1N1 ou para o desenvolvimento de vacinas da gripe comum.

Reconstruções filogenéticas e Conservação da Biodiversidade

• Filogenética pode ser extremamente útil para estudos de biodiversidade (inventariamento e classificação) e estabelecimento de prioridades conservacionistas.

• Medidas de diversidade que utilizam filogenias de sequências de DNA estão agora sendo usadas para implementar planos de conservação de espécies, priorizar unidades de conservação, definir unidades de manejo etc.

• Ex: filogenias (e filogeografia) são usadas para identificar ESUs (unidades evolutivamente significantes), as quais representam populações importantes para manter a dinâmica evolutiva de uma espécie.

10-20 milhões de anos

marinho

africano

amazônico

Filogenias dos peixes-bois (Trichechus sp)

Vianna et al 2006 Mol Ecol

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Filogenia Filogeografia

Em estudos da biodiversidade, ambas as abordagens tentam reconstruir o passado evolutivo das

espécies e de suas populações.

marinho

africano

amazônico

Populações do clado III do peixe-boi marinho (Trichechus manatus) possuem uma distribuição restrita às Guianas e ao Brasil, portanto conformam uma unidade evolutiva independente (ESU) das demais nesta espécie.

Árvore sem raiz (rede Median Joining) da região controle do DNAmt

Vianna et al 2006 Mol Ecol

Filo

geo

graf

ia c

om

par

ada

B0665

B0663

B0655

B0653

B0654

B0656

B0369 B0367

B0368

B0609

B0647

B0317

B0329

B0326

B0658

B0644

B0657

B0677

B0678

B0646

B0291

B0292

B0290

B0680

B0643

B0660

B0281

B0285

B1189

B1301

B1188

B1296

B1186

B1303

B0525

B0524

B0515

B0511

B0513

B0528

B0535

B0562

B1148

B1147

B1150

99

99

99

99

90

99

99

99

99

99

99

99

99

99

99

91

99

99

99

82

90

D. ochropyga

D. ferruginea

R. ardesiaca

D. squamata

B0335

P. leucoptera

M. loricata

T. major

D. plumbeus

F. serrana

D. mentalis

H. atricapillus

S. cristatus

T. doliatus

T. caerulescens

T. ambiguus

T. pelzelni

Árvore NJ COI em Thamnophilidae

Vilaça et al. 2006

Análises filogenéticas permitem o uso do DNA como identificador de espécies

Termos filogenéticos

• Homologia

• Analogia

• Convergência, Reversão

• Plesiomorfia – estado ancestral – “0” (Simplesiomorfia)

• Apomorfia – estado derivado – “1” (Autapomorfia - Sinapomorfia)

Homologia: um caráter (ancestral ou derivado) compartilhado entre duas ou mais espécies, o qual estava presente no ancestral comum destas.

Analogia: caráter “compartilhado”, geralmente não-presente no ancestral comum (i.e., o caráter evolui duas vezes, independentemente): evolução convergente (ou paralela) e reversão ao estado ancestral. A este caráter recorrente damos o nome de Homoplasia.

Analogia

1 3 2 4 Espécies:

Estado do caráter:

estado ancestral

Nas spp. 1 e 3 há uma analogia (caráter análogo) ou homoplasia;

Origem independente – evolução paralela ou convergente .

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Homologia Ancestral (0)

1 3 2 4 Espécies:

Estado do caráter:

estado ancestral

Nas spp. 1, 3 e 4 há uma homologia ancestral (simplesiomorfia); é ancestral porque está presente na base da árvore, no ancestral comum de todas 4 spp atuais.

Homologia Derivada (1)

1 3 2 4 Espécies:

Estado do caráter:

estado ancestral

Nas spp. 1 e 2 aparece um caráter homólogo derivado (sinapomorfia). Aconteceu uma transição do estado “basal” ou primitivo no ancestral imediato destas duas spp ou OTUs.

Convergência: origem independente do caráter (i.e., duas linhagens fixam paralelamente um “fenótipo” similar). Reversão: origem e subseqüente perda, ou mutação “de volta” ao caráter ancestral (i.e., reversão ao estado plesiomórfico).

Origem das Homoplasias Evolução Convergente = Aquisição de características

similares em espécies de diferentes linhas evolutivas,

devido ao compartilhamento de nichos ecológicos

similares, sendo a seleção natural responsável por

moldar adaptações análogas.

Exemplos: asas de pássaros e morcegos

bicos de aves e monotremados

Evolução convergente também se dá no nível molecular: sequências de DNA e proteínas podem sofrer mudanças paralelas, reversões, etc

Evolução Convergente e Seleção Natural Similaridades aparentes entre marsupiais australianos e mamíferos placentários em outros continentes. Estas espécies ocupam nichos parecidos nos diferentes continentes.

Um grupo monofilético:

é um grupo de táxons que inclui o ancestral comum e todos seus

descendentes

também podemos chamá-lo de clado

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Exemplo de grupo não monofilético: Répteis

O ancestral comum mais recente dos répteis viventes também deu origem às aves.

Considerando a paleontologia que considera que mamíferos descendem também de répteis, este ancestral comum é ainda mais antigo. Filogenia dos grandes símios sem cauda

Famílias monofiléticas Hominidae Pongidae Hyllobatidae

Filogenia dos grandes símios sem cauda

Famílias parafiléticas Hominidae Pongidae Hyllobatidae

Esta classificação equivocada não representa a história evolutiva das espécies

Abordagens filogenéticas

Fenética (Taxonomia numérica)

Cladística (Sistemática Filogenética)

Fenética

• Abordagem Clássica (desde Linnaeus).

• Agrupa espécies baseada na similaridade fenotípica (ou genotípica).

• Usa todas características distinguíveis.

• Ex: métodos baseados em distâncias (UPGMA)

Análise de vários caracteres

(fenótipos, sítios polimórficos de DNA, freq. alélicas, etc.)

Matriz de dissimilaridade em base ao número de diferenças

Construção

de árvore

filogenética

Fenograma A B C

A

B

C

3

7 6

0

0

0

A B C A B

A

B

C

Relações de similaridade

MÉTODOS FENÉTICOS

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Cladística • A Teoria Evolutiva postula que grupos de

organismos relacionados descendem de um ancestral comum.

• Sistemática Filogenética (Cladística) é um método de classificação taxonômica baseado na história evolutiva.

Foi desenvolvido em 1950 por Willi Hennig, um entomologista alemão.

Cladística • Baseia-se no padrão de ancestralidade comum e

modificação das espécies e não em mera similaridade.

• Deve usar apenas caracteres derivados (apomórficos) compartilhados (sinapomórficos ou homólogos derivados).

• Portanto, objetiva traçar a história evolutiva real, o padrão de descendência com modificação.

• Ex: métodos baseados em caracteres (parcimônia).

Análise de vários caracteres com estados ancestrais (0) e derivados (1)

Construção de árvore filogenética

Cladograma

A B C

A

B

C

Relações de ancestralidade comum

MÉTODOS CLADÍSTICOS

D E

1

2

3

4

5

6

7

8

E

D

1

2 3

4

5 6

7 8

Caracteres utilizados

Sim Não Não Cladística

Sim Sim Sim Fenética

Homologias Derivadas

Homologias Ancestrais

Analogias

Besouro Borboleta Cavalo

“Eventos Reais”

Besouro Borboleta Cavalo

Fenética Cladística

Besouro Borboleta Cavalo

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Jacaré Ave Lagarto

“Eventos reais”

Jacaré Ave Lagarto

Fenética Cladística

Jacaré Ave Lagarto

Análise Filogenética

Dado um conjunto de dados (caracteres morfológicos, alinhamento de múltiplas sequências de DNA e proteína, etc), pode-se inferir o relacionamento ancestral dentre as espécies.

Esp.1 Esp.2 Esp.3 Esp.4

Temp

o

Não-resolvida ou filogenia tipo “estrela”

Filogenia parcialmente resolvida

Completamente resolvida, filogenia bifurcada

A A A

B

B B

C

C

C

E

E

E

D

D D

Politomia ou multifurcação uma bifurcação

O objetivo da inferência filogenética é resolver a ordem de ramificação das linhagens nas árvores evolutivas:

Há 3 possíveis árvores sem raiz para 4 táxons (A, B, C, D)

A C

B D

árvore 1

A B

C D

árvore 2

A B

D C

árvore 3

Métodos de reconstrução (ou inferência) filogenética objetivam descobrir qual das árvores é a

“mais provável".

Espera-se que esta seja a “verdadeira” árvore biológica — aquela que seguramente represente

a história evolutiva dos táxons analisados – mas esta é formalmente chamada de árvore

inferida a partir dos dados, cuja confiança pode ser testada por diferentes métodos.

O número de árvores sem raiz aumenta exponencialmente com o número de táxons

# táxons

3

4

5 6

7

8 9

10

. .

.

. 30

# árvores sem raiz

1

3

15 105

945

10.935 135.135

2.027.025

. .

.

. 3,58 x 10 36

C A

B D

A B

C

A D

B E

C

A D

B E

C

F

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Inferir relacionamentos evolutivos entre os táxons requer enraizar a árvore

Note que nesta árvore

enraizada, o táxon A não

está mais estreitamente

relacionado ao táxon B

em relação a C ou D

como sugerido acima.

A

B C

Raiz D

A B C D

Raiz

árvore enraizada

árvore sem raiz

O enraizamento em outra posição:

A

B C

raiz

D

árvore sem raiz

Note que nesta árvore enraizada, táxon A é mais estreitamente relacionado ao táxon B, enquanto o C é mais relacionado ao D.

C D

raiz

árvore enraizada

A

B

Uma árvore sem raiz de 4 táxons pode ser enraizada em cinco lugares distintos para produzir cinco árvores enraizadas diferentes

árvore sem raiz:

A C

B D

árvore c/raiz 4 C

D

A

B

4

árvore c/raiz 3 A

B

C

D

3

árvore c/raiz 5 D

C

A

B

5

árvore c/raiz 2 A

B

C

D

2

árvore c/raiz 1 B

A

C

D

1

Estas árvores representam cinco histórias evolutivas diferentes entre os táxons, dependendo de onde se coloca a raiz !

# táxons

3 4 5 6 7 8 9 . . . .

30

# árvores sem raiz 1 3 15 105 945 1 0 .395

13 5 .135 . . . . ~3 , 58 x 10

3 6

# raízes

3 5 7 9 11 13 15 . . . .

57

# árvores com raiz

3 15 1 0 5 9 4 5 10.3 9 5 1 35.1 3 5 2. 0 27.0 2 5

.

.

.

. ~2 , 04 x 10

3 8

x =

C A

B D

A D

B E

C

A D

B E

C

F

Cada árvore sem raiz pode teoricamente ser enraizada em qualquer lugar ao longo de qualquer de seus ramos

Há dois modos principais de enraizar árvores

Pelo grupo externo (outgroup ):

Usa táxons de referência (o “outgroup”) que sabidamente se situam fora do grupo de interesse (o “ingroup”). Requer conhecimento a priori sobre relacionamentos entre os táxons. O outgroup pode ser uma espécie (ex: aves para enraizar uma árvore de mamíferos) ou cópias de genes duplicados (ex: a-globina para enraizar b-globinas).

outgroup

A

B

C

D

10

2

3

5

2

Pelo ponto-médio ou distância:

enraiza a árvore no ponto médio entre os dois táxons mais distantes na árvore, tal como determinado pelo tamanho dos ramos. Pressupõe que os táxons evoluem coordenadamente (evolução constante entre linhagens). Esta suposição está embutida em alguns métodos fenéticos de construção de árvores tal como o UPGMA.

d (A,D) = 10 + 3 + 5 = 18 Ponto-médio = 18 / 2 = 9

Todos estes rearranjos mostram o mesmo relacionamento evolutivo entre táxons

B

A

C

D

A

B

D

C

B

C

A

D

B

D

A

C

B

A

C

D

árvore enraizada 1 B

A

C

D

A

B

C

D

Todas estas árvores são idênticas

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H C G G C H C G H

Árvores alternativas sobre relações evolutivas entre os três “grandes símios”

A árvore do meio é considerada a “árvore verdadeira”, ou fato científico, para a história evolutiva destas três espécies.

Conclusões obtidas com dados morfológicos e moleculares nos anos 1990, corroborada atualmente por dados genômicos.

Reconstruções

filogenéticas com dados

moleculares

Variabilidade genética Fenotípica

Morfológica

Funcional

Protéica

DNA

Macromutações

SNP’s – mutações de ponto

Inserções de retroposons

Microssatélites

POP1

A - 0,4

B - 0,2

C - 0,9

D - 0,1

E - 0,2

POP2

A - 0,6

B - 0,5

C - 0,8

D - 0,3

E - 0,1

POP3

A - 0,3

B - 0,2

C - 0,9

D - 0,2

E - 0,4

Freqüências alélicas

Freqüência de um dos alelos em cinco locos bialélicos (A-E) em 3 populações (pop1, 2, 3)

Frequências alélicas servem apenas para comparações fenéticas intra-específicas.

Microssatélites AT

AT AT

AT

AT

CCG CCG

CCG CCG

CA CA CA CA

CA CA

CA

CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA

CA Alelo 3

Alelo 5

Alelo 7

são multi-alélicos

µ = 10-4 a 10-3 / loco / geração

Microssatélites servem geralmente apenas para comparações fenéticas intra-específicas, testes de paternidade, identificação individual etc.

SNPs ou mutações de ponto

Single Nucleotide Polymorphisms são geralmente bialélicos alelo 0 ...AAGCGTTATAGC... alelo 1 ...AAGTGTTATAGC...

µ = 10-7 a 10-8 / locus / geração

SNPs podem ser utilizados para comparações cladísticas interespecíficas.

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* * * ** * * * * * *

A aat tcg ctt cta gga atc tgc cta atc ctg

B ... ..a ..g ... .a. ... ... t.. ... ..a

C ... ..a ..c ..g ... ..t ... ... ... t.a

D ... ..a ..a ..g ..g ..t ... t.g ..t t..

Cada diferença de nucleotídio é um SNP e considerado

como um caráter na reconstrução filogenética

Obs: Pontos (.) se referem a posições de caracteres inalterados em relação

à primeira sequência (A)

* Posições com caracteres variáveis entre estas sequências

SNPs em sequências de DNA Analogia

T C T C

C

1 3 2 4 Espécies:

Estado do caráter:

estado ancestral

T Nas spp. 1 e 3 há uma analogia (caráter análogo ou homoplasia);

Origem independente – evolução paralela ou convergente

Homologia Ancestral (0)

T C C

C

1 3 2 4 Espécies:

Estado do caráter:

estado ancestral

C Nas spp. 1, 3 e 4 há uma homologia ancestral (simplesiomorfia); é ancestral porque está presente na raiz da árvore (ancestral comum) como uma plesiomorfia.

C

Homologia Derivada (1)

T T C C

C

1 3 2 4 Espécies:

Estado do caráter:

estado ancestral

T Nas spp. 1 e 2 possuem homólogos derivados (sinapomorfia) (i.e., aconteceu uma transição do estado “basal” ou primitivo, no ancestral comum imediato destas duas spp ou OTUs).

Tipos de abordagens filogenéticas utilizando moléculas

Fenética

Similaridade geral

Cladística

Sistemática filogenética

Reconstruções filogenéticas alternativas

Dados morfológicos e análises fenéticas

Dados morfológicos e DNA com cladística

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Similaridade vs. relacionamento evolutivo

Similaridade e relacionamento evolutivo não são a mesma coisa, mesmo que relacionamento evolutivo seja inferido de certos tipos de similaridade.

Similar: ser semelhante (uma observação, uma aparência)

Relacionado: genealogicamente conectado (um fato histórico)

Dois táxons podem ser mais similares sem ser mais relacionados:

Táxon A

Táxon B

Táxon C

Táxon D

1

1

1

6

3

5

O táxon C é mais similar ao A (d = 3)

do que ao B (d = 7), mas C e B são

mais estreitamente relacionados: C e

B compartilham um ancestral comum

mais recente do que os dois com A. Métodos baseados em caracteres podem teoricamente discriminar os tipos de similaridade e encontrar a “verdadeira” árvore evolutiva .

Tipos de Similaridade Similaridade observada entre duas OTUs pode ser por: relacionamento evolutivo : caracteres ancestrais compartilhados (‘simplesiomorfias’) caracteres derivados compartilhados (‘’sinapomorfias’) Homoplasia (evolução independente do mesmo caráter):

Eventos Convergentes (em OTUs relacionadas ou não), Eventos Paralelos (em OTUs relacionadas), Reversões (em OTUs relacionadas ou não)

C

C

G

G

C

C

G

G

C

C

G

G

C

G

G

T

Convergentes Paralelos Reversões

Desenha a árvore que melhor representa as distâncias observadas entre os pares.

Seleciona a árvore que tem a maior probabilidade de reproduzir os dados observados.

Seleciona a árvore que explica os dados com o menor número de substituições (eventos mutacionais fixados).

Distância

Verossimilhança

Parcimônia

Métodos gerais de reconstrução filogenética

C A R Á T E R

Tipos de dados usados em inferência filogenética

Métodos baseados em caracteres : Usam diretamente os caracteres alinhados, tais como sequências de DNA ou proteína

táxons caracteres

espécie A ATGGCTATTCTTATAGTACG

espécie B ATCGCTAGTCTTATATTACA

espécie C TTCACTAGACCTGTGGTCCA

espécie D TTGACCAGACCTGTGGTCCG

espécie E TTGACCAGTTCTCTAGTTCG

Métodos baseados em distâncias: Transformam os dados em distâncias (dissimilaridades) par-a-par, e usam a matriz durante inferência da árvore.

A B C D E

espécie A ---- 0,20 0,50 0,45 0,40

espécie B 0,23 ---- 0,40 0,55 0,50

espécie C 0,87 0,59 ---- 0,15 0,40

espécie D 0,73 1,12 0,17 ---- 0,25

espécie E 0,59 0,89 0,61 0,31 ----

Exemplo 1: Distância “p” (= percentagem observada de sequências diferentes)

Exemplo 2: distância Kimura 2-parâmetros (estimativa do número real de substituições entre táxons)

M A T R I Z

Estima-se primeiro qual árvore sem raiz seria a mais “correta” A

B

C

D

Alguns métodos fenéticos produzem a árvore já com a raiz (UPGMA). Os métodos cladísticos podem fornecer árvores com raiz se os dados possuem informação suficiente (Parcimônia, Verossimilhança), mas geralmente utilizam ou necessitam obrigatoriamente de um grupo externo para produzir uma árvore com raiz (Parcimônia, Verossimilhança, Bayesiano, Neighbor Joining)

Algoritmos baseados em distâncias (agrupamento)

Usam distâncias para calcular árvores filogenéticas. Estas são baseadas somente no número relativo de similaridades e diferenças entre um grupo de seqüências.

– Começa com uma matriz de distâncias par-a-par

– Estes métodos constróem uma árvore ligando os pares de

táxons menos distantes, sucessivamente ligando táxons

mais distantes.

– Ex: UPGMA (típico método fenético) e

Neighbor joining (NJ) que considera diferentes taxas

evolutivas entre linhagens.

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15

Distâncias entre DNA • distâncias entre pares de seqüências de DNA são relativamente

simples de computar como a soma de diferenças de bases entre as

duas seqüências.

– Este tipo de algoritmo somente funciona para pares de

sequências similares o bastante para serem alinhadas

• Geralmente todas alterações de bases são consideradas iguais

• Inserções/deleções geralmente possuem um peso maior do que

substituições nucleotídicas (gap penalties).

• É também possível corrigir múltiplas substituições em um único sítio,

que é comum em relacionamentos filogenéticos distantes e para

sítios de rápida evolução.

UPGMA • O mais simples dos métodos de distância é o UPGMA (Unweighted

Pair Group Method using Arithmetic averages) e apenas reconstrói fenogramas que representam meras relações de similaridade geral.

• Assume taxas evolutivas idênticas para todas as OTUs.

• Agrupa as distâncias menores e recalcula novas distâncias através de médias aritméticas para novo agrupamento.

• Os programas do pacote PHYLIP DNADIST and PROTDIST calculam distâncias genéticas entre grupos de seqüências criando uma matriz de dissimilaridades (distâncias).

• Então o programa NEIGHBOR (que também constrói árvores NJ) do PHYLIP constrói a árvore UPGMA a partir da matriz.

• Esta árvore é visualizada em um programa apropriado (Ex: TREEVIEW ou PTP).

Métodos de Distância

a ACGA

b ATGC

c GTGC

d GCAA

a b c d

a 0

b 0,5 0

c 0,75 0,25 0

d 0,5 1,0 0,75 0

d ij

a b c d a b c d

a 0

b 0,5 0

c 0,75 0,25 0

d 0,5 1,0 0,75 0

d ij

Métodos de Distância

Matriz Árvore UPGMA (mera similaridade)

a b c d

a 0

b 0,5 0

c 0,75 0,25 0

d 0,5 1,0 0,75 0

d ij

Métodos de Distância

Matriz Árvore Neighbor-Joining (similaridade e taxas evolutivas diferenciais)

b d

a

c

Máxima parcimônia

• Parcimônia é o método mais popular de reconstrução cladística dos relacionamentos por ancestralidade comum.

• Parcimônia permite o uso de toda informação evolutiva conhecida para a construção da árvore.

– em contraste, métodos de distância resumem todas diferenças entre pares de seqüências em um único número, a percentagem de diferença ou distância genética.

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Exemplo de Parcimônia

• Considere 4 táxons com as seqüências: a (ACGA),

b (ATGC), c (GTGC), d (GCAA).

• A parcimônia deve decidir qual das 3 possíveis árvores

sem raiz (4 táxons), é a mais “correta” (parcimoniosa).

• Posteriormente, se houver informações suficientes, deve-

se colocar a raiz, a qual polariza o padrão de ramificações

sequenciais na árvore filogenética.

Exemplo de Parcimônia

a

b

c

d

a

c

b

d

a

d

b

c

a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

árvore 1

árvore 2

árvore 3

1 2 3 4

total árvore 1 1

árvore 2

árvore 3

Exemplo de Parcimônia

a

b

c

d

a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

árvore 1

A

A

G

G

*

* = 1 etapa de mutação

1 2 3 4

Exemplo de Parcimônia

a

b

c

d

a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

árvore 1

1 2 3 4 C

T C

T *

* = 2 etapas de mutação

*

total árvore 1 1 2

árvore 2

árvore 3

Exemplo de Parcimônia

a

b

c

d

a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

árvore 1 A

G G 1 2 3 4

* = 1 etapa de mutação

*

G

total árvore 1 1 2 1

árvore 2

árvore 3

Exemplo de Parcimônia

a

b

c

d

a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

árvore 1

A

A

1 2 3 4

C

C *

* = 2 etapas de mutação

*

total árvore 1 1 2 1 2 6

árvore 2

árvore 3

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Exemplo de Parcimônia

a

b

c

d

a

c

b

d

a

d

b

c

a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

árvore 1

árvore 2

árvore 3

1 2 3 4

total árvore 1 1 2 1 2 6

árvore 2 2 2 1 2 7

árvore 3 2 1 1 1 5

Exemplo de Parcimônia

a

d

b

c árvore 3

Árvore sem raiz escolhida pela análise de parcimônia

Neste caso temos informações adicionais de que táxon com a sequência d possa funcionar como um grupo externo (outgroup), portanto a raiz estará entre d e os outros ( ).

a b c d Árvore com raiz escolhida usando d como outgroup

Exemplo de Parcimônia

a b c d a A C G A

b A T G C

c G T G C

d G C A A

1

1 (A) 1 (A)

A evolução dos caracteres apomórficos pode ser inferida a partir do Cladograma. Assim, eventos paralelos (recorrentes) de mutação podem ser identificados, os quais correspondem às homoplasias.

3 (G)

3

2 (T)

2

4 (C)

4

A análise de parcimônia pode discriminar alguns tipos de eventos paralelos. Na figura ao lado, 4 sequências homólogas alinhadas (a) de distintos organismos foram utilizadas para construir uma árvore de parcimônia (b). Na árvore b estão dispostos os eventos de mutações (apomorfias), numerados de 1 a 8. No evento 2, o estado alélico derivado (nucleotídio A) demonstrou ser um evento paralelo, aparecendo independentemente na seqüência do homem e do milho.

Verossimilhança (L) é a probabilidade dos dados, dado o modelo de substituições nucleotídicas e uma hipótese de topologia filogenética

Modelo evolutivo de substituições

Diferentes padrões de substituição nucleotídica específicos de cada conjunto homólogo de sequências de DNA.

A

C T

G Transição

Transversão

L = P (dados/árvore)

Máxima verossimilhança Jukes-Cantor

(1 parâmetro)

A frequência dos nucleotídios não é considerada Todas substituições têm a mesma taxa

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Kimura 2P (2 parâmetros)

A frequência dos nucleotídios não é considerada Transições e transversões têm diferentes taxas

GTR (General Time Reversible) (6 parâmetros)

a

b

c d e

f

A frequência dos nucleotídios é considerada Transições e transversões têm diferentes taxas, assim como os tipos de mudanças nucleotídicas

O modelo inapropriado de substituições nucleotídicas pode levar a uma reconstrução filogenética incorreta.

Modeltest

Posada e Krandal

O software permite selecionar o modelo de substituição mais plausível para determinado conjunto de sequências, assim como outros parâmetros necessários para a reconstrução filogenética.

Dados reais: mudanças observadas e esperadas

• Comparação de sequências de chimpanzé e homem no DNAmt (307/1333 sítios são diferentes)

• Modelos com mais parâmetros se aproximam mais do padrão observado LT = L (1) x L (2) x L (3) x L (4) x..x L (N) = L (i)

d

c

b

a

C

C

T

T

7 6 5 4 3 2 1

T G G A G A

T A T A G A

T C C C G A

T C A G A A

Táxon

Táxon

Táxon

Táxon

a

c

b

d

a

b

c

d

a

d

c

b

Método baseado na avaliação probabilística de modelos evolutivos que melhor explicam um conjunto de dados de forma que este reflita a história evolutiva mais próxima da realidade

C A

L(5) = Prob x C G

A A

Prob x C

C

A

G

A C

C

C

A

G

C T Prob x

Prob ... x

Prob C

C

A

G

N N

Máxima verossimilhança

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19

Problemas e cuidados na reconstrução filogenética

• As taxas evolutivas são diferentes para cada gene ou segmento anônimo de DNA, e também em diferentes escalas de tempo.

• As homoplasias levam à saturação dos dados, isto é, aumentam os erros de reconstrução filogenética.

• As estimativas temporais estão sujeitas a calibrações do relógio molecular e podem ter erros associados.

• Árvores filogenéticas contam a história do caráter, do gene, mas não necessariamente da espécie, pois é uma associação (inferência) histórica.

Taxas de mutação/evolução

Saturação em sequências de DNA

111

Existem pontos-quentes de mutação. Algumas regiões estão mais sujeitas ao acúmulo de substituições, portanto também apresentam mais homoplasias (alelos recorrentes) que atrapalham a reconstrução filogenética.

Um problema decorrente da saturação é o que chamamos de “atração de ramos longos”, nos quais grupos divergentes ficam parecendo mais próximos do que realmente são.

Relação entre a taxa de mutação espontânea e a taxa de evolutiva (de substituição)

A taxa estimada de acúmulo de novos variantes é maior em tempos recentes, pois em longo prazo há o aumento da homoplasia (saturação) e outros processos que mascaram o reconhecimento dos eventos de mutação.

Calibração do relógio molecular Estimando taxas evolutivas

114

Registro fóssil Biogeografia Reamostragens Genealogias

A B A B

Separação recente taxas rápidas Separações antigas

taxas lentas

A B

As calibrações destas taxas podem ser feitas por análises diversas utilizando:

23/05/2011

20

Taxas evolutivas moleculares

Exemplo taxa = 0,06 diferenças / 6 M.A. em um determinado gene taxa = 0,01 / M.A. ou 1% por milhão de anos neste gene.

6 M.A.

Erros de calibração com fósseis

Muitas vezes o fóssil usado para calibrar o “relógio” é mais recente que a divergência genética, portanto as datas estimadas com estas taxas podem ser subestimativas.

6 M.A.

O processo do coalescente

117

Erro de calibração do Coalescente

Divergência genética precede o isolamento reprodutivo

Isolamento reprodutivo

Divergência genética

Presente

Passado

Brady et al. 2006. PRSB

A evolução da eussocialidade em abelhas halictídeas está associada a um período geológico de temperaturas amenas.

Exemplo de escalas temporais em

filogenias

Exemplo de escalas temporais

em filogenias

Ohlson et al. 2008 Zool.Sc.

Correlação entre divergência, especiação, mudanças climáticas e especialização de hábitats em Tiranídeos.

Floresta húmida

F. húmida dossel

Semi-aberto

Hábitat aberto

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Árvores de genes e de espécies

• A história evolutiva dos genes reflete aquela das espécies que os carregam, exceto quando: – Transferência horizontal = transferência gênica entre

espécies (ex. entre bactérias, mitocôndrias em híbridos)

– Duplicação gênica : ortologia/ paralogia

Incongruência entre árvores de genes e de espécies

Mamíferos

Primatas

Esta é uma árvore que representa só a história dos genes e não dos táxons.

Associações históricas

Page e Charleston, 1998

Eventos entre gene (associado) e a espécie (organismo)

Page e Charleston, 1998

Associado

Espécie

Transferência Horizontal

Evento de triagem

Codivergência

Duplicação

Reconstrução da filogenia de espécies: artefatos devido à paralogia

Perda de genes pode acontecer durante a Evolução: mesmo sequências com genomas completos pode ser difícil detectar paralogia (duplicação). Algumas linhagens gênicas podem ter sido perdidas (eventos de triagem).

Rat Mouse Rat Mouse

GNS1 GNS1

GNS1 GNS2

GNS2 GNS2 GNS1 GNS2

Hamster Hamster

especiação

duplicação

Mouse Rat

GNS GNS GNS

Hamster

Árvore verdadeira Árvore obtida com amostragem

parcial de genes parálogos