Apresentação Disciplina Proteômica
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Disciplina Proteômica
Bruno Accioly Alves RomagnoliMariana Sayuri Ishikawa Fragoso
07/05/2015
Visão Geral
• Proteômica– Método novo de identificação e quantificação absoluta
“global” de proteínas– Validação do método
• Comparação com AQUA
• Variação da composição proteica em relação às condições ambientais
• Avaliação do custo proteico e de processos biológicos• Visão global do metabolismo • Heterogeneidade em Operons (mecanismos pós-
traducionais?)
Introdução
• A disponibilidade de dados de quantificação absoluta de proteínas são de grande importância na compreensão da biologia de sistemas por dois grandes motivos:
1. Participação nos sistemas biológicos
2. As concentrações proteicas determinam a taxa de adaptação de processos celulares
Introdução
• “Padrão Ouro” para quantificação absoluta:– Western Blot
• No entanto, para se obter o maior número possível de proteínas de uma maneira absoluta...
Espectrometria de massas
Introdução
• Metodologia de quantificação absoluta (AQUA)– Nessa metodologia são utilizados peptídeos sintéticos
marcados.
– Determinada pela adição (concentração conhecida) de peptídeos sintéticos marcados na amostra que permitem calcular a quantidade de peptídeos não marcados (endógenos) com base no espectro dos respectivos peptídeos marcados
Metodologia AQUA
Metodologia AQUA
• Limitações– A disponibilidade e os custos ($$$) para
encomendar os peptídeos sintéticos é um fator limitante.
– Inviável para abordagens de quantificação e identificação globais/larga escala
Contexto
• Necessidade de desenvolvimento de novas abordagens de quantificação absoluta que permitam expandir a quantificação (“escala global”) e que sejam label free (menor custo)
Objetivo Proteômico
• Quantificar de modo absoluto o maior número possível de proteínas expressas no citoplamas de Bacillus subtilis com o método LC/MSᴱ
Objetivo Científico
• Validar um novo método independente de dados LC/MSᴱ, na quantificação de proteínas de B. subtilis em diferentes condições de cultivo.
Métodos de identificação de peptídeos
• Dependente de Aquisição de Dados (DDA)– Seleção dos íons que serão fragmentados a partir dos
peptídeos mais intensos
• Independente de Aquisição de Dados (DIA)– Não há seleção dos peptídeos. O critério de
fragmentação não é com base na intensidade dos peptídeos, mas sim numa faixa de massa onde tudo que estiver dentro da faixa estipulada será fragmentado e identificado
AQUA
Método DDA (AQUA)
Método DIA (LC/MSᴱ)
Métodos de identificação de peptídeos
• Alternativo ao AQUA:– MSᴱ-Hi3• Estratégia Hi3: Após a identificação dos peptídeos
utilizando o método DIA, é feita a comparação das intensidades médias de sinal dos três peptídeos mais intensos de uma proteína com uma proteína padrão digerido internamente
DIA
MSᴱ-Hi3 AQUA
Fonte da amostra
• Bacillus subtilis cepa BSB 168 T +
•10 g/L Caseinhydrolysate •3,9 g/L Acido L-glutâmico•1,3 g /L de L-alanina•1,5 g/L de L-asparagina •1,4 g/L de KH2PO4•1,4 g/L de NH4Cl•0,1 g/L Na2SO4,•0,1 g/L de NH4NO3•0,1 g/ L de MgSO4•0,02 g/L CaCl2•0.075 g/L de MnSO4,•FeCl3 0,001 g/L
•2 g/L de (NH4) 2SO4•1,4 g/L de K2HPO4•0,6 g/L de KH2PO4,•0,1 g/L Na3citrate•0,2 g/L de MgSO4•0,001 g/L de MnSO4•5 g/L de glucose•0,001 g/L de FeCl 3
Condição S Condição CH
MetodologiaCultura de B.
subtilis
Meio CHMeio S
Coluna de C18
Tripsina
Cultura de B. subtilis
Meio CHMeio S
Coluna de C18
Tripsina
Peptideos marcados
Metodologia
LC/SRM
Hi3
AQUA
LC/MSᴱ
6 proteínas
4 proteínas
4000 QTRAP
TSQ VANTAGE
Synapt G2
DDA
DIA
Metodologia• Tempo total da corrida– 4000 QTRAP: 1620 min -> 27 hrs– TSQ VANTAGE: 1440 min -> 24 hrs– Synapt G2: 4770 min -> 79,5 hrs
• Tempo parcial de uso da máquina– Synapt G2: 5058 min -> 84,3 hrs
• Método de ánalise – 4000 QTRAP:MultiQuant 1.2– TSQ VANTAGE: Pinpoint 1.0– Synapt G2: MassLynx V4.1
Resultados
• 3 replicatas técnicas para cada 3 replicatas biológicas• Proteínas identificadas em pelo menos 3 replicatas• FDR: 0,8 para condição S 0,4 para condição CH• Identificação de 1079 proteínas
23% 67% 10%
Condição S Condição CH•88% Citoplasma•8% Membrana•4% Extracelular
• A quantificação do número de moléculas por célula chegou a 4 ordens de magnitude;– Proteínas com 18 m/c até 150.000 m/c
• Abordagem Hi3 para quantificação• Comparação das intensidades de sinal de três
péptidos trípticos mais intensos com uma proteína padrão interno (ADH1)
• Comparação com Western Blot
• Comparação com AQUA
• Quantificação absoluta mais confiável• CV abaixo de 10%• Adição de peptídeos marcados dificulta quantificação em larga escala• Etapa de pré-fracionamento• Teste Wilcoxon-Rank-Sum
Limitação do método
• 259 genes essenciais -> número de cópias elevado
• 192 quantificados absolutamente• Proteínas essenciais não quantificadas podem
ser divididos em dois subgrupos.– Proteínas de baixo peso molecular– Proteínas de membrana
• Menor probabilidade de gerar peptídeos por digestão tríptica, que se encaixam na janela analítica do espectrômetro de massa
Impactos fisiológicos
• Condição S– Glicose como fonte de carbono– Condição glicolítica– Síntese de aminoácidos
• Condição CH– Aminoácidos como fonte de carbono– Condição Gliconeogênica– Degradação de aminoácidos– Volume celular 1,94X maior do que em S
• Condição S– 35 proteínas com
abundancia maior do que 10.000 m/c
– Metabolismo do carbono
– Síntese de aminoácidos– Maquinaria de tradução– Chaperonas
• Condição CH– 51 proteínas com
abundancia maior do que 10.000 m/c
– Degradação de aminoácidos
– Gliconeogênese
127 proteínas expressas diferencialmente
Regulação pós
traducional
Cobertura das vias metabólicas
• Fator de transcrição AHRC– Reprime a
expressão de genes que codificam para a síntese de arginina
– Induz a degradação de arginina.
• Promotor ativado por ROCR – expressão de proteinas da via da degração da arginina
Síntese diminui 50xDegradação aumenta
20x
• A quantificação absoluta permitiu analisar os níveis proteicos heterogêneos de proteínas cujos genes são codificados por um mesmo operon.
• Análise da quantidade de proteínas relacionadas a operons conhecidos e que sabidamente estão envolvidos no metabolismo e em vias de sínteses de cofatores.
• Operons com no mínimo 3 proteínas identificadas
“Operon Heterogeneity”
Condição S Nº m/c
Condição CH
• Como explicar que proteínas cujos genes estão num mesmo operon pode apresentar níveis de expressão (número de moléculas por célula) tão diferentes?
Mas...
Regulação Pós-Transcricional
Cálculo de Custo de Proteína
• As células têm de investir um conjunto disponível de recursos limitados em processos biológicos
• O custo de proteína em um processo biológico é definido como a massa total de proteínas investida no processo
• O custo individual de uma proteína corresponde à quantidade de proteína multiplicado pela respectiva massa individual, em Daltons.
• Visão global sobre a distribuição de massa nas principais funções biológicas.
Conclusões
• Identificação de 1079 proteínas • ~40% de cobertura de sequência (utilizando os 3 peptídeos) • ~40% de cobertura do proteoma citosólico predito
• Comparando MSᴱ-Hi3 X AQUA – Reprodutibilidade: MSᴱ-Hi3 < AQUA– Coeficiente de variação: MSᴱ-Hi3 > AQUA– Capacidade de identificação e quantificação: MSᴱ-Hi3 > AQUA
Conclusões
• O método aplicado MSᴱ-Hi3 para a quantificação absoluta de proteínas contribuiu para a análise de biologia de sistemas por:– Aprimorar o conhecimento de modelos dinâmicos com
base na concentração de proteínas– Permite a detecção de novos mecanismos de regulação
(Pós-Transcricionais)– Capaz de inferir o custo real de proteínas em diferentes
processos (inclusive de vias metabólicas)– Tornar possível avaliar a distribuição dos recursos celulares
Conclusão
• O artigo traz um novo método (MSᴱ-Hi3)– DIA– Validado• MSᴱ-Hi3 > AQUA
• Pode ser aplicado para abordagens de investigações globais e de biologia de sistemas.
Figuras • http://
www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/mass-spectrometry/protein-aqua/protein-aqua-strategy.html
• http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40051/title/Moving-Target/
• http://www.nature.com/nmeth/journal/v10/n1/abs/nmeth.2309.html