5 - CINÉTICA DE FORMAÇÃO DE PRODUTO

Formação de produto metabólito pode ser relacionada a consumo de nutriente. Além do mais, formação de produto não pode ocorrer sem a presença de células. Assim, é esperado que crescimento e formação de produto estão intimamente relacionados à utilização de nutrientes que dependendo dos controles metabólitos regulatórios, formação de produto será ligada a crescimento e/ou concentração celular.

A relação cinética entre crescimento e formação de produto depende do papel do produto no metabolismo celular. As duas cinéticas mais comuns são aquelas que descrevem a síntese do produto durante o crescimento e após o crescimento ter cessado. Um exemplo menos comum aplica ao caso onde o crescimento inicialmente ocorre sem formação de produto, mas após algum período de tempo o produto começa a aparecer enquanto o crescimento continua.

X X X [ ] [ ] [ ]

P P P

(a) t (b) t (c) t

No gráfico (a), a formação de produto é associado ao crescimento celular. No gráfico (b), temos formação de produto associado ao crescimento, de uma forma mais ou menos confusa, chamada de formação de produto parcialmente associada ao crescimento. No gráfico (c), temos formação de produto não associada ao crescimento.

A velocidade de formação de produto é a derivada de P em cada ponto dP/dt. Da mesma forma que dX/dt e dS/dt não é usado, dP/dt (velocidade de formação de protuto) pode ser transformada em Velocidade Específica de Formação de Produto (p) que é definido da seguinte maneira:

onde: P = concentração de produto (g/L) X = concentração celular (g/L) t = tempo (h) p = velocidade específica de consumo de nutrientes (h-1)

uma vez admensionalizados pelos seus valores máximos max e pmax, podemos mostrar graficamente:

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/max /max

1 1 p/pmax p/pmax

(d) t (e) t

/max 1 p/pmax

(f) t

Os gráficos acima mostram:(d) formação de produto associada ao crescimento;(e) formação de produto parcialmente associada ao crescimento e(f) formação de produto não associada ao crescimento.

6 - FATORES DE CONVERSÃO

Crescimento e formação de produto por microrganismos são processos de bioconversão nos quais os nutrientes químicos alimentados à fermentação são convertidos a massa celular e metabólitos. Cada uma dessas conversões pode ser quantificada por um coeficiente de rendimentos, expressão como massa de célula ou produto formado por unidade de massa de nutriente consumido, Yx/s e Yp/s, para célula e produto, respectivamente. Assim, o coeficiente de rendimento representa a eficiência de conversão.

Nos processos cujo produto é a célula (ex. obtenção de levedura de panificação) o gráfico representativo da fermentação é mostrado abaixo

54s

sX

XP

[ ]

tempo

onde é maximizado o crescimento celular e minimizado a formação de subprodutos.

O coeficiente de rendimento de célula por nutriente torna-se

Yx/s = X/S

Nos processos cujo objetivo é a formação de um produto e não a célula (ex. obtenção de etanol, antibióticos) o gráfico representativo da fermentação é mostrado abaixo

onde é maximizado a formação de produtos e minimizado o crescimento celular.

O coeficiente de rendimento do produto por nutriente será:

Yp/s = P/S

A maneira usual de calcular rendimentos é medir a massa celular ou produto produzido e substrato consumido sob um período de tempo e calcular Yx/s e Yp/s.

Obs.: Quando no meio há mais de um substrato de carbono, considera-se o substrato limitante do crescimento.

7 - INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO.

Durante a maioria das fermentações descontínuas típicas, a velocidade específica de crescimento é constante e independente da concentração de nutrientes que está variando. Todavia, velocidade de crescimento, como uma velocidade de reação química, é uma função da concentração de compostos químicos. Os compostos químicos nesse caso são os nutrientes essenciais para o crescimento. A forma da relação entre velocidade de crescimento e concentração de nutriente foi observada em

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s

sP

P

X

[ ]

tempo

1949 por Monod, sendo similar à cinética de saturação exibida por adsorção monomolecular de Langmuir.

O modelo de Monod tem a forma: = max. S . = vel. específica de crescimento;

KS + S max = vel. espec. de crescimento máximo;

S = concentração de nutriente; KS= constante de saturação e é igual a S, quando = 0,5.max

(h-1) máx

0,5máx

KS concetração de S

Outra forma gráfica de determinar as constantes da equação de Monod é chamado Lineweaver-Burk, resultando da inversão da equação de Monod.

1 = KS . 1 + 1 . max S máx

1/

KS/máx

Interpolação 1/máx

-1/KS 1/S

Alguns valores para Ks no modelo de Monod para crescimento

Nutriente KS (mg/L) MicrorganismoGlicose 1,0 Enterobacter aerogenesGlicose 2,0-4,0 Escherichia coliGlicose 25,0 Sacharomyces cerevisiae

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Observações:a) Os valores de Ks são muito pequenos em relação à concentração do

nutriente nas fermentações industriais.b) max, quando S> 10 KS

c) para S< 10 KS, é uma forte função da concentração de nutriente.d) Durante a fase exponencial é constante .

8 - EVOLUÇÃO DE CALOR DURANTE A FERMENTAÇÃO

A evolução de calor durante a fermentação está intimamente relacionada à utilização da fonte de carbono e energia.

a) Quando a fonte de carbono está sendo ativamente incorporada à massa celular via crescimento, tipicamente cerca de 40-50% da entalpia disponível é conservada na biomassa e o restante, perdido como calor (50-60%).

b) Quando a fonte de carbono está sendo metabolizada para manutenção celular, toda a entalpia associada com combustão é desprendida como calor.

c) Se um produto está sendo formado, então o calor envolvido por unidade de fonte de carbono metabolizada está entre os dois extremos.

O interesse na evolução do calor está na necessidade de removê-lo durante o processo de fermentação e da utilidade do calor como indicador da viabilidade metabólica.

9 - INFLUÊNCIA DO AMBIENTE NO CRESCIMENTO CELULAR

A habilidade de um microrganismo crescer e sintetizar produtos em um dado ambiente é determinado pelo microrganismo (m.o). O desenvolvimento bem sucedido de processos de fermentação é dependente, primeiro da obtenção de boas linhagens por isolamento e mutação, segundo, dos parâmetros ambientais no crescimento celular e formação de produto, tais como:

9.1 – Efeito da Temperatura no Crescimento Celular

Crescimento microbiano e formação de produto são resultados de uma complexa série de reações químicas. Como elas, eles são influenciados pela temperatura da seguinte forma:

Três tipos de curvas crescimento-temperatura normalmente ocorrem:

Psicrófilos Mesófilos Termófilos57

/max

10 20 30 40 50 60 70 (To)

A maioria dos m.os crescem num intervalo de temperatura entre 20 e 40oC.

A velocidade de crescimento cresce rapidamente quando a temperatura aumenta até a temperatura ótima, mas a partir dessa, o crescimento cai também rapidamente.

A maioria dos m.o. apresenta o seguinte comportamento:

Morte Crescimento max

(1/T)

pode ser dado pela equação de Arrhenius:

= Ae-Ea/RT

= A’e-Ea’/RT

A e A’ = constante (h-1)Ea e Ea’ = energia de ativação (cal/mol)R = 1,98 cal/mol KT = temperatura (K) = velocidade específica de morte (h-1). = velocidade específica de crescimento (h-1)

A energia de ativação para crescimento varia de 15-20kcal/mol e para morte de 60-70kcal/mol. Assim a velocidade específica de morte é muito mais sensível à temperatura que a de crescimento.

A temperatura também pode afetar outros aspectos importantes do crescimento microbiano como Yx/s. Na produção de biomassa o importante é atingir a máxima conversão de substrato à massa celular. Assim o coeficiente de rendimento Yx/s celular é de principal interesse. Esse coeficiente de

58

rendimento é mostrado na figura a seguir para crescimento de bactérias em metanol, em função da temperatura.

Yx/s

45 50 55 60 65 T(oC)

9.2 – Efeito do pH no Crescimento Celular

- pH do meio afeta o crescimento e a formação de produtos.- Os m.os. trabalham com uma variação máxima de 3 a 4 unidades

de pH do valor ótimo. - E a velocidade máxima de crescimento se dá para intervalos de 1 a

1,5 unidades de pH

Ex.: Escherichia coli (bactéria) max

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 pH

Bactérias pH 4 – 8Leveduras pH 3 – 6 Mofos pH 3 – 7 Procaiotos superiores pH 6,5 – 7,5

Como consequência o pH deve ser controlado nos seus valores ótimos para melhorar a performance do processo.

Durante a fermentação, o pH tem uma tendência a mudar por várias razões.

Quando a fonte de N é um sal de amônio NH4+ o m.o. incorpora da

forma R-NH3+ liberando H+, portanto o pH diminui.

Quando a fonte de N é NO3-, o m.o. remove H+ do meio para

reduzir o NO3- a R-NH3

+ logo o pH aumenta.

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Outra razão para variação do pH ocorre quando ácidos orgânicos são produzidos (ácido lático, pirúvico, acético e etc.).

Através da medida do ácido ou álcali adicionado para neutralizar a mudança de pH, é possível obter informações sobre crescimento (X) e formação de produto (P). A figura abaixo mostra a relação entre a massa de NH4OH adicionado ao cultivo para controle de pH e a concentração celular. O m.o. utilizado foi E. coli BL21(DE3)pLysS para produção da proteína recombinante Troponina C

X (g/L)

X = 0,68 + 0,85(NH4OH) E. coli BL21(DE3)pLysS

NH4OH (g)

60