1

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Trabalho de Conclusão do Curso de Farmácia-Bioquímica

APLICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA PARA A DETERMINAÇÃO DA

NATEGLINIDA EM MEDICAMENTOS

Aluno: Renato Biscain

Orientadora: Profa. Dra. María Segunda Aurora Prado

São Paulo

2020

2

SUMÁRIO

Lista de Figuras …………………………………………………………………….....3

Lista de Tabelas………………………………………………………………….........4

Lista de abreviaturas…………………………………………………………………..5

RESUMO……………………………………………………………………………….6

1. INTRODUÇÃO..........................................................................................7

2. REVISÃO DA LITERATURA....................................................................8

3. OBJETIVOS............................................................................................14

3.1 Objetivo Geral........................................................................................14

3.2 Objetivos Específicos.............................................................................14

4. MATERIAL E MÉTODO.........................................................................14

4.1 MATERIAIS............................................................................................14

4.1.1 Reagentes, padrões, solventes e soluções.......................................15

4.1.2 Equipamentos....................................................................................16

4.2 MÉTODO................................................................................................16

5. RESULTADO E DISCUSSÃO................................................................22

6. CONCLUSÃO.........................................................................................29

7. REFERÊNCIAS......................................................................................31

ANEXOS

3

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Estrutura química da nateglinida.

Cromatograma da solução do padrão de nateglinida (50 µg

mL-1).

Cromatogramas da solução padrão de nateglinida, diluente,

placebo e amostra.

Curva analítica da solução padrão de nateglinida na faixa de

concentração de 40 a 60 µg mL-1

4

Tabela 1.

Tabela 2.

Tabela 3.

Tabela 4.

Tabela 5.

Tabela 6.

Tabela 7.

Tabela 8.

Tabela 9.

Tabela 10.

.

LISTA DE TABELAS

Placebo de nateglinida.

Concentração das soluções tampão de fosfato de sódio

monobásico com seus correspondentes pHs.

Composição das Fases móveis.

Teste de Youden.

Composição das fases móveis.

Dados estatísticos.obtidos na curva analítica. Método HPLC.

Precisão do método (repetitividade e precisão intermediária).

Recuperação da solução padrão de nateglinida. Método

HPLC.

Resultados obtidos em oito condições para avaliação da

robustez.

Efeitos dos parâmetros analíticos no teor e tempo de

retenção (TR).

5

ANVISA

ATP

DM

DPP4

DPR

g

GLP-1

HPLC

HPLTC

ICH

KATP

LD

LQ

mg

mm

mM

MM

min

mL

NA

nm

pH

RDC

SDS

TR

UV

Vis

λ

µg

LISTA DE ABREVIATURAS

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Adenosina trifosfato

Diabetes Mellitus

Inibidores da dipeptidil peptidase 4

Desvio padrão relativo

Grama

Peptídeo semelhante a glucagon 1

High performance liquid chromatography

High-performance thin-layer chromatography

International Council for Harmonisation

Canal de potássio sensível ao ATP

Limite de detecção

Limite de Quantificação

Miligrama

Milímetro

Milimolar

Massa molar

Minuto

Mililitro

Nateglinida

Nanômetro

Potencial hidrogeniônico

Resolução da Diretoria Colegiada

Dodecil sulfato de sódio

Tempo de retenção

Ultravioleta

Visível

Comprimento de onda

Micrograma

6

RESUMO

O diabetes mellitus é uma doença crônica onde a concentração de glicose

encontra-se anormalmente elevada (hiperglicemia) e está associada a diversas

disfunções metabólicas. Atualmente, o diabetes representa grande ameaça à

saúde global estando relacionado dentre os principais motivos ao estilo de vida

moderno das grandes metrópoles e cuja doença acomete milhões de pessoas

a cada ano. Um dos fármacos utilizados no tratamento do diabetes mellitus, a

Nateglinida da classe das metiglinidas age como anti-hiperglicêmico. Objetiva-

se com esse trabalho desenvolver e validar uma metodologia analítica que seja

rápida, exata e precisa para a determinação da nateglinida em comprimidos

através da cromatografia líquida de alta eficiência em microemulsão. Foi

utilizada uma coluna C18 Nova-Pak (150 × 3.9 mm, 4 μm) e fase móvel

constituída por 3,4 g dodecil sulfato de sódio (SDS), 6,6 g butanol, 0,8 g octano

e 89,2 g de tampão fosfato 20 mM pH 2,6, a vazão foi de 1,0 mL/min,

temperatura de forno de 25 ºC. A Detecção foi realizada em 215 nm. O método

foi validado de acordo com as diretrizes dos guias ICH, Farmacopeia

Americana e resolução RDC N° 166/2017 da ANVISA. O método demonstrou

ser linear na faixa de concentração de 40 à 60 µg mL-1 com R2 = 0,9975. A

nateglinida foi detectada em 2,7 min. Os limites de detecção e quantificação

foram 2,30 µg mL-1 e 6,98 µg mL-1, respectivamente, a precisão expressa como

desvio padrão relativo foi menor que 2%. A exatidão, expresso em termos de

percentagem de recuperação de nateglinida foi 100,6%. O método mostrou ser

linear, específicopreciso, exato, e robusto para a quantificação da nateglinida

em medicamentos. Não foi observada interferência por parte dos excipientes

com a nateglinida. O método proposto pode ser utilizado para análises de

rotina em laboratórios de controle de qualidade.

BISCAIN, R. Aplicação da cromatografia líquida de alta eficiência em fase

reversa para a determinação da nateglinida em medicamentos. no. 35 f. 38

Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia e Bioquímica – Faculdade de

Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2020.

Palavras-chave: Diabetes tipo 2, HPLC, validação.

7

1. INTRODUÇÃO

O Diabetes mellitus, também chamado de Diabetes tipo 2 é uma doença

crônica onde a concentração sérica de glicose encontra-se anormalmente

elevada (hiperglicemia). [1] Vários processos patogênicos estão envolvidos no

desenvolvimento do diabetes, os quais dois são mais comuns: a diminuição da

capacidade da insulina em atuar nos tecidos periféricos (resistência à insulina)

e a disfunção das células β pancreáticas [2] representada pela incapacidade de

produzir quantidade suficiente de insulina para superar a resistência à insulina

nos tecidos periféricos. [3]

Estima-se que cerca de 425 milhões de pessoas possuem diabetes e a

projeção para 2045 é que esse número cresça em torno de 48% entre pessoas

de 20 a 79 anos de idade em todo o mundo. [4] Estudos apontam que os

maiores aumentos ocorrerão em países de renda média e baixa. No Brasil, a

doença acomete cerca de 12,5 milhões de pessoas, sendo o quarto país com o

maior número de afetados. [4, 5] As razões para a crescente epidemia de

diabetes mellitus são múltiplas, incluindo o envelhecimento da população, a

crescente prevalência da obesidade e do sedentarismo, e os processos de

urbanização são considerados os principais fatores relacionados ao aumento

da incidência e prevalência da doença. [6, 7]

Atualmente, existem diversos medicamentos que podem ser utilizados

no tratamento da diabetes tipo 2 individualmente ou em associações. São

utilizados sulfonilureias de segunda geração (glibenclamida), biguanidas

(metformina), inibidores de α-glicosidase (acarbose, miglitol), inibidores de

DPP-4 (alogliptina), metiglinidas (nateglinida, repaglinida) entre outros. [8, 9] A

Nateglinida é um agente insulinotrópico de ação rápida e curta duração que

reduz os níveis de glicose no sangue, pela sua ligação ao canal KATP das

células β pancreáticas para estimular a liberação de insulina. [10, 11] Esses

medicamentos têm grande importância no controle da glicose sanguínea e no

tratamento da DM.

A literatura revela alguns trabalhos para a determinação de nateglinida

por cromatografia líquida de alta eficiência em fluidos biológicos como plasma

humano [12], em plasma de coelho [13, 14], em intestino de rato [15] e em

8

medicamentos [16, 17]. Outros trabalhos também foram realizados utilizando-

se as técnicas analíticas como eletroforese capilar [18, 19], cromatografia de

camada delgada de alto desempenho (HPTLC) [20]. Foi encontrado apenas um

trabalho que utilizou a fase móvel composta por microemulsões [21].

As microemulsões são definidas como fluidos macroscopicamente

homogêneos, opticamente transparentes, compostas por gotículas dispersas,

na maioria das vezes carregadas negativamente, do tamanho de nanômetros

de um solvente orgânico lipofílico imiscível. [22] Para formar essa mistura, a

tensão interfacial entre o óleo (como octano) e a água deve estabilizada pela

adição de um surfactante e um co-surfactante [23, 24] Podem ser classificadas

como óleo em água (O / A), ou água em óleo (A / O) [22]. O presente trabalho

visa o uso da cromatografia líquida em microemulsão para determinar a

nateglinida em medicametos.

2. REVISÃO DA LITERATURA

Diabetes

O Diabetes é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia

resultante de defeitos na secreção de insulina, ação da insulina ou ambos.

Vários processos patogênicos estão envolvidos no desenvolvimento do

diabetes. Estes variam desde a destruição autoimune das células β

pancreáticas com consequente deficiência de insulina até anormalidades que

resultam em resistência à ação da insulina. [2] O diabetes está associado ao

aumento da mortalidade, bem como à morbidade por cegueira, insuficiência

renal que requer diálise, amputações não traumáticas dos membros inferiores e

doença vascular aterosclerótica. O custo do gerenciamento do diabetes é muito

alto e mais da metade é gasta no gerenciamento de complicações associadas

ao DM consumindo uma grande quantidade de recursos de saúde pública.

Existem três tipos principais de diabetes: tipo 1, tipo 2 (mais comum, constitui

cerca de 90% dos casos) e diabetes gestacional. [25]

9

Apesar dessa prevalência alarmante de DM, ainda existe uma falta de

diagnóstico que afeta cerca de 193 milhões de pessoas em todo o mundo e

desconhecem a doença devido ao desenvolvimento silencioso de sintomas e

sinais mínimos e a falta de acesso aos cuidados de saúde. [26]

Os fatores de risco para DM tipo 2 incluem uma combinação de fatores

genéticos e metabólicos que contribuem para sua prevalência. Fatores não

modificáveis que incluem etnia, histórico familiar e idade avançada; além dos

fatores modificáveis, como obesidade, alimentação não saudável,

sedentarismo e tabagismo. [26, 27]

Tratamento da diabetes

Em geral, o controle do DM e a prevenção de suas complicações são

obtidas através do controle da dieta e do exercício físico ou do uso de

antidiabéticos ou da combinação de ambos. [28]

Existem no momento diversas opções terapêuticas, incluindo

secretagogos de sulfonilureia, secretagogos de não sulfonilureia, biguanidas,

inibidores da α-glucosidase e Inibidores da dipeptidil peptidase-4. As classes de

medicamentos listadas acima constituem a espinha dorsal da terapia

medicamentosa padrão ou tradicional para o diabetes tipo 2. [28]

Sulfonilureias: Derivam da condensação do grupo arilsulfona com a porção

uréia. [28] São secretagogos que atuam desencadeando a secreção endógena

de insulina das nos canais de potássio sensíveis a ATP das células β

pancreáticas. [29] A segunda geração inclui gliburida, glipizida e glimeprida [28]

Biguanidas: Apresentam dois núcleos de guanida condensados. Três

medicamentos estão incluídos nessa classe: metformina, buformina e

fenformina. [28] A metformina é o medicamento antidiabético mais prescrito,

especialmente usado em indivíduos obesos e com sobrepeso. Este

medicamento ainda é a melhor escolha para monoterapia. Atuam aumentando

a sensibilidade à insulina, aumentando a captação de glicose. [29]

10

Inibidores da α-glicosidase: A α-glicosidase é uma enzima responsável pelo

metabolismo dos carboidratos no intestino. Os inibidores dessa enzima

dificultam a absorção dos carboidratos no trato gastrointestinal e com a

secreção de insulina ativada, a glicemia é reduzida no organismo. [30] As

estruturas químicas dos membros da classe indicam moléculas semelhantes a

açúcar, projetadas para ação local no trato gastrointestinal sem absorção

sistêmica. Estão disponíveis três inibidores da enzima: acarbose, miglitol e

voglibose. [28]

Inibidores da dipeptidil peptidase-4 (DPP4): Os inibidores da DPP4

(dipeptidil peptidase 4) comumente denominados gliptinas, impedem a

inativação de GLP-1 que promove a secreção da insulina), resultando na

potencialização da sinalização pancreática dessa enzima o que aumenta o

consumo de glicose e reduz a produção de glicose hepática. Fármacos

exemplares dessa classe são a vildagliptina, sitagliptina e saxagliptina. [31]

Metiglinidas: são um grupo de medicamentos hipoglicemiantes indicados no

tratamento inicial da diabetes mellitus tipo 2. Dentre os representantes dessa

classe são a repaglinida e nateglinida. [28] Sua ação se dá pelo bloqueio dos

canais de KATP na membrana celular das células β pancreática induzindo a

secreção de insulina. O mecanismo do canal iônico é altamente seletivo para

os tecidos, com baixa afinidade para o músculo cardíaco e esquelético. [10]

Nateglinida

A Nateglinida é um pó branco ou quase branco cristalino, inodoro de

sabor amargo. [32] É um ácido orgânico fraco, cujo pka é de 3,1. [21] A NA é

altamente solúvel em metanol, etanol, clorofórmio, éter, acetona e pouco

solúvel em acetonitrila, octanol, enquanto praticamente insolúvel em água. [32,

33]. Quimicamente é Ácido (2R) -3-fenil-2 - [(4-propan 2-il ciclo-hexano

carbonil) amino]. Sua fórmula molecular é C19H27NO3, com massa molecular

de 317,429 mol/g [11]. A Figura 1 mostra a estrutura química da nateglinida:

11

Figura 1. Estrutura química da nateglinida.

Fonte: Site da tcichemicals. [34]

Usos

A nateglinida (starlix) é um agente anti-hiperglicêmico oral usado no

tratamento do diabetes mellitus não dependente de insulina que age ligando-se

às células β do pâncreas para estimular a liberação de insulina. Seu efeito na

redução da glicose pós-prandial é bastante específico e apenas modestamente

reduz a glicemia no jejum. Portanto, a nateglinida é mais apropriadamente

usada quando os níveis de glicose em jejum são moderadamente elevados no

cenário de diabetes precoce ou em combinação com sensibilizadores de

insulina ou com insulina noturna prolongada. É um fármaco de curta duração e

seu efeito ocorre poucos minutos após a ingestão de alimentos, na primeira

fase da liberação de insulina. A dose habitual é de 120 mg devendo ser tomada

antes das refeições. Os efeitos adversos do Starlix incluem ganho de peso,

hiperinsulinemia e hipoglicemia. [35, 11]

Validação de métodos analíticos

De modo a garantir eficácia e segurança dos medicamentos, é de

enorme importância o controle de qualidade de medicamentos nas indústrias

farmacêuticas, as quais precisam cumprir as determinações impostas pela

12

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) [36, 40]. Para tal, é

necessário a escolha de um método analítico adequado e validado. O

desenvolvimento do método analítico, a adaptação ou implementação de

método conhecido, envolve processo de avaliação que estime sua eficiência na

rotina do laboratório visando confirmar a confiabilidade e capacidade de

desempenho do mesmo. Esse processo que costuma ser denominado de

validação é atividade prioritária para o cumprimento das práticas de controle,

permitindo níveis apropriados de exatidão, precisão e confiabilidade. [37, 38]

Em âmbito internacional a regulamentação é realizada de acordo com as

exigências do ICH, representado por Estados Unidos, Japão e Europa, que em

comum acordo definem os parâmetros, metodologias e os requerimentos para

a validação de métodos analíticos. No Brasil a ANVISA por através da RDC Nº

166, DE 24 DE JULHO DE 2017, estabelece os critérios para validação de

métodos analíticos utilizados em produtos biológicos, insumos farmacêuticos e

medicamentos. [39] Os parâmetros de validação para uma metodologia

analítica são seletividade/especificidade, linearidade/faixa de trabalho,

precisão, exatidão, robustez, limite de detecção e limite de quantificação. [40]

Especificidade/seletividade: Especificidade é a capacidade de avaliar

inequivocamente o analito na presença de componentes que podem estar

presentes. Normalmente, estes podem incluir impurezas, produtos de

degradação, matriz, etc. A seletividade é definida como sendo a capacidade de

detecção de substâncias. [40 - 42]

Linearidade: corresponde à capacidade de obter respostas analíticas

diretamente proporcionais à concentração de um analito em uma amostra,

dentro de uma determinada faixa de aplicação. Para o estabelecimento da

linearidade, deve-se utilizar, no mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes da

substância química de referência para as soluções preparadas em, no mínimo,

triplicata. O coeficiente de determinação (R2) deve estar acima de 0,990. [40 -

42]

Precisão: avalia a proximidade de concordância entre os resultados de

análises individuais quando o procedimento é aplicado diversas vezes em uma

13

mesma amostra homogênea, em idênticas condições de ensaio. Deve ser

expressa por meio da repetibilidade, da precisão intermediária ou da

reprodutibilidade. É recomendado que a precisão seja estimada empregando-

se no mínimo, nove determinações de três concentrações, uma alta, uma

média e uma em baixas concentrações em triplicata, ou seis determinações da

concentração nominal.

Repetibilidade expressa a precisão nas mesmas condições de operação

em um curto intervalo de tempo. A repetibilidade também é denominada

precisão intra-ensaio.

A precisão intermediária expressa variações dentro dos laboratórios: dias

diferentes, analistas diferentes, equipamentos diferentes. [40 - 42]

Exatidão: O grau de concordância entre os resultados individuais do método

em estudo em relação a um valor aceito como verdadeiro é definido pela

exatidão e é calculada como a porcentagem de recuperação através do ensaio

de uma quantidade conhecida da substância em análise adicionada a um meio

de composição definida. Deve ser verificada a partir de, no mínimo, nove

determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja,

três concentrações: baixa, média e alta, com três réplicas em cada nível. [40 –

42]

Limite de detecção: é a menor concentração da substância em exame que

pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, com certo limite

de confiabilidade. [40 - 42]

Limite de quantificação: é a menor concentração de uma substância que

pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão adequadas.

O limite de quantificação é um parâmetro de ensaios quantitativos para baixos

níveis de compostos em matrizes de amostras e é usado particularmente para

a determinação de impurezas e / ou produtos de degradação. [40 - 42]

Robustez: A capacidade de um método de permanecer inalterado pequenas e

deliberadas variações como composição da fase móvel, pH, força iônica é

medida pela robustez. Fornece uma indicação de sua confiabilidade durante o

14

uso normal. Considera-se que um método é robusto quando ele não é afetado

por uma modificação pequena e deliberada em seus parâmetros. [40 - 42]

A robustez de um procedimento analítico é uma medida de sua

capacidade de permanecer inalterada por variações pequenas, mas

deliberadas, nos parâmetros do método e fornece uma indicação de sua

confiabilidade durante o uso normal. [40 - 42]

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

O presente trabalho tem como objetivo desenvolver e validar uma

metodologia analítica rápida, precisa e exata para a determinação da

nateglinida em comprimidos através da cromatografia líquida de alta eficiência

em microemulsão.

3.2 Objetivos específicos

- Desenvolver um método analítico que seja rápido, preciso e exato por

cromatografia líquida de alta eficiência em microemulsão.

- Validar a metodologia analítica desenvolvida visando à aplicação em

laboratórios de controle de qualidade.

- Aplicar da metodologia desenvolvida para a quantificação da nateglinida

em medicamentos.

4. MATERIAL E MÉTODO

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Reagentes, padrões, solventes e soluções

15

Padrão

Padrão de nateglinida, (pureza de 99,9%) (Novartis, São Paulo).

Amostra

Comprimidos revestidos contendo 120 mg de nateglinida, Starlix® (Novartis,

São Paulo).

Placebo

O placebo da amostra comercial constituído de lactose monohidratada,

celulose microcristalina, povidona, croscarmelose de sódio, estearato de

magnésio, óxido de ferro amarelo, hipromelose, dióxido de titânio, talco,

macrogol, sílica coloidal anidra.

Reagentes e Solventes

- Metanol, J.T Baker® ;

- Água purificada Milli-Q;

- Octano, Merck®;

- n-Butanol, Merck®;

- Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), Sigma Aldrich®;

- Fosfato de Sódio Monobásico, J.T Baker®;

- Ácido Fosfórico, Sigma Aldrich®;

Vidrarias e acessórios

- Pipeta automática (Eppendorf®);

- Balões volumétricos âmbar;

- Vidraria âmbar;

- Sistema de filtração a vácuo;

- Unidade filtrante PTFE Millex 0,45 µm 13mm (Millipore®);

- Membrana filtrante HV Millex 0,45 µm 47mm (Millipore®);

- Béquer de vidro;

- Bastão de vidro;

- Gral e pistilo;

- Vials

16

4.1.2 Equipamentos

- Balança analítica (METTLER-TOLEDO®)

- Aparelho de ultrassom (UNIQUE®) - modelo USC 1450;

- Aparelho medidor de pH (Digimed®)

- Cromatógrafo à Líquido (Agilent®), 1100® com bomba quaternária,

degaseificador online, amostrador automático, aquecedor/resfriador de

coluna e detector UV.

- Software OpenLab Plus

- Purificador de água Milli-Q (Millipore®)

- Coluna Nova-Pak C18 (4 μm, 150 mm × 3.9 mm)

4.2 MÉTODO

Preparação da solução padrão estoque

A solução padrão foi obtida pesando-se cerca de 5 mg do padrão

nateglinida em uma balança analítica devidamente calibrada e transferindo seu

conteúdo para um balão âmbar de 5 mL. Foi adicionado cerca de 2,5 mL de

metanol e foi sonicado por 2 minutos para dissolução. Esfriou-se e o volume foi

completado com metanol, obtendo-se uma concentração de 1000 µg mL-1. A

solução foi filtrada usando membrana de filtro PTFE de 45 µm.

Preparação da solução de trabalho

Foi transferido 250 µL da solução padrão estoque para um balão âmbar

de 5 ml e completou-se o volume com metanol, obtendo-se concentração final

de 50 µg mL-1. A solução foi filtrada usando membrana de filtro PTFE de 45

µm.

Preparação da solução da amostra estoque

Foram pesados 20 comprimidos e triturados em gral de porcelana

utilizando-se um pistilo até obter um pó fino e homogêneo. Logo depois, pesou-

se uma quantidade do pó (equivalente a 5 mg de nateglinida) e transferiu-se

para um balão volumétrico âmbar de 5 ml e foi adicionado cerca de 2,5 ml de

metanol. A amostra foi sonicada por 5 minutos para completa dissolução, foi

17

resfriada e completado o volume com metanol, obtendo-se uma concentração

de 1000 µg mL-1 de nateglinida. A solução foi filtrada usando membrana de

filtro PTFE de 45 µm.

Preparo das soluções estoque de placebo

A solução placebo foi obtida pesando-se o equivalente de placebo a 5

mg de nateglinida em uma balança analítica devidamente calibrada e

transferindo seu conteúdo para um balão âmbar de 5 mL. Foi adicionado cerca

de 2,5 mL de metanol e foi sonicado por 5 minutos para completa dissolução.

Esfriou-se e o volume foi completado com metanol. A solução foi filtrada

usando membrana de filtro PTFE de 45 µm. A constituição do placebo segue

as proporções da Tabela 1. [43]

Tabela 1: Placebo de nateglinida.

Fonte: Autoria própria.

Preparo das soluções estoque de tampão

Quatro soluções estoque de fosfato de sódio monobásico (MM 119,997

g mol-1) [44] foram preparadas. Duas soluções estoque de tampão 20 mM e

duas de 16 mM. Para a obtenção de uma concentração de 20 mM, foi pesado

aproximadamente cerca de 1,20 g de fosfato de sódio monobásico e transferido

para dois balões volumétricos de 500 ml. Em outros dois balões de 500 ml

foram pesados aproximadamente 0,9599 g deste sal. Os balões foram

18

completados com água MilliQ® e para cada concentração de tampão fosfato o

pH foi ajustado para 2,6 e 2,8 com ácido fosfórico. Obteve-se dessa forma

quatro soluções tampão segundo a Tabela 2:

Tabela 2. Concentração das soluções tampão de fosfato de sódio monobásico

com seus correspondentes pHs.

Fonte: Autoria própria.

Preparo das Fases Móveis

As fases móveis constituídas de microemulsões foram preparadas a

partir da mistura de dodecil sulfato de sódio (SDS), butanol, octano com as

Soluções 1, 2, 3 e 4 contidas na Tabela 3. As soluções foram sonicadas por 30

minutos em ultrassom. Filtrou-se cada fase móvel através de uma membrana

de 0,45 µm.

Foram obtidas quatro fases móveis: A, B, C e D, conforme a Tabela 3.

19

Tabela 3. Composição das Fases móveis.

Fonte: Autoria própria.

Validação do método analítico

Para validação do método foram avaliados os parâmetros de

seletividade, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão,

exatidão e robustez, seguindo as especificações da ANVISA e recomendações

do International Conference on Harmonization (ICH) e Farmacopeia Americana.

[40 - 42]

Seletividade/Especificidade

Com intuito de avaliar a Seletividade/Especificidade realizaram-se

injeções do diluente, placebo, padrão e amostra. Todas as soluções foram

filtradas através de membrana filtrante de de 45 µm.

Linearidade

Foram pegas 5 alíquotas da solução padrão estoque de nateglinida e

transferidas para 5 balões volumétricos âmbar de 5 mL. Foi adicionado metanol

até a metade dos balões e sonicados por 2 minutos até completa dissolução. O

volume foi completado com metanol. Filtrou-se as soluções através de um filtro

de 45 µm. Obteve-se concentrações de 40 µg mL-1, 45 µg mL-1, 50 µg mL-1, 55

µg mL-1 e 60 µg mL-1 de nateglinida (80% a 120% da concentração de

20

trabalho). As soluções foram corridas no equipamento de HPLC em triplicata.

As áreas obtidas foram plotadas versus as concentrações.

Precisão (repetitibilidade e precisão intermediária)

A repetitibilidade do método foi determinada através da preparação da

amostra a uma concentração 100% da concentração de trabalho a partir da

solução estoque da amostra. Foram pegas alíquotas da solução estoque da

amostra, previamente preparada, e transferidas para 6 balões volumétricos

âmbar de 5 mL. Os volumes foram completados com metanol e sonicados por

5 min. Filtrou-se as soluções através de um filtro de 45 µm. Obteve-se a

concentração de 60 µg mL-1 de nateglinida.

De maneira análoga foi utilizado o padrão de nateglinida. As amostras

foram quantificadas por HPLC, no mesmo dia, pelo mesmo analista e a mesma

instrumentação. A precisão do método foi expresso em termos de porcentagem

do desvio padrão relativo (% DPR).

Precisão Intermediária

A precisão intermediária foi realizada seguindo o mesmo procedimento

descrito na repetitividade. As amostras foram quantificadas pelo método de

HPLC, em dias diferentes, com mesmo analista e mesma instrumentação. A

precisão do método foi expresso em termos de porcentagem do desvio padrão

relativo (% DPR).

Exatidão

A exatidão foi determinada através da preparação de nove soluções de

placebo fortificadas com o padrão e testadas a três níveis de concentração

(80%, 100% e 120% da concentração de trabalho). Os resultados são

expressos na forma de porcentagem de recuperação das amostras.

21

Eq.(1)

Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação foram calculados a partir da

curva analítica, segundo as equações a seguir:

Onde:

σ = estimativa do desvio padrão da resposta;

S = coeficiente angular da curva analítica.

Robustez

A robustez foi realizada usando o teste de Youden, que envolve a

variação de parâmetros analíticos combinados em oito experimentos. Para

determinar a variação de um fator, foram encontrados os quatro valores

correspondentes às letras maiúsculas e minúsculas, comparando-se as médias

dos dois grupos [45]. Para calcular as variações que cada parâmetro exerce no

método foram utilizadas as equações a seguir:

Eq. (2)

Eq. (3)

22

Onde : A/a, B/b, C/c e D/d são os efeitos do pH da fase móvel, temperatura da

coluna, fluxo da fase móvel e concentração de tampão respectivamente. As

letras de s a z identificam os resultados obtidos em cada ensaio.

A Tabela 4 mostra os fatores que foram modificados para a determinação da

robustez. Foram denominados os fatores nominais por letras maiúsculas de A a

D e as variações, por letras minúsculas correspondentes. Estes fatores e suas

variações foram escolhidos pelo analista de acordo com testes preliminares.

Tabela 4. Teste de Youden.

Fonte: Dias, Silva e Bonifácio (2017, p. 4). [46 ]

O impacto em percentual (%) de cada fator é expresso dividindo a

diferença obtida pela média global de 8 resultados. Essa porcentagem

demonstra a possível mudança de sistema capacidade de resposta quando a

variável em questão é alterada no intervalo indicado.

Eq. (4)

Eq. (5)

Eq. (6)

Eq. (7)

23

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Desenvolvimento do método analítico

Seleção do Comprimento de onda

Uma solução do padrão de nateglinida foi preparada na concentração de

50 µg mL-1 e lida num espectrofotômetro UV/Vis na faixa comprimento de onda

de 200 a 400 nm. Obteve-se uma máxima em 215 nm. Este comprimento de

onda foi usado neste trabalho.

DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO POR HPLC

Foram testados diferentes fases móveis com o intuito de otimizar o

método (Tabela 5).

Tabela 5. Composição das fases móveis

Fonte: Autoria própria.

As análises foram realizadas em temperatura ambiente controlada (25,0

± 1,0 ºC) utilizando vazões de 1,0 mL min-1 e 2,0 mL min-1 e volume de injeção

de 10 µL. Após estes testes obteve se um sistema otimizado constituído por:

Fase móvel: 3,4 g SDS, 6,6 g butanol, 0,8 g octano e 89,2 g de tampão fosfato

20 mM; coluna: Nova-Pak C18 (150 × 3.9 mm, 4 μm); vazão: 1,0 mL min-1;

volume de injeção: 10 µL; temperatura: 25 ºC e comprimento de onda de 215

nm. A nateglinida foi determinada em 2,7 min (Figura 2).

24

Figura 2. Cromatograma da solução do padrão de nateglinida (50 µg mL-1).

Condições: Fase móvel: 3,4 g SDS, 6,6 g butanol, 0,8 g octano e 89,2 g de

tampão fosfato 20 mM; coluna: Nova-Pak C18 (150 × 3.9 mm, 4 μm); vazão:

1,0 mL min-1; volume de injeção: 10 µL; temperatura: 25 ºC e detecção em 215

nm. Fonte: Autoria própria.

VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

Seletividade/Especificidade

A Figura 3 apresenta os cromatogramas de diluente, placebo, padrão e

amostra. Pode-se observar que não houve interferência por parte dos

excipientes da amostra e do diluente com o pico principal da nateglinida,

portanto, o método foi específico.

25

Figura 3. Cromatogramas da solução padrão de nateglinida, diluente, placebo

e amostra. Condições: Fase móvel: 3,4 g SDS, 6,6 g butanol, 0,8 g octano e

89,2 g de tampão fosfato 20 mM; coluna: Nova-Pak C18 (150 × 3.9 mm, 4 μm);

vazão: 1,0 mL min-1; volume de injeção: 10 µL; temperatura: 25 ºC e detecção

em 215 nm. Fonte: Autoria própria, 2020.

26

Linearidade

A linearidade foi realizada a fim de garantir que os resultados obtidos

são proporcionais à concentração do padrão de nateglinida, de acordo com o

intervalo definido no item 4.2. De acordo com a resolução da RDC Nº 166/17 o

coeficiente de determinação deve ser maior que 0,99.

O método proposto foi linear na faixa de concentração de 40 a 60 µg

mL-1. Obteve se um coeficiente de determinação maior que 0,99 (Tabela 6 e

Figura 4).

Tabela 6. Dados estatísticos obtidos da curva analítica. Método HPLC.

Fonte: Autoria própria

Figura 4. Curva analítica da solução padrão de nateglinida na faixa de

concentração de 40 a 60 µg mL-1. Método HPLC.

Fonte: Autoria própria.

27

Limites de Detecção e Quantificação

A partir do cálculo realizado, encontrou-se que os valores dos limites de

detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram 2,30 µg mL-1 e 6,98 µg mL-1

respectivamente, demonstrando que o método proposto é sensível.

Precisão (Repetitividade)

Para determinar a repetitividade do método foram preparados seis

soluções da amostra à 100% da concentração de trabalho (50 µg mL-1).

Obteve-se um desvio padrão relativo (DPR) de 0,72%. (Tabela 7).

Tabela 7. Precisão do método (repetitividade e precisão intermediária).

Fonte: Autoria própria.

Precisão intermediária

Com o intuito de confirmar a precisão intermediária, esta análise foi

realizada em dia diferente e pelo mesmo analista e mesma instrumentação

obtendo se um DPR % menor de 2% (Tabela 7) o qual está de acordo com

estipulado na ANVISA.

28

Exatidão

A exatidão do método foi obtida através da percentagem de

recuperação. Obteve-se 100,6% de recuperação do padrão de nateglinida,

pode-se constatar que a percentagem de recuperação de nateglinida se

encontra dentro do intervalo estipulado, de acordo com o critério de aceitação

(98 a 102%) [40]. Deste modo, conclui-se que o método é exato (Tabela 8);

Tabela 8: Recuperação da solução padrão de nateglinida. Método HPLC.

* média de 3 determinações. Fonte: Autoria própria.

Robustez

Os resultados obtidos nas oito execuções para a amostra de nateglinida

são demonstrados na Tabela 9. Os valores apresentados na tabela

representam a média de três injeções da solução.

Para avaliar o efeito de cada parâmetro, a média dos quatro valores

correspondentes às condições alteradas foi subtraída da média dos quatro

valores obtidos nas condições nominais, conforme demonstrado nas Eqs (4),

(5), (6) e (7). Os efeitos das variações dos parâmetros nos resultados da

análise são apresentados na Tabela 10.

29

Tabela 9. Resultados obtidos em oito condições para avaliação da robustez.

* média de 3 determinações. ** média de 6 determinações (teste de precisão intermediária).

Fonte: César e Pianetti (2009, p. 238) [45]

Tabela 10. Efeitos dos parâmetros analíticos no teor e tempo de retenção (TR).

* média dos valores nominais - média das variações. Fonte: César e Pianetti (2009, p. 238) [45]

Usando os critérios do teste de Youden, o método cromatográfico

mostrou-se robusto em relação ao conteúdo de nateglinida, quando foram

introduzidas variações nos quatro parâmetros analíticos. A maior variação

obtida foi de 1,51% quando a temperatura da coluna foi alterada de 25 ºC para

30 ºC, um valor consideravelmente baixo. O resultado obtido na tabela 10

demonstrou que não existe uma tendência clara dos fatores que podem afetar

os resultados do teor e do tempo de retenção, pois, além da variação ser

consideravelmente baixa, alguns ensaios obtiveram resultados maiores tanto

na variável nominal quanto na variável alterada, a exceção foi o fluxo da fase

móvel, onde todos os ensaios com um fluxo mais alto resultaram em um tempo

de retenção menor devido a maior eluição do composto.

30

6. CONCLUSÃO

Neste trabalho foi desenvolvido e validado, com sucesso, um método

analítico, por HPLC em microemulsão. A partir dos resultados obtidos na

validação pode-se concluir que o método é específico, seletivo, exato, linear e

preciso para a quantificação da nateglinida em medicamentos, fornecendo

resultados de acordo com os parâmetros preconizados pelo ICH, Farmacopeia

Americana e ANVISA.

A fase móvel que se mostrou mais adequada para análises por HPLC foi

composta por 3,4 g SDS, 6,6 g butanol, 0,8 g octano e 89,2 g de tampão

fosfato ajustado a um pH de 2,6 a um fluxo de 1,0 mL min-1, onde o tempo de

análise foi de 2,7 minutos.

Em comparação com o único método encontrado na literatura para

quantificação da nateglinida em microemulsão houve redução de 7,1 para 2,7

minutos no tempo de retenção da nateglinida, sendo portanto, o método

proposto muito mais rápido. Em Controle de qualidade é muito importante o

uso de metodologias rápidas, econômicas e eficientes.

O método proposto pode ser utilizado para análises de rotina em

laboratórios de controle de qualidade.

31

7. REFERÊNCIAS

1. BRUTTI, B.; FLORES, J.; HERMES, J.; MARTELLI, G.; PORTO, D. S.;

ANVERSA, E. T. R. Diabete Mellitus: definição, diagnóstico, tratamento

e mortalidade no Brasil, Rio Grande do Sul e Santa Maria, no período de

2010 a 2014. Brazilian Journal of health Review, Curitiba, v. 2, n. 4, p.

3174-3182, jun. 2019.

2. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. AMERICAN

DIABETES ASSOCIATION, V. 37, p. 81 - 90.

3. PALICKA, V. Pathophysiology of Diabetes Mellitus. The Jornal of

International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory

Medicine, v. 5, n. 1, p. 140-144, mar. 2017.

4. LIMA, J. E. B. F. Estudo do estresse oxidativo e influência da

hiperglicemia crônica nos perfis de expressão gênica em pacientes

com diabetes mellitus tipo 2. 2019. 84f. Dissertação de Mestrado–

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,

Ribeirão Preto, 2019.

5. ZHENG, Y.; LEY, S. H.; HU, F. B. Global aetiology and epidemiology of

type 2 diabetes mellitus and its complications. Nature Reviews

Endocrinology, v.14, p.88 – 98, 2017.

6. COSTA, A. F.; FLOR, L. S.; CAMPOS, M. R.; OLIVEIRA, A. F. D.;

COSTA, M. D. F. D. S.; SILVA, R. S. D.; LOBATO, L. C. D. P.;

SCHRAMM, J. M. D. A. Carga do diabetes mellitus tipo 2 no Brasil.

Cadernos de Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 33, n. 2, p. 1-14, mar.

2017.

7. GRILLO, M. F. F.; GORINI, M. I. P. C. Caracterização de pessoas com

Diabetes Mellitus tipo 2. Revista Brasileira de Enfermagem, Brasília, v.

60, n. 1, p.49-59, Fev. 2007.

8. KAHN, S.R.; COOPER, M.E; DEL PRATO, S. Pathophysiology and

treatment of type 2 diabetes: perspectives on the past, present, and

future. The Lancet, v. 383, p.1068–1083, mar. 2014.

9. ARAÚJO, L. M. B.; BRITTO, M. M. dos S.; PORTO DA CRUZ, T. R.

Tratamento do diabetes mellitus do tipo 2: novas opções. Arquivos

32

Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia, Salvador, v. 44 p.509–

518, dez. 2000

10. METIGLINIDES. GLOBALRPH. Disponível em:

<https://globalrph.com/drugs/diabetes-meglitinides/>. Acesso em: 02 fev.

2020.

11. NATEGLINIDE. DRUGBANK. Disponível em:

<www.drugbank.ca/drugs/DB00731>. Acesso em 20 Ago. 2019.

12. BAUER, S.; STÖRMER, E.; KIRCHHEINER, J.; MICHAEL, C.;

BROCKMÖLLER, J.; ROOTS, I. Rapid and simple method for the

analysis of nateglinide in human plasma using HPLC analysis with UV

detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 31,

n. 3, p. 551–555, mar. 2003.

13. PANI, N. R.; NATH, L.; SINGH, A. V.; MAHAPATRA, S. K. Development

and validation of analytical method for the estimation of nateglinide in

rabbit plasma. Journal of Pharmaceutical Analysis, v. 2, n. 6, p.492–

498, dez. 2012.

14. SAHOO, R. K.; BISWAS, N.; GUHA, A.; KUOTSU, K. Maltodextrin

Based Proniosomes of Nateglinide: Bioavailability Assessment.

International Journal of Biological Macromolecules, Bengala

Ocidental, India, v. 69, p. 430-434, mar. 2014.

15. MADDI, S.; KESHETTY, S.; MOHAN EGA, C.; RAO YAMASANI, M.;

SCRIBA, G.K.E. Development and validation of a stereoselective HPLC

method for the determination of the in vitro transport of nateglinide

enantiomers in rat intestine. Journal of Separation Science, Warangal,

India, 30, n. 12, p.1875-1880. Ago. 2007.

16. HACIOGLU, A. Development and validation of an HPLC method for

determination of nateglinide in drug substances. MARMARA

PHARMACEUTICAL JOURNAL, Istambul, v. 2, n. 19, p. 103-108, mar.

2015.

17. PATHARE, D. B.; JADHAV, A. S.; SHINGARE, M. S. A Validated

Stability Indicating LC Method for Nateglinide. Drug Development

and Industrial Pharmacy, v. 33 n. 5, p. 551-557, maio. 2007.

18. YAN, H.; YANG, G.; QIAO, F.; CHEN, Y. Determination of nateglinide in

animal plasma by micellar electrokinetic chromatography and on-line

33

sweeping technique. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, v. 36, n.1, p. 169-174, maio. 2004.

19. PHAN, T. D.; NGUYEN, N. H.; Kim, D. J.; Lee, Y. J.; CHOI, S.H.; KIM,

K. H. Determination of the L-enantiomer of nateglinide in pharmaceutical

formulations by micellar electrokinetic chromatography. Archives of

Pharmacal Research, Chuncheon, Coréia do Sul, v. 33, n. 12, p. 2017-

2024, set. 2010.

20. THOMAS, A. B.; PATIL, S. D.; NANDA, R. K.; KOTHAPALLI, L. P.;

BHOSLE, S. S.; Deshpande, A. D. Stability-indicating HPTLC method for

simultaneous determination of nateglinide and metformin hydrochloride

in pharmaceutical dosage form. Saudi Pharmaceutical Journal, Riade,

Arábia Saudita, v. 19, n. 4, p. 221-231, jun. 2011.

21. EL-WASSEEF, D. R. Simultaneous Determination of Metformin,

Nateglinide and Gliclazide in Pharmaceutical Preparations Using Micellar

Liquid Chromatography. International Journal of Biomedical Science,

Almançora, Egito, v. 8, n. 2 , jun. 2012.

22. EL-SHERBINY, D. T. M.; El-ASHRY, S. M.; MUSTAFA, M. A.; ABD-EL-

RAHMAN EL-EMAM, A.; HANSEN, S. H. Evaluation of the use of

microemulsions as eluents in high-performance liquid chromatography.

Journal of Separation Science, v. 26 n. 6-7, p.503-509, maio de 2003.

23. MCEVOY, E.; DONEGAN, S.; POWER, J.; ALTRIA, K. Optimisation and

validation of a rapid and efficient microemulsion liquid chromatographic

(MELC) method for the determination of paracetamol (acetaminophen)

content in a suppository formulation. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, v. 44, n. 1, p. 137-143, maio. 2007.

24. RYAN, R.; DONEGAN, S.; POWER, J.; MCEVOY, E.; ALTRIA, K.

MICROEMULSION HPLC. 2008.

25. KHOO, C. M. Diabetes Mellitus Treatment. International Encyclopedia

of Public Health, 2. ed, v. 1, p. 288–293.

26. GLOVACI, D.; FAN, W.; WONG, N. D. Epidemiology of Diabetes Mellitus

and Cardiovascular Disease. Current Cardiology Reports, v. 21, n. 4,

mar. 2019.

27. BELLO, L. M. G; LIMA, A. M. S; ALVES, K. C. G; SOUSA, S. T. K;

SILVA, A. D. MORTALIDADE PRECOCE POR DIABETES MELLITUS E

34

FATORES DE RISCO EM PALMAS, TOCANTINS. SOCIEDADE DE

PATOLOGIA DO TOCANTINS, Tocantins, v. 4, n. 01, p. 01-22, 2017.

28. MEHANNA, A. Antidiabetic agents: past, present and future. Future

Medical Chemistry, v. 5, n. 4, p. 411-430, abr. 2012.

29. TAN, S. Y.; MEI WONG, J. L.; SIM, Y. J.; WON, S. S.; MOHAMED

ELLHASSAN, S. A.; TAN, S. H.; LIM, G. P. L.; TAY, N. W. R.; ANNAN,

N. C; BRATTAMISRA, S.; CANDASAMY, M. Type 1 and 2 diabetes

mellitus: A review on current treatment approach and gene therapy as

potential intervention. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical

Research & Reviews., v. 13, n. 1, fev. 2019.

30. NERES, L. V. Efeitos adversos no tratamento do diabetes tipo 2.

2018. 41 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharel) – Instituto de

Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas, Universidade Federal

de São Paulo, Diadema, 2018.

31. COPPOLINO, G.; LEPORINI, C.; RIVOLI, L.; URSINI, F.; DI PAOLA, E.

D.; CERNARO, V.; ANDREUCCI, M. Exploring the effects of DPP-4

inhibitors on the kidney from the bench to clinical trials.

Pharmacological Research, v. 129, p. 274-294. mar. 2018.

32. NATEGLINIDE. Chemical Book, 2020. Disponível em:

<https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB9472

923.htm>. Acesso em 21 jan. 2020.

33. NAIK, J.; LOKHANDE, A.; MISHRA, S.; KULKARNI, R. Preparation and

Characterization of Nateglinide Loaded Hydrophobic Biocompatible

Polymer Nanoparticles. Journal of The Institution of Engineers,

Maharashtra, India, serie D, v. 98 n. 2, p. 269-277, ago. 2016.

34. Nateglinide. TCI - Tokyo Chemical Industry. Disponível em:

<https://www.tcichemicals.com/AU/en/p/N0912>. Acesso em 20. jun.

2020.

35. DUNGAN K. M. Management of Type 2 Diabetes Mellitus.

Endocrinology: Adult and Pediatric, 2. ed, p. 839-853, 2016.

35

36. ROCHA, T. G.; GALENDE, S. B. A IMPORTÂNCIA DO CONTROLE DE

QUALIDADE NA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA. Revista UNINGÁ, v.

20, n. 2, p. 97-103, out. 2014.

37. BRITO, N. M.; DE AMARANTE JUNIOR, O. P.; POLESE, L.; RIBEIRO,

M. L. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS: ESTRATÉGIA E

DISCUSSÃO. Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio

Ambiente, v. 13, p. 129-146, dez. 2003.

38. LOMBARDO, M.; ESERIAN, J. K.; A análise da qualidade de

medicamentos e o papel do laboratório oficial no contexto da saúde

pública. Revista de Administração em Saúde, São Paulo, v. 17, n. 67,

Abr. – Jun. 2017.

39. DIAS, F. R. S. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

ANALÍTICOS. 2019. 16 f. Programa de Pós-graduação em Fármacos e

Medicamentos Curso de Farmácia e Bioquímica, Universidade de São

Paulo (USP), 2019.

40. ANVISA – AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA.

Resolução RDC nº 166, de 24 de julho de 2017. Guia para validação de

métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da República

Federativa do Brasil, Brasília, DF, de 25 de julho de 2017.

41. INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION OF

TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF

PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE. Validation of Analytical

Procedures: Text and Methodology Q2(R1), 2005.

42. THE UNITED STATES PHARMACOPEIA. General Chapter, <1225>

Validation of compendial procedures, Rockville, Maryland, USA:

United States Pharmacopeial Convention.

43. MINISTERIO DE SALUD SECRETARÍA DE POLÍTICAS, REGULACIÓN

e INSTITUTOS. A.N. M.A.T. Disposición nº 1541. Novartis Argentina,

Buenos Aires, 12. fev. 2015. Disponível em:

<http://www.anmat.gov.ar/boletin_anmat/febrero_2015/Dispo_1541-

15.pdf>. Acesso em 12. out. 2019.

44. PUBCHEM. Monosodium phosphate. Disponível em:

<https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Monosodium-phosphate>.

Acessado em: 01. dez. 2019.

36

45. CÉSAR, I. da C.; PIANETTI, G. A. Robustness evaluation of the

chromatographic method for the quantitation of lumefantrine using

Youden’s test. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 45, n. 2,

p. 235-240, jun. 2009.

46. DIAS, D.C.S.; SILVA, N. C.; BONIFÁCIO, R. L. Robustness study in

SSNTD method validation: indoor radon quality. Brazilian National

Commission for Nuclear Energy, Poços de Caldas, 25 set. 2017.

_________________________ ________________________

Data e assinatura do aluno(a) Data e assinatura do orientador(a)

São Paulo, 26/06/2020 São Paulo, 26/06/2020