“AÇÃO FOTOTÓXICA DO LASER EM BAIXA INTENSIDADE ......FIGURA B.1- Modelo de formação de um LED...
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“AÇÃO FOTOTÓXICA DO LASER EM BAIXA
INTENSIDADE E DIODO DE EMISSÃO DE LUZ (LED) NA
VIABILIDADE DO FUNGO Trichophyton rubrum: ESTUDO “IN
VITRO”
JOSÉ CLÁUDIO FARIA AMORIM
Belo Horizonte, 04 de julho de 2007.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
ENGENHARIA MECÂNICA
José Cláudio Faria Amorim
“AÇÃO FOTOTÓXICA DO LASER EM BAIXA
INTENSIDADE E DIODO DE EMISSÃO DE LUZ (LED)
NA VIABILIDADE DO FUNGO Trichophyton rubrum:
ESTUDO “IN VITRO”
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Mecânica da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor
em Engenharia Mecânica.
Área de concentração: Calor e Fluidos
Linha de Pesquisa: Bioengenharia
Orientador: Prof. Dr. Marcos Pinotti Barbosa
Departamento de Engenharia Mecânica
Belo Horizonte
Escola de Engenharia da UFMG
2007
COLABORADORES
Laboratório de Bioengenharia da UFMG
Laboratório de Micologia da UFMG (Departamento de Microbiologia)
Laboratório de Física da UFMG
Centro de Lasers e suas Aplicações IPEN-SP
A Deus, sempre presente em minha vida.
Ao meu pai embora longe de minha vida
terrena sempre presente nela espiritualmente.
A minha mãe exemplo de fé, força e amor.
A minha esposa Marina e filha Sabrina pelo
incentivo, dedicação e apoio
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Marcos Pinotti pela oportunidade de poder interagir em
uma área abrangente como a Bioengenharia. As suas interpretações objetivas me
fizeram desenvolver um raciocínio mais lógico das questões do dia a dia contribuindo
para meu desenvolvimento profissional.
Ao Professor Dr. Roberto Márcio de Andrade pelo incentivo e amizade
durante o transcorrer do curso de doutorado. Ensinou conceitos que colaboraram para o
desenvolvimento e término deste trabalho.
A Betânia Maria Soares por me ajudar em todas as fases deste trabalho e
compartilhar seus conhecimentos de forma simples e objetiva.
Aos colegas Gerdal Roberto de Sousa, Lívio de Barros Silveira e Marcus
Vinícius Lucas Ferreira pelo engrandecimento de nossa amizade e companherismo.
Ao Reitor da Universidade de Itaúna, Dr. Faiçal David Freire Chequer, pelo
incentivo e ajuda que me permitiram realizar o doutorado.
Aos colegas da Clínica Integrada da FOUI pelo apoio dispensado em minha
ausência.
Ao colega Renato Prates pela colaboração nos pilotos deste trabalho.
A Walquíria Lopes Borges no preparo dos materiais para os experimentos.
Ao Danilo Nagem e Cláudio Henrique Gerken Dias pelo auxílio nas
fotografias
Ao Fabrício Carvalho, Ivan Rodrigues de Andrade Lourenço, Claysson
Vimieiro e Sara Del Vecchio pelo auxílio na realização dos cálculos envolvidos no
trabalho.
A Maria Cecília Berger pela ajuda na confecção das tabelas e fotos.
A ECCO FIBRAS (São Paulo-Brasil) pelo laser cedido.
A MMOPTICS (São Paulo-Brasil) pelo LED cedido.
SUMÁRIO
Lista de Figuras 7
Lista de Quadros 9
Lista de Gráficos 10
Lista de Tabelas 11
Lista de Símbolos e Unidades 12
Resumo 14
1.Introdução 15
2. Objetivos 21
3. Revisão de Literatura 22
3.1. Base Científica da Terapia Fotodinâmica 22
3.1.1. Histórico 22
3.1.2. Mecanismos de interação 24
3.1.3. Efeitos fototóxicos da PDT 26
3.1.4. Fotossensibilizadores 28
3.1.5. Efeitos fungicidas da terapia fotodinâmica 30
3.2. Dermatófitos e dermatofitose 36
3.2.1. Trichophyton rubrum 37
3.2.2. Manisfestações clínicas 37
3.2.3. Onicomicose 38
3.2.4. Tratamento das onicomicoses 38
3.2.5. Tratamento tópico 39
3.2.6. Tratamento sistêmico 39
3.2.7. Falhas terapêuticas 40
4. Materiais e Métodos 42
4.1 Detalhamento dos materiais 44
4.2 Detalhamento dos métodos 49
4.2.1 Preparo do inóculo 50
4.2.2 Procedimento de teste 52
4.2.3 Cálculo da área e volume de suspensão irradiada 54
4.2.4 Análise estátistica 59
5. Resultados e Discussão 61
6. Conclusões 68
Abstract 69
Referências Bibliográficas 70
Anexo A A.1
A.1 Laser A.1
A.2 Laser de baixa intensidade A.2
Anexo B B.1
B.1 LED B.1
Anexo C C.1
C.1 Cálculo da área e do volume das imagens dos grupos 5 e 6 C.1
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 3.1- Diagrama de Jablonski modificado de Wainwright 25
FIGURA 3.2- Estrutura molecular do Azul de Metileno e do Azul de Toluidina 29
FIGURA 4.1- Diagrama da metodologia 43
FIGURA 4.2- Equipamento laser de baixa intensidade 44
FIGURA 4.3- Equipamento LED 45
FIGURA 4.4- Unidade de Leitura de Potência Luminosa 45
FIGURA 4.5- Espectrofotômetro - MICRONAL B542 46
FIGURA 4.6- Vórtex Biomatic 46
FIGURA 4.7- Fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO) 47
FIGURA 4.8- Amostra de referência ATCC 40051 de T. rubrum 47
FIGURA 4.9-Transferência dos conídios e fragmentos de hifas para o tubo de
ensaio
51
FIGURA 4.10- Microscopia óptica da absorção do corante pelas células fúngicas
após a TPI
53
FIGURA 4.11- Irradiação pelas fontes de luz do fundo para a abertura do tubo 53
FIGURA 4.12- Colônias de T. rubrum repicadas em placas de Petri 54
FIGURA 4.13- Dados dimensionais do tubo de ensaio 55
FIGURA 4.14- Baseline da água sendo irradiada pelo LED e laser 55
FIGURA 4.15- (a) Amostra do grupo 6 sendo irradiada pelo laser e (b) Amostra
do grupo 5 sendo irradiada pelo LED
56
FIGURA 4.16- (a) Conversão da imagem para tons de cinza do grupo 6 e (b)
Conversão da imagem para tons de cinza do grupo 5
57
FIGURA 4.17- Imagem processada onde a área irradiada pelo laser foi de 15,1
mm² sendo que a escala de cores representa a intensidade de luz em cada região
irradiada
57
FIGURA 4.18- Imagem processada onde a área irradiada pelo LED foi de 52,2
mm² sendo que a escala de cores representa a intensidade de luz em cada região
irradiada
58
FIGURA 4.19- (a) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo Laser e
(b) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo LED
58
FIGURA 4.20- Sólido gerado pela revolução da curva para o laser 59
FIGURA 4.21- Sólido gerado pela revolução da curva para o LED 59
FIGURA 5.1- Placas de Petri com colônias de T.rubrun dos grupos 1 (a) e 4 (b) 61
FIGURA 5.2- Placas de Petri dos grupos 2 (a) e 3(b) 61
FIGURA 5.3- Placas de Petri dos grupos 5 (a) e 6 (b) 62
FIGURA B.1- Modelo de formação de um LED B.1
FIGURA C.1- (a) Área/laser=15,1 mm2 e (b) Área/LED=52,2 mm2 C.1
FIGURA C.2- Imagens originais do tubo sendo irradiado pelo laser à esquerda
(a) e pelo LED à direita (b). Em destaque a área de corte
C.2
FIGURA C.3- Esquema do procedimento para criação do sólido que forneceu o
valor numérico do volume
C.3
LISTA DE QUADROS
QUADRO 3.1- Caminhos fototóxicos da PDT 27
QUADRO 3.2- Principais fotossensibilizadores utilizados em PDT com suas
bandas de absorção 29
QUADRO 4.1- Grupos do experimento 52
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 4.1- Espectroscopia de absorção óptica do fotossensibilizador, Azul
de Toluidina 25µg/mL No eixo Y encontra-se a absorção normalizada do corante
em unidades arbitrárias e no eixo X a porção visível do espectro eletromagnético
em nanômetros.
49
GRÁFICO 4.2- Espectroscopia de absorção óptica da suspensão de Trichophyton
rubrum em salina. No eixo Y encontra-se a absorção normalizada do corante em
unidades arbitrárias e no eixo X a porção visível do espectro eletromagnético em
nanômetros.
50
GRÁFICO 4.3- Espectroscopias do fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO)
na concentração de 25µg/ mL, de Trichophyton rubrum isoladamente e de
Trichophyton rubrum associado ao Azul de Toluidina (TBO) 25µg/ mL. No eixo
Y encontra-se a absorção normalizada do corante em unidades arbitrárias e no
eixo X a porção visível do espectro eletromagnético em nanômetros.
51
GRÁFICO 5.1- Avaliação descritiva da média percentual de crescimento em
relação ao controle considerando-se os 3 experimentos
64
LISTA DE TABELAS
TABELA 5.1- Avaliação descritiva do percentual de colônias viáveis em relação
ao controle considerando-se cada experimento
63
TABELA 5.2- Resultado da análise de variância da influência dos fatores de
interesse na avaliação do percentual de colônias viáveis em relação ao controle
64
LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES
LASER = amplificacão da luz por emissão estimulada de radiação
LED =diodo emissor de luz
TBO = azul de toluidina
MB = azul de metileno
nm = nanômetro
mW = miliwatt
mW/cm² = miliwatt por cm²
HeNe = hélio-neonio
CO2 = dióxido de carbono
I = intensidade
W = watt
s = segundo
J = joules
g = grama
L = litro oC = graus celsius
J/ cm 2 = joules por centímetro quadrado
µm = micrometro � = comprimento de onda
PDT = terapia fotodinâmica
EROs = espécies reativas de oxigênio
DNA = ácido desoxiribonucléico
ATP = trifosfato de adenosina
HIV = imunodeficiência adquirida
HPD = derivado de hemato-porfirina
PpIX = protoporfirina IX
FDA = administração americana de alimentos e drogas
HO = hidroxila
H2O2 = peróxido de hidrogênio
µg/ mL = microgramas por mililitro
TPI = tempo de pré-irradiação
ALA = ácido 5 amino-levulínico � = formulação comercial
µM = micromolar
Ab-TBO = conjugado anticorpo-azul de toluidina
LPS =lipopolissacarídeos
AsGa = arseneto de gálio
AsGaAl = arseneto de gálio alumínio
p/v = por volume
CLSI = instituto de padronizações clínicas e laboratoriais
ø = diâmetro
d.p = desvio padrão
RESUMO
O efeito do laser em baixa intensidade emitindo no vermelho do espectro
eletromagnético com comprimento de onda de 660nm, 100mW de potência média de
saída e tempo de 3 minutos foi comparado com LED em baixa intensidade emitindo no
vermelho com comprimento de onda de 630nm, 100mW de potência média de saída e
tempo de 3 minutos, associado ao fotossensibilizador Azul de Toluidina com uma
concentração de 25µg/mL em uma amostra do fungo Trichophyton rubrum sendo
realizado em triplicata. As espectroscopias do corante azul de toluidina (TBO), do fungo
Trichophyton rubrum, assim como o cálculo do volume e da área de suspensão do
inóculo associado ao fotossensibilizador e irradiada pelo laser e LED nos tubos de
ensaio foram analisados. O corante TBO (25µg/mL) foi o escolhido devido a sua
ressonância com os comprimentos de onda do laser e LED e por ser bem absorvido
pelas células fúngicas mostrando-se promissor para sua utilização “in vivo”. Foi obtido
um volume final de suspensão de 1000µL sendo analisados seis grupos: grupo 1
(controle de crescimento sem tratamento), grupo 2 (suspensão do inóculo submetida à
irradiação com LED), grupo 3 (suspensão do inóculo submetida à irradiação com
laser), grupo 4 (100 µL de TBO acrescentados a 900 µL do inóculo), grupo 5 (100 µL
de TBO foram acrescentados a 900 µL do inóculo e realizada irradiação com LED) e
grupo 6 (100 µL de TBO foram acrescentados a 900 µL do inóculo e realizada
irradiação com laser). Com exceção do grupo 1, todos os outros grupos foram
irradiados por três minutos sendo para os grupos 4, 5 e 6, estabelecido o tempo de pré-
irradiação (TPI) de 5 minutos para absorção do corante pelas células fúngicas. Os
resultados mostraram diferenças significativas entre os grupos 5 e 6 (PDT) com redução
de 68,1% e 56% respectivamente, quanto ao número de colônias viáveis sendo que o
LED por apresentar uma divergência maior que a luz laser, abrangeu um volume maior
de suspensão do inóculo mostrando-se mais eficiente na sua ação fototóxica.
Palavras chaves: Trichophyton rubrum, PDT, LASER, LED.
1. INTRODUÇÃO
O Trichophyton rubrum é um fungo cosmopolita, sendo o mais implicado em
quadros de dermatofitose humana segundo a literatura científica. Sua transmissão é
principalmente inter-humana ou por fômites contaminados. Clinicamente é responsável
por quase todos os tipos de infecção dermatofítica humana, estando muitas vezes
correlacionados com o fato de serem refratários ao tratamento estabelecido, em razão de
sua maior facilidade de burlar as defesas inatas do hospedeiro e permanecer como uma
infecção residual, com exacerbações clínicas eventuais. É um fungo ubiqüitário, não
havendo área ou grupo de pessoas que se encontrem totalmente isolados de tal
microrganismo. Têm a capacidade de invadir tecidos ceratinizados (pele, pêlos e unhas)
de homens e animais, produzindo condições patológicas (COSTA et al., 2002).
A onicomicose é uma doença multifatorial. A faixa etária do paciente tem
exercido importante efeito em sua ocorrência, com correlação entre o aumento da idade
e da infecção. Estudos observaram que a genética é um fator que governa a
epidemiologia da onicomicose e a doença causada pelo T. rubrum apresenta um padrão
familiar. Tem sido observada a associação entre a ocorrência de onicomicose e o estilo
de vida do paciente. Diabetes, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida e doenças
arteriais periféricas são fatores predisponentes para a instalação desta infecção fúngica.
Como qualquer doença infecciosa, um diagnóstico correto e precoce é imprescindível
para a escolha do tratamento adequado. Estudos revelam que as espécies Trichophyton
rubrum e Trichophyton mentagrophytes estão envolvidos em mais de 90% das
onicomicoses (FAERGEMANN E BARAN, 2003).
O tratamento das onicomicoses representa uma das principais dificuldades
terapêuticas encontradas na prática clínica, em razão de algumas particularidades: as
unhas são estruturas não-vascularizadas o que explica a pequena penetração dos
medicamentos utilizados por via sistêmica e o crescimento das unhas se faz de maneira
lenta (5 a 6 meses nas unhas das mãos e 12 a 18 meses nas unhas dos pés). Portanto, as
dermatofitoses das unhas dos pés são mais rebeldes ao tratamento que as das mãos
(SIDRIM E MOREIRA, 1999).
O tratamento tópico com amorolfina e ciclopiroxolamina produz poucos
efeitos adversos sistêmicos e não faz interação com outras drogas sistêmicas utilizadas
16
pelo paciente, porém, em monoterapia, está indicada apenas para onicomicoses
superficiais com comprometimento inferior a 50% da lâmina ungueal e para pacientes
nos quais a medicação sistêmica está contra-indicada (LECHA, 2001; BALLESTÉ et
al., 2003).
Os antifúngicos sistêmicos classicamente empregados no tratamento das
onicomicoses são a griseofulvina e o cetoconazol que apresentam efeitos adversos
como: cefaléia, hipersensibilidade e eritema. Interagem com outras drogas
(anticoagulantes orais e fenobarbital) acelerando seu metabolismo e diminuindo sua
biodisponibilidade (LLAMBRICH E LECHA, 2002; BALLESTÉ et al., 2003). Por
volta de 1990 foram substituídos por itraconazol, fluconazol e terbinafina, que
apresentam melhores resultados em menor tempo, maior segurança para o paciente
embora apresentando ainda efeitos colaterais (BALLESTÉ et al., 2003).
De acordo com Ribeiro e Zezell (2004), o tratamento fotodinâmico (PDT) é
estudado pela Medicina em várias modalidades terapêuticas. Na Oncologia, o
tratamento dos tumores malignos com o uso do laser tem mostrado bons resultados. As
primeiras experiências com o tratamento fotodinâmico datam de aproximadamente 100
anos, relatadas por Raab, que observou que a exposição ao corante alaranjado de
acridina associado à luz pode ser letal para protozoários como o paramécio. Além disso,
sugeriu que este efeito era causado pela transferência de energia da luz para a substância
química, similarmente ao que ocorre nas plantas, com a absorção da luz pela clorofila.
Nem a luz nem o corante isoladamente tiveram qualquer efeito aparente sobre os
paramécios, mas, associados, foram altamente citotóxicos. Os dois autores citados
anteriormente afirmaram que outros pesquisadores tentaram destruir células tumorais,
pela exposição à radiação X, associada ao corante hematoporfirina. Entretanto, esse
procedimento não obteve sucesso, demonstrando que a fonte de luz deve interagir com o
corante.
A PDT representa um complexo sistema de fototerapia que requer a presença
de três fatores que interagem concomitantemente: corante (agente fotossensibilizador),
uma fonte de luz e o oxigênio. Isoladamente, nem o fotossensibilizador, nem a luz tem a
capacidade de produzir efeito deletério ao sistema biológico alvo. O mecanismo de ação
se dá por dois tipos de reações físico-químicas: Reação do tipo I e reação do tipo II
(MELLO et al., 2001; ALLISON et al., 2004).
Segundo Konan et al 2002, o efeito fotodinâmico tem seu início quando a
molécula do corante absorve a luz irradiada saindo do seu estado de repouso
17
(fundamental) assumindo um estado mais energético, porém, menos estável chamado
estado singleto. Devido à grande instabilidade deste nível de energia, a molécula tem
um tempo de vida muito curto (em água é cerca de 4,0µs, MACHADO, 2000) e tende a
voltar para um nível de energia mais baixo ou mesmo retornando ao seu estado de
repouso (reação do tipo I). Nesta transição, o excesso de energia pode ser transferido ao
substrato de várias maneiras: por meio de fluorescência (espontâneo), onde o
fotossensibilizador emite energia em forma de fótons, por conversão interna ou também
pode passar a um nível intermediário (reação do tipo II), chamado estado tripleto,
situado entre o estado de repouso e o estado singleto apresentando um tempo de vida
um pouco mais longo. A curta meia vida do oxigênio singleto, mais uma vez, assegura a
reação localizada. Os processos do tipo II são geralmente aceitos como os maiores
caminhos na lesão da célula microbiana. Como na reação do tipo I discutida acima, o
oxigênio singleto também reagirá com as moléculas envolvidas na manutenção e
estrutura da parede da célula/membrana, tais como os fosfolipídeos, os peptídeos e os
esteróis.
Como a maioria das bactérias e fungos em geral não absorvem a luz visível
de alguns lasers que operam com baixa potência e LEDs (Diodos de emissão de luz), a
utilização de um agente de absorção óptica que se fixe à parede celular atraindo para si a
luz laser / LED no momento da irradiação é essencial para que ambos tenham ação
antimicrobiana. Portanto, o fotossensibilizador funciona como um agente de absorção
óptica, devendo ser ressonante com o comprimento de onda da fonte de luz utilizada
bem como, não apresentar efeitos tóxicos aos tecidos (ZANIN et al., 2002; ZANIN E
GONÇALVES., 2003). Ao selecionar-se um determinado fotossensibilizador para uso
em terapia fotodinâmica, o espectro de absorção óptica, ou seja, os comprimentos de
onda nos quais este fotossensibilizador é capaz de absorver é uma das primeiras
características que devem ser analisadas, pois, conforme mencionado anteriormente, é
necessário que o cromóforo (qualquer substância capaz de absorver luz) absorva a
energia da fonte de luz para poder então passar pelo processo de transição eletrônica que
possibilita sua ação fotodinâmica. Sendo assim, conhecendo-se a faixa do espectro
eletromagnético na qual este composto absorve luz, é possível escolher a fonte de
ativação adequada para obtenção do efeito fotodinâmico (RIBEIRO E GROTH, 2005).
Allison et al. (2004) formularam as diretrizes e características ideais que o
fotossensibilizador deve apresentar para maximizar o efeito fotodinâmico da terapia.
Devem apresentar eficiência fotoquímica, ser biologicamente estável, provocar
18
toxicidade mínima aos tecidos, ser de fácil eliminação, não provocar mutagenicidade,
ser de fácil ativação, administração e ter ação localizada.
Os corantes Azul de Toluidina (TBO) e Azul de Metileno (MB) associado ao
laser de He-Ne apresentaram bons resultados na redução microbiana de diversas
culturas de bactérias e fungos demonstrando a importância da ressonância entre os
corantes e o comprimento de onda (�) emitido pela fonte de luz (DOBSON E WILSON
1992).
A concentração do corante é outro fator de relevância para o sucesso da
reação fotodinâmica. Devem ser utilizadas concentrações não tóxicas, ou seja, a
concentração escolhida não deverá produzir danos ao alvo antes da ativação pela fonte
de luz (toxicidade no escuro). As concentrações utilizadas variam de um
fotossensibilizador para outro de acordo com as características químicas de cada
composto e de sua toxicidade. As concentrações típicas utilizadas em PDT
antimicrobiana são da ordem de µg/ml (REYS, 2004).
O tempo de pré-irradiação (TPI), que significa o tempo decorrido entre a
aplicação do corante no alvo e sua ativação pela fonte de luz, varia de acordo com a
interação desejada. A morfologia microbiana pode variar com as espécies levando as
diferenças na localização do fotossensibilizador. Além disso, o tempo necessário para a
absorção do corante antes da iluminação pode ser importante (WAINWRIGHT, 1998).
Para a PDT anti-neoplásica, o fotossensibilizador é aplicado por via endovenosa e o
tempo de pré-irradiação pode chegar a 48 horas. Nas aplicações tópicas da PDT,
principalmente a antimicrobiana, espera-se que o corante una-se ao microorganismo ou
mesmo chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular, localizando-se no
citoplasma da célula num tempo de 1 a 10 minutos. Espera-se também que durante esse
período, antes da ativação pela fonte de luz, que o fotossensibilizador não sofra
degradação (RIBEIRO E GROTH, 2005).
O fato de a fotossensibilização ser localizada é vantajoso em um aspecto: é
possível matar bactérias e fungos presentes numa infecção mista. No entanto, as
bactérias comensais e os tecidos do hospedeiro podem ser afetados. Algumas receitas
terapêuticas usadas para infecções orais (antibióticos sistêmicos) eliminam tanto os
microorganismos patogênicos quanto os comensais indiscriminadamente rompendo o
ecossistema natural da cavidade oral. Portanto, é importante desenvolver um tratamento
que possa especificamente atingir o microorganismo patogênico sem provocar qualquer
efeito colateral no tecido do hospedeiro (BHATTI et al., 2000). De acordo com Chan e
19
Lai (2003), a PDT é aplicada clinicamente apenas em áreas teciduais com doença
porque a ação fotodinâmica se dá apenas onde o corante foi aplicado juntamente com a
incidência da irradiação luminosa, portanto, tendo o seu efeito bem localizado evitando-
se desta maneira, as super dosagens e também a probabilidade dos efeitos colaterais
associados à administração sistêmica de agentes antimicrobianos.
As primeiras fontes de energia utilizadas na PDT eram lâmpadas
convencionais emitindo luz não coerente e policromática (luz branca) nas quais podiam
ser acoplados filtros coloridos para obtenção de determinados comprimentos de onda.
As lâmpadas convencionais apresentam um forte componente térmico associado e
devido às características de luz não coerente, o cálculo da dose era difícil tendo como
maior vantagem o baixo custo das lâmpadas. Com o advento dos lasers de diodo de
baixa intensidade (anexo A), estes passaram a ser utilizados devido às suas próprias
características como a monocromaticidade e a coerência, facilitando a associação com
um corante de banda de absorção ressonante ao comprimento de onda emitido pelo
laser. Por emitirem em baixas intensidades de potência, esses lasers não apresentam
componente térmico mensurável associado. A dose de radiação é facilmente calculada,
a área de irradiação pode ser bem controlada focalizando o tratamento. A luz pode ser
transmitida por fibra óptica e estas fibras podem receber adaptações para melhor acessar
a área alvo, como microlentes e difusores (ACKROYD et al., 2001; GARCEZ, 2006;
RIBEIRO E ZEZELL, 2004).
Diversos tipos de lasers com diferentes meios ativos como o de argônio, de
corantes, de vapores de metais, hélio-neônio e os de diodos semi-condutores foram
utilizados ao longo dos anos. O importante na terapia fotodinâmica é a capacidade de
excitar o fotossensibilizador em seu alvo com um foto-efeito mínimo sobre o tecido
adjacente. Na PDT é utilizado o laser e o LED em baixa intensidade emitindo no
espectro do vermelho por serem bem absorvidos pelos tecidos biológicos do que lasers
em alta intensidade. A fotodestruição microbiana é mais alcançada com potências da
ordem de W/cm2, do que por dezenas de watts. Vale destacar que os efeitos obtidos por
esta terapia não são por incrementos de temperatura, e sim por reações fotoquímicas
entre fotossensibilizador, luz e o substrato. Mantendo-se a mesma dose (fluência –
J/cm2), pode-se variar a densidade de potência (W/cm2) ou o tempo de exposição (s), no
entanto, uma potência alta sobre um curto período de tempo (s) pode oferecer resultados
diferentes em termos de destruição microbiana, do que com potência baixa aplicado por
20
um período mais longo, embora a dosagem de luz (J/cm2) tenha sido a mesma em cada
caso (KONIG et al., 2000; RIBEIRO E GROTH, 2005).
Uma fonte de luz alternativa para a PDT são os LEDs (Anexo B), que
também podem ser utilizados com sucesso como fontes de ativação em terapia
fotodinâmica, apresentando um baixo componente térmico e luz monocromática, com
banda estreita de comprimentos de onda (WALSH, 2003). LEDs são diodos especiais
que emitem luz quando conectados a um circuito. A diferença básica entre laser e LED
é que nestes predomina o mecanismo da emissão espontânea de radiação e nos lasers, a
emissão estimulada. Dessa distinção básica decorrem as diferenças estruturais entre os
dois dispositivos e que nem sempre são acentuadas, decorrendo diferenças funcionais
que dão aos lasers um desempenho geralmente superior, porém, mais caro. Os lasers
precisam de grande quantidade de energia para sua geração, enquanto os LEDs
necessitam de pouca energia para a geração de luz. Entre os dispositivos utilizados
como fonte de luz, os LEDs são os mais simples. Apresentam um largo espectro de luz
não coerente e apresentam uma divergência maior, diferentemente dos lasers. Embora
seja uma fonte de luz divergente e não coerente semelhante à luz halógena, apresentam
um espectro de emissão bem mais estreito, tendo um aproveitamento bem melhor que à
luz halógena (STHAL et al., 2000).
Fatores tais como: interações farmacológicas, resistência fúngica e a não
adesão do paciente ao tratamento das onicomicoses também são razões que podem
explicar as possíveis falhas terapêuticas utilizando drogas antifúngicas (SIDRIM E
MOREIRA, 1999). Portanto, os estudos relacionados à terapia fotodinâmica devem ser
incentivados devido à extrema importância do estabelecimento de novos métodos que
possam reduzir o número de pessoas acometidas por onicomicose, representando
melhora à saúde pública e à qualidade de vida destes pacientes.
2. OBJETIVOS
1. Analisar a susceptibilidade “in vitro” do Trichophyton rubrum frente à terapia
fotodinâmica (PDT).
2. Comparar os resultados obtidos pela PDT utilizando-se laser em baixa
intensidade emitindo no vermelho do espectro eletromagnético com
comprimento de onda de 660nm, 100mW de potência média de saída e tempo de
3 minutos, com LED em baixa intensidade emitindo no vermelho com
comprimento de onda de 630nm, 100mW de potência média de saída e tempo de
3 minutos.
3. Avaliar, por meio de espectroscopia, se a banda de absorção do Azul de
Toluidina (25µg/mL), do fungo Trichophyton rubrum e da suspensão do fungo
associada ao corante Azul de Toluidina são ressonantes com o comprimento de
onda dos equipamentos utilizados na pesquisa.
4. Calcular a área e o volume de suspensão irradiada pelo laser e LED nos tubos de
ensaio referentes aos grupos da PDT.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Base científica da terapia fotodinâmica
Por ser ainda uma terapia não muito conhecida, é oportuno esclarecer aos
leitores sobre o seu complexo mecanismo de interação com os microorganismos. Deve-
se ressaltar que a PDT moderna teve início em 1970 para tratamento de neoplasias. A
partir da década de 90 os estudos em bactérias começaram a se intensificar
principalmente com Dobson e Wilson (1992) e mais recentemente trabalhos em fungos
começaram a ser realizados.
3.1.1 Histórico
O uso da luz como agente terapêutico vem desde a antiguidade. Ela foi usada
no Egito, Índia e China para tratar doenças da pele, como psoríase, vitiligo e o câncer
com a exposição do paciente ao sol. Os gregos antigos empregavam a exposição total do
corpo ao sol para a restauração da saúde, terapia essa denominada pelo filósofo grego
Heródoto como Helioterapia (ACKROYD et al., 2001).
As primeiras experiências com a terapia fotodinâmica datam de
aproximadamente, 100 anos atrás, sendo o primeiro artigo cientifico publicado por
Marcacci em 1888, mas ainda com poucos dados de observação. Já no ano de 1900,
Oscar Raab e Von Tappeiner estudaram a ação do corante acridina sobre culturas de
paramécios. Eles verificaram o aumento da toxicidade deste corante laranja no
paramécio provocado pelo aumento da intensidade luminosa durante uma tempestade de
raios, levando-os a concluir que as condições de luz no ambiente durante os
experimentos poderiam alterar o resultado das pesquisas. Eles postularam que este
efeito era causado pela transferência da energia luminosa dos raios para a substância
química (corante), similar ao que ocorre nas plantas com a absorção da luz pela clorofila
(ACKROYD et al., 2001; SCHABERLE, 2002).
O primeiro relato da administração sistêmica de fotossensibilizadores em
humanos foi realizado em 1900, por Prime, um neurologista francês, que usou
oralmente a eosina utilizada no tratamento de epilepsia induzindo à dermatite nas áreas
23
da pele expostas ao sol. Esta descoberta levou à primeira aplicação tópica da eosina com
exposição à luz branca para tratar tumores cutâneos, realizada por Von Tappeiner e o
dermatologista Jesionek. O prêmio Nobel de 1903 foi designado ao físico dinamarquês
Niels Finsen, devido ao seu trabalho de fototerapia. Finsen descobriu que o tratamento
com luz poderia controlar manifestações de tuberculose cutânea, uma doença muito
comum na ocasião. Obteve, também, sucesso no tratamento da varíola, usando a luz
vermelha, o que preveniu a supuração das pústulas (ACKROYD et al., 2001; ALLISON
et al., 2004).
Em 1907, Von Tappeiner juntamente com Jodlbauer, demonstraram a
necessidade do oxigênio nas reações fotossensibilizantes, introduzindo o termo “ação
fotodinâmica” para descrever este fenômeno (ACKROYD et al., 2001). Também, na
virada do século XX, após décadas de experimentações sobre os efeitos da pigmentação
dos corantes de anilina sobre células animais e microbianas, Paul Ehrlich formulou o
princípio da seletividade, trabalho no qual estabeleceu os fundamentos da quimioterapia
moderna (WAINWRIGHT, 1998).
Estes estudos continuaram a partir da metade do século XX quando
Schwartz, Winkelman e Lipson publicaram uma série de artigos demonstrando que
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirinas (HPD) poderiam ser usados para
detectar tumores por fluorescência. A PDT moderna iniciou em meados de 1970 tendo
como grande nome o cientista Thomas J. Dougherty, que descobriu o potencial das
hematoporfirinas para tratamento de neoplasias (SCHABERLE, 2002).
Em 1972, Lancet e Diamond tentaram destruir células tumorais com
associação de hematoporfirinas com o raio X, entretanto, o uso do raio X como fonte de
energia para ativação não foi capaz de provocar nenhum efeito deletério sobre as células
tumorais, demonstrando que a fonte de luz deve ser ressonante com a absorção do
corante (ACKROYD et al., 2001).
Em 1976, Weishaupt e colaboradores postularam que o oxigênio singleto,
gerado a partir da transferência de energia do agente fototerapêutico no estado tripleto
excitado para o oxigênio molecular no estado fundamental, era o agente citotóxico
responsável pela desativação de células tumorais. Embora a PDT tenha sido
originalmente desenvolvida visando a terapia do câncer em suas diversas formas é claro
seu grande potencial no que concerne a outras moléstias. Nesse contexto incluem-se a
psoríase, onde se tem atingido resultados bastante promissores, degeneração macular da
retina, condições autoimunes, arteriosclerose, remoção de verrugas na laringe,
24
tratamento de micoses fungóides e destruição de bactérias resistentes a tratamentos
tradicionais à base de antibióticos (MACHADO, 2000).
Nas últimas décadas, diversos autores se voltaram para o primeiro estudo de
Raab, investigando a eliminação de microorganismos pela terapia fotodinâmica. A PDT
com finalidade antimicrobiana encontra-se bem estabelecida na literatura, com sua ação
sobre diferentes bactérias e vírus, principalmente em casos de infecções localizadas
(RIBEIRO E GROTH, 2005).
3.1.2 Mecanismos de interação
A PDT representa um complexo sistema de fototerapia que requer a presença
de três fatores que interagem concomitantemente: corante (agente fotossensibilizador),
uma fonte de luz e o oxigênio. Isoladamente, nem o fotossensibilizador, nem a luz, tem
a capacidade de produzir efeito deletério ao sistema biológico alvo. O mecanismo de
ação se dá por dois tipos de reações físico-químicas: Reação do tipo I e reação do tipo II
(MELLO et al., 2001; ALLISON et al., 2004).
• Reação do tipo I:
Nesta reação, o fotossensibilizador sofre degradação, levando-o a uma
transformação química, que resulta na formação de espécies reativas de oxigênio (EROs
– Peróxido de hidrogênio, íons hidroxila, radicais hidroxila, ânion superóxido entre
outros), que são tóxicas ao microorganismo.
Segundo Konan et al 2002, o efeito fotodinâmico tem seu início quando a
molécula do corante absorve a luz irradiada saindo do seu estado de repouso
(fundamental), assumindo um estado mais energético, porém menos estável chamado
estado singleto. Devido a grande instabilidade deste nível de energia, a molécula tem
um tempo de vida muito curto e tende a voltar para um nível de energia mais baixo ou
mesmo retornando ao seu estado de repouso (reação do tipo I). Nesta transição, o
excesso de energia pode ser transferido ao substrato por meio de fluorescência
(espontâneo), onde o fotossensibilizador emite energia em forma de fótons. Pode-se
passar também a um nível intermediário (reação do tipo II), chamado estado tripleto,
situado entre o estado de repouso e o estado singleto, apresentando um tempo de vida
um pouco mais longo (fosforecência) (FIG. 1).
25
FIGURA 3.1 - Diagrama de Jablonski modificado de Wainwright.
FONTE - RIBEIRO E ZEZELL, 2004.
Para fotossensibilizadores, é importante que o estado tripleto seja bem
povoado (presença de muitos elétrons/fótons) e relativamente de longa duração. Se isto
ocorrer, o corante excitado tem tempo de reagir com o seu ambiente (por transferência
eletrônica/reações redox) ou transferir sua energia de excitação a uma molécula de
oxigênio do meio e produzir o altamente reativo oxigênio singleto. Se estas reações são
iniciadas no meio biológico, por exemplo, dentro de um tumor ou na parede celular
bacteriana e fúngica provocará efeito deletério celular e biológico (REYS, 2004).
Alguns estudos demonstram que a maioria das bactérias e fungos, apresentam uma
membrana celular / parede especial e resistente à terapia fotodinâmica. Esforços têm
sido feitos para se desenvolver fotossensibilizadores que aumentem a permeabilidade da
membrana celular microbiana, facilitando sua lise (PFITZNER et al., 2004).
De acordo com Meisel e Kocher (2005), o mecanismo da terapia
fotodinâmica obedece a três princípios fotobiológicos:
1. A lei GROTTHUS - DRAPER: a luz usada deve ter um comprimento de onda
adequado (ressonante) ao fotossensibilizador, uma vez que apenas a luz
absorvida pode desencadear uma reação fotoquímica.
2. A lei STARK -_EINSTEIN : cada molécula do fotossensibilizador envolvida na
reação induzida pela luz, absorve um quantum da irradiação eletromagnética
emitida.
26
3. A lei de BUNSEN – ROSCOE: o efeito fotoquímico é uma função do produto da
intensidade da luz e do tempo de exposição (dosagem da luz).
Segundo Ribeiro e Zezell (2004) a eficácia da terapia fotodinâmica é, essencialmente,
dependente de três fatores:
1. Biológicos
Seletividade e retenção do fotossensibilizador na área alvo.
2. Físicos
Intensidade da radiação eletromagnética que chega à região de tratamento
(propriedades ópticas do tecido).
Eficiência da absorção dos fótons ativadores.
Eficiência da transferência de energia de excitação da molécula
fotossensibilizadora para o substrato.
3. Químicos
Efeito oxidante na molécula.
Tempos de vida razoavelmente longo dos estados excitados para permitir a
transferência de energia.
3.1.3 Efeitos fototóxicos da PDT
A morte da célula bacteriana induzida pela ação fotodinâmica no nível
molecular é, em alguns casos, bem estabelecida. A ação fototóxica provocada pela
reação do tipo I com a água em meio microbiano pode elevar os radicais de hidroxila
(HO), que podem também reagir ou combinar com as biomoléculas para proporcionar a
formação de peróxido de hidrogênio (H2O2) in situ com resultados citotóxicos, levando
por exemplo, a remoção do hidrogênio da membrana citoplasmática bacteriana. Pode
causar também, possível inativação das enzimas das membranas e dos receptores. Na
reação do tipo II, o fotossensibilizador em estado tripleto transfere sua energia para o
oxigênio molecular (do meio), formando oxigênio singleto que reage, rapidamente, com
os constituintes celulares (parede celular, os ácidos nucléicos, os peptídeos, dentre
outros). A curta meia vida do oxigênio singleto mais uma vez assegura a reação
localizada. Como na reação do tipo I discutida acima, o oxigênio singleto também
reagirá com as moléculas envolvidas na manutenção e estrutura da parede da
27
célula/membrana, tais como os fosfolipídeos, os peptídeos e os esteróis
(WAINWRIGHT, 1998), conforme QUA. 3.1).
QUADRO 3.1
Caminhos fototóxicos da PDT
Lugar
de ação Ação Resultado Consequência
Evento
Citotóxico
Água Redução de
H+
Formação de radical
hidroxila (HO)
Formação de
peróxido de
hidrogênio,
superóxido (O2)
Posterior
processos
oxidativos
Parede
celular/membrana
lipídios
insaturados/
esteróis
Peroxidação Peroxidação Formação de
hidroperóxido
Aumentada
permeabilidade a
íons (passagem
de Na+/K+)
Peptídeos Redução de
hidrogênio
Ligação cruzada nos
peptídeos
Inativação de
enzimas
Perda da
facilidade de
reparação; lise
Camada de
proteína viral
Oxidação de
resíduos de
aminoácidos
Degradação de
proteínas
Perda de
infectividade
viral
Cadeia respiratória Reações
redox
Inibição da
respiração
Enzimas
citoplasmáticas/en
zimas virais
Oxidação ou
ligações
cruzadas
Inibição do corpo
de ribossomos;
Inibição de
replicação/infecti
vidade
Resíduos de ácidos
nucléicos
(tipicamente
guanosina)
Oxidação da
base ou
açúcar
8-hidroxiguanosina
Degradação de
nucleotídeos;
Degradação de
açúcar/quebra
Substituição de
base; Quebra de
fitas; Mutação;
Inibição de
replicação
FONTE - WAINWRIGHT, 1998; Adaptado por Ribeiro e Zezell, 2004.
28
3.1.4 Fotossensibilizadores
Entre as características importantes do fotossensibilizador estão sua banda de
absorção de energia e a intensidade de absorção, bem como sua eficiência na produção
de espécies reativas de oxigênio. Tem sido enfatizada também a importância do meio
em que o fotossensibilizador é empregado, bem como as diferentes formulações
possíveis. A aplicação tópica, principalmente para o tratamento de infecções
superficiais, tem forte apelo por se tratar de uma terapia não invasiva, sem complicações
sistêmicas, porém, a estabilidade do agente fotossensibilizador deve ser mantida até a
sua ativação pela fonte de luz, bem como a penetração através da pele e mucosa deve
ocorrer de forma eficiente. Além destes fatores, é de grande importância a remoção do
fotossensibilizador do local de ação após a sua aplicação. No caso da odontologia e
infecções de pele, o manchamento da superfície torna inviável o uso de certos agentes
corantes. O corante azul (TBO) do grupo das fenotiazinas utilizado neste estudo, em
baixas concentrações não produz ação citotóxica e a dose necessária para a morte
bacteriana é menor que a dose necessária para provocar danos à célula do hospedeiro
(queratinócitos e fibroblastos) (WAINWRIGHT, 1998). Os determinantes da eficácia
fototerapêutica são o alto coeficiente de absorção do corante, o tempo de pré-irradiação,
a concentração do corante no alvo e o fluxo de energia da luz incidente. Os corantes
azuis (FIG 2) têm uma especificidade restrita, podendo provocar danos às proteínas
plasmáticas. Candida albicans, o agente causador da candidíase, em sua forma de
levedura ou hifa, também é sensível a PDT com os corantes azuis. Os corantes azuis
absorvem luz entre � = 620 nm a 700 nm, conforme QUA. 3.2. Sua principal aplicação é
na PDT antimicrobiana (RIBEIRO E GROTH, 2005; PRATES et al., 2006).
Dobson e Wilson (1992), Wilson (1993), Sarkar e Wilson (1993) utilizaram
os fotossensibilizadores Azul de Metileno (MB) e Azul de Toluidina (TBO), associado
ao laser He-Ne (632,8 nm) com tempos de 30” e 80” e com diferentes concentrações de
TBO e MB. Foram testadas as bactérias presentes em amostras de placa subgengival da
cavidade oral, formada pelas espécies S. sanguis, P. gingivalis, F. nucleatum e A.
actinomycetemcomitans em placas de Petri. Os autores concluíram que os corantes
derivados de fenotiazinas (MB – TBO) foram eficientes em eliminar as quatro espécies
bacterianas. Os autores sugerem que a técnica de terapia fotodinâmica pode ser efetiva
em eliminar bactérias patogênicas encontradas na inflamação gengival.
29
FIGURA 3.2 - Estrutura molecular do Azul de metileno e do Azul de toluidina.
FONTE - WAINWRIGHT, 1998.
QUADRO 3.2
Principais fotossensibilizadores utilizados em PDT com suas respectivas bandas de
absorção.
Fotossensibilizador Banda de Absorção
Derivados da Hematoporfirina (HpD) 620 – 650 nm
Ftalocianinas 660 – 700 nm
Fenotiazinas (TBO e MB) 620 – 700 nm
Fitoterápicos (Azuleno) 550 – 700 nm
Verde Malaquita 400 – 700 nm
Soukos et al. (1996), estudaram “in vitro”, a ação fotodinâmica da
irradiação da luz vermelha de um laser associada ao corante Azul de Toluidina (TBO)
sobre queratinócitos, fibroblastos e o Streptococcus sanguis. Os autores concluíram que
o uso de baixa concentração do corante TBO e da baixa densidade de energia do laser,
provocava somente a morte da bactéria não afetando as células orais humanas.
Wilson et al. (1995), Zampieri et al. (2003) e Matevski et al. (2003), em
estudos “in vitro” e “in vivo” obtiveram êxito na redução das bactérias, Streptococcus
mitis, Streptococcus sanguis, Porphyromonas gingivalis e Actinomices utilizando um
laser de He-Ne (� = 632,8 nm), dois de diodo semi-condutor AsGaAl (
� = 680 nm e
670 nm) e uma fonte de luz convencional com lâmpada de xenônio associada a filtros
na região do vermelho e com cinco diferentes densidades de energia: 1,31 J/cm2,
2,2 J/cm2, 3 J/cm2, 6 J/cm2 e 9 J/cm2. Foram coradas pelo Azul de Toluidina na
concentração de 75 µg/mL e 50 µg/mL. O percentual maior de morte bacteriana foi
30
obtido utilizando-se o laser de He-Ne para a espécie S. sanguis e Porphyromonas
gingivalis alcançado com a fluência de 3 J/cm2, enquanto que para a espécie S. mitis e
Actinomices foi obtida com a fluência de 6 J/cm2. Isso provavelmente ocorreu devido ao
comprimento de onda do laser de He-Ne ser coincidente com o pico máximo de
absorção de energia do corante TBO, que é em torno de 632 nm.
Rovaldi et al. (2000) e Lauro et al. (2002) conjugaram a porfirina com uma
substância fotoreativa catiônica, chamada pentalisina (polilisina), o que facilitou a
aglutinação desse conjugado-fotossensibilizador à membrana celular bacteriana gram-
negativa, aumentando o espectro de atividade contra essas bactérias, mantendo um forte
efeito destruidor. Nesse estudo “in vitro”, foram testados o fotossensibilizador puro
(porfirina), e o conjugado pentalysina-porfirina. Enquanto a porfirina pura apresentou
alguma atividade apenas contra bactérias gram-positivas e também contra células
eucarióticas, a molécula conjugada pentalysina-porfirina destruiu consistentemente
tanto as gram-negativas e gram-positivas, demonstando pouca atividade contra células
eucarióticas. Apenas 20% do corante aglutinado foram preservados na superfície das
células sobreviventes, demonstrando aparente falta de indução de resistência à PDT.
Walsh (1997) e Walsh (2003) relataram que a PDT mostrou-se eficaz na
destruição de bactérias em placas bacterianas orais, que são resistentes à ação de agentes
antimicrobianos, portanto, tendo sua ação eficaz em bactérias gram-positivas e gram-
negativas, além de ser ativa contra fungos e vírus. Os autores afirmam também que a
ação fotodinâmica é uma terapia mais segura e sem efeitos colaterais, devido às espécies
de oxigênio reativas residuais serem rapidamente conduzidas pela catalase enzimática,
presente em todos os tecidos e na circulação periférica. Concluíram também que a PDT
não provoca aumento de temperatura mensurável.
3.1.5 Efeitos fungicidas da terapia fotodinâmica
Jackson et al. (1999) estudaram três parâmetros: a concentração do
fotossensibilizador, a dose de luz do laser e o tempo de pré-irradiação. O
fotossensibilizador utilizado foi o Azul de Toluidina (TBO), testado nas concentrações
de 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL. O laser utilizado foi o de Hélio-Neonio (He-
Ne) com potência de 35 mW e área do spot com 2 mm2 . Ambas as formas de Candida
albicans (pseudohifas e leveduras) foram expostas a 4,2; 10,5; 21 e 42 J/cm2. Antes da
irradiação, ambos os morfotipos foram incubados durante vários períodos de tempo
31
(TPI). O resultado com relação à concentração do TBO, a mais eficaz para a forma de
levedura foi a 25 µg/mL, e para a forma de hifa foi a de 12,5 µg/mL. O tempo de pré-
irradiação considerado ótimo para as leveduras foi de 5 minutos, enquanto que a morte
das hifas não foi afetada pelo TPI. Com relação à fluência, verificou-se que com o
aumento da dosagem de energia da luz aumentava-se o índice de morte dos dois
morfotipos, sendo a fluência de 42 J/cm2 a mais eficaz. Os resultados deste estudo
indicam que ambas as formas de Candida albicans são susceptíveis a terapia
fotodinâmica, sugerindo que essa abordagem poderá ser útil na eliminação dos fungos
das lesões “in vivo”.
Friedberg et al (2001) utilizaram o fotosensibilizador Green 2W sobre
isolados de Aspergillus fumigatus, fungo presente no ar, mas que pode produzir graves
infecções em pacientes imunossuprimidos. Observaram uma atividade fungicida ao
utilizarem 5 W de luz com λ = 630 nm, fluência variável (5 – 440 J/ cm2), por um
intervalo de 12 h. O Green 2W demonstrou ser um agente bem tolerado, após aplicação
intravenosa.
Zeina et al (2001) observaram que isolados de Candida albicans foram
susceptíveis à PDT “in vitro” utilizando o azul de metileno, apesar de apresentarem
uma boa resistência ao tratamento. Foi utilizada uma fonte de luz policromática
produzida por uma lâmpada de 250 W com filtros para obter λ = 400 – 700nm e
intensidade de 1,6 – 4,2 W/ cm2.
Teichert et al (2002) realizaram um estudo “in vivo” num modelo animal,
que foram induzidos à imunodeficiência e inoculados com o fungo da Candida albicans
com o intuito de reproduzirem a candidíase oral relacionada à Aids em seres humanos.
Foi utilizado como fotossensibilizador o Azul de Metileno (MB) nas seguintes
concentrações: 250, 275, 300, 350, 400, 450 e 500 µg/ml. O tempo de pré-irradiação
(TPI) foi de 10 minutos. A fonte de ativação empregada foi um laser diodo com 664 nm
de comprimento de onda, potência de 400 mW e dose de 275 J/cm2 por um difusor
cilíndrico com 1 cm de diâmetro, durante 687,5s. Após a PDT, as amostras dos animais
foram coletadas para determinar as unidades formadoras de colônias (UFC) e os animais
sacrificados para avaliação histopatológica. Os resultados indicaram um efeito letal
dependente da concentração do fotossensibilizador, que foi maior à medida que
aumentava a concentração do corante MB, sendo o índice 100% letal a 450 e 500 µg/ml.
Os autores concluíram que a PDT é uma alternativa em potencial de tratamento à terapia
32
com drogas anti-fúngicas tradicionais (fluconazol, cetoconazol) que estão tornando-se
ineficazes devido a crescente resistência adquirida pelos fungos.
Bliss et al (2004) avaliaram “in vitro” a ação fotodinâmica sobre três
espécies de Candida: C. albicans, C. krusei e C. glabrata. Os autores utilizaram um
derivado da hematoporfirina, o Photofrin® como fotossensibilizador nas seguintes
concentrações: 0,1; 0,3; 1; 3 e 10 µg/ml, ativada por uma luz azul com 450 nm de
comprimento de onda, 15 mW de potência distribuindo 9 J/cm2 de densidade de energia.
O percentual de morte foi crescente de acordo com o aumento da concentração do
fotossensibilizador observado nas espécies C. albicans e C. krusei respectivamente. Já a
espécie C. glabrata foi resistente à PDT, provavelmente, devido à baixa adesão do
Photofrin® à sua parede celular. Os resultados indicam que a PDT poderá ser uma
abordagem alternativa para as atuais modalidades terapêuticas anti-candida no
estabelecimento da resistência aos anti-fúngicos convencionais.
Smijs et al (2004) utilizaram uma luz policromática produzida por uma
lâmpada de 500W - 230 V e filtros, capazes de absorver o infravermelho e obter a parte
vermelha do espectro, para testar amostras de porfirinas (Sylsens B, DPmme e QDD)
em isolados de Trichophyton rubrum “in vitro”. Utilizaram um tempo de irradiação por
uma hora a 30 W/ cm2. A PDT foi realizada em hifas e microconídios de T. rubrum. A
importância dos experimentos utilizando microconídias é devido à sua maior resistência
ao tratamento que as hifas. Utilizando luz vermelha com o fotosensibilizador Sylsens B
foi obtida completa inibição do crescimento a partir de uma concentração de 10 µM.
Para o DPmme houve inibição do crescimento a partir de uma concentração de 40 µM.
O QDD apresentou-se fungistático em todas as concentrações testadas (0 – 50 µM).
Calvazara-Pinton et al (2004a) utilizaram o ácido aminolevulinico-5 (ALA)
como agente fotossensibilizador em creme nas lesões cutâneas de nove pacientes com
evidência clinica e microbiológica de micose interdigital dos pés. Após quatro horas
(TPI), as lesões foram irradiadas com 75 J/cm² de luz vermelha aplicada com um
aparato Penta-PTL (Teclas, Sorengo, Suíça), consistindo de uma lâmpada de halógeno
(Osram 250 V-Osram, Munique, Alemanha) equipada com um filtro vermelho (Filtro
R61, Teclas) e um dispositivo de fibra óptica. As lesões interdigitais de um dos pés foi
tratada com PDT e a do outro pé serviram de controle (tratadas apenas com luz ou
apenas com ALA). Quatro semanas após o último tratamento, os pacientes passaram
por um acompanhamento clínico e um exame laboratorial. A recuperação clínica e
33
microbiológica foi observada em seis dos nove pacientes. Porém, após 4 semanas, foi
observada recorrência em quatro pacientes. No total, a tolerância foi sempre boa.
Durante e logo após as exposições, foram observados eritema localizado e edema. Sete
pacientes experimentaram um desconforto brando (ameno) e dois pacientes
apresentaram dor que foi controlada com um fracionamento do tempo de irradiação e a
redução dela. Foi observada descamação após 3-5 dias. Nas condições empregadas
neste estudo, a ALA-PDT apresentou bons efeitos terapêuticos sobre micoses
interdigitais dos pés. Porém, as recorrências foram rápidas. Em condições ambientais
“in vivo”, exemplo, a temperatura, umidade e pH da pele interdigital, podem induzir
uma fraca captação celular de ALA e a uma biossíntese deficiente da fotosensibilização
da protoporfirina IX.
Szpringer et al (2004) enfoca a terapia fotodinâmica (PDT) como uma nova
modalidade de tratamento para uma ampla variedade de malignidades e displasias pré-
malignas, assim como para algumas indicações não cancerosas. A reação terapêutica a
PDT é obtida por meio da ativação de fotossensibilizador não-tóxico localizado dentro
do tecido neoplásico, usando uma luz visível focalizada numa banda de absorção
apropriada da molécula fotossensibilizadora. Isto produz radical livre citotóxico como
oxigêno singleto, que resulta numa foto-oxidação local, danos celulares e destruição das
células do tumor. A administração sistêmica de fotossensibilizadores foi usada com
exposição da luz endoscópica para tratar uma variedade de malignidades internas. A
distribuição de uma droga tópica é usada no tratamento de doenças cutâneas. A
distribuição seletiva da fotossensibilização no tecido alvo é o fundamento do processo
da PDT. A fotossensibilização específica do tecido e a conservação do tecido normal
resultam numa boa cicatrização e em bons resultados estéticos. A PDT pode ser usada
para o tratamento de várias lesões cutâneas como: micoses fúngicas, eritroplasia de
Queyrat, Síndrome de Gorin, queratose actínica, tumores gastrointestinais dentre outras,
assim como indicações não oncológicas como: pele, líquen plano, psoríase, vitiligo e
verrugas.
Segundo Calvazara-Pinton P. G et al (2004b) até os dias de hoje existem
poucas publicações com relação à aplicação da PDT em fungos, provavelmente devido
ao fato das pesquisas serem direcionadas principalmente para a desinfecção sanguínea e
esses patógenos apresentarem um baixo risco de transmissão por transfusão. No entanto,
os achados preliminares demonstraram que os fungos podem ser efetivamente
sensibilizados “in vitro” administrando-se fotossensibilizadores que pertencem
34
principalmente a quatro grupos químicos: corantes à base de fenotiazinas, porfirinas e
ftalocianinas, assim como ácido aminolevulínico que, enquanto não é um
fotossensibilizador propriamente dito, é efetivamente metabolizado dentro da
protoporfirina IX. Além da eficácia, a PDT demonstrou outros benefícios. Primeiro, os
sensibilizadores usados são altamente seletivos demonstrando que alguns fungos podem
ser mortos em combinações de droga e dosagens de luz muito menores do que as
necessárias para o efeito semelhante sobre os queratinócitos. Esses fotossensibilizadores
investigados não apresentaram atividade mutagênica e o risco da seleção de cepas
fúngicas resistentes à droga nunca foi relatado. Deve-se, portanto, incentivar estudos de
PDT em micoses cutâneas por apresentarem a vantagem de ser altamente seletiva
evitando a ocorrência de cepas resistentes à droga.
Kamp et al (2005) avaliaram “in vitro” se o fungo Trichophyton rubrum
causador da onicomicose pode ser efetivamente inativado pela terapia fotodinâmica, já
que pela terapia convencional com antimicóticos tradicionais o fungo é altamente
persistente. Os autores inocularam o T. Rubrum em meio de cultura líquido na presença
de 0 (controle); 0,1; 1; 5; 10 e 100 µM de ALA (ácido-5 aminolevulínico). Somente
entre o 10º e o 14º dia após o início do estudo, o Trichophyton rubrum conseguiu
metabolizar o ALA para a protoporfirina IX (PpIX), devido ao crescimento lento deste
fungo “in vitro”. Após esse tempo (TPI), as placas foram irradiadas por uma lâmpada
halógena não filtrada emitindo luz branca com uma intensidade de 36,8 W/cm2, através
de fibra óptica distante 5 cm. As placas com T. rubrum foram expostas durante 60
minutos correspondendo a 128 J/cm2 de densidade de energia. A PDT reduziu tanto o
número quanto o diâmetro das colônias em aproximadamente 50%, comparada ao
controle correspondente, sendo verificado nas concentrações de 1 a 10 µM ficando o
melhor resultado para a concentração de 10 µM. O ALA na concentração mais forte
(100 µM) levou a um índice de crescimento significativamente reduzido e a ausência da
formação de PpIX devido às condições altamente ácidas. Os autores concluíram que
apesar do índice de inativação do fungo não ter alcançado 100%, a PDT com ALA deve
ser uma abordagem promissora na redução da colonização de T. rubrum em
onicomicoses.
Jori G (2006) salienta a importância do uso dos fotossensibilizadores que
absorvem luz como agentes antimicrobinanos fotodinâmicos. Devem possuir
características favoráveis dentre elas: (a) o amplo espectro de ação antimicrobiana em
35
bactérias gram-negativas, fungos, e parasitas devendo seguir um protocolo foto-
terapêutico e condições favoráveis de irradiação; (b) as porfirinas, ftalocianinas e as
fenotiazinas não devem exibir toxicidade no escuro em dosagens ativadas
fotoquimicamente; (c) a morte da célula microbiana é uma conseqüência da foto-
destruição da membrana através de um processo típico de múltiplos alvos que minimiza
o risco tanto do início dos processos mutagênicos quanto da seleção de células
fotorresistentes; (d) esses fotossensibilizadores são considerados eficientes enquanto
não forem observados patógenos microbianos fotorresistentes; (e) é possível a
combinação da terapia fotodinâmica com a antibiótica. Eles concluem que a terapia
fotodinâmica (PDT) está se tornando, com o passar dos tempos, um tratamento
alternativo eficiente para as infecções microbianas, um problema atualmente agravado
pela crescente difusão das cepas microbianas resistentes a antibióticos.
Souza et al. (2006) avaliaram os efeitos da irradiação laser em baixa
intensidade com comprimento de onda de 685nm, 28 J/cm2 associado com
fotossensibilizadores na viabilidade de diferentes espécies de Candida. Suspensões de
Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida krusei e Candida tropicalis, contendo
106 células viáveis por mililitros foram obtidas. De cada espécie, 10 amostras da
suspensão de célula foram irradiadas na presença de Azul de Metileno (0,1 mg/mL), 10
amostras foram somente tratadas com azul de Metileno, 10 amostras foram irradiadas
com laser na ausência do Azul de Metileno. De cada amostra, uma série de diluições
com 10-2 e 10-3 foram obtidas e concentrações de 0,1 mL de cada diluição foram
plaqueadas em duplicata em agar Sabouraud dextrose. A irradiação com laser na
presença de Azul de Metileno reduziu o número de UFC/mL em 88.6% para C.
albicans, 84.8% para C. dubliniensis, 91.6% para C. krusei e 82.3% para C. tropicalis.
Pode-se concluir que a fotoativação do Azul de Metileno pelo laser com 685nm
apresentou um efeito fungicida nas espécies de Candida estudadas.
36
3.2 Dermatófitos e dermatofitose
Dermatófitos são um grupo de fungos relacionados capazes de invadirem
tecidos queratinizados (pele, pêlos e unhas) de homens e animais, para produzir
infecção (dermatofitose). Esta infecção é geralmente cutânea e restrita ao extrato córneo
não vascularizado, devido à inabilidade desses fungos de penetrar em tecidos mais
profundos e órgãos de um hospedeiro imunocompetente (WEITZMAN E
SUMMERBELL, 1995).
Apresentam uma predileção ecológica, no que diz respeito à sua adaptação
ao meio ambiente. Assim, os dermatófitos podem ser divididos em três grupos, em
relação ao seu habitat: geofílicos, zoofílicos e antropofílicos. Os geofílicos apresentam
como característica primária a habilidade de manter sua viabilidade em solos
geralmente ricos em resíduos de queratina e podem causar infecções em humanos e
animais. Os zoofílicos são adaptados às condições de parasitismo em espécies de
animais (caninos, felinos, bovinos, eqüinos, suínos, aves, dentre outros) mas,
ocasionalmente causam infecções humanas. Muitas infecções por dermatófitos
zoofílicos são adquiridas indiretamente de materiais ceratinosos provenientes de
animais em decomposição no solo. Os antropofílicos estão primariamente associados a
infecções humanas e raramente infectam animais. Os grupos dos dermatófitos zoofílicos
e geofílicos, em geral, tendem a provocar, no homem, a formação de lesões com
características inflamatórias mais pronunciadas do que aquelas causadas por
dermatófitos antropofílicos (WEITZMAN E SUMMERBELL, 1995; SIDRIM E
MOREIRA, 1999).
Os agentes etiológicos das dermatofitoses estão classificados em três
gêneros: Trichophyton spp. Microsporum spp. e Epidermophyton spp (WEITZMAN E
SUMMERBELL, 1995).
Quanto à distribuição geográfica, os dermatófitos são ubiquitários, não
havendo área ou grupo de pessoas que se encontrem isoladas destes fungos (COSTA et
al., 2002).
37
3.2.1 Trichophyton rubrum
De crescimento intermediário, as colônias do T. rubrum, em ágar Sabouraud,
mostram características de maturação de 12 a 16 dias após a semeadura primária. Estas
colônias caracterizam-se por uma textura algodonosa com pregas radias, formando uma
pequena saliência no centro. Essa morfologia, que com freqüência se confunde com as
colônias de T. tonsurans apresenta ainda tonalidade branca que com o passar do tempo,
pode ficar avermelhada. Esta coloração pode ser observada também no bordo da colônia
(SIDRIM E MOREIRA, 1999, LACAZ et al., 2002).
A microscopia óptica revela uma grande quantidade de microconídios
clavados com 2-3 µm por 3-5µm de tamanho, dispostos ao longo das hifas ou em
cachos. Os macroconídios, quando presentes, podem apresentar - se como clavas
alongadas, quase com um aspecto cilíndrico e com duas a nove septações (LACAZ et
al., 2002).
Na maioria dos laboratórios de rotina, a simples evidência de algumas
estruturas não é diagnóstico definitivo para micologistas mais experientes, necessitando-
se nessas situações lançar mão de testes complementares para o correto diagnóstico
(SIDRIM E MOREIRA, 1999).
3.2.2 Manifestações clínicas
Tradicionalmente, as dermatofitoses ou tineas, são denominadas de acordo
com sua localização anatômica. Exemplo: Tinea pedis corresponde à dermatofitose dos
pés (WEITZMAN E SUMMERBELL, 1995). Já a corrente francesa classifica como
tineas as lesões dermatofíticas que acometem o couro cabeludo e/ ou região de barba e
bigode, como epidermofítides as lesões dermatofíticas encontradas na região de pele
glabra, como onicomicoses dermatofíticas as lesões encontradas nas unhas e
dermatofitoses subcutâneas e profundas às lesões que acometem o espaço celular
subcutâneo ou outros órgãos profundos, sendo geralmente relacionadas a pacientes
imunocomprometidos. Os aspectos clínicos das lesões dermatofíticas são bastante
variados e resultam da combinação de destruição da queratina associada a uma resposta
inflamatória, mais ou menos intensa, na dependência do binômio microrganismo/
hospedeiro. A variação clínica da lesão, portanto, está correlacionada a três fatores: a
38
espécie de dermatófito envolvida no processo infeccioso, o sítio anatômico acometido e
o status imunológico do hospedeiro (SIDRIM E MOREIRA, 1999).
3.2.3 Onicomicose
Esta infecção é a doença ungueal mais comumente encontrada, sendo
responsável por mais de 50% dos acometimentos das unhas.
A etiologia destas micoses apresenta uma grande variabilidade nas diferentes
regiões do Brasil. As constantes correntes migratórias que ocorrem no país têm sido
citadas como uma das principais causas para a alteração desta etiologia (COSTA et al.,
2002).
A distribuição de diferentes patógenos não é uniforme e depende de vários
fatores como o clima, a geografia e a migração. Porém, estudos revelam que as espécies
Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes estão envolvidas em mais de 90% das
onicomicoses (FAERGEMANN E BARAN, 2003).
Santos et al. (1997) observaram em um estudo, em janeiro/ 1995 a
novembro/ 1996, a predominância de T. rubrum sobre outros dermatófitos, e sugeriram
que este fungo é provavelmente o principal agente etiológico das dermatofitoses em
Florianópolis (SC).
Lopes et al. (1999) avaliaram em um estudo epidemiológico de 1988 a 1997,
na região central do Rio Grande do Sul, a presença de fungos em 2.664 casos de
micoses superficiais. Os autores isolaram com maior freqüência T. rubrum, que foi o
fungo predominante nas lesões das unhas.
Costa et al. (2002) observaram em seu estudo epidemiológico, de janeiro a
dezembro de 1999, na região de Goiânia (GO.) que de 1.955 amostras coletadas de
pacientes com suspeita de infecção fúngica, o T. rubrum foi responsável pelo maior
número de lesões nas unhas dos pés, perfazendo um total de 60,2% (47/78 casos) e
fazendo-se a correlação do agente etiológico com a faixa etária, verificou-se que T.
rubrum e T. mentagrophytes prevaleceram na fase adulta.
3.2.4 Tratamento das onicomicoses
O tratamento das onicomicoses dermatofíticas representa uma das principais
dificuldades terapêuticas encontradas na prática clínica, em razão de algumas
39
particularidades: as unhas são estruturas não-vascularizadas o que explica a pequena
penetração dos medicamentos utilizados por via sistêmica. Portanto, as dermatofitoses
das unhas dos pés são mais rebeldes ao tratamento que as das mãos (SIDRIM E
MOREIRA, 1999).
O tratamento das onicomicoses ocorre a partir de três medidas conjuntas:1-
Tratamento sistêmico, que pode durar de 4 a 8 meses; 2- Excisão química com uréia a
40% e 3- Tratamento tópico.
Em muitos casos a excisão cirúrgica total da unha é uma medida severa,
mas, necessária (SIDRIM E MOREIRA, 1999).
3.2.5 Tratamento tópico
Esta terapia produz poucos efeitos adversos sistêmicos e não faz interação
com outras drogas sistêmicas utilizadas pelo paciente, porém, em monoterapia está
indicada apenas para onicomicoses superficiais com comprometimento inferior a 50%
da lâmina ungueal e para pacientes cuja medicação sistêmica está contra-indicada.
Amorolfina – antifúngico de amplo espectro da classe das morfolinas,
veiculado em verniz a 5% devendo ser aplicado de uma a duas vezes por semana
durante seis meses para as onicomicoses das mãos e nove a doze meses para as
onicomicoses dos pés.
Ciclopiroxolamina – antifúngico hidroxipiridímico de amplo espectro
veiculado em verniz a 8%. Deve ser aplicado a cada 48 h durante o primeiro mês,
diminuir as aplicações para duas vezes por semana no segundo mês, e posteriormente,
uma vez por semana, devendo ser aplicado por um período mínimo de 6 meses
( LECHA , 2002; BALLESTÉ et al., 2003).
3.2.6 Tratamento Sistêmico
Os antifúngicos sistêmicos classicamente empregados no tratamento das
onicomicoses são a griseofulvina e o cetoconazol. Por volta de 1990, foram substituídos
por itraconazol, fluconazol e terbinafina que apresentam melhores resultados em menor
tempo e maior segurança para o paciente (BALLESTÉ et al., 2003).
Itraconazol – sua administração é realizada exclusivamente por via oral
sendo lipofílico e queratinofílico, o que confere grande afinidade por tecidos
40
superficiais como: pele, mucosas e unhas alcançando nestes tecidos níveis superiores
aos plasmáticos. Os níveis cutâneos alcançados permanecem em concentrações altas
após sua administração (pele e pêlos – 3 a 4 semanas e unhas – 4 a 6 meses). Esta
farmacocinética permite seu uso em terapias de pulsos mensais, mantendo sua eficácia e
diminuindo os efeitos colaterais. Seus efeitos adversos são leves e interage
farmacologicamente com antihistamínicos, fenitoína, anticoagulantes cumarínicos,
hipoglicemiantes orais, digoxina, quinina e ciclosporina (BALLESTÉ et al., 2003).
Fluconazol – apresenta-se mais hidrofílico que os azólicos anteriores e se
une menos à queratina que o itraconazol. Pode ser administrado tanto por via oral como
parenteral, alcançando bons níveis em pele e unhas. Penetra rapidamente nos tecidos e é
eliminado lentamente, o que permite uma administração com menor freqüência e doses
mais alta. Possue interações medicamentosas como o aumento o tempo de vida das
sulfonilureas causando hipoglicemias quando administrado com varfarina, aumentando
o tempo de protrombina (BALLESTÉ et al., 2003).
Terbinafina – antifúngico da classe das alilaminas cujas concentrações nas
unhas são similares às do plasma, chegando por difusão através da derme. Permanece
depositada nas unhas por meses após o tratamento, sendo esta característica considerada
uma proteção contra recidivas. Os efeitos colaterais são geralmente gastrointestinais e
excepcionalmente cutâneos apresentando escassas interações medicamentosas. O
tratamento utilizando a associação de antifúngicos orais e tópicos têm demonstrado
melhores resultados que o emprego das drogas em monoterapia (BALLESTÉ et al.,
2003).
3.2.7 Falhas terapêuticas
O tratamento das onicomicoses apresenta geralmente taxas de fracasso terapêutico
próximas de 25% em experimentos e 10% a mais na prática clínica. Santos e Hamdann
(2007) analisaram trinta e dois isolados clínicos de Trichophyton rubrum resistentes a
fluconazol [concentrações inibitórias mínimas (MIC) >/= 64 mug ml (-1)], que foram
selecionados para testar a atividade antifúngica de cetoconazol, itraconazol,
griseofulvina e terbinafina. Foram seguidas as diretrizes do National Committee for
Clinical Laboratory Standards para testar fungos filamentosos. Foram incluidas para
controle de qualidade, cepas de Candida parapsilosis (ATCC 22019), Candida krusei
(ATCC 6258); T. rubrum (ATCC 40051) e Trichophyton mentagrophytes (ATCC
41
40004). As placas com microdiluições foram incubadas a 28º C e lidas visualmente após
7 dias de incubação. As variações de MIC para os quatro antifúngicos foram: 0.0625-2
mug ml(-1) para cetoconazol; 0.25-2.0 mug ml(-1) para griseofulvina; </=0.031-1.0
mug ml (-1) para itraconazol e </=0.031 mug ml(-1) para terbinafina (para todos os
isolados testados). In vitro, a Terbinafina foi a drogra mais potente contra T. rubrum,
seguida por itraconazol, cetoconazol e griseofulvina. Ainda são necessários muitos
estudos parra correlacionar os MICs dessas drogas aos resultados clínicos para
desenvolver a interpretação dos limites de resistência do T. rubrum e outros
dermatófitos.
As razões das falhas terapêuticas podem ser (LLAMBRICH E LECHA,
2002):
• Baixo índice de cooperação no tratamento por parte do paciente,
aproximadamente 52%;
• Farmacocinética inadequada dos fármacos para alcançar a massa ungueal
afetada. Os medicamentos orais chegam com dificuldade às bordas laterais das unhas e
a maior parte das drogas tópicas dificilmente difunde até as camadas mais profundas da
lâmina ungueal. Para o tratamento tópico, é importante estabelecer um veículo
adequado para a droga antifúngica e sua capacidade de difusão na lâmina ungueal.
Quanto aos antifúngicos orais, estudos têm demonstrado a penetração e depósito na
lâmina ungueal para o itraconazol, fluconazol e terbianfina, porém, existem diferenças
entre estes fármacos que obrigam a realização de regimes de administração diferentes
(intermitente ou contínuo) e uma variação quanto à duração do tratamento.
Em condições “in vitro”, várias amostras fúngicas, inclusive leveduras,
puderam ser inativadas através de irradiação com comprimentos de onda de luz visível,
na presença de soluções fotosensibilizantes tais como, compostos porfirínicos e
ftalocianinas. Na verdade, a PDT pode representar uma abordagem de tratamento útil
para essas infecções “in vivo” uma vez que os tratamentos convencionais com drogas
são prolongados e dispendiosos sendo o surgimento de isolados resistentes a
medicamentos mais freqüentes hoje em dia (CALVAZARA-PINTON, P.G et al 2004a).
4. MATERIAIS E MÉTODOS
No presente trabalho, foi observado a redução do número de UFC/mL∗ de
Trichophyton rubrum após o tratamento de suspensões do inóculo com TBO a 25
µg/mL, laser e LED. O cálculo da área e do volume de suspensão do inóculo submetido
à PDT e irradiados pelo laser e pelo LED nos tubos de ensaio foram também realizados.
Os controles dos experimentos foram realizados através da exposição do fungo ao TBO,
do fungo ao laser e LED na ausência do corante e do fungo sem exposição à luz e
corante.
Para os experimentos uma amostra de referência (ATCC-40051) de
T.rubrum foi utilizada e incubada a 28ºC durante 7 dias. A mistura resultante de
conídios e fragmentos de hifas foi transferida para um tubo de ensaio esterilizado e em
seguida homogeneizada em vórtex. A densidade da suspensão foi analisada em
espectrofotômetro levando a uma concentração de 1-5 x 106 células/mL. Essa suspensão
obtida foi transferida para seis tubos formando-se seis grupos:
Grupo 1- Inóculo sem nenhum tratamento (controle);
Grupo 2- Suspensão do inóculo submetida à irradiação com LED por 3
minutos;
Grupo 3- Suspensão do inóculo submetida à irradiação com laser por 3
minutos;
Grupo 4- 100 µL de TBO acrescentados a 900 µL da suspensão do inóculo
sem a presença de luz;
Grupo 5- 100 µL de TBO acrescentados a 900 µL da suspensão do inóculo
submetida à irradiação com LED por 3 minutos. PDT-LED;
Grupo 6- 100 µL de TBO acrescentados a 900 µL da suspensão do inóculo
submetida à irradiação com Laser por 3 minutos. PDT-laser.
Para os grupos 4, 5 e 6 foi estabelecido o tempo de pré-irradiação (TPI) de 5
minutos para absorção do corante pelas células fúngicas.
Posteriormente, cada grupo sofreu diluição do inóculo para 10 UFC/mL e
repiques em placas de Petri contendo ágar Sabouraud. As placas foram incubadas e após
∗ UFC/ml – Unidades formadoras de colônia por mL – número de unidades celulares com capacidade de reprodução por ml.
43
o período de incubação foram realizadas as contagens das colônias por método visual
(FIG.4.1). Para garantir a reprodutibilidade dos dados, este experimento foi realizado
em triplicata.
FIGURA 4.1- Diagrama da metodologia.
44
4.1 Detalhamento dos materiais
1 - Máquina fotográfica Canon EOS - Digital Rebel Resolução 3072 x 2048
pixels - Tipo de sensor CMOS - Sistema de cor RGB - Distância da máquina aos tubos
de ensaio= 70 cm - Lente 105 mm - Câmara com fator de multiplicação focal= 1.6 -
Abertura 18 -Total 6.3 mega pixels - Tempo de exposição 1/4 segundos - Fabricante:
Canon Inc. - Japão
2 - Estativa (fixação do laser e LED para irradiação)
3 –Equipamentos:
(a)- Laser de baixa intensidade modelo QTUMOOB (Quantum) da Ecco
Fibras (Brasil), com diodo de arsênio, gálio e alumínio (AsGaAl), emitindo no
vermelho com �= 660nm, emissão contínua, 100mW de potência média de saída, tempo
de 3 minutos, intensidade de 2 W/cm², diâmetro do spot de 8mm e dose de 360J/cm2
(FIG. 6.2).
FIGURA 4.2.- Equipamento laser de baixa intensidade
(b) Diodo de Emissão de Luz (LED): modelo Fisioled da MMoptics (São
Paulo-Brasil) com emissão de luz a �= 630nm (±10nm), 100mW de potência média de
saída, tempo de 3 minutos, intensidade de 0,5 W/cm², dose de 90J/cm2 , diâmetro do
45
spot de 15,6 mm, em meio ativo de índio, gálio, alumínio e fósforo (InGaAlP) (FIG.
6.3).
FIGURA 4.3- Equipamento LED
As potências dos aparelhos de laser e LED foram aferidas pela unidade de leitura
modelo NOVA- Analogic Performance Report, Laser Power/Energy Monitor.
Fabricante: OPHIR OPTRONICS- Science Based Industry Park, Jerusalém- Israel (FIG.
6.4).
FIGURA 4.4- Unidade de Leitura de Potência Luminosa
46
4-Espectrofotômetro: modelo - MICRONAL B542 (Micronal S/A-São
Paulo-Brasil), com resolução de leitura de 1nm, na região espectral de 325 a 1000nm,
com faixa de medição fotométrica de 0∼200%T, e -0,3∼3ABS. Exatidão fotométrica de
± 0,018ABS com filtros padrões. Lâmpada Halógena de 6V x 10W com freqüência de
60Hz e voltagem de 117 a 227V (FIG. 6.5)
FIGURA 4.5- Espectrofotômetro - MICRONAL B542.
5- Vórtex - Biomatic-Porto Alegre- Brasil (FIG. 6.6)
FIGURA 4.6- Vórtex
47
6- Fotossensibilizador: O fotossensibilizador azul de toluidina foi submetido
à espectroscopia e suas bandas de absorção determinadas entre os comprimentos de
onda de 400 a 900nm. Foi utilizado o azul de toluidina (TBO) (Sigma, St. Louis, MO,
USA) (FIG. 6.7) na concentração final de 25µg/mL diluído em água.
FIGURA 4.7– Fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO)
7-Microorganismo: Neste estudo foi utilizada uma amostra de referência
(ATCC-40051) de T. rubrum obtida da coleção de culturas da Universidade da Geórgia
(Atlanta, GA, EUA), gentilmente cedida pelo Laboratório de Micologia do
Departamento de Microbiologia, ICB-UFMG (FIG. 6.8).
FIGURA 4.8- Amostra de referência (ATCC-40051) de T. rubrum
48
8- Meios de cultura
Ágar Saboraud Dextrose:
Glicose.............................................................................40,00 g
Peptona............................................................................10,00 g
Extrato de Levedura......................................................... 5,0 g
Cloranfenicol.................................................................... 0,10 g
Ágar..................................................................................15,00 g
Água destilada.................................................................. 1000,00 ml
O meio de cultura Sabouraud foi obtido comercialmente (GIBCO) e seu
preparo procedeu de acordo com as orientações do fabricante, com o acréscimo de 3 g/L
de ágar.
Ágar Batata dextrose
Infusão à base de batatas..........................................200,00 g/L
Dextrose ....................................................................20 g/L
Ágar ...........................................................................15 g/L
Para hidratar, foi suspenso 39 g em 1 L de H2O destilada e aquecido até
ferver para dissolver completamente. Em seguida foi distribuído em tubos e esterilizado
a 121oC por 15 minutos. Foi esfriado até 45 - 50º C e os tubos inclinados para
solidificação do meio de cultura.
Solução Salina
Cloreto de sódio..............................................................0,85 g
Água destilada.................................................................100,00 mL
9- Isolamento e manutenção da amostra. A amostra foi semeada e preservada
em ágar Sabouraud em câmara fria a 4º C. Durante os experimentos, foram realizados
repiques em ágar batata, para produção de esporos.
49
4.2 Detalhamento dos métodos
As espectroscopias do fotossensibilizador Azul de Toluidina na concentração
de 25 µg/mL (GRA. 4.1 e 4.3), de Trichophyton rubrum (GRA. 4.2 e 4.3) e do TBO
associado ao fungo (GRA. 4.3) foram realizadas com o objetivo de determinar se suas
bandas de absorção foram ressonantes com o comprimento de onda das fontes de luz
utilizadas.
GRÁFICO 4.1-Espectroscopia de absorção óptica do fotossensibilizador, Azul de
Toluidina 25µg/mL que foi obtida utilizando-se uma cubeta de
quartzo com caminho óptico de 1mm. No eixo Y encontra-se a
absorção do corante em unidades arbitrárias (u.a) e no eixo X a
porção visível do espectro eletromagnético em nanômetros
50
GRÁFICO 4.2- Espectroscopia de absorção óptica da suspensão de Trichophyton
rubrum em salina. No eixo Y encontra-se a absorção da
suspensão do fungo em unidades arbitrárias (u.a) e no eixo X a
porção visível do espectro eletromagnético em nanômetros.
4.2.1 Preparo do inóculo
Para o preparo do inóculo foi utilizado o método espectrofotométrico
proposto pelo M38-A (CLSI, 2002). A amostra de T. rubrum foi cultivada em tubos de
ensaio contendo ágar batata dextrose e incubada a 28º C durante 7 dias. A massa de
micélio obtida foi coberta com aproximadamente 5,0 mL de salina 0,85% esterilizada e
assepticamente com alça de platina foi feita uma raspagem da superfície do ágar. A
mistura resultante de conídios e fragmentos de hifas foi transferida para um tubo de
ensaio esterilizado e então deixada em repouso por 5 minutos para que as partículas
mais pesadas se sedimentassem (FIG. 4.9). O sobrenadante foi coletado fazendo-se em
seguida uma homogeneização em vórtex por 15 segundos. A densidade da suspensão foi
analisada em espectrofotômetro e ajustada para uma densidade ótica de 0,15 a 0,17 (65
a 70% de transmitância a 530 nm), o que proporciona uma concentração de 1-5 x 106
células/mL. Essa suspensão obtida foi transferida para seis tubos formando-se seis
grupos.
51
GRÁFICO 4.3- Espectroscopias do fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO)
na concentração de 25µg/ mL, de Trichophyton rubrum e de
Trichophyton rubrum associado ao Azul de Toluidina (TBO)
25µg/ mL. No eixo Y encontra-se a absorção do corante em
unidades arbitrárias (u.a) e no eixo X a porção visível do espectro
eletromagnético em nanômetros.
FIGURA 4.9- Transferência dos conídios e fragmentos de hifas para o
tubo de ensaio
52
4.2.2 Procedimento de teste
Foram utilizados tubos de 10 x 10 mm contendo um volume final de
suspensão de 1000 µL e separados em seis grupos. No primeiro grupo, correspondente
ao controle de crescimento do fungo, a suspensão de 1000 µL do inóculo não foi
submetida a qualquer tratamento. No segundo grupo, a suspensão do inóculo foi
submetida à irradiação com LED por 3 minutos. No terceiro grupo, a suspensão do
inóculo foi submetida à irradiação com laser por 3 minutos. No quarto grupo, 100 µL de
TBO foram acrescentados a 900 µL da suspensão do inóculo (diluição do
fotossensibilizador de 1:10), sem a presença de luz. No quinto grupo, 100 µL de TBO
foram acrescentados a 900 µL do inóculo e realizada irradiação com LED por 3
minutos. No sexto grupo, 100 µL de fotossensibilizador foram acrescentados a 900 µL
do inóculo e realizada irradiação com laser por 3 minutos, QUA. 4.1.
QUADRO 4.1
Grupos do experimento
Grupos Procedimento Símbolo
correspondente
Grupo 1 1000 µL de suspensão do inóculo sem nenhum
tratamento (controle) G1
Grupo 2 1000 µL de suspensão do inóculo submetida à
irradiação com LED por 3 minutos G2
Grupo 3 1000 µL de suspensão do inóculo submetida à
irradiação com laser por 3 minutos G3
Grupo 4 100 µL de TBO acrescentados a 900 µL da
suspensão do inóculo sem a presença de luz G4
Grupo 5
100 µL de TBO acrescentados a 900 µL da
suspensão do inóculo submetida à irradiação com
LED por 3 minutos. PDT-LED
G5
Grupo 6
100 µL de TBO acrescentados a 900 µL da
suspensão do inóculo submetida à irradiação com
laser por 3 minutos. PDT-laser
G6
53
Para os grupos 4, 5 e 6, foi estabelecido o tempo de pré-irradiação (TPI) de 5
minutos para absorção do corante pelas células fúngicas (FIG. 4.10).
FIGURA 4.10- Microscopia óptica da absorção do corante pelas
células fúngicas após a TPI
A irradiação pelas fontes de luz foi realizada do fundo para a abertura do
tubo (FIG.4.11).
FIGURA 4.11- Irradiação pelas fontes de luz do fundo para a abertura
do tubo.
54
Posteriormente, cada grupo sofreu uma diluição do inóculo para 10 UFC/mL
repiques em placas de Petri contendo ágar Sabouraud (FIG.4.12). As placas foram
incubadas a 28ºC por 4 dias, de acordo com as necessidades da amostra, e após o
período de incubação foram realizadas as contagens das colônias por método visual.
Este experimento foi realizado em triplicata.
FIGURA 4.12- Colônias de T. rubrum repicadas em placas de Petri.
4.2.3 Cálculo da área e volume de suspensão irradiada
Após as irradiações dos tubos referentes aos grupos 5 e 6 (PDT), cálculos da
área e volume de suspensão do inóculo absorvidos pelas luzes (laser/LED) foram
realizadas observando-se os dados dimensionais do tubo de ensaio (FIG. 4.13):
Diâmetro externo = 12,28 ± 0,02 mm
Espessura do tubo = 0,82 ± 0,02 mm
Diâmetro interno = 10,64 ± 0,02 mm
Comprimento cilíndrico = 69,40 ± 0,02 mm
Comprimento total = 73,80 ± 0,02 mm
Volume da amostra irradiada = 1000,0 ±3,8µL
Volume da calota esférica = 182,0 ± 0,4 µL
Volume da parte cilíndrica = 818,0 ± 3,1µ L
55
FIGURA 4.13- Dados dimensionais do tubo de ensaio
A FIG. 4.14 ilustra a transmissão da luz LED e laser através da água
indicando a quase ausência de absorção (baseline).
Na FIG. 4.15a é observada a suspensão do fungo associado ao TBO sendo
irradiada pelo laser (grupo 6) e na FIG. 4.15b a suspensão do fungo associado ao TBO
sendo irradiada pelo LED (grupo 5).
FIGURA 4.14- Baseline da água sendo irradiada pelo LED e laser
56
(a)
(b)
FIGURA 4.15- (a) Amostra do grupo 6 sendo irradiada pelo laser e (b) Amostra do
grupo 5 sendo irradiada pelo LED.
Para facilitar a compreensão da realização dos cálculos da área e do volume
irradiados pelo laser e LED (Anexo c), duas etapas foram realizadas. Na etapa 1 foram
calculadas as áreas fotografadas em que houve maior absorção da luz pelo corante
(região mais avermelhada) dos tubos de ensaio dos grupos 5 e 6. Na etapa 2, foram
calculados os volumes de suspensão do inóculo irradiados dos tubos de ensaio dos
grupos 5 e 6.
ETAPA 1
Foi utilizado o software laser.exe para a obtenção das medidas em pixels da
região dos tubos irradiados pelo laser e LED. O primeiro passo do software foi
converter a escala de cores da imagem para tons de cinza (FIG 4.16a e 4.16b).
57
(a)
(b)
FIGURA 4.16- (a) Conversão da imagem para tons de cinza do grupo 6 e (b)
Conversão da imagem para tons de cinza do grupo 5
Em seguida foi realizada a conversão das imagens em tons de cinza para em
cores de acordo com a intensidade de luz (aumentando do azul para o vermelho),
obtendo-se assim, as áreas irradiadas (FIG. 4.17 e 4.18).
FIGURA 4.17- Imagem processada onde a área irradiada pelo laser foi
de 15,1 mm² sendo que a escala de cores representa a
intensidade de luz em cada região irradiada
58
FIGURA 4.18- Imagem processada onde a área irradiada pelo LED foi
de 52,2 mm² sendo que a escala de cores representa a
intensidade de luz em cada região irradiada
Foi obtida a relação entre as áreas LED/laser obtendo-se um valor de 3,45.
ETAPA 2
Foi realizado o cálculo e a comparação dos volumes irradiados pelo laser e
LED (FIG. 4.19 a e FIG. 4.19b, respectivamente).
(a)
(b)
FIGURA 4.19- (a) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo Laser
e (b) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo
LED.
O cálculo dos volumes foi realizado focando a borda inferior do tubo onde
há maior concentração de suspensão do inóculo e de energia do laser e LED absorvidos
59
pelo corante. As imagens das áreas correspondentes aos grupos 5 e 6 foram exportadas
para o programa Solidworks 2006 para gerar o sólido de revolução correspondente a
estas imagens (FIG. 4.20 e 4.21). O volume de suspensão irradiado pelo LED foi de
413,70 mm³ (grupo 5) e pelo laser foi de 64,85 mm³ (grupo 6). Foi obtida a relação
entre os volumes do LED/laser 413,70 mm³ / 64,85 = 6,4. O volume irradiado pelo LED
é 6,4 vezes maior que o volume irradiado pelo laser.
FIGURA 4.20- Sólido gerado pela revolução da curva para o laser.
FIGURA 4.21- Sólido gerado pela revolução da curva para o LED
4.2.4 Análise Estatística
Este estudo teve como objetivo identificar o número de colônias viáveis do
fungo frente à exposição de luz laser e LED, considerando-se 6 grupos:
1 Controle
2 ILED (Inóculo-LED)
3 ILASER (Inóculo-laser)
60
4 ITBO (Inóculo-TBO)
5 PDT-LED
6 PDT-LASER
O resultado avaliado foi o percentual de colônias viáveis de cada um dos
grupos em relação ao comportamento do grupo controle de crescimento do fungo. As
medidas descritivas são apresentadas em porcentagens e tabelas com a média, mínimo
(mín), máximo (máx) e desvio padrão (d.p.). O valor de n refere-se ao tamanho da
amostra avaliada. Com o objetivo de avaliar a influência conjunta dos fatores de
interesse (experimentos e grupos), foi utilizada uma análise de variância baseado num
modelo de dois fatores. Esta análise tem como objetivo avaliar a influência de cada um
dos fatores, bem como a interação existente entre eles. Quando uma interação mostra-se
significativa, pode-se concluir que o comportamento de um fator difere quando se
considera os níveis do outro fator. Como a análise indicou uma influência significativa
de um dos fatores foi utilizado o teste de comparações múltiplas de médias LSD (Least
Significant Difference) para avaliar tal efeito. Todos os resultados foram considerados
significativos para uma probabilidade de significância inferior a 5% (p < 0,05),
apresentando 95% de confiança nas conclusões apresentadas (MONTGOMERY, D.C
1991).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados mostraram diferenças significativas entre os grupos quanto a
porcentagem de colônias presentes (p < 0,05) (FIG 5.1, 5.2 e 5.3).
(a)
(b)
FIGURA 5.1- Placas de Petri com as colônias de Trichophyton rubrun dos grupos 1 (a)
e 4 (b).
(a)
(b)
FIGURA 5.2- Placas de Petri dos grupos 2 (a) e 3 (b).
62
(a)
(b)
FIGURA 5.3- Placas de Petri dos grupos 5 (a) e 6 (b).
Os resultados mostraram também que não existem diferenças significativas
entre os experimentos, não existindo interação entre os dois fatores: grupo e
experimento (TAB. 5.1 e TAB. 5.2). O comportamento entre os grupos foi similar em
todos os experimentos.
Na TAB 5.1 os grupos apresentados representam as seguintes suspensões:
• Grupo 2: suspensão do inóculo irradiada pelo LED (ILED)
• Grupo 3: suspensão do inóculo irradiada pelo laser (Ilaser)
• Grupo 4: suspensão do inóculo associada ao TBO sem irradiação
• Grupo 5: suspensão do inoculo associada ao TBO e irradiada pelo LED (PDT-
LED)
• Grupo 6: suspensão do inóculo associada ao TBO e irradiada pelo laser (PDT-
laser)
Os grupos 2, 3 e 4 não apresentaram diferenças estatísticas quando
comparados entre si. O percentual de colônias viáveis quando foi utilizado PDT-LED
(G-5) e PDT-laser (G-6) foi significativamente inferior ao resultado observado nos
demais grupos nos três experimentos (GRA. 5.1).
63
TABELA 5.1
Avaliação descritiva do percentual de colônias viáveis em relação ao controle
considerando-se cada experimento
Medidas descritivas Experimento Grupos
Mínimo Máximo Média D.p. CV
2-ILED 33,3 83,3 63,9 26,8 41,9
3-ILASER 50,0 141,7 83,3 50,7 60,8
4-ITBO 100,0 150,0 119,4 26,8 22,4
5-PDTLED 17,4 30,4 24,6 6,6 27,0
1
6-PDTLASER 30,4 47,8 39,1 8,7 22,2
2-ILED 98,1 98,1 98,1 0,0 0,0
3-ILASER 86,5 115,4 100,0 14,5 14,5
4-ITBO 51,9 92,3 75,0 20,8 27,7
5-PDTLED 17,3 40,4 26,9 12,0 44,6
2
6-PDTLASER 11,5 69,2 40,4 28,8 71,4
2-ILED 15,3 137,3 71,2 61,6 86,6
3-ILASER 55,9 188,1 139,0 72,3 52,0
4-ITBO 96,6 117,0 108,5 10,6 9,8
5-PDTLED 40,7 45,8 44,1 2,9 6,7
3
6-PDTLASER 25,4 76,3 52,5 25,6 48,7
Depois de realizadas as comparações entre os grupos dos três experimentos
observou-se que o grupo 4 não apresentou redução na porcentagem de crescimento das
colônias indicando que o corante sozinho não leva a morte fúngica. Os grupos 2 e 3
apresentaram pouca redução na porcentagem de crescimento das colônias mostrando
que a ação do LED e do laser, sem a presença do corante, não foi capaz de inibir o
crescimento do fungo de maneira satisfatória.
64
77,2
107,4
101,0
31,9
44,0
0
20
40
60
80
100
120
ILED ILASER ITBO PDTLED PDTLASER
% n
úm
ero
de c
olô
nia
s e
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ela
çã
o a
o c
on
tro
le
GRÁFICO 5.1- Avaliação descritiva da média percentual de crescimento em relação ao
controle considerando-se os 3 experimentos
TABELA 5.2
Resultado da análise de variância da influência dos fatores de interesse na avaliação do
percentual de colônias viáveis em relação ao controle
Fonte de variação F p
Experimento 1,24 0,3027
Grupo 9,81 0,0001
Experimento x Grupo 1,02 0,4409
Nota: F � estatística do teste da análise de variância
Diferenças significativas foram observadas entre os grupos 5 e 6 em
comparação com os demais grupos testados. Ficou comprovado que a associação do
LED ao corante (G5) e do laser ao corante (G6) leva a uma diminuição percentual
elevada do crescimento das colônias se comparada aos demais grupos. O grupo 5
apresentou a menor porcentagem de crescimento das colônias dentre os demais grupos.
Uma explicação para essa diferença é encontrada após a análise da relação entre os
volumes de suspensão irradiados pelo laser (64,85 mm³) e LED (413,70 mm³), onde foi
observado que o volume irradiado pelo LED é 6,4 vezes maior que o volume irradiado
pelo laser.
65
Após a análise das áreas irradiadas pelo laser e LED ficou demonstrado que a
área irradiada pelo LED é 3,5 vezes maior que a área irradiada pelo laser. O LED,
diferentemente do laser, não emite radiação com coerência espacial, portanto, a radiação
emitida pelo LED pode ser caracterizada como monocromática, não coerente, e
espontânea. Apresenta ainda, área de spot e divergência da luz maior que o laser,
abrangendo um volume maior do tubo de ensaio levando consequentemente, a uma
maior redução do número de colônias. Além do mais, pela análise das espectroscopias,
seu pico de absorção está mais próximo ao pico de absorção do TBO, mostrando-se
mais ressonante que o laser. A porcentagem média nos três experimentos de colônias
viáveis de Trichophyton rubrum foi de 31,9% para o LED e 44,0% para o laser.
Uma PDT bem sucedida sempre envolve a otimização de um grande número
de parâmetros. Obviamente, a seleção de um fotossensibilizador eficaz é essencial para
o sucesso da técnica. Assim, como ele não deve ser tóxico para os seres humanos, o
fotossensibilizador necessita absorver o feixe do laser em comprimentos de onda
compatíveis e precisa produzir uma eficiência de alta excitação (CHAN E LAI, 2003).
Uma forte relação entre absorção do corante e comprimento de onda deve ser
observada na utilização da terapia fotodinâmica, pois a ação fotototóxica só ocorre
quando a banda de absorção do fotossensibilizador é ressonante com a radiação emitida
(SZPRINGER et al., 2004; RIBEIRO E GROTH, 2005; JORI G, 2006). A constante
busca por novos corantes só tende a ampliar ainda mais a eficiência e a aplicabilidade
clinica da PDT. Corantes menos tóxicos, com banda de absorção ressonante ao
comprimento de onda emitido pelos lasers/LEDs aumentariam a eficiência desta terapia,
permitindo o combate a infecções cada vez mais profundas e sem a necessidade de
múltiplas sessões de aplicação (GARCEZ et al., 2006).
O TBO na concentração de 25 µg/ml foi o escolhido por não apresentar
toxicidade no escuro para o microorganismo testado, já que ele sozinho, em contato
com a suspensão fúngica não produziu redução do número de unidades formadoras de
colônias (UFC/ mL). Por preencher outros requisitos essenciais como: penetração na
célula fúngica, banda de absorção ressonante com o comprimento de onda das luzes
produzidas pelos equipamentos utilizados, em baixa concentração apresentar efeito
antimicrobiano quando irradiado por uma fonte de luz e por ser bem referenciado na
literatura.
A PDT direcionada a micologia está na fase inicial. Os poucos trabalhos
existentes na literatura em fungos fazem relatos da PDT em espécies de Candida .spp.,
66
Aspergillus fumigatus e Trichophyton rubrum. Diferentes fontes de luzes foram
utilizadas pelos autores tais como, lâmpadas de mercúrio, lâmpadas comuns (luz
branca) acopladas à filtros coloridos para obtenção do comprimento de onda específico,
lâmpadas halógenas equipadas com filtros vermelhos e brancos, laser Hélio-neon (HeNe
- 632,8 nm), Arseneto de Gálio-alumínio (GaAl - 630-685 nm), Arseneto de gálio
(GaAs – 904 nm), e LEDs (BHATTI et al 2000; FRIEDBERG et al 2001; ZEINA et al
2001; BLISS et al 2004; KARU (1999); CALVAZARA-PINTON, P.G et al 2004a).
Com o advento dos lasers de baixa intensidade, estes passaram a ser utilizados
devido às suas próprias características como: monocromaticidade, coerência e
colimação, facilitando a associação com um corante de banda de absorção ressonante ao
comprimento de onda emitido pelo laser (ACKROYD et al., 2001; RIBEIRO E
ZEZELL, 2004).
Exposição a lasers e LEDs tem sido utilizada em várias terapias. A irradiação
mais efetiva está no espectro do vermelho. A possibilidade de utilizar o espectro
vermelho em PDT para dermatofitoses, deve ser considerada, pois este espectro de luz
não é absorvido pela hemoglobina e pode penetrar mais profundamente nos tecidos
vivos. Esta propriedade é particularmente importante no tratamento de infecções em
unhas, bastante persistentes à terapia convencional (SMIJS et al, 2004).
A literatura analisada apresenta parâmetros de aplicação das fontes de luz
extremamente variados, dificultando a comparação entre os estudos. Há necessidade de
se padronizar o comprimento de onda, a densidade de energia, a potência, a
concentração do fotossensibilizador e o modo de aplicação da fonte de luz para que se
obtenha uma melhor efetividade antimicrobiana (ZANIN et al., 2003).
Em se tratando de onicomicoses, o tratamento convencional utilizando drogas
antifúngicas orais, muitas vezes não é capaz de remover o fungo das unhas antes que
estas sejam renovadas. Isto sugere uma possível explicação para o difícil tratamento de
tal condição patológica. Apesar da escassez de trabalhos presentes na literatura, a PDT
direcionada ao tratamento de dermatofitoses, com o desenvolvimento de
fotosensibilizadores específicos para Trichophyton rubrum, representa uma opção de
tratamento contra uma infecção fúngica em constante expansão.
A revisão da literatura nos mostra que a PDT antimicrobiana em estudos “in
vitro” e “in vivo” vem alcançando resultados positivos por sucessivos autores em
maiores ou menores proporções. Em fungos poucos trabalhos foram realizados sendo
que na maioria utilizou-se de amostras não patogênicas.
67
Uma grande vantagem da terapia fotodinâmica é sua ação local e restrita no
tratamento, assegurando uma manutenção na ecologia entérica que normalmente é
muito afetada pelos antibióticos. Apesar de ainda não existirem estudos conclusivos
sobre resistência bacteriana à ação da terapia fotodinâmica, só o fato dela não agir
indiscriminadamente no organismo do hospedeiro já constitui um benefício significativo
nos complexos sistemas bacterianos e fúngicos (CHAN E LAI 2003).
Os resultados obtidos neste estudo demonstram que a terapia fotodinâmica
constitui uma alternativa de inibir “in vitro” o crescimento de T. rubrum. É necessária a
realização de outros estudos, principalmente “in vivo”, para melhor adaptação da
técnica às condições orgânicas dos pacientes. Esta técnica, aliada a um diagnóstico
correto, pode possibilitar um aumento da cura desta doença, sem os efeitos colaterais
produzidos pelas drogas antifúngicas e com maiores taxas de adesão ao tratamento pelos
pacientes.
6. CONCLUSÕES
O corante TBO na concentração de 25µg/mL apresenta-se promissor para sua
utilização em testes de inativação fotodinâmica devido principalmente:
– ser ressonante com os comprimentos de onda do laser e LED.
– ser bem absorvido pelo T. rubrum.
O Trichophyton rubrum corado pelo TBO apresentou redução de 68,1% e 56%
do número de colônias viáveis utilizando-se respectivamente LED e laser.
O LED por apresentar uma divergência maior que a luz laser, abrangeu um volume
maior de suspensão do inóculo mostrando-se mais eficiente na sua ação fototóxica.
ABSTRACT
Trichophyton rubrum is the most common micro-organism infecting fungal
dermatological lesions. The aim of the present work is to study the effect of low
intensity light source (in the red band of the electromagnetic spectrum) on Trichophyton
rubrum sample associated to a photosensitizer (Toluidine Blue). Two light sources were
employed in the tests: diode laser (660 nm, power output of 100 mW, exposition time of
3 minutes) and LED (630 nm, power output of 100 mW, exposition time of 3 minutes).
Toluidine Blue (TBO) was chosen due to its optical (maximal absorption in the
wavelengths of the laser and the LED sources) and biochemical (well absorbed by fungi
cells) properties. Trichophyton rubrum were suspended in a standard solution and six
test groups were prepared with a final suspension volume of 1000 L. Group 1: growth
control without treatment; Group 2: inoculum suspension exposed to LED irradiation;
Group 3: inoculum suspension exposed to laser irradiation; Group 4: 100 L of TBO
added to 900 L of inoculum; Group 5: 100 L of TBO added to 900 L of inoculum and
exposed to LED irradiation; Group 6: 100 L of TBO added to 900 L of inoculum and
exposed to laser irradiation. The irradiation time was 3 minutes for Groups 2, 3, 4, 5 and
6. For Groups 5 and 6 it was observed 5 minutes of pre-irradiation time (PIT) after the
introduction of TBO and before irradiation. The results exhibited significant differences
between Groups 5 and 6 with 68.1% and 56% reduction, respectively, regarding the
number of viable colonies. LED source generates a non-coherent light beam, presenting
bigger divergence if compared to the laser beam. As consequence, it encompassed a
bigger volume of inoculum suspension, bringing, by this way, its phototoxic action to a
bigger number of cells.
Keywords: Trichophyton rubrum, PDT, LASER, LED
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p.274-278, Feb. 2001.
ANEXO A
A.1 LASER
A presença do laser já é notada em várias atividades como em telefonia,
“shows”, hospitais, dentre outras. Em numerosas fábricas e indústrias de diversas
atividades, os lasers executam uma série de tarefas com mais rapidez e precisão que os
métodos tradicionais. Sua importância cresce à medida que novos avanços são obtidos
no domínio da tecnologia de sua construção, de novos meios laser, regimes de operação,
tratamento do feixe e do conhecimento da interação da radiação com a matéria. Suas
características peculiares possibilitam a execução de tarefas que seriam muito difíceis,
ou até impossíveis, através de outros métodos. Um feixe laser pode atingir pontos
pequenos, com intensidade extremamente alta em lugares de difícil acesso ou de
ambiente agressivo. Logo após o desenvolvimento do primeiro laser de rubi, em 1960, a
utilização do laser em medicina, foi dirigida por uma curiosidade científica natural com
a esperança de que estes equipamentos pudessem se tornar uma nova opção de
tratamento. Os primeiros sistemas lasers eram caros e raramente dedicados para uma
tarefa médica particular.
Atualmente, os lasers perderam seu mistério e devem demonstrar sua
eficiência em comparação a técnicas convencionais ou novos instrumentos
competitivos. Já se tornaram instrumentos bem estabelecidos na oftalmologia,
ortopedia, dermatologia, odontologia, em cirurgia geral entre tantas outras aplicações. A
palavra laser é formada pelas iniciais de Light Amplication by Stimulated Emission of
Radiation que significa Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação. A
emissão estimulada foi descrita pela primeira vez em 1917, por Einstein, de forma
teórica. Em 1951, Charles Townes, da Universidade de Colúmbia (EUA) desenvolveu o
MASER (Microwave Amplification by Stimulated Emission of Radiation). Em 1958,
Townes e Schawlow, do Bell Telephone Laboratories, EUA, propuseram estender os
princípios do MASER para as regiões do infravermelho e visível do espectro
eletromagnético. Idéias similares ao MASER tiveram lugar em Moscou (Basov e
Prokhorov) em 1954. Entretanto, apenas em 1960 foi demonstrada a primeira ação laser
pulsada, baseada em um cristal de rubi, por Maiman, da Hughes Aircraft, EUA. Logo
A.2
após, em 1961, foi demonstrada a emissão laser contínua em He-Ne por Javan, da Bell
Labs, EUA. Gordon desenvolveu em 1964 os lasers de argônio, criptônio e xenônio e
Patel introduziu o laser de CO2 em 1965. Goldman, em 1964, assim como Stern and
Sognnaes, realizaram pesquisas com o laser de rubi para preparos cavitários de dentes.
No início dos anos 80, os lasers já eram usados em campos como a dermatologia,
otorrinolaringologia, ginecologia, cirurgia geral, neurocirurgia e urologia. O
desenvolvimento de materiais levou à obtenção de fibras ópticas e a miniaturização
levou ao desenvolvimento de fibroscópios que permitiram, a partir do início da década
de 80, um crescimento nas aplicações de laser em todas as áreas de saúde (AMORIM et
al., 2006).
A.2 Laser de baixa intensidade
Os comprimentos de onda associados aos efeitos obtidos com estes lasers
situam-se dentro do espectro eletromagnético, na porção do visível ao infravermelho
próximo. Os comprimentos de onda mais utilizados nas áreas biomédicas estão entre
600nm e 980nm apresentando boa penetração na pele e nas mucosas. Os lasers mais
utilizados em aplicações clínicas são os de He-Ne e semicondutor. Os de He-Ne são
lasers compostos por uma mistura de gases nobres com predomínio do Hélio (90%) e de
neônio (10%), operando no visível. Os lasers de diodo (semicondutores) consistem de
um sanduíche p-n, sendo a radiação emitida pelas laterais entre as camadas do
sanduíche. Se as suas faces laterais forem polidas precisamente perpendiculares ao
sanduíche elas podem servir de espelhos da cavidade ressonante. Neste caso não há a
necessidade de espelhos ou de nenhuma outra estrutura em todo o laser exceto a fonte
de alimentação, tornando-se um sistema extremamente compacto. A junção p-n de
arseneto de gálio é essencialmente um diodo emissor de luz, o qual é levado à emissão
laser pela passagem de uma corrente excessivamente alta (AMORIM et al., 2006).
Na utilização dos lasers é de fundamental importância conhecer duas
medidas físicas: intensidade e densidade de energia.
Intensidade (I) é a quantidade de potência, P, em Watts (W), sobre a área, A, a
ser depositada, em cm², dada pela EQ.A.1:
A
PI = A.1
A.3
Como existe uma variedade enorme de lasers utilizados nas áreas
biomédicas, com potências diferentes, esta relação entre as grandezas pode modificar o
efeito desejado sobre os tecidos biológicos.
Densidade de energia ou fluência é a potência, P, em Watt, multiplicada
pelo tempo, T, em segundos, sobre a área, A, em cm², dada pela seguinte expressão
matemática (AMORIM et al., 2006), EQ. A.2:
A
TPF
∗= A.2
Os lasers que emitem em baixas intensidades não causam efeitos térmicos,
mas sim, fotoquímicos, fotofísicos e/ ou fotobiológicos, quando interagem com células
ou tecidos. Os tecidos biológicos possuem cromóforos (substâncias que absorvem luz)
como a melanina, hemoglobina, hemomoléculas, porfirinas, citocromo-oxidase dentre
outras, que ao absorverem a luz laser, produzem estimulação ou inibição de atividades
enzimáticas e reações fotoquímicas. Estas ações determinam uma cascata de reações
metabólicas com efeitos terapêuticos (CRUANES, 1984).
De acordo com (KARU, 1999) as mitocôndrias são os primeiros cromóforos
absorvedores pelos lasers de luz visível e as membranas celulares pelos lasers de
emissão infravermelha. Esta seria uma proposta para explicar as diferentes ações desses
lasers de baixa intensidade sobre os tecidos. Esses lasers são amplamente utilizados na
medicina e odontologia, principalmente, devido às ações de aliviar a dor, reduzir edema,
atuar em parestesias, paralisias faciais e mais recentemente em PDT.
ANEXO B
B.1 LED “Light Emitting Diodes”
LEDs são diodos especiais que emitem luz quando conectados a um circuito.
Apresentam dois fios (positivo e negativo) ligados a um bulbo. A parte negativa pode
ser indicada pelo lado mais plano e através do fio menor. O LED opera em voltagens
relativamente baixas, um a quatro volts, e correntes entre 10 e 40 milliamperes (FIG.
B.1).
FIGURA B.1- Modelo de formação de um LED
A parte mais importante de um LED é o “chip” semicondutor localizado no
centro do bulbo. O semicondutor possui duas regiões “p”e “n” separadas por uma
junção”p-n”. A região “p” é dominada por cargas positivas e a “n” por cargas negativas.
A junção age como uma barreira através da qual os elétrons circulam. Apenas quando
uma voltagem suficiente é aplicada ao “chip” semicondutor, a corrente elétrica pode
circular e os elétrons atravessam a junção para a região “p”. Cada elétron que recombina
com uma carga positiva forma uma energia elétrica potencial que é convertida em
energia eletromagnética. Um quantum dessa energia é emitido na forma de um fóton de
luz com a freqüência característica do material semicondutor (geralmente uma
combinação de elementos químicos: gálio, arsênio e fósforo). Somente fótons com
freqüências pequenas podem ser emitidos através de qualquer material. Os LEDs que
emitem diferentes cores são feitos de diferentes materiais semi-condutores e requerem
B.2
diferentes energias para produção de luz. Além de policromática, a luz produzida por
um LED é despolarizada, ao contrário daquela produzida por um laser. A energia
elétrica é proporcional à voltagem necessária para causar a circulação dos elétrons na
junção “p-n”. A energia (E) da luz emitida através do LED está relacionada à carga
elétrica (q) de um elétron e à voltagem (V) requerida, através da equação: E = qV, onde
q (constante de Coulomb) = - 1,6 x 10-19. A freqüência da luz está inversamente
relacionada ao seu comprimento de onda, em um único meio. Através de um
espectrômetro, a luz emitida pelo LED pode ser examinada obtendo-se o pico do
comprimento de onda (BOZKURT, A. E ONARAL, B, 2004).
O LED apresenta várias vantagens como: alta durabilidade, fácil adaptação
aos circuitos elétricos, pode ser facilmente transportado para qualquer lugar, altamente
eficiente, não há produção elevada de calor já que a maior porcentagem da energia
elétrica utilizada é direcionada para a produção de luz.
Nos 20 anos de história das comunicações ópticas, assistimos a uma notável
evolução na tecnologia das fibras, dos lasers, dos LEDs e fotodetectores que permitem
aos sistemas ópticos, não apenas substituir os elétricos com vantagens operacionais, mas
também realizar funções que eram antes impossíveis. Existem várias fontes ópticas que
podem ser utilizadas em odontologia como os lasers e os LEDs (Light Emitting Diode).
A diferença básica entre eles é que nos LEDs predomina o mecanismo da emissão
espontânea de radiação e nos lasers a emissão estimulada de luz. Dessa distinção básica
decorrem as diferenças estruturais entre os dois dispositivos que nem sempre são
acentuadas, decorrendo diferenças funcionais que dão aos lasers um desempenho
geralmente superior, porém, bem mais complexo. Os lasers precisam de grande
quantidade de energia para sua geração, enquanto os LEDs necessitam de pouca energia
para a geração de luz. Entre os dispositivos utilizados como fonte de luz em
odontologia, os LEDs são os mais simples e baratos. Apresentam um largo espectro de
luz sendo mais utilizados em sistemas de transmissão de menor capacidade. Embora
seja uma fonte de luz divergente e não coerente semelhante a luz halógena, apresentam
um espectro de emissão bem mais estreito tendo um aproveitamento bem melhor que a
luz halógena (STHAL et al., 2000).
ANEXO C
C.1 Cálculo da área e do volume das imagens dos grupos 5 e 6
Para realizar o cálculo da área e do volume das imagens dos grupos 5 e 6 foi
feito o seguinte procedimento:
1- As fotos foram tiradas posicionando-se o LED e o laser exatamente
abaixo do fundo do tubo de ensaio.
2- Foi utilizada uma máquina fotográfica Canon EOS - Digital Rebel
Resolução 3072 x 2048 pixels - Tipo de sensor CMOS - Sistema de cor RGB -
Distância da máquina aos tubos de ensaio foi de 70 cm - Lente 105 mm - Câmara com
fator de multiplicação focal= 1.6 - Abertura 18 -Total 6.3 mega pixels - Tempo de
exposição 1/4 segundos - Fabricante: Canon Inc. - Japão
3- Cada foto foi tratada, a fim de criar uma falsa escala de cores, que
relaciona as propriedades da região do tubo de ensaio fotografada com as cores dessa
escala.
4- A partir da imagem tratada, foi usado um software LASER.EXE (cuja
rotina foi desenvolvida no Labbio) que, a partir da informação que relaciona número de
pixels com o tamanho real da imagem, retornou como resultado a área da imagem (FIG
C.1a e FIG C.1b).
(a)
(b)
FIGURA C.1- (a) Área/laser=15,1mm² e (b) Área/ LED= 52,2mm²
É possível ver nas imagens acima que o fundo das mesmas é reto e
horizontal, ao contrário do restante do contorno, o que nos causa a impressão que a
C.2
imagem foi “cortada”. No entanto, ao observar as fotos originais e compará-las com as
imagens obtidas, é fácil perceber que o fundo da imagem foi apenas aproximado para a
reta, perdendo uma quantidade muito pequena de imagem. Além disso, os softwares
disponíveis para o tratamento das fotos não oferecem uma resolução que seja capaz de
identificar o contorno inferior das imagens. Outro fator de relevância que sustenta a
hipótese de aproximar esse contorno a uma linha reta é estarmos trabalhando com um
método de aproximação para o cálculo da área e posteriormente do volume. Ou seja, o
erro devido ao contorno é desprezível quando comparado aos erros dos softwares e do
operador para o cálculo da área e volume. É sabido também que, os valores numéricos
obtidos da área e do volume, serão usados como razões, a fim de se obter números
adimensionais. Dessa maneira, todas as imagens possuem o mesmo erro, o que nos dá
mais segurança para compará-las. Por fim, é importante ressaltar, que todos os
argumentos, apesar de serem qualitativos e não quantitativos, nos dão segurança
suficiente para fazer tal aproximação. A FIG. C.2 identifica as fotos originais com um
quadrante em destaque mostrando onde a imagem foi cortada.
(a)
(b)
FIGURA C.2- Imagens originais do tubo sendo irradiado pelo laser à esquerda (a) e
pelo LED à direita (b). Em destaque a área de corte
5- Especificamente, para o cálculo do volume, foi utilizado um software
comercial de engenharia SolidWorks 2006. Para cada uma das imagens, pegou-se um
número de pontos da borda e traçou-se uma linha reta horizontal até a outra borda. Cada
uma dessas retas foi revolucionada a partir de um eixo central, perpendicular às
mesmas. Novamente utilizando as informações que relacionam o número de pixels com
o tamanho real da imagem, foi possível, através desse software, criar um número de
planos circulares próximos um do outro que estariam contidos no sólido que se deseja
C.3
calcular o volume. Com as ferramentas disponíveis no SolidWorks, esses planos foram
aproximados e um sólido foi criado. O volume desse sólido (que numericamente é dado
pelo próprio software SolidWorks) é a aproximação do volume que se desejava calcular.
A FIG. C.3 esquematiza como foi feito esse procedimento descrito.
FIGURA C.3- Esquema do procedimento para a criação do sólido que forneceu
o valor numérico do volume