Ação de Esquistossomicidas na Fase Inicial da ... cássia... · E claro sem esquecer Clarice,...

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Pesquisas René Rachou

Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

Ação de Esquistossomicidas na Fase Inicial da Esquistossomose Experimental

por

Andréa Cássia Simões Vimieiro

Belo Horizonte

Junho/ 2009

DISSERTAÇÃO MDIP-CPqRR A.C.S. VIMIEIRO 2009

II





Ação de Esquistossomicidas na Fase Inicial da Esquistossomose Experimental

por


Dissertação apresentada com vistas à

obtenção do Título de Mestre em Ciências

na área de concentração Doenças

Infecciosas e Parasitárias.

Orientação: Dr. Paulo Marcos Zech Coelho

Belo Horizonte

Junho/ 2009

III

Catalogação-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975 V764a 2009

Vimieiro, Andréa Cássia Simões Ação de esquistossomicidas na fase inicial da esquistossomose experimental/ Andréa Cássia Simões Vimieiro. – Belo Horizonte, 2009. XIX,100: il, 210 x 297 mm. Bibliografia: f. 106 – 119 Dissertação (Mestrado) – Dissertação para obtenção do título de Mestre em Ciências pelo Programa de Pós - Graduação do em Ciências da Saúde. Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias. 1. Esquistossomose mansoni/quimioterapia. 2. Schistosoma mansoni/Efeitos de drogas 3. Schistosoma mansoni/crescimento & desenvolvimento 4. Esquistossomicidas/Uso terapêutico.I Título II. Coelho, Paulo Marcos Zech (Orientação).

CDD – 22. ed. – 616.963

IV





Ação de Esquistossomicidas na fase inicial da esquistossomose experimental

por


Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:

Prof. Dr.Paulo Marcos Zech Coelho (Presidente)

Prof. Dra. Andréa Teixeira Carvalho

Prof. Dr. Edward Felix da Silva

Suplente: Prof. Dr: Stefan Michael Geiger

Dissertação defendida e aprovada em: 30/06/2009

V

Dedico este trabalho a meu filho Pedro Augusto

que me ensinou o amor mais puro e incondicional.

Meu querido esposo Douglas pelo

companheirismo, amor e compreensão.

Aos meus amados pais Álvaro Vimieiro e Sandra

e irmãos Juninho, Alysson e Amanda

pelo carinho e incentivo em todos os momentos.

VI

Agradecimentos

Agradeço a Deus por colocar sempre no meu caminho grandes oportunidades, me

ajudar vencer obstáculos que parecem intransponíveis, mas que se tornam apenas

mais um degrau na escalada da vida.

Ao meu orientador Dr. Paulo Marcos Zech Coelho pela acolhida carinhosa em seu

laboratório. Obrigada pela amizade, confiança, atenção, alem de todos os

ensinamentos que me enriquecem como profissional e como pessoa.

À Neusa Araújo que mais do que uma grande colaboradora neste trabalho, foi

amiga, conselheira, mestra. Muito obrigada pela dedicação, por seu carinho, sua

atenção e as boas horas de conversa durante as perfusões...

Ao Dr. Naftale Katz pelas sugestões que enriqueceram este trabalho.

A Cristina Toscano que logo nos primeiros experimentos me ajudou a entender o

Prisma.

A Vandinha, o Àureo, Jussara e D. Vera que sempre foram muito atenciosos e

prestativos. Obrigada pela amizade de vocês...

Aos meus amigos do Laboratório de esquistossomose, Ana Carolina, Rafaella, Ana

Karine agradeço as sugestões, as boas conversas e todo apoio de vocês.

À Tatiane, Gardênia, Suedali e Juliano pela amizade e o bom convívio.

À Flávia pelo carinho e tempo dedicado me ajudando nas perfusões.

À Fernanda companheira de mestrado, pelo carinho e amizade.

E claro sem esquecer Clarice, Liliane, Watson, Lizandra e Ludmila que chegaram a

pouco renovando a alegria do Laboratório de esquistossomose...

Obrigada a todos pelas horas agradáveis que passamos juntos!!

Ao Martin pela presteza e a grande ajuda sempre que precisei.

A Raquel e Simone, pessoas que admiro pela grande competência.

VII

Aos funcionários do biotério: Jaci, Douglas, Wanderley, Marcílio, Moisés, Vera, pela

colaboração e atenção de todos vocês.

Ao Bibliotecário Segemar pela competência e presteza sempre que foi necessário

sua colaboração.

Aos demais funcionários pelo respeito e atenção que sempre me trataram.

Aos colegas do curso de Pós-graduação do CPqRR.

Ao Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ pelo suporte técnico-científico.

À Biblioteca do CPqRR em prover acesso gratuito local e remoto à informação

técnico-científica em saúde, custeada com recursos públicos federais, integrante do

rol de referências desta dissertação, também pela catalogação e normalização da

mesma.

A minha amiga e comadre Erica pelo carinho e incentivo, sempre.

Aos meus tios e primos pelo carinho e apoio.

A minha família sempre presente, apoiando, incentivando e sendo meu alicerce para

todos os momentos.

A Sr. Rafael e D. Maria pelo apoio e incentivo.

A Rubiane pelo cuidado e carinho com meu filho.

Obrigada por partilharem o conhecimento e a amizade. Todos que contribuíram de

forma direta ou indireta são co-autores neste projeto que agora se faz real. Sou feliz

por vocês existirem em minha vida!!!

VIII

E Alice perguntou ao gato: -Que caminho devo seguir?

O gato respondeu: -Depende de onde você quer chegar...

(Lewis Caroll)

IX

SUMÁRIO

Lista de Figuras .......................................................................................................XI

Lista de Tabelas......................................................................................................XII

Lista de Gráficos ....................................................................................................XIII

Lista de Quadros.....................................................................................................XV

Lista de Abreviaturas.............................................................................................XVI

Resumo .................................................................................................................XVIII

Abstract...................................................................................................................XIX

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................21

1.1 ESQUISTOSSOMOSE ............................................................................................................................. 21 1.2 PRAZIQUANTEL ................................................................................................................................... 27 1.3 OXAMNIQUINA.................................................................................................................................... 30 1.4 ARTESUNATO E OUTROS DERIVADOS DAS ARTEMISINA....................................................................... 32 1.5 RESISTÊNCIA À DROGAS ESQUISTOSSOMICIDAS................................................................................... 36 1.6 EFETIVIDADE DE DROGAS ESQUISTOSSOMICIDAS NO PERÍODO PRÉ-PATENTE DA ESQUISTOSSOMOSE .. 38

2 OBJETIVO GERAL ...........................................................................................45

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................................................... 45

3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................47

3.1 PARASITOS .......................................................................................................................................... 47 3.2 CAMUNDONGOS .................................................................................................................................. 47 3.3 INFECÇÃO............................................................................................................................................ 47 3.4 TRATAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................................................ 48 3.5 PERFUSÃO – OBTENÇÃO DE ESQUISTOSSÔMULOS OU VERMES ADULTOS............................................. 48 3.6 SCHISTOGRAMA .................................................................................................................................. 49 3.7 OOGRAMA........................................................................................................................................... 51 3.8 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DO S. MANSONI À DROGAS DURANTE O PERÍODO PRÉ-PATENTE DA

ESQUISTOSSOMOSE EXPERIMENTAL................................................................................................................... 51 3.8.1 Experimentos 1 e 3: Avaliação do Schistograma e contagem de vermes adultos provenientes de camundongos tratados com OXA, ART e PZQ no 15º dia de infecção ....................................................... 52 3.8.2 Experimentos 2 e 4: Avaliação do Schistograma e contagem de vermes adultos recuperados de camundongos tratados com OXA, ART e PZQ no 23º dia de infecção ....................................................... 53 3.8.3 Experimentos 5 e 6: Avaliação do Schistograma de esquistossômulos recuperados de camundongos tratados com associação ART + PZQ no 14º ou 21º dia de infecção ................................. 55

3.9 AVALIAÇÃO DE VERMES ADULTOS RECUPERADOS APÓS EXPOSIÇÃO À DROGAS ESQUISTOSSOMICIDAS

NO PERÍODO PRÉ-PATENTE................................................................................................................................. 56 3.9.1 Experimentos 7 e 8 – Contagem de vermes adultos recuperados aos 100 dias de infecção, de camundongos tratados com diferentes esquemas terapêuticos no período pré-patente .............................. 56

3.10 EFEITOS DO TRATAMENTO “IN VIVO” COM OXA, ART E PZQ SOBRE O TEGUMENTO DE

ESQUISTOSSÔMULOS DE S. MANSONI .................................................................................................................. 58 3.10.1 Microscopia de Fluorescência ..................................................................................................... 58 3.10.2 Marcação dos parasitos com sonda fluorescente......................................................................... 58 3.10.3 Perfusão – Obtenção de esquistossômulos para uso nas técnicas de fluorescência .................... 59 3.10.4 Experimentos 9 e 10 – Tratamento “in vivo” com OXA, ART e PZQ e marcação com sonda Hoechst para avaliação de dano no tegumento de vermes imaturos aos 14 e 21 dias de infecção............. 60

3.11 IMAGENS FOTOGRÁFICAS .................................................................................................................... 61 3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................................................... 61

4 RESULTADOS ..................................................................................................64

4.1 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DO S. MANSONI À DROGAS DURANTE O PERÍODO PRÉ-PATENTE DA

ESQUISTOSSOMOSE EXPERIMENTAL................................................................................................................... 64 4.1.1 Experimento 1-a ........................................................................................................................... 64 4.1.2 Experimento 1- b .......................................................................................................................... 65

X

4.1.3 Experimento 2- a .......................................................................................................................... 67 4.1.4 Experimento 2- b .......................................................................................................................... 68 4.1.5 Experimento 3- a .......................................................................................................................... 69 4.1.6 Experimento 3- b .......................................................................................................................... 71 4.1.7 Experimento 4- a .......................................................................................................................... 73 4.1.8 Experimento 4- b .......................................................................................................................... 75 4.1.9 Experimento 5 .............................................................................................................................. 77 4.1.10 Experimento 6 .............................................................................................................................. 79

4.2 AVALIAÇÃO DE VERMES ADULTOS RECUPERADOS APÓS EXPOSIÇÃO A DROGAS ESQUISTOSSOMICIDAS

NO PERÍODO PRÉ-PATENTE................................................................................................................................. 81 4.2.1 Experimento 7 .............................................................................................................................. 81 4.2.2 Experimento 8 .............................................................................................................................. 82

4.3 EFEITOS DO TRATAMENTO “IN VIVO” COM OXA, ART E PZQ SOBRE O TEGUMENTO DE

ESQUISTOSSÔMULOS DE S. MANSONI .................................................................................................................. 83 4.3.1 Experimento 9 – a......................................................................................................................... 83 4.3.2 Experimento 9- b .......................................................................................................................... 86

5 DISCUSSÃO......................................................................................................89

6 CONSIDERAÇÕES .........................................................................................100

7 PERSPECTIVAS .............................................................................................102

8 CONCLUSÕES................................................................................................104

9 REFERÊNCIAS ...............................................................................................106

XI

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - REPRESENTAÇÃO DO CICLO EVOLUTIVO DO S. MANSONI .................................24

FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS ETAPAS DO DESENVOLVIMENTO DOS

ESQUISTOSSÔMULOS. ...........................................................................................25

FIGURA 3 - ESTRUTURA QUÍMICA DO PZQ......................................................................27

FIGURA 4 - ESTRUTURA QUÍMICA DA OXA......................................................................30

FIGURA 5 - ESTRUTURA QUÍMICA DA ARTEMISINA ............................................................32

FIGURA 6 - ESTRUTURA QUÍMICA DO ART......................................................................33

FIGURA 7 - ESQUISTOSSÔMULO 1º ESTÁDIO....................................................................49



FIGURA 10 - ESQUISTOSSÔMULO 4º ESTÁDIO..................................................................50

FIGURA 11- ESQUISTOSSÔMULO 5º ESTÁDIO...................................................................51

FIGURA 12 - ESQUISTOSSÔMULOS DE 3º, 2º E 4º ESTÁDIO EVOLUTIVO. ..............................51

FIGURA 13 - ESTRUTURA QUÍMICA SONDA HOECHST 33258 ............................................58

FIGURA 14 - VERMES RECUPERADOS DO GRUPO TRATADO COM OXA 400 MG/KG NO 15º DPI.

...........................................................................................................................72

FIGURA 15 - VERMES RECUPERADOS DO GRUPO TRATADO COM ART 600 MG/KG NO 15º DPI.

...........................................................................................................................73

FIGURA 16 – VERMES RECUPERADOS DO GRUPO TRATADO COM PZQ 800 MG/KG NO 15º DPI

E CONTROLE NÃO TRATADO ...................................................................................73

FIGURA 17– VERMES RECUPERADOS DE GRUPOS TRATADOS COM OXA 400 MG/KG E ART

600 MG/KG...........................................................................................................76

FIGURA 18 – VERMES RECUPERADOS APÓS 100 DIAS DE INFECÇÃO.................................83

FIGURA 19 – MARCAÇÃO DOS PARASITOS COM SONDA HOECHST 33258 TRATADOS NO 14º

DPI E COLETADOS 2 HORAS APÓS TRATAMENTO. ......................................................85

FIGURA 20 - MARCAÇÃO DOS PARASITOS COM SONDA HOECHST 33258 TRATADOS 21º DPI E

COLETADOS 2 H APÓS TRATAMENTO. ......................................................................87

XII

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - DISTRIBUIÇÃO DE ESQUISTOSSÔMULOS NO SCHISTOGRAMA RECUPERADOS DE

CAMUNDONGOS TRATADOS COM OXA 200 MG/KG, ART 300 MG/KG OU PZQ 400

MG/KG. ................................................................................................................64

TABELA 2 - PERCENTUAL DE REDUÇÃO DE VERMES ADULTOS RECUPERADOS DE


MG/KG .................................................................................................................65

TABELA 3 - DISTRIBUIÇÃO DE ESQUISTOSSÔMULOS RECUPERADOS DE CAMUNDONGOS

TRATADOS COM OXA 200 MG/KG, ART 300 MG/KG OU PZQ 400 MG/KG. .................67



MG/KG. ................................................................................................................68





MG/KG. ................................................................................................................71





MG/KG. ................................................................................................................75

TABELA 9 - DISTRIBUIÇÃO DE ESQUISTOSSÔMULOS NO SCHISTOGRAMA RECUPERADOS DE

CAMUNDONGOS TRATADOS COM ART 300 OU 600 MG/KG; PZQ 400 OU 800 MG/KG;

ART 300 + PZQ 400 MG/KG; E ART 600 + PZQ 800 MG/KG...................................77


TRATADOS COM ART 300 OU 600 MG/KG; PZQ 400 OU 800 MG/KG; ART 300 + PZQ

400 MG/KG; E ART 600 + PZQ 800 MG/KG. ...........................................................79

TABELA 11 - NÚMERO DE VERMES VIVOS RECUPERADOS 100 DIAS APÓS A INFECÇÃO, DE

CAMUNDONGOS TRATADOS COM OXA 200 MG/KG, ART 300 MG/KG E PZQ 400 MG/KG.

...........................................................................................................................81

TABELA 12 - NÚMERO DE VERMES VIVOS RECUPERADOS 100 DIAS APÓS A INFECÇÃO, DE

CAMUNDONGOS TRATADOS COM OXA 400 MG/KG, ART 600 MG/KG E PZQ 800 MG/KG.

...........................................................................................................................82

XIII

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 - GRÁFICO REPRESENTATIVO DAS MÉDIAS DE VERMES IMATUROS RECUPERADOS

DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS E GRUPO CONTROLE E OS RESPECTIVOS DESVIOS PADRÃO

OBTIDOS NO EXPERIMENTO 1- A. ............................................................................65



OBTIDOS NO EXPERIMENTO 1- B. ............................................................................66


















OBTIDOS NO EXPERIMENTO 4. ................................................................................76



OBTIDOS NO EXPERIMENTO 5 PARA AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO ART + PZQ

ADMINISTRADA NO 15º DIA APÓS INFECÇÃO. ............................................................78



OBTIDOS NO EXPERIMENTO 6 PARA AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO ART + PZQ

ADMINISTRADA NO 21º DIA APÓS INFECÇÃO. ............................................................80

XIV

GRÁFICO 11 - GRÁFICO DE BARRAS DA MÉDIA DE ESQUISTOSSÔMULOS VIVOS RECUPERADOS



GRÁFICO 12 - GRÁFICO DE BARRAS DA MÉDIA DE ESQUISTOSSÔMULOS VIVOS RECUPERADOS



XV

LISTA DE QUADROS QUADRO 1 - ESTIMATIVA DE PREVALÊNCIA DA ESQUISTOSSOMOSE PARA ALGUNS PAÍSES DA

AMÉRICA LATINA...................................................................................................21

QUADRO 2 - ESQUEMAS TERAPÊUTICOS DOS EXPERIMENTOS 1 E 3 ..................................52




QUADRO 6 - ESQUEMAS TERAPÊUTICOS DOS EXPERIMENTOS 9 E 10 ...............................60

XVI

LISTA DE ABREVIATURAS

OXA – Oxamniquina

PZQ – Praziquantel

ART – Artesunato

Dpi – days post infection - Dias após infecção

WHO – World Health Organization - Organização Mundial de Saúde

Cyt D – Cytochalasin D

XVII

Resumo

XVIII

RESUMO O tratamento da esquistossomose na fase postural da doença é bem estabelecido e

tem como drogas disponíveis o praziquantel (PZQ) e a oxamniquina (OXA), que

geralmente promovem boa resposta terapêutica. Entretanto, o S. mansoni apresenta

diferente susceptibilidade a drogas na fase pré-postural, podendo causar falhas

terapêuticas. O PZQ é pouco ativo para esquistossômulos de 2 a 4 semanas, bem

como a OXA na 3º semana de infecção. O Artesunato (ART) tem demonstrado boa

atividade contra esquistossômulos. Para elucidar estas diferenças, foram avaliados

quais estádios evolutivos são mais susceptíveis ao tratamento na fase pré-postural

da doença através do schistograma. O tratamento com ART promoveu as maiores

alterações no schistograma. Doses de 300 mg/kg ou 600 mg/kg administradas no

15º dpi diminuíram significativamente o número de vermes de 3º e 4º estádios. Dose

de 300 mg/kg no 23º dpi reduziu o número de vermes do 5º e 6º e ART 600 mg/kg

reduziu o número de vermes do 4º, 5º e 6º estádios. Tratamentos com ART 600

mg/kg resultaram em grande número de esquistossômulos com intestino degradado

impedindo sua classificação no schistograma. Estas alterações levaram a diferenças

estatísticamente significativas no número total de esquistossômulos e no percentual

de redução de vermes adultos recuperados aos 42 dpi. Vale ressaltar que parte dos

vermes recuperados com 100 dias de infecção, principalmente fêmeas, tratados com

ART 600 mg/kg apresentavam aspecto de imaturos. Doses de OXA 200 mg/kg e 400

mg/kg administrados no 15º dpi reduziram o número de esquistossômulos do 4º

estádio, enquanto o tratamento no 23º dpi de OXA 200 mg/kg reduziu o número de

vermes do 6º estádio e de 5º e 6º estádios quando a dose foi de 400 mg/kg. O

tratamento com OXA 400 mg/kg no 23º dpi causou diferenças estatísticamente

significativas no percentual de redução de vermes adultos recuperados. Muitos

vermes recuperados dos tratamentos com OXA 400 mg/kg tiveram seu

desenvolvimento comprometido e estas alterações também foram observadas nos

grupos recuperados 100 dpi. O schistograma de camundongos tratados com PZQ

400 mg/kg permaneceu inalterado. A dose de 800 mg/kg utilizada no 15º dpi reduziu

o número de esquistossômulos do 4º estádio e no 23º dpi reduziu o número de

vermes de 6º estádio. As associações ART 600 + PZQ 800 mg/kg e ART 300 + PZQ

400 mg/kg não diferiram estatísticamente do grupo tratado com ART 600 mg/kg

isoladamente. Dados sugerem maior dano no tegumento de vermes tratados com

OXA 400 mg/kg, ART 300 e 600 mg/kg e PZQ 800 mg/kg.

XIX

ABSTRACT The treatment of schistosomiasis during the postural phase is well established and

the use of praziquantel (PZQ) and oxamniquine (OXA) shows satisfactory therapeutic

efficiency. However, S. mansoni presents different susceptibility profiles to these

drugs during the pre-patent phase, causing treatment failures.

PZQ shows little activity against 2 to 4 weeks old schistosomules, as OXA does

during the 3rd week of infection. Artesunate (ART) has shown good activity against

schistosomules during this period. In order to elucidate these differences, the

susceptibility to treatment at various maturation stages during the pre-postural phase

of the disease was evaluated, registering schistogram changes of infected mice.

Treatment with ART revealed the biggest changes in the schistogram. ART doses of

300 mg/kg or 600 mg/kg administered 15 days after infection reduced significantly

the number of schistosomules at 3rd and 4th stages. A dose of 300 mg/kg on the 23rd

day reduced the number of worms at 5th and 6th stage and a dose of 600 mg/kg on

the same day showed a reduction in the number of schistosomules at 4th, 5th and 6th

stages. Treatment with ART 600 mg/kg caused gut lesions of schistosomules,

impeding the staging in the schistogram. These results show statistically significant

differences in the total number of schistosomules and in the percentage of the adult

worm reduction obtained 42 days after infection among the treated and not treated

groups. It is worth mentioning that most of the worms, especially females, examined

from the group treated with 600 mg/kg ART 100 days after infection, showed

immature aspect. OXA doses of 200 mg/kg or 400 mg/kg administered 15 days after

infection reduced the number of schistosomules at the 4th stage. A dose of 200

mg/kg on the 23rd day reduced the number of worms at the 6th stage and a dose of

400 mg/kg on the same day showed a reduction in the number of schistosomules at

the 5thand 6thstage. The treatment with OXA 400 mg/kg on the 23 rd day after

infection revealed a significant reduction of adult worms compared to the untreated

control group. Most worms of the group treated with 400 mg/kg OXA showed

abnormal development. The schistogram of mice treated with PZQ 400 mg/kg

remained unchanged. The dose of 800 mg/kg administered on the 15th day after

infection reduced the number of schistosomules at stage 4 and that on day 23

revealed activity at those of stage 6. Associations of ART 600 + PZQ 800 mg/kg and

ART 300 + PZQ 400 mg/kg did not differ to treatment with ART 600 mg/kg alone. The

data also indicate considerable damage to worm’s tegument treated with OXA 400

mg/kg, ART 300 and 600 mg/kg as well as with PZQ 800 mg/kg.

20

Introdução

21

1 Introdução

1.1 Esquistossomose

Cerca de 1 bilhão ou mais de pessoas no mundo são afetadas pelas doenças

tropicais negligenciadas. Elas são chamadas negligenciadas por que persistem

exclusivamente na pobreza e nas comunidades mais marginalizadas (WHO 2008). A

esquistossomose pertence a este grupo, sendo endêmica em 76 países e territórios

distribuídos pela África, Ásia e Américas (Engels et al. 2002).

Embora a distribuição da esquistossomose tenha mudado nos últimos 50

anos e tenha havido sucesso nos programas de controle, o número estimado de

pessoas infectadas ou com risco de infecção não reduziu. Onde o controle tem

obtido sucesso, no caso de países da Ásia e Américas, o número de infectados e o

risco de infecção são bem menores, ao contrário do que ocorre na África

Subsaariana (Engels et al. 2002). Segundo dados da Organização Mundial de

Saúde (2007), mais de 200 milhões de pessoas estão infectadas e 650 milhões

estão expostas ao risco de contrair a doença. Estima-se que 85 % do número de

pessoas infectadas estão no continente Africano (Chitsulo et al. 2000).

Dados da Organização Mundial de Saúde para o ano de 2007 confirmam o

Brasil como o país com a maior prevalência de esquistossomose na América Latina

com mais de 6 milhões de pessoas infectadas e mais de 42 milhões de pessoas

vivendo em áreas endêmicas sobre o risco de contrair a infecção (quadro 1).

Quadro 1 - estimativa de prevalência da esquistossomose para alguns países da

América Latina.

País Ano Número estimado de

pessoas infectadas

Número de pessoas vivendo

em áreas endêmicas

Número reportado de

pessoas tratadas

Brasil 2007 6.712.683 42.189.186 21.551

Republica

Dominicana 2007 287.785 975.966 -

Suriname 2007 4.133 41.328 -

Venezuela 2007 43.078 7.188.227 -

Fonte: http://www.who.int/neglected_diseases/preventive_chemotherapy/sch/db/index. O controle da esquistossomose depende medidas de saneamento. È

inquestionável a necessidade imediata de aumento de investimentos no

22

fornecimento de água potável e sistema de esgoto, associados às medidas de

educação para a saúde e tratamento clínico em larga escala,visando uma resposta

adequada para o controle da transmissão da esquistossomose (Katz, 2005).

Programas de controle baseados em quimioterapia geralmente têm obtido

tanto sucesso que todas as outras ferramentas para controle têm sido

marginalizadas. Subentende-se que educação em saúde nas áreas rurais onde não

há acesso a água segura deveria existir (Bergquist 2008).

Almejando o controle da doença em áreas endêmicas, a OMS recomenda

garantia de acesso às drogas essenciais contra a esquistossomose (e geohelmintos)

nos serviços de saúde nas zonas endêmicas (WHO, 2006).

As esquistossomoses são causadas por helmintos, pertencentes à classe

Trematoda, ao gênero Schistosoma, com a característica de possuírem dimorfismo

sexual na fase adulta.

São cinco as espécies do gênero Schistosoma que apresentam interesse

médico por serem capazes de infectar o homem, sendo elas: Schistosoma

haematobium (Bilhartz, 1852), Schistosoma japonicum (Katsurada, 1904),

Schistosoma mekongi (Voge, Brickner e Bruce, 1978), Schistosoma intercalatum

(Fischer, 1934) e Schistosoma mansoni (Sambon, 1907).

As espécies do gênero Schistosoma que afetam o homem chegaram as

Américas durante período de tráfico de escravos e com os imigrantes orientais e

asiáticos. Entretanto, apenas o S. mansoni conseguiu se fixar devido condições

ambientais propícias e a presença de bons hospedeiros intermediários (Melo &

Coelho, 2005)

O S. mansoni possui morfologia diferenciada em cada fase do seu ciclo

biológico que compreende estágio de ovo, miracídio, esporocisto, cercária,

esquistossômulo e verme adulto (macho e fêmea). Dessa forma, o parasito que

possui complexo ciclo biológico, representa uma notável interação adaptativa com

seus hospedeiros intermediários e definitivos e com o ambiente natural onde o ciclo

ocorre (Melo & Coelho, 2005).

Para manutenção do ciclo do parasito e seu desenvolvimento são necessários

a presença de hospedeiros invertebrados que são os caramujos do gênero

Biomphalaria e os hospedeiros vertebrados mamíferos, principalmente o homem. No

Brasil já foram identificadas dez espécies pertencentes ao gênero Biomphalaria,

sendo apenas B. glabrata, B. straminea e B. tenagophila encontradas eliminando

cercárias na natureza (Bezerra 2005).

23

A contaminação fecal dos ambientes aquáticos dulcícolas é o principal

componente do processo de transmissão da esquistossomose, proporcionando

riscos de transmissão da infecção para pessoas que dependem diretamente dessas

águas para suas atividades diárias ou mesmo para outras que as utilizam

esporadicamente para diferentes atividades (Barbosa et al 2008).

Enk et al (2004) chamam atenção para o grande aumento do turismo rural em

áreas endêmicas como fator de risco para infecção, especialmente de indivíduos

vindos de áreas não-endêmicas para esquistossomose, que por não terem sido

expostos previamente ao parasito poderiam apresentar formas mais graves da

doença. Esquistossomose aguda é observada geralmente em pessoas que se

infectaram durante visitas a áreas endêmicas, e parece estar relacionada a infecção

intensa, podendo em alguns casos ser observada em pacientes com infecção

moderada (Hiatt et al 1979).

O ciclo da esquistossomose se inicia quando ovos de S. mansoni atingem a

água em condições favoráveis, eclodem liberando o miracídio, forma infectante para

os caramujos. Nos seus hospedeiros invertebrados o S. mansoni desenvolve seu

ciclo assexuado, que compreende complexos processos de multiplicação celular e

mecanismos adaptativos. Estas divisões celulares e modificações morfológicas

levam a formação de cercárias que são liberadas em coleções de água. Tal forma

larvar é o agente penetrante na pele ou mucosa dos hospedeiros definitivos. Após

penetração, a cercária sofre transformações bioquímicas e morfológicas que as

transformam em esquistossômulos que atravessam a epiderme, atingem a derme

quando invadem vasos preferencialmente venosos; os parasitos são carregados

passivamente para o coração, são bombeados para os pulmões, retornam ao

coração e são bombeados para circulação sistêmica. Os esquistossômulos

perfazem dois ou três ciclos sistêmicos até ficarem retidos nos sinuisóides hepáticos,

onde se desenvolvem devido aos estímulos do soro sanguíneo portal, e

amadurecem sexualmente, a partir de complexas interações moleculares entre os

sexos. No sistema porta-hepático intestinal, as fêmeas maduras passam liberar

ovos, que amadurecem nos tecidos do hospedeiro vertebrado e são eliminados nas

fezes, dando continuidade ao ciclo biológico (Lenzi et al 2008).

24

Fonte: http://bioinfo.cpqrr.fiocruz.br/files/images/cicloshisto.

Figura 1 - Representação do ciclo evolutivo do S. mansoni

Sabe-se que durante o desenvolvimento de esquistossômulo até verme

adulto, o S. mansoni passa por seis estádios evolutivos, onde há alterações

morfológicas e grande crescimento corporal. Faust et al (1934) utilizando infecção

experimental em ratos, coelhos e macacos Rhesus observou que este

desenvolvimento ocorre de forma assincrônica.

Critérios morfológicos foram criados para classificar o parasito do 1° ao 6°

estádio, a saber: Esquistossômulos de estádio 1 são recém-chegados dos pulmões

apresentam somente uma pequena mancha escura que representa o início do ceco.

Este estágio tem uma curta duração. No estádio 2 a mancha escura agora bifurca,

mas não ultrapassa o acetábulo. No estádio 3 a mancha escura bifurcada ultrapassa

o acetábulo e se religa depois dele. No estádio 4 a mancha escura na porção

reconectada começa crescer para extremidade do parasito, mas não é maior que

sua parte bifurcada. O 5º estádio possui o final ligado do ceco maior que a parte

bifurcada, mas é menor que três vezes seu tamanho final. No estádio 6 encontramos

25

adultos jovens e maduros. Seu ceco está completamente desenvolvido, sendo três

vezes maior que no 5º estádio (Barbosa et al 1978).

Fonte: Barbosa et al 1978

Figura 2 - Representação esquemática das etapas do desenvolvimento dos esquistossômulos.

A esquistossomose mansoni é basicamente uma doença que decorre da

resposta inflamatória granulomatosa que ocorre em torno dos ovos vivos do parasito

(Bogliolo 1959, Warren 1968).

A doença se apresenta no homem sob uma forma aguda e duas formas

crônicas, polares. Destas, uma forma é leve geralmente assintomática, atingindo a

maioria absoluta dos indivíduos infectados que vivem em áreas endêmicas, sendo

conhecida como forma hepatointestinal. A outra forma crônica é rara e se manifesta

com hepatoesplenomegalia e outros sinais de hipertensão porta, sendo usualmente

designada como forma avançada ou hepatoesplênica (Andrade & Azevedo 1987).

A fase aguda se caracteriza em alguns pacientes com manifestações clínicas

de febre, prostração, diarréia e eosinofilia e uma imunopatologia exacerbada com

granulomas maiores do tipo necrótico exudativo. Geralmente, surge com o início do

aparecimento de ovos nas fezes e dura até 120 dias após infecção (Diaz-Rivera et al

1956, Ferreira et al 1966 ).

A forma habitual ou leve atinge a maioria absoluta dos indivíduos infectados

que vivem em áreas endêmicas, eliminando ovos viáveis nas fezes, mas

26

assintomáticos ou com queixas vagas. Segundo Andrade (2008), a classificação de

duas formas separadas, hepática e hepatointestinal, não se justificam uma vez que

em qualquer infecção esquistossomática o fígado está sempre lesado e o intestino,

sede da eliminação dos ovos, é geralmente pouco lesado nos casos de

esquistossomose mansoni no Brasil.

Também de acordo com Andrade (2008), forma grave ou avançada da

esquistossomose é caracterizada morfologicamente pela fibrose hepática periportal.

Em muitos casos há sinal de hipertensão porta: esplenomegalia e circulação

colateral daí a designação forma hepatoesplênica.

Os métodos de diagnóstico da esquistossomose podem ser classificados

como diretos ou indiretos. Os métodos diretos detectam o parasito ou suas partes,

neste grupo incluímos exames parasitológicos de fezes e biópsia retal, pesquisa de

antígenos circulantes e PCR. Os métodos indiretos identificam evidências indiretas

da presença do parasito que podem ser através de aspectos clínicos, propedêutica

clínica, reação intradérmica e métodos sorológicos (Rabello et al 2008). O exame de

amostras de fezes para detecção de ovos de acordo com a técnica de Kato-Katz

(Katz et al 1972) é o método mais utilizado no mundo para diagnóstico da

esquistossomose intestinal (Bergquist 2008).

O tratamento específico da esquistossomose causada pelo S. mansoni é

prescrito somente quando a infecção é comprovada pela presença de ovos viáveis

de parasitas nas fezes e/ou eventualmente nos tecidos (Enk, Katz & Coelho 2008).

A Oxamniquina (Mansil ® – Pfizer S.A.) e o Praziquantel (Farmanguinhos -

Fundação Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ) são as duas drogas atualmente disponíveis

para tratamento da esquistossomose no Brasil. Além de possuir custo mais

acessível, o Praziquantel (PZQ) é a droga recomendada pela organização mundial

de saúde para tratamento da doença (WHO, 2006).

Poucos trabalhos estão disponíveis na literatura sobre o tratamento durante a

fase inicial da doença. Alguns autores demonstram que esquistossômulos são

menos susceptíveis do que vermes adultos a drogas esquistossomicidas (Gonnert &

Andrews 1977, Sabath et al 1986, Xiao et al 1985 e 1987, Silva et al 2003, Botros et

al 2005). Este fato indica que uma falha terapêutica pode resultar quando o

tratamento é feito em hospedeiros infectados ou re-infectados recentemente, em

virtude dos mesmos apresentarem formas migrantes e imaturas do parasito, as

quais são particularmente resistentes aos esquistossomicidas (Medeiros et al 1983,

Sabah et al 1986, Utzinger et al 2000, Silva et al 2003).

27

Tendo em vista a necessidade de compreender melhor como os diferentes

estádios de maturação do S. mansoni diferem na susceptibilidade a drogas, este

trabalho se propõe a elucidar quais estádios são mais susceptíveis (ou resistentes) à

ação dos esquistossomicidas PZQ e Oxaminiquina (OXA), utilizados há muitos anos

como agentes esquistossomicidas, e ao Artesunato (ART) um derivado do grupo das

Artemisinas, um grupo de drogas promissoras no tratamento da esquistossomose.

1.2 Praziquantel

Atualmente o PZQ é a droga de escolha para o tratamento de todas as formas

clínicas da esquistossomose (Pica-Mattocia & Cioli, 2004).

Figura 3 - Estrutura química do PZQ

È comercializado no Brasil com o nome comercial de Cestox® ou Cisticide®,

sendo também produzido pela Farmanguinhos/FIOCRUZ.

A dose recomendada é de 40 mg/kg de peso para tratamento da

esquistossomose mansoni (WHO 2006).

O PZQ (2-ciclo hexylcarbonyl)-1, 2, 3, 6, 7,11b-hexahidro-2H-pyrazino[2,1-

a]isoquinolino-4-one), é um derivado sintético da pirazina isoquinolina. È um pó

branco quase cristalino, de sabor amargo, funde-se 136- 140°C. Estável em

condições normais e praticamente insolúvel em água, parcialmente solúvel em

etanol e solúvel em solventes orgânicos.

È rapidamente absorvido quando administrado por via oral, alcançando pico

de concentração plasmática de 1-2 horas (Leopold et al 1978). Possui um extenso

28

metabolismo de primeira passagem no fígado, com rápido desaparecimento da

circulação, e tempo de ½ vida geralmente de 1 a 3 horas (Pica-Mattoccia & Cioli

2004). Apresenta maior concentração plasmática quando ingerido na presença de

alimentos (Mandour et al 1990). Sua eliminação é feita através da urina e fezes,

sendo 80% eliminada após 24 horas (Steiner et al 1976).

Sua preparação comercial é uma mistura racêmica em partes iguais de “Levo”

(-) e “Dextro” (+). Apenas o enantiômero Levo possui atividade esquistossomicida

(Tanaka et al 1989, Wu et al 1991). Em estudo conduzido por Wu et al (1991)

pacientes foram tratados com 20 mg/kg de levo-PZQ ou 40 mg/kg de PZQ. Não

houve diferença estatísticamente significativa entre os percentuais de cura,

entretanto o levo-PZQ produziu menos efeitos colaterais.

A droga é igualmente eficaz contra S. mansoni, S. haematobium, S.

japonicum, S. intercalatum, e S. mattheei sendo pouco ativo contra vermes de 2 a 4

semanas, mas é efetivo contra esquistossômulos de 5 semanas ou mais (Gönnert &

Andrews, 1977), além disso, as fêmeas são mais susceptíveis a droga. Há

importante correlação entre taxa de cura e intensidade de infecção antes do

tratamento sendo que maiores taxas de cura são encontradas em infecção mais

brandas (Utzinger et al 2000). O tratamento de camundongos na dosagem de 250

mg/kg por 5, 3, 2 dias consecutivos ou 1 dia reduz o número de parasitas em 96, 89,

75 e 75% respectivamente (Gönnert & Andrews 1977).

O mecanismo molecular detalhado da ação do PZQ ainda não é bem

elucidado (Cioli 2000), embora seja usado no tratamento da esquistossomose a

mais de 20 anos (Aragon et al 2009). A primeira alteração visível provocada no

verme adulto exposto à droga consiste na paralisia da musculatura do verme,

acompanhada e, provavelmente causada, pelo rápido influxo de cálcio no parasito

(Pax et al 1978). O influxo de cálcio não é pelo transporte direto pelo PZQ, já que a

droga não atua como ionóforo (Pax et al 1978). Blair et al (1992) investigaram a

contração celular e paralisia flácida (perda de resposta a estímulo) de S. mansoni

em meio contendo elevada proporção de Mg 2+: Ca 2+ e concluíram que a ação do

PZQ, possivelmente estava relacionada à interação com sítios específicos Ca 2+

permeáveis. Estes sítios são os canais de Cálcio, complexas proteínas trans-

membrana que contribuem para propagação de impulso e regulam a entrada do íon

na célula, desempenhando importante papel na homeostase. Os canais de Ca 2+

consistem em um poro formado de subunidades α1 associadas a outras

subunidades que modulam sua atividade. As subunidades associadas com α são

29

α2/δ, β e γ. As subunidades β dos canais de cálcio modulam a subunidade α1 a fim

de manter as concentrações de Ca 2+ em equilíbrio. Segundo Kohn et al 2001, o

PZQ poderia romper a interação α1/ β culminando com a perda do efeito modulatório

da subunidade α1, pela β. Entretanto, recentemente, Pica-Mattoccia et al (2008)

realizaram estudos “in vitro”, usando cytochalasin D (cyt D) capaz de bloquear os

canais de cálcio voltagem dependente e suprimir os efeitos do PZQ, e encontraram

falta de correlação entre a indução do influxo de Ca 2+ promovida pelo PZQ e a

morte do parasito. Nestes estudos, os vermes expostos a PZQ em meio contendo

Ca 2+ radioativo apresentaram influxo de Ca 2+ duas vezes maior que o controle, e

morreram até 7º dia de incubação. Quando PZQ foi adicionado após 1hora de

incubação com cyt D, ao contrário do que se esperava, ocorreu influxo de Ca 2+

maior do que nos vermes expostos apenas ao PZQ, uma vez que a cyt D não foi

capaz de impedir influxo de Ca 2+. Apesar desta grande entrada de Ca 2+ os

parasitos sobreviveram. Nestes vermes o efluxo de Ca 2+ foi mais rápido. Os

pesquisadores também observaram grande influxo de cálcio em vermes de 28 dias

expostos ao PZQ, embora estes sejam menos sensíveis aos efeitos da droga. Com

estes achados os autores sugerem que apenas o acúmulo de cálcio não represente

a única explicação para ação esquistossomicida do PZQ.

Também se observam alterações morfológicas no tegumento de parasitos

tratados com PZQ. Há formação de bolhas na camada superficial do tegumento que

pode ser desencadeado por um processo de vacuolização do lado interno para o

externo na camada sincicial (Mehlhorn et al 1981). Estágios imaturos de

desenvolvimento do S. mansoni são mais resistentes à formação de vesículas que

as formas maduras do parasito, quando tratadas com PZQ (Xiao et al 1985), o que

talvez esteja envolvido com a pequena sensibilidade de vermes imaturos a droga.

Estas alterações morfológicas promovem um aumento da exposição de antígenos

na superfície do parasito (Harnet & kusel 1986). Células do sistema de defesa do

hospedeiro se ligam aos vacúolos no tegumento e iniciam a penetração para o

interior do parasito cerca de 4 horas após tratamento, em consequência ocorrem

lesões e eliminação do verme (Mehlhorn et al 1981). Dessa forma a imuno-

dependência da ação do PZQ parece estar relacionada ao dano induzido pela droga

na superfície do verme, que resulta na exposição de antígenos susceptíveis ao dano

por anticorpos (Doenhoff et al 1988).

Estudos revelam que o PZQ possui muito baixa toxicidade aguda em testes

realizados em ratos, camundongos, coelhos e cachorros. Não apresenta efeitos

30

teratogênicos em camundongos, coelhos e ratos além de não apresentar sinais de

potencial carcinogênico em pequenos roedores (Frohberg & Schulze 1981).

Os efeitos colaterais mais comumente relatados são dor de cabeça, náusea,

anorexia, vômito, dor abdominal, dor epigástrica, diarréia com ou sem sangue e

muco, tonteira, febre, mialgia, zumbido, insônia e mais raramente rash cutâneo com

edema (Jaoko et al 1996). A frequência e a intensidade dos efeitos colaterais têm

sido diretamente correlacionadas à intensidade da infecção (Stelma et al 1995,

Pica-Mattoccia & Cioli 2004).

1.3 Oxamniquina

A OXA pertence a uma série de derivados 2-amino-metil-

tetrahidroquinolínicos que apresentaram ação esquistossomicida marcante

(Richards & Foster 1969).

Figura 4 - Estrutura química da OXA

É uma droga de cor amarelada, pouco solúvel em água. A OXA usada na

dose de aproximadamente 15 mg/kg, possui pico de concentração plasmática entre

1 e 4 horas após ingestão e o tempo de meia-vida em torno de 2,2 horas (Kokwaro &

Taylor 1991, Daneshmend & Homeida 1987).

A droga é extensamente metabolizada por processos oxidativos gerando

metabólitos inativos. A maior parte é excretada pela urina, apenas 0,4 a 1,9 % sendo

eliminada na forma inalterada (Cioli, Pica-Mattoccia, & Acher 1995). Parâmetros

farmacocinéticos da OXA não são influenciados pela gravidade da doença

(Daneshmend & Homeida 1987).

31

Por ser um produto que necessita de uma etapa de fermentação continuam a

ser fabricadas unicamente pela Pfizer, sendo comercializada no Brasil com o nome

de Mansil®. A falta de concorrência manteve o alto preço dessa droga, o que nos

últimos anos fez com que seu uso diminuísse muito (Katz 2005).

Ao contrário do PZQ, a OXA apresenta atividade apenas contra S. mansoni.

Esse composto além da ação curativa em dose oral única apresenta também,

atividade profilática e ação contra todos os estágios imaturos em camundongos

(Foster et al. 1971). Vermes machos mostraram-se mais susceptíveis à droga do

que as fêmeas (Foster et al 1971), além disso, OXA é ativa contra todas as fases de

infecção com exceção da terceira semana (Foster 1973). È eficaz no tratamento da

esquistossomose aguda (Garcia et al 1997).

Pellegrino et al (1973) relataram que a OXA mostrou atividade acentuada na

esquistossomose mansoni em camundongos, hamsters e macacos Cebus. Dose

intramuscular única em camundongos de 100 mg/kg e em hamsters de 50 mg/kg

produziu alterações do oograma de todos animais tratados e deslocamento de

vermes para o fígado. Macacos Cebus tratados com dose única de 20-40 mg/kg

intramuscular levou ao desaparecimento progressivo dos ovos e não foram

encontrados vermes em perfusão realizada após 120 dias.

Ensaios clínicos no Brasil mostraram que a dose única oral de 15 mg/kg para

adultos e 20 mg/kg para crianças apresentou boa tolerância, poucos efeitos tóxicos

e índice de cura entre 80 e 90 % em adultos e 65 a 90 % em crianças (Silva et al

1974; Katz N 2008-b ).

O mecanismo de ação da OXA é razoavelmente bem conhecido (Utzinger et

al 2003), parece estar relacionado com a capacidade de inibição irreversível da

síntese dos ácidos nucléicos nos vermes. È aceita a seguinte hipótese: a droga é

ativada em um único passo, em que uma enzima do schistosoma converte a OXA

em um éster (provavelmente acetato, fosfato, ou sulfato). Subsequentemente, o

éster dissocia espontaneamente, enquanto o reagente eletrofílico resultante é capaz

de realizar a alquilação do DNA do schistosoma (Cioli, Pica-Mattoccia, & Acher

1995). Estudos realizados por Pica-Mattoccia et al (2006) avaliaram evidências que

sugerem que este éster ativo é um sulfato e a enzima uma sulfotransferase. Neste

estudo, substratos clássicos da sulfotransferase como beta-estradiol inibiram

competitivamente a ação da OXA. Além disso, estes substratos puderam ser

sulfonados in vitro usando extrato de schistosomas sensíveis (não resistentes).

Análise em gel mostrou que o fator de ativação eluído corresponde massa molecular

32

de 32kDa, que é o tamanho médio típico de subunidade da sulfotransferase.

Cromatografia de troca iônica e afinidade confirmaram a natureza da enzima de

sulfotransferase.

Os efeitos adversos observados após administração de OXA são geralmente

leves, e, frequentemente relacionados ao sistema nervoso central como vertigens, e

dor de cabeça (Katz et al 1977).

Conforme Katz (2005) afirma após 13 milhões de tratamentos realizados em

zonas endêmicas de esquistossomose no Brasil, a OXA é uma droga bem tolerada e

com boa atividade terapêutica, para tratamento individual ou em larga escala.

1.4 Artesunato e outros derivados das Artemisina

A Artemisina, uma lactona sesquiterpena ligada a um grupo peróxido, é o

princípio ativo obtido das folhas de Arthemisia annua que possui excelente

propriedade antimalárica.

Figura 5 - Estrutura química da artemisina

Esta planta é usada há mais de 2000 anos na medicina chinesa tradicional,

inicialmente para tratamento de hemorróidas e mais tarde também para tratamento

de febres (Xiao 2005, Utzinger et al 2003). Foram desenvolvidos vários derivados

semi-sintéticos com melhores propriedades físico-químicas e com grande atividade

antimalárica (Xiao et al 2002), entre eles destacamos o ART(dihidroartemisina-10-α-

succinato).

33

Figura 6 - Estrutura química do ART

A atividade esquistossomicida dos derivados da Artemisina foi inicialmente

estudada pelos chineses a partir da década de 80 em experimentos com S.

japonicum. Em 1983 a publicação do primeiro estudo de atividade do ART em

infecção experimental por S. japonicum (Le et al 1983). Posteriormente, sua ação

esquistossomicida também foi comprovada em S. mansoni (Araújo, Kohn & Katz

1991), S. Haematobium (Xiao et al 2002) e S. mekongi (Jiraungkoorskul et al 2006).

Estudos farmacocinéticos realizados Na-Bangchang et al (2002) com

voluntários tailandeses sadios revelaram que o ART via oral é rapidamente

biotransformado em dihidroartemisina, que é detectada na plasma em até 15

minutos após ingestão da droga. Utilizando-se a dose de 4 mg/kg de peso corporal

de ART, o pico de concentração plasmática máximo foi encontrado 0,7 horas e o

tempo de ½ vida foi de 0,74 horas. A mesma dose de dihidroartemisina (4 mg/kg

peso) atingiu pico de concentração plasmático máximo em 1,5 horas e tempo de ½

vida em 1,2 horas, sendo que a concentração plasmática máxima de ART atingida

foi maior que a obtida com dihidroartemisina, porém a exposição sistêmica foi maior

com a dihidroartemisina.

Num estudo realizado com 180 pacientes revelou que o ART é uma droga

bem tolerada, provocando efeitos adversos leves como náusea e cefaléia (DeClerq

2000). O ART é menos tóxico que Artemeter (Shaohong et al 2006).

Derivados de Artemisina demonstram maior atividade nas formas mais jovens

de schistosoma. Utzinger et al (2002) compararam a atividade esquistossomicida de

Artemeter e ART em diferentes estágios de desenvolvimento de S. mansoni.

Quando o esquema terapêutico utilizado foi Artemeter ou Artesunato, 150 ou 300

mg/kg em três doses (7º, 21º e 35º dias de infecção) obteve-se 88-97% de redução

34

de vermes com Artemeter que foi significativamente maior que 67-77% alcançada

com ART. Doses de 600 ou 800 mg/kg administradas 2 ou 4 dias consecutivos em

camundongos infectados com vermes adultos levou a redução na recuperação de

vermes de 46-51% com Artemeter contra 24-33% com ART que não diferiu

estatísticamente do controle não tratado.

Estudos realizados por Lu et al (2004) para avaliar o efeito do ART na

esquistossomose mansoni experimental revelaram a dosagem ótima de ART na

prevenção da doença como 300 mg/kg. Os parasitos mostraram-se especialmente

susceptíveis a droga na forma de esquistossômulo de 14 e 21 dias, com percentual

de redução de vermes de 84% e 93% respectivamente.

A atividade esquistossomicida dos derivados de Artemisinas ainda não é bem

conhecida, mas parece envolver vários mecanismos. A alteração bioquímica mais

notável medida em vermes adultos recuperados de camundongos tratados com

Artemeter é a redução de seu conteúdo de glicogênio (Utzinger 2001). Esta redução

nos níveis de glicogênio foi parcialmente paralela ao decréscimo ao nível de glicose,

que foi particularmente proeminente em fêmeas. Entretanto, a redução do nível de

glicose não foi acompanhada pelo decréscimo da incorporação de glicose ao

glicogênio, sugerindo que redução de glicogênio induzida pelo Artemeter foi até

certo ponto mais relacionada à inibição da glicólise que a interferência com o nível

de glicose.

Assim como ocorre com PZQ foram observadas lesões no tegumento com

vesiculação, degeneração de estruturas sensoriais, dano na musculatura

subtegumental, tecidos parênquimais, lise focal ou extensa e redução no reticulo

endoplasmático granular quando camundongos infectados com S. mansoni foram

tratados com Artemeter 400 mg/kg em dose única no 21º dia após infecção (Xiao et

al 2002a), bem como quando este mesmo tratamento foi realizado em infecção de

sete semanas (Xiao et al 2002b).

Estudos histológicos e histoquímicos mostraram que o tratamento com

Arteeter na dose de 300 mg/kg por 2 dias, em infecção experimental com S.

japonicum, leva a vesiculação do tegumento do parasito, distensão do intestino,

aparente decréscimo ou até mesmo desaparecimento do glicogênio e inibição da

atividade da fosfatase alcalina no tegumento e no tecido parênquimal, bem como

morte do ovo no granuloma (Xiao et al 1992).

A microscopia eletrônica revelou que o ART também causa dano

principalmente no tegumento de vermes, com vesiculação e formação de rugas, há

35

colapso das ventosas de machos e fêmeas, e adesão de leucócitos do hospedeiro

nos locais de dano do tegumento (Shaohong et al 2006).

O ART inibe a maturação sexual de fêmeas reduzindo sua fecundidade (Lu et

al 2004). Estudos conduzidos por Araújo, Kohn & Katz (1999) demonstraram que

camundongos infectados com S. mansoni e tratados 45 dias após, com ART 300 ou

500 mg/kg em dose oral única ou por cinco dias, causaram alterações no aparelho

reprodutor de vermes fêmeas, diminuição do volume ovariano, rarefação dos

folículos vitelínicos. Entretanto, quando os animais foram submetidos à eutanásia 60

ou 90 dias após tratamento estas alterações foram menores, mostrando que os

vermes sobreviventes ao tratamento se recuperam e iniciam postura.

El-Bassiouni et al 2007 estudaram a ação do ART na defesa antioxidante de

vermes imaturos e adultos e verificaram que a droga causa depleção dos níveis de

glutationa (GSH) tempo-concentração dependentes, alem de promover o aumento

nos níveis de peroxidação lipídica tempo-concentração dependente, ambos efeitos

são importantes nas formas jovens do parasito. Além disso, o ART induziu atividade

da superóxido dismutase em vermes adultos, e induziu atividade de glutationa

peroxidase (tGPx, nGPx) além da glutationa transferase de maneira tempo-

concentração dependentes nas formas imatura e adulta do verme. Estes fatos

indicam que o mecanismo de ação do ART envolve morte por processos de stress

oxidativo sendo que as formas mais jovens do parasito se revelaram mais

susceptíveis.

Chippaux et al (2003), questionam o uso de derivados da Artemisina em

áreas co-endêmicas para malária. Os autores alertam para os riscos do uso destas

drogas no tratamento da esquistossomose, pois os mesmos são realizados com

dosagens insuficientes para o tratamento da malária o que poderia provocar

resistência do Plasmodium.

A possibilidade do ART ser usado no tratamento da esquistossomose como

outra opção diante do surgimento de resistência ao PZQ e OXA, associado a estas

drogas ou como escolha durante o período pré-patente da doença, ou até mesmo

em casos de co-infecção com malária, tornam necessários mais estudos sobre sua

aplicação na esquistossomose.

36

1.5 Resistência à drogas esquistossomicidas

Atualmente o controle da esquistossomose é dependente principalmente do

uso de PZQ que é uma droga segura e eficaz. Até hoje são poucas as evidências

importantes de desenvolvimento de resistência, apesar de casos de baixas taxas de

cura no Senegal, e o preocupante fato dos regulares e repetidos tratamentos

administrados no Brasil, China e particularmente Egito, onde mais de 53 milhões de

doses de PZQ já foram administradas (Fenwick et al 2003).

Coles (2002) define resistência em Schistosoma como sendo quando um

isolado tem uma taxa de cura significativamente mais baixa do que a maioria dos

isolados sensíveis. O termo resistência está relacionado com a pressão seletiva. Por

outro lado, o termo tolerância deve ser usado para espécies que não respondem a

uma droga onde quer que ela seja usada, assim tolerância é ausência natural de

resposta a determinada droga. Dessa forma, o autor sugere que alteração da

resposta a drogas antiparasitárias é devido à resistência.

Os mecanismos de escape da ação de drogas mais comuns são: diminuição

na captação da droga pelo organismo, diminuição ou inativação da droga após sua

entrada, alteração da formação do complexo alvo-droga, exclusão da droga para o

exterior do organismo e maior eficiência do reparo do DNA. Os mecanismos de

ativação da droga podem ser suprimidos ou perdidos. A interação da droga com o

alvo pode ser menos efetiva devido ao aumento da competição pelo substrato ou

pela interação do alvo (Lage 2005).

O primeiro relato de um percentual de cura muito baixa após tratamento com

PZQ (apenas 18%) ocorreu num foco de intensa transmissão de S. mansoni no

norte de Senegal (Stelma et al 1995). Outros estudos realizados no local

confirmaram a cura de apenas 36-39% com dose de 40 mg/kg de PZQ, embora

redução na contagem de ovos foi de 85%, considerada significativamente alta

(Gryseels et al 1994). Tratamentos realizados nesta população com OXA 20 ou 40

mg/kg obtiveram sucesso de cura dentro do padrão esperado, sugerindo mais

estudos para confirmar esta resistência ao PZQ (Stelma et al 1997). O baixo

percentual de cura obtido com a droga foi associado à intensa carga parasitária,

rápida re-infecção, maturação de infecções pré-patentes mais longas, resposta

imune específica ainda não desenvolvida da população exposta, ou a combinação

destes fatores, e dessa forma a presença de resistência ao PZQ não foi

completamente confirmada (Gryseels et al 2001).

37

Fallon & Doenhoff (1994) demonstraram relativa resistência ao PZQ ou OXA

de schistosomas sujeitos repetidamente a pressão das drogas esquistossomicidas,

em laboratório. A resistência a esquistossomicidas é estável por longos períodos

mesmo sem continuidade de exposição às drogas (Drescher et al 1993, Ismail et al

2002).

Lage (2005) demonstrou que a pressão seletiva com PZQ altera a estrutura

genética da cepa LE de S. mansoni diminuindo a sua variabilidade genética.

No Brasil, Araújo et al (1996) estudaram dez isolados de S. mansoni

derivados de pacientes de áreas endêmicas no estado da Bahia, que haviam sido

tratados com OXA e PZQ mas que não tinham sido parasitologicamente curados. A

resposta terapêutica in vivo em alguns isolados foi estatísticamente diferente, mas

não o suficiente para caracterizar nenhum isolado como resistente. Bonesso-

Sabadini & Souza-Dias (2002) avaliaram a susceptibilidade à OXA e PZQ, da quarta

geração da cepa Ouh de S. mansoni, isolada em pacientes nunca tratados com

esquistossomicidas. Dos diferentes esquemas terapêuticos utilizados foi identificado

resistência a dose de 100 mg/kg com ambas drogas. Os autores sugerem

necessidade de uma nova dose da droga no acompanhamento dos pacientes.

Coelho et al (1997) compararam a susceptibilidade da cepa LE

conhecidamente susceptível a esquistossomicidas e a cepa R1 isolada de paciente

tratado quatro vezes com OXA e uma vez com PZQ, não curado e que informou não

ter contato com água contaminada durante o período de tratamento. O tratamento

em camundongos com PZQ 500 mg/kg no 50º dia após infecção praticamente

erradicou o parasitismo nas duas cepas. Já OXA 250 mg/kg curou todos os tratados

da cepa LE, enquanto 12 dos 17 camundongos infectados com R1 apresentaram

vermes vivos. Na dose de 200 mg/kg a cepa R1 obteve recuperação de 18,57%

contra 1,06% da cepa LE para machos, e 61,14% contra 20,58% da cepa LE para

fêmeas. Na dose de 100 mg/kg foram recuperados 29,9% de machos em R1 contra

2,26% de LE, não houve diferença estatística entre fêmeas recuperadas. Os

achados sugerem resistência da cepa R1 a OXA.

Estudos realizados por Cioli et al (1992) revelaram que a resistência à OXA é

controlada por um único gene autossômico recessivo. Posteriormente, associou-se

esta resistência a perda de uma enzima ativadora da droga – a sulfotransferase, que

está presente em S. mansoni sensíveis e ausentes em vermes resistentes.

Possivelmente, há uma inibição irreversível na síntese de DNA e RNA nos parasitos

38

susceptíveis enquanto nos resistentes esta inibição ocorra de modo reversível (Cioli

et al 1993).

Vários estudos são realizados na tentativa de entender os mecanismos de

resistência ao PZQ, porém estas investigações são dificultadas pela ausência de

uma clara compreensão dos mecanismos de ação desta droga (Redman et al 1996).

Estudos realizados por Willian et al (2001) demonstraram redução no dano ao

tegumento causado pelo PZQ em isolados de cepas menos susceptíveis a droga.

Na intenção de verificar se mutações nos genes que codificam as estruturas

dos canais dependentes de Ca2+ seriam os responsáveis por resistência de

algumas cepas de S. mansoni ao PZQ, Valle et al (2003) seqüenciaram os cDNAs

que codificam as subunidades SmCavbeta1 e SmCavbeta2 de cepas sensíveis e

resistentes mas não foram capazes de detectar diferenças significativas entre elas.

Também não foi possível detectarem diferenças quantitativas na expressão das

subunidades beta avaliando várias cepas e diferentes estágios de desenvolvimento

do parasito.

Para tratar vermes resistentes ao PZQ, a única alternativa disponível

atualmente é a OXA. Assim, pesquisa e desenvolvimento de novas drogas

esquistossomicidas é urgentemente necessário (Cioli 2000).

1.6 Efetividade de drogas esquistossomicidas no período pré-patente da

esquistossomose

A resposta do S. mansoni ao tratamento com esquistossomicidas durante os

estágios imaturos difere de acordo com a droga utilizada. Na literatura existem

poucos trabalhos sobre o tratamento da esquistossomose durante o período pré-

patente apesar de evidências demonstrarem que o tratamento poderia prevenir as

complicações da doença.

Sabe-se que o PZQ não apresenta a mesma eficácia durante o período pré-

patente da esquistossomose. Para estudar ação do PZQ nas formas juvenis de S.

mansoni, Gönnert & Andrews (1977) trataram camundongos infectados com 100-120

cercárias, com 1000 mg/kg de PZQ 4 horas antes ou após infecção obtendo o

percentual de redução de esquistossômulos de 98%. Quando a droga foi

administrada do 1º ao 7º dia de infecção, o percentual de redução de

esquistossômulos diminuiu de 78,5 para 69,4. Doses únicas de 1000 mg/kg

39

fornecidas no 14º, 21º, 28º, 35º ou 48º dias obtiveram percentual de cura de 31%,

50%, 17%, 71%e 95%, respectivamente.

Um trabalho realizado por Xiao et al (1985) sugeriu que a eficácia

antiparasitária de PZQ em diferentes estágios de desenvolvimento do S. mansoni

estaria relacionada principalmente a capacidade da droga de produzir lesão no

tegumento sendo necessário dose maior da droga para produzir dano mais grave.

Os vermes com lesões menos graves recuperavam seus movimento e migravam

novamente para veias mesentéricas.

Estudos in vitro realizados por Pica-Mattoccia & Cioli (2004) demonstraram

que esquistossômulos de S. mansoni aos 28 dias foram intensamente refratários a

altas concentrações de PZQ (80 µl ml-1 ou mais).

Grandière-Pèrez et al (2006) acompanharam um grupo de 18 turistas

infectados por Schistosoma haematobium. O grupo 1 composto de 8 pacientes

assintomáticos receberam PZQ 40 mg/kg por volta do 14º dia de infecção, o

segundo grupo com 4 pacientes também assintomáticos, receberam o mesmo

tratamento em média no 33º dia de infecção e o último grupo composto de 6

pacientes sintomáticos foram tratados em torno do 26º dia de infecção. Todos

pacientes do grupo 1 desenvolveram esquistossomose aguda semelhante a

apresentada pelo grupo sintomático, ao contrário do grupo 2 que não apresentou

sintomas agudos. Dos 18 pacientes acompanhados, 17 desenvolveram

esquistossomose crônica. Os autores concluem pela ineficácia do PZQ administrado

precocemente para prevenção da fase aguda e crônica da doença.

A OXA possui eficácia maior sobre formas juvenis de S. mansoni comparada

ao PZQ. Estudos realizados por Coelho et al (1993) revelaram eficácia da OXA

400mg/kg, em dose única oral administrada 24 horas após infecção experimental de

camundongos. A recuperação dos esquistossômulos realizada 4, 24, 48, 72 horas e

35 dias após tratamento demonstrou que a migração dos esquistossômulos da pele

aos pulmões foi prevenida, confirmando a eficácia da droga nesta fase da infecção.

Ainda Coelho et al (1998) testaram a eficácia da OXA 200 mg/kg no período

pré-patente em duas cepas (LE e R1) sendo uma delas (R1) conhecidamente

resistente na fase adulta. Tratamentos realizados em esquistossômulos de 1 e 5

dias obtiveram eficácia parcial em ambas cepas sem diferenças estatísticas entre

elas. Entretanto, quando o tratamento foi realizado no 25º dia de infecção a cepa LE

mostrou significativa redução na taxa de recuperação de vermes enquanto a cepa

R1 foi resistente ao tratamento.

40

Enk, Katz & Coelho (2008) relataram caso de duas famílias infectadas em

lagos contaminados, além de dois técnicos infectados acidentalmente em

laboratório. Todos foram tratados com OXA dose oral única de 50 mg/kg, com

exceção de uma pessoa. O tratamento preveniu o aparecimento de sinais e

sintomas patognomônicos da fase aguda, nenhum paciente teve complicações e

ninguém apresentou ovos nas fezes 50 dias após exposição. O paciente não tratado

teve a forma toxêmica da doença com febre, dor abdominal, diarréia, perda de peso

e foi então tratado com OXA 20 mg/kg.

Os derivados da Artemisina têm demonstrado boa atividade no tratamento da

esquistossomose, especialmente contra schistosomas imaturos (Cioli 1998). A

avaliação da efetividade do ART em estádios imaturos de S. mansoni foi estudada

por Shaohong et al (2006). Foi demonstrada atividade máxima alcançada nos

tratamentos realizados entre 14º-15º e 21º-22º de infecção quando o percentual de

redução de vermes foi de 93%. No estádio pulmonar (7º-8º dias após infecção)

também houve redução significativa de 41%. Em jovens adultos (35º-36º dias) o

percentual de redução de vermes encontrado foi de 46%.

Em estudos com Artemeter, Xiao et al (2004) encontraram como dose mínima

efetiva 200 mg/kg contra esquistossômulos de S. mansoni com 21 dias, resultando

num percentual de redução de vermes de 81%.

A associação entre drogas poderia ser uma alternativa na busca de uma

droga para o tratamento efetivo da fase inicial da esquistossomose. Campos et al

(1985) avaliaram os efeitos da associação OXA + PZQ no tratamento da

esquistossomose mansônica aos 23 dias de infecção. Foram testados a associação

OXA 50 mg/kg + PZQ 75 mg/kg, e as drogas OXA 50 mg/kg e PZQ 75 mg/kg

isoladamente. Em todos os grupos houve recolhimento de vermes adultos e

perfeitos, autores concluíram pela ineficácia dos tratamentos testados no período

pré-patente.

Botros et al (1989) compararam o efeito da combinação de OXA e PZQ

(ambas 1/3 da dose curativa) com a dose usual, dose reduzida e controle não

tratado, administrados 24 horas antes da infecção, 4 horas, 1, 2, 3, 4 e 5 semanas

após infecção. Animais que receberam a combinação obtiveram menores

recuperações de vermes, sendo maior eficácia quando administrada 4 horas após

infecção (96% redução vermes). Entretanto, valor similar foi encontrado com PZQ na

dose usual (94%) e mais eficaz que dose usual da OXA (89%). A recuperação de

41

vermes em camundongos que receberam a combinação foi significativamente

diferente em todos diferentes tempos de tratamento.

Silva et al (2003) estudaram o efeito terapêutico de OXA e PZQ durante

estágios imaturos do S. mansoni. Durante os 20 primeiros dias de infecção a OXA

apresentou baixo percentual de redução de vermes (28-34%). Entretanto, 30 dias

após exposição o percentual de redução de vermes foi de 86-100%. Para o PZQ a

eficácia foi de 48-52% para animais tratados até 10 dias após exposição a cercária,

reduzindo para 19% no 30º dia.

Evidências sugerem que as combinações PZQ e derivados da Artemisina são

promissoras (Utzinger et al 2003). O efeito da associação PZQ 75 mg/kg + Artemeter

150 mg/kg em camundongos infectados simultaneamente com esquistossômulos de

14 e 21 dias e vermes adultos de S. mansoni foi estudado por Utzinger et al (2001).

Os tratamentos com drogas isoladas obtiveram taxa de redução de vermes de 2%

para PZQ, 66 % para Artemeter e 77 % para associação quando as drogas foram

administradas juntas. Quando a associação foi administrada com intervalo de 6h, 1,

3 ou 7 dias a redução variou entre 68- 81% para administração iniciando com PZQ e

entre 81- 84% para administração iniciando com Artemeter. O aumento das

dosagens para 100 mg/kg de PZQ e 300 mg/kg Artemeter elevou a taxa de redução

de vermes a 36 e 76% para drogas isoladas respectivamente, e variou entre 92-

96% para administração iniciando por PZQ e entre 95- 99% quando administração

iniciou por Artemeter.

Estudos feitos por De Clercq et al (2000) mostraram que a associação PZQ

40 mg/kg (dose única) + ART 12 mg/kg (5 dias) aumentou significativamente o

número de indivíduos curados na quinta semana após tratamento quando

comparados as drogas isoladas, porém durante o acompanhamento dos pacientes,

a contagem de ovos recuperados nas fezes na décima - segunda e vigésima –

quarta semanas não diminuiu significativamente na combinação, se comparada ao

tratamento com PZQ isoladamente.

Outros schistosomas também apresentam susceptibilidade diferente durante

o periodo pré-patente. Em trabalho realizado por Botros et al (2005) utilizando

hamsters infectados com S. haematobium, cujos primeiros ovos aparecem nas

fezes em torno de 75 dias, foram tratados aos 35 dias após infecção apresentando

percentual de redução de vermes de 60,6- 68,0% para doses de 150- 250 mg/kg de

PZQ respectivamente. Porém o tratamento realizado aos 55 dias de infecção elevou

este percentual para 97,8- 99,6%, revelando-o completamente sensível. In vitro

42

vermes jovens (28-35 dias) demonstraram susceptibilidade muito menor ao PZQ,

entretanto, vermes com 49 dias ou mais a susceptibilidade não foi significativamente

diferente de vermes adultos.

Em estudos realizados com camundongos infectados com S. japonicum o

PZQ apresentou mais efetivo contra esquistossômulos tratados com dose de 400

mg/kg, 2-4 h antes da infecção com percentual de redução de vermes maior que

94%, em esquistossômulos de 28 dias e vermes adultos de 42 dias com percentuais

de redução de vermes de 47,2- 84,3 %, respectivamente. Porém, eficácia muito

pequena foi encontrada contra esquistossômulos de 3 a 21 dias (com percentuais de

redução de vermes entre 2,5- 3,7%) (Xiao et al 1987).

Com base nestas informações podemos perceber que o estudo da

susceptibilidade do parasito ao tratamento com as drogas esquistossomicidas na

fase imatura do ciclo do parasito demanda certo cuidado, uma vez que as

abordagens metodológicas utilizadas não foram padronizadas e, portanto resultaram

em conclusões às vezes conflitantes. Mas no geral, podemos observar que estudos

revelam maior resistência ao PZQ e maior susceptibilidade a OXA, principalmente no

início do período pré-patente. Verifica-se ainda boa eficácia terapêutica dos

derivados de Artemisina principalmente em esquistossômulos jovens, na maioria dos

artigos publicados.

Em nosso trabalho propomos contribuir para elucidar quais são os estádios

evolutivos dos esquistossômulos mais resistentes a ação do PZQ, OXA e ART em

dois períodos críticos na resposta a drogas esquistossomicidas, em torno do 15º e

21º dia após infecção.

Para tanto foi utilizado o schistograma que consiste em contar e classificar os

esquistossômulos recuperados com auxílio de microscópio estereoscópico,

classificando-os por critérios morfológicos baseados no desenvolvimento do intestino

sendo que as proporções de cada estádio evolutivo em todos os dias da fase pré-

patente já foram bem definidas por Barbosa et al (1978). Nosso trabalho teve o

objetivo de avaliar quais os estádios evolutivos durante a fase de esquistossômulos

são sensíveis ao tratamento específico, observando alterações nas proporções de

esquistossômulos recuperados e comparando-as com as proporções dos vermes do

controle não tratado. Foram utilizadas doses maiores que as doses efetivas usadas

na fase pós-postural uma vez que o S. mansoni é sabidamente menos susceptível

ao tratamento na fase pré-postural.

43

A carência de informações na literatura científica sobre o comportamento do

S. mansoni durante a fase pré-postural do ciclo justifica a realização de nosso

trabalho. Dessa forma, estes esclarecimentos poderiam contribuir para novas

abordagens na terapêutica experimental da esquistossomose nesta fase da

infecção, considerando que a cura nesta etapa vai abortar toda a patogenia

resultante da fase adulta do parasito que tem no ovo o elemento fundamental das

lesões, o granuloma esquistossomótico. Enk, Katz & Coelho (2008), Coelho, Enk &

Katz (inpress, 2009) enfatizam a necessidade de estudos visando estabelecer

esquemas terapêuticos para a cura da esquistossomose na fase pré-postural que

eliminaria as manifestações mais graves da fase pós-postural.

44

OBJETIVOS

45

2 Objetivo Geral

Avaliar a susceptibilidade de estádios de desenvolvimento do S. mansoni , na

fase de esquistossômulo, frente a diferentes drogas durante a fase pré-postural da

esquistossomose experimental.

2.1 Objetivos específicos

1- Verificar qual(ais) estádio(s) de maturação do parasito, durante a fase de

esquistossômulo é(são) mais ou menos susceptível(is) ao tratamento com PZQ,

OXA e ao ART através de avaliação de alterações no schistograma comparando

o perfil dos grupos tratados ao controle não tratado.

2- Verificar se o tratamento realizado no período pré-patente promove danos no

parasito interferindo no seu desenvolvimento posterior.

3- Avaliar através da marcação com sonda fluorescente, se o tratamento

realizado no período pré-patente promove danos no tegumento do parasito.

46

MATERIAIS E MÉTODOS

47

3 Materiais e Métodos

3.1 Parasitos

Foram utilizadas cercárias da cepa LE (Belo Horizonte) de S. mansoni, cujo

ciclo é mantido rotineiramente em caramujos da espécie Biomphalaria glabrata, e

camundongos albinos no Centro de Pesquisa René Rachou/ FIOCRUZ. O ciclo

evolutivo desta linhagem está sendo mantido a mais de 35 anos no Centro de

Pesquisas René Rachou.

3.2 Camundongos

Foram utilizados camundongos Mus musculus, albinos, sem linhagem

definida, fêmeas com aproximadamente dois meses de idade, pesando cerca de 20

g, nascidos e criados no Biotério de Criação do Centro de Pesquisa René Rachou/

FIOCRUZ.

Os animais utilizados em todos os experimentos foram mantidos no biotério

de experimentação, em gaiolas devidamente identificadas, alimentados com ração

comercial autoclavada e água ad libitum.

Os procedimentos realizados com os animais foram submetidos a Comissão

de Ética no Uso de Animais de Experimentação da Fundação Oswaldo Cruz

(CEUA/FIOCRUZ), e aprovados com licença de nº L-019/09.

3.3 Infecção

Os camundongos foram inoculados no dorso, individualmente, por via

subcutânea segundo Pellegrino & Katz (1968). A infecção foi realizada utilizando

uma seringa com volume ajustável sendo que a quantidade de cercárias a serem

inoculadas estava contida num volume máximo 0,5ml ou mínimo 0,2ml por

camundongo.

Para permitir a avaliação de alterações na distribuição dos esquistossômulos

nos vários estádios evolutivos, o número de cercárias inoculadas variou entre 50 ou

200 cercárias. Com intuito de minimizar a mortalidade dos camundongos foram

inoculadas cerca de 50 cercárias nos experimentos de longa duração cujos vermes

foram recuperados 100 dpi e nos outros experimentos foram inoculadas cerca de

200 cercárias.

48

3.4 Tratamento experimental

Os camundongos foram pesados individualmente e com a média de peso

obtida para cada grupo foram realizados cálculos da quantidade de droga a ser

pesada através de regras de três simples.

Os comprimidos de PZQ contendo 600 mg de substância ativa

(FIOCRUZ/Farmanguinhos lote nº 06122554 – validade 12/08) foram pesados

individualmente e uma regra de três simples foi usada para ajustar a quantidade a

ser pesada, considerando a presença dos excipientes. A seguir os comprimidos

foram triturados com grau e pistilo e a dose necessária para os tratamentos foi

pesada.

As cápsulas de OXA contendo 500 mg de substância ativa (Mansil® – Pifzer

S.A. lote nº 60442001- validade 02/2011) foram abertas para obtenção do pó e

pesadas individualmente; uma regra de três simples foi usada para ajustar a

quantidade a ser pesada considerando a presença dos excipientes.

O ART disponível já na forma de pó PA (registro 27354).

As drogas foram pesadas em balança analítica (Fabricante/ modelo: Mettler/

H10). PZQ e OXA foram diluídos em água destilada e homogeneizados em vórtex. O

ART foi diluído em solução de gelatina a 10% e homogeneizado em vórtex.

Os tratamentos foram administrados com auxílio de seringa de gavagem por

via oral, em dose única.

As drogas e dosagens utilizadas, bem como o dia de realização do tratamento

e o número de animais utilizados variou para cada experimento e está descrito

detalhadamente nos tópicos relacionados aos experimentos.

3.5 Perfusão – Obtenção de esquistossômulos ou vermes adultos

Nos experimentos de 1 a 8 foi empregada a técnica descrita por Pellegrino &

Siqueira (1956) que resumidamente consiste em: após expor o conteúdo visceral

dos camundongos que foram submetidos à eutanásia por fratura cervical; o fígado e

mesentério foram separados pela ligadura da veia renal e a veia porta foi

seccionada. Com auxílio de uma agulha, acoplada a um pipetador automático

(Brewer), injetou-se solução salina 0,85% heparinizada na aorta descendente

permitindo, assim, a perfusão do sistema porta e das veias mesentéricas,

recuperando-se os vermes presentes.

49

Para recuperar vermes adultos, o líquido coletado da perfusão foi filtrado em

tela plástica para placas de Petri e posterior contagem com auxílio de microscópio

estereoscópio.

No caso de obtenção de esquistossômulos foi utilizada a técnica de

separação descrita por Barbosa et al (1978) com adaptações. O líquido coletado da

perfusão em copos foi sedimentado por quinze minutos e então eliminado todo

sobrenadante deixando cerca de 35ml, que foram transferidos para tubos falcon de

40 ml e ficando novamente 15 minutos para sedimentação. Em seguida todo

sobrenadante foi eliminado e os 15 ml restantes transferidos para tubos tipo falcon

de 15 ml e centrifugados a 1000 rpm durante 2 minutos. Foi eliminado o

sobrenadante e aos 3 ml restantes foi adicionado solução salina a 0,85%. O

procedimento foi repetido 3 vezes e somente o sedimento ressuspenso em 3 ml foi

colocado em placa de petri para realização do schistograma.

3.6 Schistograma

O schistograma consiste em contar e classificar os esquistossômulos

recuperados com auxílio de microscópio estereoscópio. Critérios morfológicos são

usados para classificar o parasito em relação ao seu estágio, sendo estes baseados

no desenvolvimento do intestino do parasito após ingestão de sangue (Barbosa et al,

1978). O esquema representativo dos estádios evolutivos de esquistossômulos de

S. mansoni podem ser visualizados na fig. 2 pag. 22.

A classificação seguiu os critérios:

Esquistossômulos de estádio 1 são recém-chegados dos pulmões

apresentam somente uma pequena mancha escura que representa o

início do ceco. Este estágio tem uma curta duração.

Figura 7 - esquistossômulo 1º estádio

50

No estádio 2 a mancha escura agora bifurca, mas não ultrapassa o

acetábulo.


No estádio 3 a mancha escura bifurcada ultrapassa o acetábulo e se

religa depois dele.


No estádio 4 a mancha escura na porção reconectada começa crescer

para extremidade do parasito, mas não é maior que sua parte

bifurcada.


O 5º estádio possui o final ligado do ceco maior que a parte bifurcada,

mas é menor que três vezes seu tamanho final.

51

Figura 11- esquistossômulo 5º estádio

No estádio 6 encontramos adultos jovens e maduros. Seu ceco está

completamente desenvolvido, sendo três vezes maior que no 5º

estádio (Barbosa et al 1978).

Figura 12 - esquistossômulos de 3º, 2º e 4º estádio evolutivo.

3.7 Oograma

A técnica consiste em remover fragmentos do intestino (íleo terminal) após a

perfusão de cada animal, lavagem dos fragmentos com salina 0,85% para retirada

das fezes. Esses fragmentos são colocados em uma lâmina de vidro e uma lamínula

de plástico. A preparação é pressionada em uma prensa de ferro. As lâminas então

são levadas ao microscópio a fim de se verificar a presença de estádios de

desenvolvimento dos ovos em cada grupo.

3.8 Avaliação da susceptibilidade do S. mansoni à drogas durante o período

pré-patente da esquistossomose experimental

Para verificar como ocorrem as diferenças na susceptibilidade do S. mansoni

as drogas durante a fase pré-postural da esquistossomose, foi executado o modelo

experimental proposto que está descrito a seguir.

52

3.8.1 Experimentos 1 e 3: Avaliação do Schistograma e contagem de

vermes adultos provenientes de camundongos tratados com OXA,

ART e PZQ no 15º dia de infecção

Em cada um destes experimentos foram infectados subcutaneamente 100

camundongos fêmeas, pesando cerca de 20 gramas, com cerca de 200 cercárias da

cepa LE.

Quinze dias após infecção os animais foram divididos em 4 grupos de 25

animais cada, devidamente identificados. Os animais receberam tratamento via oral

individualmente e em dose única. Os seguintes esquemas terapêuticos foram

administrados:

Experimento 1: 200 mg/kg de OXA; 300 mg/kg de ART e 400 mg/kg de PZQ.


Em cada experimento um grupo não recebeu tratamento e foi mantido como controle

positivo de infecção.

Quadro 2 - Esquemas terapêuticos dos experimentos 1 e 3

Grupo Nº animais Dia do tratamento Tratamento

A 25 15º dpi OXA 200 mg/kg

B 25 15º dpi ART 300 mg/kg

C 25 15º dpi PZQ 400 mg/kg

Experimento 1

D 25 - Controle não tratado




Experimento 3


No vigésimo dia após infecção (quinto dia após tratamento), metade dos

camundongos de cada grupo foi submetido à eutanásia e realizada a perfusão do

sistema porta (Pellegrino & Siqueira, 1956) a fim de recuperar os esquistossômulos.

No quadragésimo segundo dia após infecção (e vigésimo sétimo dia após

tratamento), o restante dos camundongos foram perfundidos (Pellegrino & Siqueira,

1956) para recuperação de vermes adultos.

53

Os experimentos 1 e 3 acompanharam a seguinte cronologia:

1º dia 15º 20º 42º dia

(Tempo de infecção em dias)

1º dia infecção experimental

15º dpi realização dos tratamentos.

20º dpi realização de perfusão para coleta de esquistossômulos e avaliação

de schistograma.

42º dpi perfusão para recuperação de vermes adultos.

3.8.2 Experimentos 2 e 4: Avaliação do Schistograma e contagem de

vermes adultos recuperados de camundongos tratados com OXA,

ART e PZQ no 23º dia de infecção

Para cada um destes experimentos também foram infectados

subcutaneamente 100 camundongos fêmeas pesando cerca de 20 gramas, com

cerca de 200 cercárias da cepa LE.

Os procedimentos realizados nos experimentos 2 e 4 foram idênticos aos

realizados nos experimentos 1 e 3 diferenciando apenas o dia de realização do

tratamento. Os esquemas terapêuticos estão no quadro 2:



Em cada experimento um grupo não recebeu tratamento e foi mantido como controle

positivo de infecção.

54






Experimento 2


A 25 23º dpi OXA400 mg/kg



Experimento 4


No vigésimo-oitavo dia de infecção (quinto dia após tratamento), metade dos

camundongos de cada grupo experimental foi submetida à eutanásia para perfusão

do sistema porta, a fim de recuperar os esquistossômulos, em seguida foi realizada

a avaliação do schistograma.

No quadragésimo-segundo dia após infecção (décimo-nono dia após

tratamento), o restante dos camundongos foram perfundidos, para contagem de

vermes adultos recuperados.


1º dia 23º 28º 42º dia



23º dpi realização dos tratamentos.

28º dpi realização de perfusão para coleta de esquistossômulos e avaliação

de schistograma.

42º dpi perfusão para recuperação de vermes adultos.

55

3.8.3 Experimentos 5 e 6: Avaliação do Schistograma de

esquistossômulos recuperados de camundongos tratados com

associação ART + PZQ no 14º ou 21º dia de infecção

Em cada um destes experimentos foram infectados subcutaneamente 80

camundongos fêmeas pesando cerca de 20 gramas, com cerca de 200 cercárias da

cepa LE.

Os animais foram divididos em 7 grupos, devidamente identificados

recebendo tratamento via oral e em dose única. Os seguintes esquemas

terapêuticos foram administrados no 14º ou 21º dia após infecção:



A 11 14º dpi PZQ 400 mg/kg

B 11 14º dpi PZQ 800 mg/kg

C 11 14º dpi ART 300 mg/kg

D 11 14º dpi ART 600 mg/kg

E 12 14º dpi PZQ 400 + ART 300

F 12 14º dpi PZQ 800 + ART 600

Experimento 5

G 12 - Controle não tratado


A 11 21º dpi PZQ 400 mg/kg

B 11 21º dpi PZQ 800 mg/kg

C 11 21º dpi ART 300 mg/kg

D 11 21º dpi ART 600 mg/kg

E 12 21º dpi PZQ 400 + ART 300

F 12 21º dpi PZQ 800 + ART 600

Experimento 6

G 12 - Controle não tratado

Em cada experimento um grupo não recebeu tratamento e foi mantido como

controle positivo de infecção.

No quinto dia após tratamento (correspondente ao décimo-nono dia após

infecção no experimento 5 e vigésimo-sexto dia após infecção no experimento 6) foi

realizada a perfusão do sistema porta a fim de recuperar os esquistossômulos, em

seguida foi realizada a avaliação do schistograma.

56


Experimento 5

1º dia 14º 19º


Experimento 6

1º dia 21º 26º



14º ou 21º dpi realização dos tratamentos.

19º ou 26º dpi após tratamento realização de perfusão para coleta de

esquistossômulos e avaliação de schistograma.

3.9 Avaliação de vermes adultos recuperados após exposição à drogas

esquistossomicidas no período pré-patente

3.9.1 Experimentos 7 e 8 – Contagem de vermes adultos recuperados

aos 100 dias de infecção, de camundongos tratados com

diferentes esquemas terapêuticos no período pré-patente

Os procedimentos realizados nos 7º e 8º experimentos foram semelhantes,

variando a dose utilizada de cada medicamento. Para realização de cada um destes

experimentos foram infectados subcutaneamente 105 camundongos fêmeas

pesando cerca de 20 gramas, com cerca de 50 cercárias da cepa LE. Quatorze dias

após infecção foram separados 45 animais (para cada experimento) e divididos em 3

grupos de 15 animais cada, devidamente identificados. Os animais receberam

tratamento via oral individualmente e em dose única conforme os esquemas

terapêuticos:

Experimento 7: 200 mg/kg de Oxaminiquina; 300 mg/kg de Artesunato e 400 mg/kg

de Praziquantel.

57

Experimento 8: 400 mg/kg de Oxaminiquina; 600 mg/kg de Artesunato e 800 mg/kg

de Praziquantel.


Experimentos 7 e 8

Grupo Nº animais Dia do tratamento Tratamento exp. 7 Tratamento exp. 8

A 15 14º dpi OXA 200 mg/kg OXA 400 mg/kg

B 15 14º dpi ART 300 mg/kg ART 600 mg/kg

C 15 14º dpi PZQ 400mg/kg PZQ 800mg/kg

D 15 21º dpi OXA 200mg/kg OXA 400 mg/kg

E 15 21º dpi ART 300 mg/kg ART 600 mg/kg

F 15 21º dpi PZQ 400mg/kg PZQ 800mg/kg

G 15 - Controle não tratado Controle não tratado

No quadragésimo-segundo dia após infecção, os camundongos do grupo

controle foram perfundidos para contagem de vermes adultos recuperados. A

perfusão antecipada do controle não tratado foi necessária para minimizar o

sofrimento dos camundongos, que estavam infectados com cerca de 50 cercárias, e

evitar perda destes camundongos nestes experimentos de longa duração.

Os camundongos tratados foram submetidos à eutanásia por fratura cervical e

perfundidos cem dias após infecção (correspondente ao octogésimo-sexto dia após

tratamento no experimento 7 e septuagésimo-nono dia após tratamento no

experimento 8) para contagem de vermes adultos recuperados.

Os fígados dos camundongos foram esmagados entre duas placas de vidro e

observados quanto à presença de vermes mortos. Também foi realizada a técnica

do oograma.


1º dia 14º 21º 42º 100º



14º ou 21º dpi realização dos tratamentos.

58

42º dpi realização de perfusão dos grupos controle para coleta e contagem de

vermes adultos, avaliação de vermes mortos no fígado e realização do

oograma.

100º dpi perfusão dos grupos tratados para coleta e contagem de vermes

adultos, avaliação de vermes mortos no fígado e realização do oograma.

3.10 Efeitos do tratamento “in vivo” com OXA, ART e PZQ sobre o tegumento

de esquistossômulos de S. mansoni

3.10.1 Microscopia de Fluorescência

A fluorescência é um tipo de luminescência (emissão de luz) em que um

corpo absorve luz e após um curto intervalo de tempo re-emite essa luz.

Dependendo da fonte de energia, a luminescência pode ser do tipo

eletroluminescência, radioluminescência, quimioluminescência ou fotoluminescência,

onde a última, que é utilizada na microscopia de fluorescência, ocorre quando a

fonte de energia são fótons.

Os compostos químicos chamados fluoróforos ou sondas fluorescentes são

usados para produzir a fluorescência do material em estudo, permitindo visualização

de estruturas, compostos ou processos em curso.

3.10.2 Marcação dos parasitos com sonda fluorescente

Para avaliar se OXA, ART e PZQ promovem danos no tegumento de

esquistossômulos expostos as drogas no 14º e 21º dia de infecção, foram realizados

experimentos utilizando microscopia de fluorescência e como marcador de

fluorescência a sonda Hoechst 33258.

Hoechst 33258 É conhecido que a sonda Hoechst 33258 (fig. 13) possui a propriedade de se

ligar ao DNA.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/2b/Hoechst_33258_Structure.gif&imgrefurl

Figura 13 - Estrutura química sonda Hoechst 33258

59

Entretanto, por se tratar de uma molécula hidrofílica só é capaz de se difundir

para o interior das células na presença de lesões e portanto pode ser usada como

indicador da integridade de membrana (Oliveira 2005).

Nestes experimentos foram observados presença ou não de dano na

membrana de esquistossômulos tratados com OXA, ART ou PZQ , através da

fluorescência emitida pela sonda Hoechst 33258 quando esta foi capaz de se ligar

ao DNA. A fluorescência dos esquistossômulos submetidos à ação das drogas foi

comparada qualitativamente a observada em esquistossômulos recuperados de

grupos controle não tratados.

Hoecsht 33258 produzida por Sigma Chemical Co.St. Louis, MO, USA. Pó

diluido em água destilada para solução estoque de 10 mg/mL.

3.10.3 Perfusão – Obtenção de esquistossômulos para uso nas técnicas

de fluorescência

Foi empregada a técnica de perfusão retrógada do fígado descrita por

Smithers & Terry (1965), resumidamente: os camundongos foram submetidos à

eutanasia por “overdose” de pentobarbital sódico 3% (Hypnol®), administrado por via

intraperitoneal (± 0,3mL). Posteriormente, as vísceras abdominais e o coração foram

expostos, a veia porta foi seccionada com o auxílio de uma agulha conectada a uma

seringa de 10mL. Imediatamente, na parte inferior dos ventrículos do coração, foi

injetado meio de cultura RPMI – 1640, pH 7,4 heparinizado, obtendo-se assim, os

parasitos que foram coletados em cálices de sedimentação. Para separação dos

esquistossômulos, o líquido coletado foi sedimentado por quinze minutos, retirado o

sobrenadante e transferidos os 15 ml restantes para tubos tipo falcon. Os tubos

foram centrifugados a 1000 rpm por 1 minuto, o sobrenadante foi coletado e aos 3

ml restantes foi adicionado meio de cultura RPMI – 1640. O procedimento foi

repetido 4 vezes. A última lavagem foi realizada com meio de cultura RPMI – 1640

acrescido de 5% de soro fetal bovino (SFB).

RPMI – 1640 produzido por Sigma- Aldrich Chemical Co.St Louis, MO, USA.

Pó diluído em água destilada e pH ajustado para 7,2. Lote 026K83582.

60

3.10.4 Experimentos 9 e 10 – Tratamento “in vivo” com OXA, ART e PZQ

e marcação com sonda Hoechst para avaliação de dano no

tegumento de vermes imaturos aos 14 e 21 dias de infecção

Os procedimentos realizados nos experimentos 9 e 10 foram idênticos,

distinguindo-se apenas o dia de realização dos mesmos após infecção e por isso

serão descritos conjuntamente.

Para cada experimento foram utilizados quatorze camundongos infectados a

14 ou 21 dias, com cerca de 200 cercárias de S. mansoni e foram divididos em sete

grupos que receberam tratamento conforme quadro a seguir.


Grupo Nº de animais Dia do tratamento Droga/Dosagem

A 2 14º OXA 200 mg/kg

B 2 14º OXA 400 mg/kg

C 2 14º ART 300 mg/kg

D 2 14º ART 600 mg/kg

E 2 14º PZQ 400 mg/kg

F 2 14º PZQ 800 mg/kg

Experimento 9

G 2 -- Controle não

tratado

Grupo Nº de animais Dia do tratamento Droga/Dosagem

A 2 21º OXA 200 mg/kg

B 2 21º OXA 400 mg/kg

C 2 21º ART 300 mg/kg

D 2 21º ART 600 mg/kg

E 2 21º PZQ 400 mg/kg

F 2 21º PZQ 800 mg/kg

Experimento 10

G 2 -- Controle não

tratado

Os esquistossômulos recuperados após perfusão retrógrada foram mantidos

em 1mL de meio de cultura RPMI – 1640 acrescido de 5% de SFB onde

acrescentou-se 5μL da sonda Hoechst 33258 (solução estoque 10mg/mL) e os

vermes foram incubados por 60 minutos em estufa 37°C e 5% de CO2. Os vermes

foram lavados por cinco vezes com meio de cultura sendo mantidos por 15 minutos

para sedimentação entre cada troca de meio de cultura. Finalmente foram

61

transferidos para lâminas delimitadas com vaselina para evitar o extravasamento

dos vermes e levados para observação em microscópio de fluorescência (K- Zeiss)

utilizando-se de filtro com DAPI - excitação/emissão máxima da Hoechst 33258

352/455 nm.

3.11 Imagens fotográficas

Imagens registradas com máquina fotográfica digital Cannon Rebel modelo

EOS 300D.

3.12 Análise estatística

A princípio foi verificado se os dados eram paramétricos ou não paramétricos

através testes de normalidade em todos os resultados obtidos. Logo após esta

análise era feita a opção pelo teste estatístico mais adequado.

Quando os dados se apresentavam paramétricos, eram aplicados testes de

análise de variância- ANOVA seguida das comparações múltiplas de Tukey com o

objetivo de comparar os resultados dos grupos controles e cada um dos grupos

tratados. Também foram comparadas a eficácia dos grupos tratados entre si.

Para dados não paramétricos foram aplicados os testes de Kruskal Wallis,

seguido das comparações múltiplas de Dunn’s para comparar os resultados dos

grupos controles e cada um dos grupos tratados. Também foram comparadas a

eficácia dos grupos tratados entre si.

Todas as análises deste estudo foram realizadas com 5% de significância,

utilizando-se o programa estatístico PRISMA 4.2. Testes de normailidade foram

realizados no programa MINITAB.

62

Os resultados dos experimentos 1 a 5 serão apresentados em duas partes: A- Distribuição média de vermes no schistograma após diferentes esquemas

terapêuticos.

A avaliação do schistograma foi realizada através da observação e contagem

de esquistossômulos, seguida da média vermes recuperados em cada estádio

evolutivo para cada grupo de tratamento comparado com controle não tratado e

posteriormente entre os diferentes grupos de tratamento.

B- Total de vermes adultos recuperados e percentuais de redução de vermes

após diferentes esquemas terapêuticos.

O percentual de redução de vermes adultos recuperados foi calculado de

acordo com a fórmula:

%RV = 100 – VT x 100

VC

Onde %RV é percentual de redução de vermes, VT é o número de vermes

recuperado no grupo tratado e VC é o número de vermes recuperados no grupo

controle não tratado.

63

RESULTADOS

64

4 Resultados

4.1 Avaliação da susceptibilidade do S. mansoni à drogas durante o período

pré-patente da esquistossomose experimental

4.1.1 Experimento 1-a

Tabela 1 - Distribuição de esquistossômulos no schistograma recuperados de

camundongos tratados com OXA 200 mg/kg, ART 300 mg/kg ou PZQ 400 mg/kg.

Tratamento realizado no 15º dia após infecção com cerca de 200 cercárias e

submetidos à eutanásia no 20º dia de infecção (5 dias após tratamento).

Grupos de tratamento

Número de animais

Tratados - Examinados

Média

de Vermes

Distribuição média de vermes por estádio evolutivo (nº absolutos) 1 2 3 4 5 6 NI.

Total

Controle 13 12 29,1 0,9(11) 2,1(25) 7,7(92) 17,2(206) 0,1(1) 0(0) 1,2(14) 349

OXA 200 mg/kg

13 13 12,5* 0,1(1) 1,5(20) 4,6(60) 6,2(81)** 0(0) 0(0) 0,1(1) 163**

ART 300 mg/kg

13 13 10* 0,4(5) 0,9(11) 1,1 (14)*** 5,8(75) ** 0,2(3) 0(0) 1,7(0) 130***

PZQ 400 mg/kg

13 13 16,5 0,2(2) 1,0(13) 4,0(52) 11,2(145) 0,2(2) 0(0) 0,1(1) 215

NI. -Esquistossômulo não identificado

Diferença em relação ao controle não tratado * p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001

Os vermes imaturos que possuíam o intestino deteriorado e não permitiram

sua classificação por estádio evolutivo foram classificados como NI, ou seja,

esquistossômulo não identificado. Neste experimento não houve diferença

estatísticamente significativa entre média de esquistossômulos NI dos grupos

tratados entre si ou em relação ao controle não tratado.

Análises estatísticas demonstraram que o grupo tratado com PZQ 400 mg/kg

não apresentou redução estatísticamente significativa na média de vermes

recuperados em comparação com o controle não tratado.

O grupo tratado com OXA 200 mg/kg apresentou redução estatísticamente

significativa no número de esquistossômulos recuperados no 4º estádio em relação

ao mesmo estádio do grupo controle. Esta redução foi suficiente para acarretar

diferença estatísticamente significativa no número total de esquistossômulos

recuperados deste grupo em comparação com o grupo controle.

Da mesma forma que OXA 200 mg/kg, o grupo tratado com ART 300 mg/kg

mostrou diferenças estatísticamente significativas entre 4º estádio e controle. Além

disso, houve redução estatísticamente significativa no número de esquistossômulos

do 3º estádio em relação ao controle não tratado.

65

Ao comparar o perfil dos tratamentos entre si, ART 300 mg/kg apresentou

redução de esquistossômulos no 3º estádio estatísticamente significativa em relação

ao tratamento com OXA 200 mg/kg e PZQ 400 mg/kg. O esquema terapêutico

proporcionou maior redução no número total de esquistossômulos em relação aos

outros esquemas utilizados (dados não foram sinalizados na tabela).

* p< 0,05 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle não tratado.

Gráfico 1 - Gráfico representativo das médias de vermes imaturos recuperados dos

grupos experimentais e grupo controle e os respectivos desvios padrão obtidos no

experimento 1- a.

4.1.2 Experimento 1- b

Tabela 2 - Percentual de redução de vermes adultos recuperados de camundongos

tratados com OXA 200 mg/kg, ART 300 mg/kg ou PZQ 400 mg/kg


submetidos à eutanásia 42 dias após infecção.

Grupos de Tratamento

Nº de animais Tratados-

Examinados

Média de vermes

Número de vermes (% de redução) Macho Fêmea Total

Percentual de vermes imaturos

Controle 13 13 58,4 386 355 759 (18) 2,4

OXA 200 mg/kg

13 12 33,7* 194 (49,7)** 191 (53,8)* 404 (46,8)* (19) 4,7

ART 300 mg/kg

13 13 22,5* 129 (66,5)** 134 (66,5)*** 293 (61,4)*** (45) 15,4*

PZQ 400 mg/kg

13 12 41,2 244 (36,8) 223 (37,2) 506 (33,3) (39) 7,7


* *

66

O tratamento com PZQ 400 mg/kg no 15º dia de infecção não foi capaz de

reduzir significativamente o número de vermes adultos recuperados, dado que

reforça o resultado encontrado no schistograma, quando PZQ 400 mg/kg não foi

capaz de reduzir o número de esquistossômulos recuperados.

Em contrapartida, os grupos tratados com OXA 200 mg/kg e ART 300 mg/kg

apresentaram redução de vermes estatísticamente significativas em relação ao

controle, tanto nos vermes machos quanto nas fêmeas.

O grupo tratado com ART 300 mg/kg apresentou maior percentual de vermes

imaturos, além de maior redução na carga de vermes recuperados.

controle OXA 200mg/kg ART 300mg/kg PZQ 400mg/kg05

101520253035404550556065

méd

ia d

e ve

rmes

viv

os

* p< 0,05 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle.



experimento 1- b.

*

*

67

4.1.3 Experimento 2- a

Tabela 3 - Distribuição de esquistossômulos recuperados de camundongos tratados

com OXA 200 mg/kg, ART 300 mg/kg ou PZQ 400 mg/kg.




Número de animais


Média de Vermes

Distribuição média de vermes por estádio evolutivo (nº absolutos) 1 2 3 4 5 6 NI

Total

Controle 13 11 53,8 0(0) 0,2(2) 0,6(7) 4,8(53) 17,7(195) 30,5(335) 0(0) 592

OXA 200 mg/kg

13 12 37,0 0(0) 0(0) 0,3(3) 5,4(65) 14,2(170) 17,4(209)* 0(0) 444

ART 300 mg/kg

13 13 27,8* 0(0) 0,1(1) 0,1(1) 3,6(47) 8,8(114)* 15,3(198)* 0(0) 361*

PZQ 400 mg/kg

13 13 42,7 0(0) 0(0) 0,9(11) 5,8(75) 16,4(213) 19,8(257) 0(0) 556



Os resultados demonstraram que o grupo tratado com PZQ 400 mg/kg não

promoveu redução no total de esquistossômulos recuperados, bem como na média

de vermes recuperados em nenhum dos estádios evolutivos, uma vez que não

houve diferenças significativas entre este grupo e o controle não tratado.

O grupo tratado com OXA 200 mg/kg apresentou redução significativa no

número de esquistossômulos recuperados no 6º estádio em relação ao mesmo

estádio do grupo controle. Esta redução não foi suficiente para acarretar diferença

estatísticamente significativa no número total de esquistossômulos recuperados

deste grupo e os do grupo controle.

O grupo tratado com ART 300 mg/kg mostrou diferenças significativas no 5º

estádio comparado com o controle. Também houve redução significativa no número

de esquistossômulos do 6º estádio em relação ao controle não tratado. O esquema

terapêutico proporcionou redução no total de esquistossômulos em relação ao

controle, diferentemente do resultado encontrado no tratamento com os outros

esquemas utilizados.

68

controle OXA 200 mg/kg ART 300 mg/kg PZQ 400mg/kg 05

101520253035404550556065

méd

ia d

ees

qu

isto

ssô

mu

los




experimento 2- a.



tratados com OXA 200 mg/kg, ART 300 mg/kg ou PZQ 400 mg/kg.





Examinados

Média de

Vermes


Percentual de vermes

imaturos

Controle não tratado

12 12 70,6 381 450 847 (16) 1,9

OXA 200 mg/kg

12 12 52,4 228 (39,6) 273 (39,3)* 629 (25,7) (128) 20,3*

ART 300 mg/kg

12 11 43,7* 200 (47,5) 248 (44,9)* 481 (43,2)* (33) 6,9

PZQ 400 mg/kg

12 12 52,4 277 (27,3) 282 (37,8)* 629 (25,7) (70) 11,1*


Análises estatísticas demonstraram que tanto o tratamento com PZQ 400

mg/kg quanto com OXA 200 mg/kg no 23º dia de infecção não foi capaz de reduzir

significativamente o total de vermes adultos recuperados, embora ambos tenham

causado redução significativa do número de vermes fêmeas. Estes esquemas

terapêuticos ocasionaram maior número de vermes ainda imaturos em relação ao

controle.

*

69

Em contrapartida, o tratamento com ART 300 mg/kg foi capaz de promover

uma redução de vermes estatísticamente significativa em relação ao controle,

reduzindo principalmente o número de fêmeas. Este grupo não apresentou diferença

em relação ao número de vermes imaturos comparado ao controle.

controle OXA 200 mg/kg ART 300 mg/kg PZQ 400 mg/kg0

10

20

30

40

50

60

70

80

méd

ia d

e ve

rmes

viv

os

recu

per

ado

s




experimento 2- b.





submetidos a eutanásia no 20º dia de infecção (5 dias após o tratamento).


Número de animais


Média

de Vermes

Distribuição média de vermes por estádio evolutivo (nº absolutos) 1 2 3 4 5 6 NI

Total

Controle 13 11 49,4 0,5(5) 3,6(40) 9,3(102) 34,6(381) 0,3(3) 0(0) 1,1(12) 543

OXA 400 mg/kg

13 9 33,3* 0,6(5) 3,7(33) 8,1(73) 19(171)** 0(0) 0(0) 2(18) 300*

ART 600 mg/kg

13 12 24,1*** 1,5(18) 4,6(55) 2,9(35)** 8,6(103)*** 0(0) 0(0) 6,5(78)* 289***

PZQ 800 mg/kg

13 9 28,9* 0,4(4) 4(36) 8,6(77) 15,8(142)** 0(0) 0(0) 0,1(1) 260*



*

70

Em todos os grupos foi observado redução no número de vermes

estatísticamente significativas em relação ao controle. Porém OXA 400 mg/kg e PZQ

800 mg/kg atuaram reduzindo significativamente apenas o 4º estádio em relação ao

controle.

Enquanto isso, ART 600 mg/kg foi capaz de promover diferenças

significativas nos 3º e 4º estádios evolutivos, além de aumentar o número de

esquistossômulos com o intestino deteriorado sendo computados como

esquistossômulos não identificados.

Comparando os esquemas terapêuticos entre si, ART 600 mg/kg promoveu

redução significativa do 3º estádio em relação ao PZQ 800 mg/kg e ainda

apresentou diferença em relação ao número de esquistossômulos não identificados

comparado a OXA 400 mg/kg e PZQ 800 mg/kg (dados não sinalizados na tabela).


10152025303540455055

méd

ia d

ees

qu

isto

ssô

mu

los




experimento 3- a.

* *

*

71








Examinados

Média de

vermes



Controle 15 14 97,5 662 682 1365 (21) 1,5

OXA 400 mg/kg

15 15 40,8*** 233(64,8)*** 270(60,4)*** 612 (55,2)*** (104) 16,8**

ART 600 mg/kg

15 15 35,1*** 241(63,6)*** 261(61,7)*** 526 (61,5)*** (24) 4,6

PZQ 800 mg/kg

15 14 53,8* 339(48,8)* 362(46,9)* 753 (44,8)* (52) 6,9


O aumento na dose das três drogas permitiu que todos os tratamentos

reduzissem o percentual de vermes adultos recuperados. Foram encontradas

diferenças estatísticamente significativas entre o número de vermes machos e

fêmeas dos grupos tratados em relação ao controle não tratado.

O grupo tratado com OXA 400 mg/kg apresentou percentual de vermes

imaturos significativamente maior que o controle.

72


102030405060708090

100110

méd

ia d

e ve

rmes

viv

os

recu

per

ado

s

* p< 0,05 *** p< 0,001 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle.



experimento 3- b.

Deve-se ressaltar que os vermes adultos recuperados do grupo tratado com OXA

400 mg/kg foram menores que os vermes do grupo controle, as fêmeas na sua

maioria com aspecto de imaturas, machos apresentando manchas escuras. Também

houve presença de vermes ainda nos 4º e 5º estádios evolutivos (fig.14).

(a) (b) (c)

Figura 14 - Vermes recuperados do grupo tratado com OXA 400 mg/kg no 15º dpi.

(a) fêmea visivelmente menor que recuperadas no controle. (b) Macho pequeno e com machas

escuras. (c) Macho apresentando manchas escuras ao lado de esquistossômulo no início do 5º

estádio.

Vermes recuperados de grupo tratado com ART 600 mg/kg também se

apresentaram menores que os vermes recuperados no grupo controle. As fêmeas

apresentaram aspectos de imaturas (fig. 15).

*

***

***

73

(a) (b)

Figura 15 - vermes recuperados do grupo tratado com ART 600 mg/kg no 15º dpi.

(a) fêmea pequena e com intestino claro e (b) macho pouco desenvolvido.

Os vermes recuperados dos animais tratados com PZQ 800 mg/kg

apresentaram aspecto semelhante ao controle (fig.16).

(a) (b) (c)

Figura 16 – vermes recuperados do grupo tratado com PZQ 800 mg/kg no 15º dpi e controle não

tratado

(a) fêmea aparentemente normal (b) casal recuperado grupo tratado com PZQ 800 mg/kg (c) fêmea

recuperada do grupo controle.





submetidos a eutanásia no 28º de infecção (5 dias após tratamento).


Número de animais


Média

de Vermes

Distribuição média de vermes por estágio evolutivo (nº absolutos) 1 2 3 4 5 6 NI

Total

Controle não 12 12 59,1 0(0) 0,1(1) 0,8(9) 6,2(74) 24,8(298) 26,7(320) 0,6(7) 709

OXA 400 mg/kg

12 12 28,9*** 0(0) 0,1(1) 1,2(14) 8(96) 12,1(145)** 3,8(45)*** 3,8(46) 347***

ART 600 mg/kg

12 12 25,8*** 0(0) 0,1(1) 0,1(1) 1,3(15)** 8,3(99)*** 6,1(73)*** 10(120)** 309***

PZQ 800 mg/kg

12 12 40,4** 0(0) 0,3(3) 0,6(7) 4,3(51) 24,8(297) 10,4(125)*** 0,2(2) 485**



74

As comparações estatísticas para avaliar a eficácia do tratamento com OXA

400 mg/kg, ART 600 mg/kg e PZQ 800 mg/kg no 23º dia de infecção, foram

realizados da mesma maneira que nos experimentos anteriores.

De fato, o aumento da dose permitiu que todos os grupos promovessem

redução no número de vermes estatísticamente significativas em relação ao

controle. Porém, o perfil de atuação das três drogas foi diferente. PZQ 800 mg/kg

atuou reduzindo significativamente apenas o 6º estádio em relação ao controle.

OXA 400 mg/kg gerou diferenças entre 5º e 6º estádio em relação ao controle.

Enquanto isso, ART 600 mg/kg foi capaz de promover diferenças significativas nos

4º , 5º e 6º estádios evolutivos, além de aumentar o número de esquistossômulos

não identificados.

Na comparação entre os esquemas terapêuticos, ART 600 mg/kg apresentou

diferença significativa no 4 º estádio evolutivo em relação a OXA 400 mg/kg e ainda

diferença no 5º estádio e esquistossômulos não identificados se comparado ao PZQ

800 mg/kg kg (dados não sinalizados na tabela).


101520253035404550556065

méd

ia d

ees

qu

isto

ssô

mu

los

** p< 0,01 *** p< 0,001 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle.



experimento 4- a.

***

**

***

75







Os tratamentos com OXA 400 mg/kg e ART 600 mg/kg administrados no 23º

dia após infecção foram capazes de reduzir significativamente o número total de

vermes recuperados, bem como o número de machos e fêmeas. Estes grupos

também revelaram maior número de vermes ainda imaturos.

No grupo tratado com PZQ 800 mg/kg não ocorreu diferença significativa no

número de vermes recuperados em relação ao controle.

Comparações entre os esquemas terapêuticos revelam diferenças

significativas entre total de vermes recuperados, totais de machos e fêmeas do

grupo tratado com OXA 400 mg/kg, comparado ao grupo tratado com PZQ 800

mg/kg. ART 600 mg/kg apresentou diferença significativa em relação ao grupo

tratado com PZQ 800 mg/kg na recuperação de vermes fêmeas (dados não

sinalizados na tabela).



Examinados

Média de vermes

Nº de vermes (% de redução ) Macho Fêmea Total


Controle 14 13 83,8 577 497 1089 (15) 1,4

OXA 400 mg/kg

14 13 20,9*** 64(88,9)*** 113(77,3)*** 272(75,0)*** (95) 34,9***

ART 600 mg/kg

14 14 32,7*** 141(75,6)*** 132(73,4)*** 458(57,9)*** (185)40,4***

PZQ 800 mg/kg

14 12 56,8 329(42,9) 314(36,8) 681(37,5) (38) 5,6

76

controle OXA 400 mg/kg ART 600 mg/kg PZQ 800 mg/kg

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

méd

ia d

e ve

rmes

recu

per

ado

s

*** p< 0,001 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle.



experimento 4.

O aspecto debilitado apresentado pelos vermes recuperados dos grupos

tratados no 15º dpi se repetiu quando o tratamento foi realizado no 23º dpi (fig. 17).

Vermes machos recuperados do grupo tratado com OXA 400 mg/kg apresentavam

“bolhas” escuras no tegumento. Os vermes recuperados no tratamento com ART

600 mg/kg tinham aspecto de frágeis, pequenos, fêmeas com intestino claro.

Parasitos recuperados do grupo tratado com PZQ 800 mg/kg eram semelhantes ao

controle não tratado.

(a) (b) (c)

Figura 17– vermes recuperados de grupos tratados com OXA 400 mg/kg e ART 600 mg/kg

(a) macho recuperado do grupo tratado com OXA 400 mg/kg apresentando “manchas” escuras no

seu tegumento (b) macho recuperado do grupo tratado com ART 600 mg/kg, pequeno, claro (c)

fêmeas recuperadas do grupo tratado com ART 600 mg/kg, pequenas e com intestino claro.

***

***

77

4.1.9 Experimento 5

Tabela 9 - Distribuição de esquistossômulos no schistograma recuperados de

camundongos tratados com ART 300 ou 600 mg/kg; PZQ 400 ou 800 mg/kg; ART

300 + PZQ 400 mg/kg; e ART 600 + PZQ 800 mg/kg.




Número de animais

tratados- examinados

Média de

Vermes

Distribuição média de vermes por estágio evolutivo (nº absolutos)

1 2 3 4 5 6 NI

Total

Controle 12 12 43,5 0,3(3) 1,7(20) 8,1(97) 32,4(386) 1(12) 0 0,3(4) 522

PZQ 400 mg/kg

11 10 29,3 0,1(1) 1,6(16) 8,0(80) 22,0(220) 0,1(1) 0 0,5(5) 293

PZQ 800 mg/kg

11 11 23,5 *** 0,2(1) 1,1(12) 7,3(80) 12,7(140)*** 1,6(17) 0 0,7(8) 258***

ART 300 mg/kg

11 10 17,9 *** 0,2(2) 1,5(15) 2,9(29)** 9,2(92)*** 0,1(1) 0 3,3(33) 172***

ART 600 mg/kg

11 9 7,7 *** 0,1(1) 1,6(14) 0,6(5)*** 2,7(24)*** 0,1(1) 0 2,7(24) 69***

PZQ 400+ ART300

12 12 9,8 *** 0,3(3) 1,7(20) 2,9(35)* 4,2(50)*** 0 0 0,8(10) 118***

PZQ 800 + ART 600

12 11 9,1 *** 0,1(1) 0,6(6) 1,7(19)** 5,1(56)*** 0,1(1) 0 1,6(18) 101***

NI. Esquistossômulos não identificados


Os grupos tratados com ART 300 ou 600 mg/kg e PZQ 400 ou 800 mg/kg

apresentaram o mesmo perfil relatado nos experimentos anteriores para animais

tratados aos 15 dias após infecção.

A associação de ART 300 + PZQ 400 mg/kg promoveu redução significativa

nos esquistossômulos de 3º e 4º estádios evolutivos, bem como no total de

esquistossômulos recuperados, comparada ao controle não tratado.

Associação ART 300 + PZQ 400 teve vantagem terapêutica em relação ao

PZQ 400 mg/kg isoladamente, pois apresentou redução significativa nos 3º e 4º

estádios evolutivos e no total de esquistossômulos. No entanto, a associação não

apresentou diferença estatistísticamente significativa nos resultados obtidos em

relação ao tratamento com ART 300 mg/kg isoladamente.

Os resultados obtidos com a associação ART 300 + PZQ 400 mg/kg não

demonstraram diferença significativa na redução total de esquistossômulos nem nos

estádios evolutivos se comparado ao PZQ 800 mg/kg e ao ART 600 mg/kg

isoladamente.

78

Associação ART 600 + PZQ 800 apresentou redução significativa nos 3º e 4º

estádios evolutivos e no total de esquistossômulos em relação ao grupo controle não

tratado. Entretanto a associação não apresentou diferença estatistísticamente

significativa nos resultados obtidos em relação ao tratamento com ART 600 mg/kg

ou PZQ 800 mg/kg utilizados isoladamente.

Não houve diferença estatísticamente significativa entre os dois tratamentos

com as associações. As comparações dos grupos entre si não foram sinalizadas nas

tabelas.

1 2 3 4 5 6 705

10152025303540455055

grupos de tratamento

méd

ia d

ees

qu

isto

ssô

mu

los

*** p< 0,001 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle.



experimento 5 para avaliação da associação ART + PZQ administrada no 15º dia

após infecção.

***

*** *** ***

***

Tratamentos: 1 – controle não tratado 2 - PZQ 400 mg/kg 3 - PZQ 800 mg/kg 4 - ART 300 mg/kg 5 - ART 600 mg/kg 6 - PZQ 300 + ART 600 7 - PZQ 800 + ART 600

79

4.1.10 Experimento 6

Tabela 10 - Distribuição de esquistossômulos recuperados de camundongos

tratados com ART 300 ou 600 mg/kg; PZQ 400 ou 800 mg/kg; ART 300 + PZQ 400

mg/kg; e ART 600 + PZQ 800 mg/kg.


submetidos a eutanásia no 26º dia de infecção (5 dias após tratamento).


Número de animais

tratados- examinados

Média de

Vermes

Distribuição média de vermes por estádio evolutivo (nº absolutos)

1 2 3 4 5 6 NI

Total

Controle 11 11 61 0 0,2(2) 2,0(22) 13,2(145) 23,1(254) 21,5(236) 1,1(12) 671

PZQ 400 mg/kg

11 10 57,6 0 1,0(10) 2,2(22) 20,1(201) 25,6(256) 7,9(79) 0,8( 8) 576

PZQ 800 mg/kg

11 11 36,0* 0 0,1(1) 3,5(38) 12,3(135) 16,5(181) 3,5(38)* 0,3(3) 396*

ART 300 mg/kg

11 11 26,9 ** 0 0,1(1) 0,4(4) 2,7(30) 7,9(87)* 3,9(43)** 1,9(131)** 296**

ART 600 mg/kg

12 12 20,6 *** 0 0,2(2) 0 3,2(38)*** 7,3(87)* 1,0(12)*** 9,0(108)** 247***

PZQ 400+ ART 300

12 11 29,3 ** 0 0,3(3) 1,0(11) 7,9(87) 8,1(89)* 1,4(15)** 0,6(117)** 322**

PZQ 800+ ART 600

12 11 19,2 *** 0 0,1(1) 0,8(9) 3,8(42)* 7,5(82)* 1,6(17)*** 5,5(60)* 211***

NI. Esquistossômulos não identificados


Os grupos tratados com ART 300 ou 600 mg/kg e PZQ 400 ou 800 mg/kg

apresentaram o perfil relatado nos experimentos anteriores para animais tratados no

23º dia após infecção.

A associação ART 300 + PZQ 400 mg/kg levou a redução de

esquistossômulos de 5° e 6º estádios e, consequentemente, do total de

esquistossômulos recuperados. Também foi observado aumento significativo de

esquistossômulos com intestino danificado.

Esta associação apresentou redução estatísticamente significativa no 5º

estádio e no número total de vermes em relação ao grupo tratado com PZQ 400

mg/kg. Também promoveu aumento no número de esquistossômulos não

identificados comparado aos grupos tratados com PZQ 400 mg/kg e PZQ 800 mg/kg

isoladamente.

Quando a dose na associação foi aumentada para ART 600 + PZQ 800 mg/kg

houve redução estatísticamente significativa no número total esquistossômulos

recuperados, bem como no número de vermes de 4º, 5º e 6º estádios.

80

A associação ART 600 + PZQ 800 mg/kg levou a redução estatísticamente

significativa de esquistossômulos de 4º, 5º estádio e no total recuperado em relação

aos tratados com PZQ 400 mg/kg.

As associações apresentram vantagem terapêutica apenas em relação ao

tratamento com PZQ 400 mg/kg isoladamente. Não houve diferença

estatísticamente significativa entre os outros tratamentos isolados com as

associações. As comparações dos grupos entre si não foram sinalizadas na tabela.

1 2 3 4 5 6 70

10

20

30

40

50

60

70


méd

ia d

ees

qu

ito

ssô

mu

los

* p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001 diferença estatísticamente significativa em relação ao controle.



experimento 6 para avaliação da associação ART + PZQ administrada no 21º dia

após infecção.

*

** ***

**

***

Tratamentos: 1- controle não tratado 2 - PZQ 400 mg/kg 3 - PZQ 800 mg/kg 4 - ART 300 mg/kg 5 - ART 600 mg/kg 6 - PZQ 300 + ART 600 7 - PZQ 800 + ART 600

81

4.2 Avaliação de vermes adultos recuperados após exposição a drogas

esquistossomicidas no período pré-patente

4.2.1 Experimento 7

Tabela 11 - Número de vermes vivos recuperados 100 dias após a infecção, de

camundongos tratados com OXA 200 mg/kg, ART 300 mg/kg e PZQ 400 mg/kg.

Tratamentos realizados nos 14° ou 21° dia após infecção com cerca de 50 cercárias.

Droga .....mg/kg

Sacrificados ... dias após o tratamento

Tratado ....... dias

após infecção

Número de animais Tratados-Examinados

Média de

Vermes

Distribuição de vermes (%) Mesentério- Fígado

Vermes mortos

no fígado

(%)

Alteração do

oograma (%)

OXA 200 100 14 15 11 7,1* 86,2 13,8 0,0 45,5

ART 300 100 14 15 9 7,0* 94,9 5,1 0,0 11,1

PZQ 400 100 14 15 13 12,6 97,6 2,4 0,0 0,0 OXA 200 100 21 15 11 7,4* 93,6 6,4 0,0 27,3

ART 300 100 21 15 13 5,2*** 95,6 4,4 0,0 15,4

PZQ 400 100 21 15 7 9,3 82,4 17,6 0,0 28,6 Controle 42 -- 15 13 20,2 88,5 11,5 0,0 0


Análises estatísticas mostraram que os grupos tratados com OXA 200 mg/kg

e ART 300 mg/kg apresentaram redução na carga parasitária detectada em perfusão

100 dias após infecção, nos tratamentos realizados tanto no 14º quanto no 21º dia.

O grupo tratado com PZQ 400 mg/kg não apresentou redução da carga parasitária.

1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20

25


méd

ia d

e es

qu

isto

ssô

mu

los

vivo

s re

cup

erad

os


Gráfico 11 - Gráfico de barras da média de esquistossômulos vivos recuperados dos


experimento 7.

* * **

Droga / dia do tratamento 1- controle 2 - OXA 200 mg/kg (14 dpi) 3 – ART 300 mg/kg (14 dpi) 4 – PZQ 400 mg/kg (14 dpi) 5 – OXA 200 mg/kg (21 dpi) 6 – ART 300 mg/kg (21dpi) 7 – PZQ 400 mg/kg (21 dpi)

82

4.2.2 Experimento 8

Tabela 12 - Número de vermes vivos recuperados 100 dias após a infecção, de

camundongos tratados com OXA 400 mg/kg, ART 600 mg/kg e PZQ 800 mg/kg.

Tratamentos realizados nos 14° ou 21° dias após infecção com cerca de 50

cercárias.

Droga .....mg/kg

Sacrificados ... dias após o infecção

Tratado ....... dias

após infecção

Número de animais Tratados -Examinados

Média de

Vermes

Distribuição de vermes (%) Mesentério- Fígado

Vermes mortos

no fígado

(%)

Alteração do

oograma (%)

OXA 400 100 14 15 11 5,2*** 76,2 23,8 9,5 63,6 ART 600 100 14 15 13 4,5*** 81,0 19,0 0,0 15,4

PZQ 800 100 14 15 8 9,5 76,9 23,1 0,0 0,0 OXA 400 100 21 15 12 6,8* 85,2 14,8 0,0 58,6

ART 600 100 21 15 11 5,7** 87,3 12,7 0,0 27,3

PZQ 800 100 21 15 7 7,9 83,6 16,4 0,0 14,3 Controle 42 - - 15 16,2 86,1 13,9 0,0 0,0

* p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001

Os resultados apresentados mostram que o aumento das doses não

aumentou a eficácia dos fármacos em relação à redução da carga parasitária,

quando os tratamentos foram realizados 14º ou 21º dias após infecção.

1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20


méd

ia e

squ

isto

ssô

mu

los

recu

per

ado

s


Gráfico 12 - Gráfico de barras da média de esquistossômulos vivos recuperados dos


experimento 8.

È importante ressaltar que mesmo realizando a perfusão após 100 dias de

infecção, os vermes recuperados dos grupos tratados com OXA 400 mg/kg e ART

*

** *

Droga / dia do tratamento 1- controle 2 - OXA 200 mg/kg (14 dpi) 3 – ART 300 mg/kg (14 dpi) 4 – PZQ 400 mg/kg (14 dpi) 5 – OXA 200 mg/kg (21 dpi) 6 – ART 300 mg/kg (21dpi) 7 – PZQ 400 mg/kg (21 dpi)

83

600 mg/kg mantiveram aspecto de frágeis e pequenos. Grande parte das fêmeas

estava com intestino claro, com aspecto de imaturas. No grupo tratado com ART 600

mg/kg no 21º dpi, 16 das 34 fêmeas estavam imaturas, enquanto 14 das 36 fêmeas

estavam imaturas no grupo tratado no 14º dpi. No grupo tratado com OXA 400

mg/kg no 21º dpi, 22 das 49 fêmeas estavam imaturas, enquanto 8 das 28 fêmeas

estavam imaturas no grupo tratado no 14º dpi.

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

Figura 18 – Vermes recuperados após 100 dias de infecção

(a) fêmea recuperada de camundongo tratado com OXA 400 mg/kg aos 21 dpi. (b) fêmea recuperada

de camundongo tratado com OXA 400 mg/kg aos 14 dpi. (c) detalhe macho recuperado de

camundongo tratado com OXA 400 mg/kg 14 dpi.(d) fêmea recuperada de camundongo tratado com

ART 600 mg/kg 21 dpi. (e) fêmea recuperada de camundongo tratado com ART 600 mg/kg aos 14 dpi

(f) macho recuperado de camundongo tratado com ART 600 mg/kg aos 14 dpi.

4.3 Efeitos do tratamento “in vivo” com OXA, ART e PZQ sobre o tegumento

de esquistossômulos de S. mansoni

4.3.1 Experimento 9 – a

Todos os vermes coletados dos grupos experimentais apresentaram

marcação pela sonda Hoechst 33258, mas nos grupos tratados com OXA 400

mg/kg, ART 600 mg/kg e 300 mg/kg e PZQ 800 mg/kg a marcação foi lum pouco

mais intensa.

84

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

(i) (j)

85

(k) (l)

(m) (n) Figura 19 – Marcação dos parasitos com sonda Hoechst 33258 tratados no 14º dpi e coletados 2

horas após tratamento.

(a) e (B) tratamento OXA 400 mg/kg (c) e (d) tratamento OXA 200 mg/kg (e) e (f) tratamento ART 600

mg/kg (g) e (h) tratamento ART 300 mg/kg (i) e (j) tratamento PZQ 800 mg/kg (k) e (l) tratamento PZQ

400 mg/kg (m) e (n) Controle não tratado.

Por se tratar de uma análise qualitativa através da observação da

fluorescência do tegumento do verme e como não houve marcação muito intensa

semelhante à observada ao padrão de marcação de vermes adultos tratados, não é

possível afirmar que houve diferença entre os vermes recuperados dos grupos

tratados com OXA 400 mg/kg, ART 600 e 300 mg/kg e PZQ 800 mg/kg comparados

ao controle não tratados.

86


(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

(i) (j)

87

(k) (l)

(m) (n) Figura 20 - Marcação dos parasitos com sonda Hoechst 33258 tratados 21º dpi e coletados 2 h após

tratamento.

(a) e (B) tratamento OXA 400 mg/kg (c) e (d) tratamento OXA 200 mg/kg (e) e (f) tratamento ART 600

mg/kg (g) e (h) tratamento ART 300 mg/kg (i) e (j) tratamento PZQ 800 mg/kg (k) e (l) tratamento PZQ

400 mg/kg (m) e (n) Controle não tratado.

As marcações foram mais intensas nos vermes que sofreram a ação da droga

21 dias após infecção, principalmente naqueles que se encontravam em estádios de

desenvolvimento mais avançados.

Nos experimentos 9-a e 9-b os vermes tratados apresentavam movimentação

normal, comparável ao controle não tratado. Também foi visualizada presença de

vermes bem marcados e outros com leve marcação em todos os grupos de

tratamento dos experimentos 9-a e 9-b.

88

DISCUSSÃO

89

5 DISCUSSÃO

A esquistossomose pertence ao grupo das doenças tropicais consideradas

negligenciadas que poderiam ser controladas com medidas de baixo custo e

eficientes intervenções de saúde pública como investimento em saneamento básico,

educação e tratamento da população (WHO 2006).

Atualmente, o tratamento da esquistossomose na fase postural da doença é

bem estabelecido e tem como arsenal terapêutico disponível no mercado o

praziquantel (PZQ) e a oxamniquina (OXA). Entretanto o PZQ é o fármaco

recomendado pela OMS para o tratamento da doença, pois apresenta efetividade

contra todos os tipos de esquistossomose, é seguro e principalmente de baixo custo

(WHO 2006).

Embora a indicação médica para tratamento da esquistossomose ocorra

somente quando a infecção é comprovada pela presença de ovos viáveis de

parasitas nas fezes e/ou eventualmente nos tecidos (Enk, Katz & Coelho 2008),

alguns autores sugerem que o tratamento da esquistossomose durante a fase pré-

postural deveria ser melhor estudado, uma vez que através dele poderia se prevenir

o desenvolvimento da doença (Coelho et al 1993, Coelho et al 1998, Enk, Katz &

Coelho 2008, Coelho, Enk & Katz -inpress, 2009).

A esquistossomose mansoni é uma doença que decorre da reação

inflamatória granulomatosa em torno dos ovos vivos do parasito (Bogliolo 1959,

Warren 1968), seu abortamento na fase pré-postural seria a melhor forma de

prevenção de quase toda patogenia da doença.

Inicialmente esse trabalho teve como objetivo determinar quais seriam os

estádios evolutivos que apresentam maior ou menor susceptibilidade frente a OXA,

PZQ e ART. Para tanto utilizamos o schistograma, uma técnica desenvolvida por

Barbosa et al (1978) que estabelece com boa precisão os estádios evolutivos do S.

mansoni no hospedeiro vertebrado.

O assincronismo apresentado pelo S. mansoni pode ser observado

claramente nesse trabalho e a distribuição de esquistossômulos recuperados nos

grupos controle não tratados foi semelhante a descrita por Barbosa et al (1978) para

cada período específico do desenvolvimento. Assim é possivel avaliar alterações

nas médias de esquistossômulos de cada estádio do schistograma recuperados dos

grupos tratados em relação a média de esquistossômulos dos respectivos estádios

recuperados do grupo controle não tratado. Dessa forma pode-se determinar qual(is)

90

estádio(s) seria(m) afetado(s) pelo tratamento. No presente estudo, optou-se por

tratar em torno do 15º ou 21º dias de infecção, períodos conhecidamente críticos

para sucesso da terapêutica e com o schistograma bem diversificado de estádios

evolutivos. No 15º dpi há predomínio de 3º e 4º estádio, vermes ainda no 2º e 1º

estádios e apenas alguns esquistossômulos no 5º estádio. Em torno do 23º dia

encontra-se mais vermes entre 4º e 5º estádios.

Considerando o tratamento nesta fase inicial da esquistossomose, uma

característica importante do schistosoma que deve ser considerada é a resposta

terapêutica pouco eficiente apresentada neste período. A abordagem do presente

estudo é original com o uso do schistograma.

Das drogas utilizadas na clínica médica, o PZQ considerado a principal droga

esquistossomicida mostra-se parcialmente eficaz nos primeiros dias de infecção,

tornando-se praticamente inativo contra vermes jovens entre 7 a 28 dias (Gönnert

and Andrews 1977, Xiao et al 1985, Sabah et al 1986, Utzinger et al 2003, Pica-

Mattoccia & Cioli 2003, Ribeiro et al 2004). Os resultados aqui apresentados

também demonstraram a baixa eficácia da droga nesta fase da doença. Quando

PZQ 400 mg/kg foi administrado no 15º dpi obteve-se apenas 33% de percentual de

redução de vermes, e este percentual tornou-se ainda mais baixo quando o

tratamento foi realizado no 23º dpi sendo de apenas 26% o percentual de redução

de vermes. Para os dois esquemas terapêuticos utilizados o schistograma ficou

inalterado o que confirma a menor susceptibilidade das formas jovens ao PZQ.

Entretanto, o percentual de redução de S. mansoni no 14º dia de infecção

encontrado por Xiao, Catto & Webster (1985) foi de 63% que apesar de ser menor

que o valor normalmente encontrado para PZQ em tratamento na fase pós-postural

foi o dobro do resultado apresentado nesse trabalho. Estas diferenças podem em

parte ser justificadas por divergências na metodologia como, por exemplo, pela

carga parasitária elevada utilizada nos experimentos deste trabalho (cerca de 200

cercárias). Contudo, resultados semelhantes aos aqui apresentados foram

encontrados em estudos com S. japonicum que mostraram vermes totalmente

resistentes ao PZQ 400 mg/kg do 3º ao 21º dia de infecção, alcançando 47% de

percentual de redução de vermes aos 28 dpi (Xiao et al 1987).

Segundo Xiao, Catto & Webster (1985) a eficácia de PZQ contra diferentes

estádios de desenvolvimento está associada principalmente a capacidade da droga

promover dano no tegumento do verme sendo necessárias altas concentrações da

droga para produzir lesões graves.

91

Dessa forma, foi realizado tratamento com uma dose mais alta de PZQ (800

mg/kg) a fim de verificar se o aumento da dose mudaria essa condição de baixa

sensibilidade à droga pelo parasito. Observou-se que PZQ 800 mg/kg promoveu

redução estatísticamente significativa de vermes recuperados quando o tratamento

foi realizado aos 15 dias de infecção (45%). Neste caso o schistograma mostrou-se

alterado, com redução dos esquistossômulos do 4º estádio evolutivo e

consequentemente no total de esquistossômulos recuperados. O tratamento no 23º

dpi acarretou redução estatísticamente significativa no número de vermes do 6º

estádio evolutivo e do número total de esquistossômulos recuperados, mas, ao

contrário do que se esperava, essa redução não se manteve estatísticamente

significativa quando a perfusão foi realizada aos 42 dpi para recuperação de vermes

adultos, levando a um percentual de redução de 38%. Este fato possivelmente

ocorreu porque, embora a média de esquistossômulos recuperados do grupo tratado

com PZQ 800 mg/kg e grupo controle tenha apresentado diferença estatísticamente

significativa, esta não foi significativa quando confrontada com a média encontrada

nos outros tratamentos e em relação ao controle. Assim, com o amadurecimento dos

esquistossômulos essa pequena diferença não foi suficiente para dar resultados

estatísticamente significativos.

Segundo Doenhoff et al (1987), a ineficácia do PZQ nestas fases imaturas da

infecção parecem estar relacionadas, em parte, com a necessidade de uma resposta

imune contra o S. mansoni para sua completa eliminação. Na fase inicial da doença

o hospedeiro não previamente imunizado ainda não teve tempo de desenvolver

resposta adequada contra o parasito. Este fato pode ser ilustrado com estudos em

que há redução na carga parasitaria de camundongos infectados e re-infectados e

finalmente tratados com PZQ na fase pré-patente da re-infecção (Silva et al 2003,

Ribeiro et al 2004). Assim, possivelmente apesar das altas doses usadas em nosso

trabalho o efeito do PZQ não foi melhorado por deficiência da resposta imune

específica contra o parasito nesta fase da infecção.

A OXA mostra-se efetiva contra o parasito nas fases jovens, com exceção a

3º semana, de acordo com Foster et al (1973). Doses administradas nas fases de

pele e pulmonar revelam abortamento da infecção experimental (Coelho et al 1993 e

1998), além de promover a cura de pacientes sabidamente infectados e tratados

com OXA 50 mg/kg logo nos primeiros dias de infecção (García Goyco et al 1997,

Enk, Katz & Coelho 2008, Coelho, Enk & Katz 2009 in press). Resultados

compatíveis foram observados nesse estudo, uma vez que OXA 200 mg/kg

92

administrada no 15º dpi levou a alteração no percentual de redução de vermes que,

embora baixa, foi estatísticamente significativa (47%); entretanto, no 23º dia de

infecção este percentual de redução de vermes atingiu apenas 27%, confirmando a

baixa eficácia da droga neste período. Existem controvérsias na literatura quanto a

eficácia da droga administrada no período pré-patente da doença, como exemplo as

conclusões de Silva et al (2003). A OXA na dose de 100 mg/kg revelou percentual

de redução de vermes entre 28-34% para grupos tratados do 5º ao 20º dpi. No

presente trabalho, a alteração no schistograma para o tratamento no 15º reduziu a

média de esquistossômulos recuperados por atuar em vermes de 4º estádio

evolutivo, revelando ser essa forma evolutiva mais susceptível a ação da OXA nesta

fase da infecção. O schistograma do grupo tratado no 23º dpi apresentou redução de

esquistossômulos de 6º estádio evolutivo, mas não foi suficiente para promover

redução estatísticamente significativa no total de esquistossômulos recuperados.

O aumento da dose de OXA para 400 mg/kg melhorou o desempenho do

tratamento, elevando para 55 o percentual de redução de vermes quando os

camundongos foram tratados no 15º dia de infecção e para 75% nos que receberam

tratamento no 23º dia de infecção, ou seja o aumento da dose melhorou a ação da

OXA no período crítico da infecção que é em torno do 21º dpi. Esta melhora talvez

tenha sido possível devido ao fato de, ao contrário do PZQ, o mecanismo de ação

da OXA não ser tão marcadamente dependente da resposta imune específica do

hospedeiro (Cioli, Pica-Mattocia & Archer, 1995). Os esquistossômulos que

demonstraram maior susceptibilidade foram de 4º estádio para tratamento no 15º

dpi. A quantidade de esquistossômulos recuperados no 5º e 6º estádios foi

diminuída quando o tratamento foi no 23º dpi, ou seja, o aumento da dose de OXA

para tratamento neste período crítico tornou possível atuar em mais estádios

evolutivos sendo uma das possíveis explicações para a eficácia da OXA nesta fase

crítica para a terapêutica.

Vale ressaltar que os vermes adultos vivos recuperados dos grupos tratados

com OXA 400 mg/kg tinham aspectos de vermes frágeis, eram menores que os

vermes recuperados do grupo controle. Machos possuíam “bolhas“ escuras no

tegumento. Parte das fêmeas apresentava aspecto de imaturas, bem pequenas e

com o intestino claro. Nos dois esquemas terapêuticos avaliados o número de

vermes imaturos foi estatísticamente maior do que no grupo controle indicando que

a droga pode estar retardando o tempo de desenvolvimento dos parasitos.

93

Dentre as demais drogas testadas para tratamento da esquistossomose

destacam-se os derivados de artemisina que mostram maior atividade contra vermes

jovens, em torno do 14º ao 22º dia de infecção (Xiao et al 2002, Xiao et al 2004,

Shaolong et al 2006), entretanto alguns resultados são divergentes e sua aplicação

nesta fase da doença carece de mais investigações.

Estudos conduzidos por Utzinger et al (2002) resultaram em percentual de

redução de vermes 67-77% para esquemas terapêuticos realizados com três doses

de ART 150 ou 300 mg/kg (7, 21, e 35 dpi). Nesse trabalho doses de 300 mg/kg de

ART administradas no 15° ou 23º dias de infecção foram capazes de promover

redução no número de vermes estatísticamente significativa, sendo de 61 e 43%,

respectivamente. Estudos realizados por Shaohong et al (2006) mostraram 93% de

percentual de redução para tratamento com ART 300 mg/kg realizados entre 14º-15º

e 20º-21º dpi. Esta diferença em relação ao resultado aqui obtido pode ter ocorrido

por diferenças no esquema terapêutico uma vez que o referido trabalho optou por

tratar com ART 300 mg/kg em dois dias consecutivos (600 mg/kg no total), enquanto

no presente trabalho foi administrado ART 300 mg/kg em dose única.

O schistograma revelou-se alterado com redução estatísticamente

significativa nos 3º e 4º estádios para os grupos tratados aos 15 dpi, e 5º e 6º

estádios nos grupos que receberam tratamento aos 23 dpi. Estes achados mostram

que ART comparado a OXA e PZQ consegue atuar em mais estádios evolutivos e

em consequência promover maior redução no total de esquistossômulos

recuperados.

Com o aumento da dose de ART para 600 mg/kg obteve-se percentual de

redução de vermes de 62 e 58 nos tratamentos realizados no 15º e 23º dpi,

respectivamente. Este aumento de dose apenas acarretou em diferença terapêutica

para tratamento no 23º dia de infecção. Isso talvez possa ser explicado pelo fato de

que ART 600 mg/kg administrado no 15º dpi atuou nos mesmos estádios evolutivos

que ART 300 mg/kg ou seja, 3º e 4º estádios evolutivos. Todavia, ART 600 mg/kg

promoveu aumento no número de vermes computados como NI (não identificados)

por possuírem danos em seu intestino e sua forma, impossibilitando sua

classificação dentre os estádios evolutivos. Estes vermes NI podem ter

amadurecido, chegado a vermes adultos e talvez possam ser parte dos vermes de

estrutura comprometida exemplificados nas figuras 15 (a, b) para grupos tratados no

15º dpi e figuras 17 (b, c) para grupos tratados no 23º dpi. Dessa forma pode-se

sugerir que o aumento da dose não gerou diferença na quantidade, mas sim na

94

“qualidade” de vermes adultos recuperados. Por outro lado, ART 300 mg/kg

administrado no 23º dpi atuou apenas nos 5º e 6º estádios, enquanto ART 600

mg/kg no 23º dia atuou diminuindo os esquistossômulos de 4º, 5º e 6º estádios

evolutivos. Esta interferência em mais estádios evolutivos pode ter promovido a

diferença observada em relação ao percentual de redução de vermes recuperados.

Alem disso, no tratamento aos 23 dpi houve aumento estatísticamente significativo

no número de vermes NI e ao recuperar vermes adultos aos 42 dpi, também foi

observada presença de grande número de vermes adultos pouco desenvolvidos.

Nestes experimentos, os vermes recuperados do grupo tratado com PZQ

tinham aspecto semelhante aos parasitos recuperados do grupo controle.

As observações de que muitos esquistossômulos recuperados de animais

tratados com ART possuiam intestino degradado e ainda, que vermes expostos ao

tratamento com OXA ou com ART nos 15º ou 23º dpi e recuperados aos 42 dpi,

apresentavam-se mal desenvolvidos nos levou a realizar experimentos, cujos dias

de tratamentos foram 14º ou 21º dpi, mas a recuperação dos vermes aos 100 dias

de infecção para verificar se este dano seria reversível.

Um fato interessante foi que, vermes recuperados dos grupos tratados com

OXA e ART apesar de passados 100 dias após a infecção, mantiveram aparência de

frágeis, parte das fêmeas eram claras, pequenas com aspecto de imaturas. Machos

apresentavam “bolhas” escuras pelo tegumento. Apesar de acasalados muitos

vermes eram bem menores do que os recuperados do controle. Estas observações

nos levam a sugerir que o tratamento com estas drogas poderia interferir no

desenvolvimento normal dos vermes sobreviventes ao tratamento.

A alteração no oograma dos grupos tratados no 14º ou 21º dpi com OXA 200

mg/kg foram de 46 e 21% respectivamente, e de 63 e 59% quando foi usado OXA

400 mg/kg. Supõe-se que o tratamento com OXA interferiu na maturação sexual dos

vermes uma vez que os oogramas alterados foram provenientes de camundongos

cujas fêmeas recuperadas tinham aspecto de imaturas.

Nos animais tratados com ART foi encontrada pequena alteração no oograma

sendo que ART 300 mg/kg ocasionou 11 e 15% de alteração no oograma para

grupos tratados no 14º ou 21º dpi e com ART 600 mg/kg obteve-se 15 e 27% de

alteração, respectivamente. De acordo com Araújo, Kohn & Katz, (1999) o

tratamento na fase postural com ART é capaz de interromper a postura, mas de

forma reversível. Assim o tratamento na fase pré-postural pode não ter afetado a

95

produção de ovos ou esta interferência da droga já havia sido revertida quando foi

realizada a perfusão dos camundongos.

Os tratamentos com OXA e ART nas duas dosagens, usadas no 14º ou 21°

dpi promoveram reduções estatísticamente significativas nas médias de vermes

adultos recuperados se comparadas com o controle não tratado. Vale lembrar que

utilizamos cerca de 50 cercárias nestes experimentos de maior duração o que pode

ter contribuído para uma melhor ação da OXA 200 mg/kg no 21º dpi.

O PZQ e derivados de artemisina são eficazes em diferentes estágios de

desenvolvimento dos vermes, têm-se sugerido que sua associação seria mais eficaz

do que ambas isoladamente (Abdul-Ghani et al 2009). A associação

Arthemeter/PZQ utilizada por Xiao et al (2000) para tratamento de coelhos

infectados simultaneamente com formas jovens e adultas de S. japonicum

demonstrou maior atividade que as drogas isoladamente. Resultados promissores

também foram encontrados com a associação PZQ/Artemether em camundongos

infectados com S. mansoni e S. japonicum, infecção simultânea com vermes

imaturos e maduros (Utzinger et al 2001).

A associação PZQ 40 mg/kg / ART 4 mg/kg apresentou maior eficácia

terapêutica que as drogas administradas isoladamente no tratamento de escolares

nigerianos infectados por S. haematobium, apresentando poucos eventos adversos

e revelando ser uma associação segura (Inyang-Etoh et al 2008). Entretanto alguns

estudos não revelaram vantagem terapêutica na associação PZQ/derivados de

artemisina. A combinação PZQ/ART foi administrada por DeClercq et al (2000) em

pacientes infectados, de área endêmica para S. mansoni mas não houve benefício

comparada ao PZQ administrado isoladamente.

No presente trabalho, foram verificadas as alterações ocorridas no

schistograma pelas combinações PZQ 400 mg/kg + ART 300 mg/kg e PZQ 800

mg/kg + ART 600 mg/kg em animais com alta carga parasitária, a fim de detectar se

o efeito do ART poderia potenciar a atividade de PZQ na fase pré-patente da

infecção. Comparando a associação PZQ 400 mg/kg + ART 300 mg/kg administrada

no 15º dia de infecção com PZQ 400 isoladamente observou-se uma aparente

vantagem terapêutica, pois a droga isolada não altera o schistograma, mas a

associação alterou 3º e 4º estádios no schistograma além de reduzir o total de

esquistossômulos recuperados. Porém, o perfil apresentado pela associação é o

mesmo observado pela administração de ART 300 mg/kg isoladamente e não há

diferença estatísticamente significativa entre estes tratamentos. Do mesmo modo

96

não ocorre diferença estatísticamente significativa entre esta combinação e doses de

ART 600 mg/kg ou PZQ 800 mg/kg usados isoladamente em tratamentos.

Era esperado que a associação PZQ 800 mg/kg + ART 600 mg/kg por efeito

de sinergismo ou aditividade fosse capaz de eliminar completamente os

esquistossômulos, já que se trata de uma combinação usando o dobro da dose

usual usada para camundongos. Contudo este resultado esperado não ocorreu, e o

perfil do schistograma encontrado para associação foi semelhante ao do ART 600

mg/kg usado isoladamente. Talvez, melhor desempenho seria obtido se a

associação fosse utilizada em infecções mistas, com vermes adultos e imaturos

(Utzinger et al 2001). Aumento na dose da associação não levou a diferença

estatísticamente significativa na média de esquistossômulos recuperados.

Quando as associações foram administradas no 21º dia de infecção,

percebeu-se que o tratamento com PZQ 400 mg/kg + ART 300 mg/kg apresentou o

perfil de schistograma semelhante ao obtido com ART 300 mg/kg isoladamente,

apresentando diferença estatísticamente significativa apenas em relação ao

tratamento com PZQ.

Novamente, observou-se que a associação PZQ 800 mg/kg + ART 600 mg/kg

apresentou perfil do schistograma semelhante à administração isolada de ART 600

mg/kg, apresentando diferença estatísticamente significativa apenas em relação aos

grupos tratados com PZQ. O aumento da dose para PZQ 800 mg/kg + ART 600

mg/kg não levou a diferenças estatísticamente significativas em relação ao grupo

tratado com PZQ 400 mg/kg + ART 300 mg/kg.

Os resultados aqui apresentados permitem inferir que o melhor tratamento

testado para o 15º dia de infecção seria ART 600 mg/kg já que esta dose promoveu

maior alteração no schistograma, comparável ao efeito das associações e superior

ao das drogas isoladamente. Pelos mesmos motivos pode-se sugerir que para

grupos tratados no 23º dia de infecção, a droga e dosagem que promove maior

alteração no schistograma seria ART 600 mg/kg. Além disso, os tratamentos tanto

no 15º quanto 21º dpi não mostraram aumento na mortalidade dos camundongos se

comparado as doses menores ou controle, sugerindo que esta dose é pelo menos

em parte segura para tratamento experimental de camundongos. Também foi

observado que em todos os grupos tratados com ART houve aumento

estatísticamente significativo nos esquistossômulos classificados por NI, o que nos

sugere capacidade do ART interferir no perfeito desenvolvimento dos

esquistossômulos, como discutido anteriormente.

97

Diversos estudos demonstram que PZQ e derivados da artemisina atuam

promovendo danos no tegumento de schistosomas (Mehlhorn et al 1981, Doenhoff

et al 1988, Xiao et al 2002, Jiraungkoorskul et al 2006).

Nosse estudo foi utilizada sonda Hoechst 33258 a fim de verificar a extensão

do dano causado pelos tratamentos. Em todos os experimentos as marcações foram

pouco intensas e não seguiram o padrão de marcação observado em vermes

adultos, isso dificulta a análise dos resultados uma vez que é feita de maneira

qualitativa. Contudo, pode-se sugerir que nos tratamentos realizados aos 15 dpi os

esquistossômulos recuperados dos grupos tratados com OXA 400 mg/kg, ART 600 e

300 mg/kg e PZQ 800 mg/kg apresentavam marcação ligeiramente mais intensa que

os outros grupos.

De fato, era de se esperar que os grupos tratados com ART apresentassem

marcação mais intensa que os demais. Em todos os experimentos observou-se nos

esquistossômulos recuperados dos grupos tratados com ART a presença de vermes

com intestino deteriorado, dessa forma não se pode excluir a hipótese que havia

dano no tegumento também. Estudos de microscopia eletrônica demonstraram que

Artemether foi capaz de causar danos extensos no tegumento de esquistossômulos

de 21 dias (Xiao et al 2000), o que poderia justificar esses achados.

Apesar de diversos trabalhos mostrando que PZQ promove danos no

tegumento de schitosomas, estudos sugerem que estágios imaturos de

desenvolvimento do S. mansoni são mais resistentes à formação de vesículas que

as formas maduras do parasito, quando tratadas com PZQ (Xiao et al 1985), o que

talvez reflita a pequena sensibilidade de vermes imaturos à droga. Associado a este

fato ainda pode-se lembrar a ausência de resposta imune eficiente formada contra o

parasito que normalmente atua em sinergia com o PZQ na fase adulta (Fallon et al

1992, Ribeiro et al 2004). Isso poderia justificar o fato da marcação ligeiramente

mais intensa apenas nos vermes pertencentes aos grupos tratados com a maior

dose PZQ 800 mg/kg.

Quanto aos vermes coletados dos grupos tratados com OXA, apenas na

maior dosagem nota-se esquistossômulos marcados um pouco mais intensamente.

Esta observação está de acordo com os resultados encontrados em estudos com

vermes adultos, onde parasitos recuperados de grupos tratados com OXA 200

mg/kg foram expostos a várias sondas de marcação de dano no tegumento, sendo

marcados apenas com a sonda mais sensível, sugerindo que OXA possivelmente

promove danos menos intensos no tegumento dos parasitos (Oliveira 2005).

98

Outra observação feita foi que principalmente nos grupos tratados com OXA

400 mg/kg, ART 300 e 600 mg/kg e PZQ 800 mg/kg houve presença de vermes bem

marcados e outros com leve marcação, o que leva a sugerir por exemplo, que talvez

os vermes pouco marcados sejam os que sobrevivem quando o tratamento é feito

nesta fase da infecção ou ainda poderia ser necessário aguardar tempo maior

depois do tratamento para a perfusão, permitindo a recuperação completa e

inquestionável destes vermes.

É necessário reforçar que como dito anteriormente, a marcação fora do

padrão encontrado para vermes adultos inspira cuidados ao formular estes

comentários.

Finalmente, com todos estes resultados pretende-se contribuir para elucidar

de maneira inovadora, algumas dificuldades da terapêutica experimental na fase

pré-postural da doença, revelando os estádios mais sensíveis aos esquemas

terapêuticos testados. A observação dos vermes realizada longo período após

quimioterapia é original e mostrou que muitos vermes não conseguem atingir o

estádio de adulto. Pela sua relevância estes achados devem ser levados em conta

em ensaios sobre desenvolvimento de drogas esquistossomicidas.

99

CONSIDERAÇÕES

100

6 CONSIDERAÇÕES

A partir do presente estudo pode-se considerar que:

1. Os tratamentos acarretaram alterações nos estádios do S. mansoni avaliados

pelo schistograma,

2. Os grupos tratados com ART 300 mg/kg e 600 mg/kg apresentaram maior

redução no percentual de vermes adultos recuperados em tratamentos

realizados no 15º ou 23º dpi comparados as outras drogas testadas,

3. A OXA 200 mg/kg não foi eficaz na redução do percentual de vermes adultos

recuperados para grupos tratados aos 23 dpi, confirmando estudos

anteriores, entretanto a dose 400 mg/kg mostrou atividade de 75%

(percentual de redução de vermes),

4. O PZQ apenas alterou schistograma na dose 800 mg/kg, no 15º dpi

promovendo redução estatísticamente significativa no percentual de vermes

adultos recuperados (45%),

5. As alterações no desenvolvimento dos vermes tratados no período pré-

patente com OXA e ART são irreversíveis na maior parte da população

sobrevivente ao tratamento,

6. O ART 600 mg/kg leva a alterações morfológicas no intestino de

esquistossômulos com tal impacto que impede sua classificação no

schistograma,

7. As associações PZQ 400 mg/kg + ART 300 mg/kg e PZQ 800 mg/kg + ART

600 mg/kg não causam alterações no schistograma mais significativas do que

o ART 600 mg/kg administrado isoladamente. A média de esquistossômulos

recuperados não apresenta diferenças estatísticamente significativas entre

estes grupos,

8. Grupos tratados com os esquemas anteriores e em seguida expostos a sonda

Hoechst 33258 sugerem maior dano no tegumento dos grupos tratados com

OXA 400 mg/kg, ART 300 mg/kg e 600 mg/kg e PZQ 800 mg/kg.

101

Perspectivas

102

7 Perspectivas

Avaliar a susceptibilidade do parasito a associação OXA + ART durante a

fase pré-patente da infecção.

Avaliar o dano no tegumento do verme imaturo exposto as drogas por

marcação por sonda, usando-se de métodos quantitativos.

Testar a ação no parasito de outros derivados de artemisina, como por

exemplo, o Artemeter.

103

CONCLUSÕES

104

8 CONCLUSÕES

Foram demonstradas diferenças estatísticamente significativas na

susceptibilidade entre os estádios evolutivos do parasito, principalmente em relação

aos tratamentos com Oxamniquina e Artesunato. Por outro lado, confirmou-se a

pequena sensibilidade do parasito quando o tratamento é realizado com

Praziquantel no período pré-patente da esquistossomose. O estudo revela que a

exposição a Oxamniquina e ao Artesunato, na fase pré-postural, compromete o

desenvolvimento do verme que sofre alterações morfológicas, em sua maioria

irreversíveis. Entretanto, foi observado que o tratamento com Artesunato atua em

mais estádios evolutivos em relação a Oxamniquina e Praziquantel. Assim, pode-se

inferir que dentre os tratamentos testados para infecção entre o décimo-quarto e

vigésimo-terceiro dia, o Artesunato revelou ser a droga mais eficiente no tratamento

na fase pré-postural da esquistossomose.

Uma droga que atua eficientemente na fase pré-postural tem o potencial de

prevenir toda patologia resultante de uma infecção com vermes adultos, produzindo

ovos, os elementos fundamentais da patogenia da esquistossomose.

105

Referências

106

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