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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA
ELAINE FLAMIA TONIOLO
Ação da proteína-quinase ativada por RNA na
neurobiologia da dor crônica de origem inflamatória
RIBEIRÃO PRETO-SP
2010
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA
ELAINE FLAMIA TONIOLO
Ação da proteína-quinase ativada por RNA na
neurobiologia da dor crônica de origem inflamatória
RIBEIRÃO PRETO-SP
2010
ELAINE FLAMIA TONIOLO
Ação da proteína-quinase ativada por RNA na
neurobiologia da dor crônica de origem inflamatória
Dissertação
Ribeirão Preto
2010
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/Universidade de São Paulo como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Fisiologia Orientador: Prof. Dr. Guilherme A. Lucas
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICOVEÍCULO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Toniolo, Elaine Flamia.
Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia da dor crônica de origem inflamatória. Ribeirão Preto, 2010.
67 p.
Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ Universidade de São Paulo. Área de concentração: Fisiologia.
Orientador: Lucas, Guilherme.
1.Proteína-quinase dependente de RNA. 2. Dor crônica. 3. Dor inflamatória. 4. Gânglio da raiz dorsal. 5. Corno dorsal da medula espinhal.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Elaine Flamia Toniolo
Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia da dor crônica de
origem inflamatória.
Aprovado em: ___/___/___
Banca examinadora
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição: _____________________________Assinatura_________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição: _____________________________Assinatura_________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição: _____________________________Assinatura_________________
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/
Universidade de São Paulo como requisito
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências.
Área de concentração: Fisiologia
Trabalho realizado no Laboratório de Neurofisiologia da Dor, do Departamento
de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de
São Paulo, com o auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo (FAPESP) processo 2007/06780-7 e 2008/04994-2;
Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(FAEPA) e Pró-Reitoria de Pesquisa da USP.
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação a quatro pessoas de fundamental importância em
minha vida. Aos meus pais, José Cleto e Maria Olinda que nunca mediram
esforços para que eu pudesse buscar todos meus objetivos, mesmo que para
isso fosse necessário passar por muitas privações. A minha irmã e grande
amiga Alessandra, que sempre me incentivou e acreditou que fosse capaz de
conquistar tudo o que desejasse. E ao meu companheiro Thiago, que esteve
ao meu lado me ajudando a superar todas as angustias e me proporcionando
muitas alegrias. Obrigada a todos e amo muito vocês!
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador Guilherme Lucas por sua orientação e atenção no decorrer
do desenvolvimento de todo o trabalho.
Ao Prof. Dr. Fernando Luiz Lucca que cedeu seu laboratório para que
pudéssemos utilizá-lo para o desenvolvimento deste trabalho, juntamente com
o auxílio de suas técnicas Cacilda Dias Pereira e Zuleica Aparecida S. de
Morais e alunas de pós-graduação Thais e Vivi que sempre estavam dispostas
a ajudar.
Ao Dr. Luiz Carlos dos Reis do Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer de
São Paulo por fornecer os animais PKR+/+ e PKR +/-.
À Profª. Angela Kaysel Cruz por disponibilizar o aparelho de Real Time PCR.
Aos membros da banca Prof. Dr. Luiz Guilherme de Sirqueira Branco e a Prof.
Dra. Maria Inês Nogueira.
À Sônia Zanon, além de técnica do laboratório é uma grande amiga e
companheira de experimentos, que apenas tenho muito a agradecer.
Ao Ricardo e a Maria Ida, pessoas que tenho a agradecer pelos ensinamentos
e participação no desenvolvimento do projeto.
A Paula, pela sua participação sempre que necessária no desenvolvimento do
projeto e pelas conversas.
Ao Adriano que além da participação inicial no desenvolvimento do projeto e
ensinamentos, também tenho que agradecer pela amizade, apoio e pelas
muitas risadas. Valeu Brother!
Aos companheiros de laboratório pela colaboração sempre que necessário:
Flaviane, Maurício, Karina, Rodrigo (Mion), Carla, Pedro, Josi e Thiago.
Aos amigos e companheiros do Departamento de Fisiologia: Thiago, André,
Cadu, Pedro, Dani e Prof. Ricardo Leão.
Ao Thiago por toda sua paciência, compreensão, amor, carinho, por toda sua
dedicação durante todos esses anos, e acima de tudo pela sua amizade e
cumplicidade... Amo você!
Ao André e Adriano que sempre que necessário me deram o ombro amigo.
Muito obrigada pelas intermináveis conversas, por toda a atenção despendida,
por todas as risadas (e foram muitas), enfim por todo o companheirismo. O que
mais posso dizer... só que Adoro vocês!
A todos da minha família que sempre acreditaram na minha capacidade e
torceram por mim em todas as etapas, principalmente aos meus pais e meus
avós: Demétrio, Ignez, Nilson e Ana que sempre me deram todo apoio.
As minhas amigas Edinalva e Édina que mesmo longe continuam me dando
força.
A todos da secretaria do Departamento de Fisiologia: Elisa, Cláudia, Fernando
e Carlos, que sempre estavam dispostos a ajudar.
Aos bioteristas Leonardo e Eduardo.
A todos os demais funcionários do Programa de Pós-Graduação do
Departamento de Fisiologia e da Faculdade de Medicina.
Ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/
Universidade de São Paulo.
Ao auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP) e Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (FAEPA) e Pró-Reitoria de Pesquisa da USP.
ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
aCSF – Artificial cerebro spinal fluid / Fluido cerebrospinal artificial
BDNF – Brain-derived neurotrophic factor / Fator Neurotrófico derivado do cérebro
CETEA – Comissão de Ética em Experimentação Animal
CFA – Complete Freund’s Adjuvant /Adjuvante Complemento de Freund
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
Ct – Cycle threshold
DNA – Deoxyribonucleic acid / Ácido desoxirribonucléico
eIF2α – eukaryotic initiation factor 2 alpha
ERK – Extracellular signal-regulated kinase
ERK-2 – Extracellular signal-regulated kinase-2
GDR – Dorsal root ganglion / Gânglio da raiz dorsal
IFN – Interferon
IFN γ – Interferon γ
IKK – Ikappa kinase
IL– Interleucina
IL- 1ß – Interleucina 1ß
IL-6 – Interleucina 6
IL-8 – Interleucina 8
IRF-1 – Interferon regulatory factor-1
I.T. – Intra tecal
JNK – c-Jun N-terminal kinase
Kb – Kilobase
KDa – Quilodaltons
L4 – Vértebra lombar 4
L5 – Vértebra lombar 5
L6 – Vértebra lombar 6
Log – Logaritmo
LPS – Lipopolysaccharide
MAPK – Mitogen-activated protein kinases
mA – Miliampére
mL – Mililitro
nº – Número
NF-ҚB – Fator nuclear-ҚB
NGF – Fator de crescimento neural
NK-1 – Neuroquinina-1
NMDA – N-Methyl-D-Aspartate
NPY – Neuropeptídeo Y
NT-4 – Neurotrophin 4
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PKR – Protein kinase – R / Proteína quinase – R
RNA – Ribonucleic acid / Ácido ribonucléico
RNAfd – Double-stranded-RNA / Ácido ribonucleico de fita dupla
RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro
RT – Real time / Tempo real
RT – Transcript reversal / Transcrição reversa
S – Segundos
SCI – Spinal Cord Injury / Injuria na medula espinal
Sham – Grupo controle
SNC – Sistema Nervoso Central
STAT – Signal transducers and activators of transcription
STAT-1– Signal transducers and activators of transcription-1
STAT-3 – Signal transducers and activators of transcription-3
TLR – Toll-like receptor
TLR 1 – Toll-like receptor 1
TLR 2 – Toll-like receptor 2
TLR 3 – Toll-like receptor 3
TLR 4– Toll-like receptor 4
TLR 5 – Toll-like receptor 5
TLR 6– Toll-like receptor 6
TLR 7 – Toll-like receptor 7
TRP – Transient receptor potential / Receptor de potencial transiente
TRPV 1 – Transient receptor potential vanilloid 1/ Receptor de potencial transiente vaniloide 1
TNFα – Fator α de necrose tumoral
µg – Micrograma
µL – Microlitro
V – Volt
VPL – Ventral posterior lateral
VPM – Ventral posterior medial
∆ – Delta
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação esquemática das principais vias ascendentes
ântero-laterais de transmissão da dor.................................................................6
FIGURA 2: Representação esquemática dos múltiplos fatores envolvidos na
transmissão e modulação da informação nociceptiva.........................................9
FIGURA 3: Mecanismo de interação PKR/RNAfd.............................................11
FIGURA 4: Mecanismos extra e intracelulares de ativação da PKR.................14
FIGURA 5: Mecanismo de ação de PKR sobre a atividade de NFB...............17
FIGURA 6: Fotografia representativa do teste de sensibilidade mecânica...... 26
FIGURA 7: Representação esquemática do gânglio da raiz dorsal e da coluna
dorsal da medula espinal entre L4 e L6.............................................................27
FIGURA 8: Fotografia representativa do equipamento para a realização do
teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico.....................................29
FIGURA 9: Caracterização dos mecanismos envolvidos na reação de
transcrição reversa e na reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real...31
FIGURA 10: Representação esquemática do protocolo experimental
empregado para a identificação do perfil de expressão do RNAm de PKR no
gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinal durante processo
inflamatório........................................................................................................33
FIGURA 11: Diagrama demonstrando a inserção da agulha no espaço
intervertebral entre L5 e L6, utilizado na técnica de injeção intratecal..............35
FIGURA 12: Representação esquemática do protocolo experimental do
monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico
antes e durante processo inflamatório; e antes e após injeção intratecal de
Inibidor de PKR e Controle Negativo de Inibidor de PKR..................................37
FIGURA 13: Representação esquemática do protocolo experimental
empregado para a imunodetecção das proteínas p38, JNK e p42/ p44 e seus
resíduos fosforilados no gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula
espinal durante processo inflamatório...............................................................40
FIGURA 14: Expressão relativa do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal e
no corno dorsal da medula espinal em animais submetidos a inflamação
crônica...............................................................................................................42
FIGURA 15: Imunohistoquímica para a proteína p-PKR no corno dorsal da
medula espinal.................................................................................................. 44
FIGURA 16: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais
PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação térmica.................................................46
FIGURA 17: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais
PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação mecânica.............................................47
FIGURA 18: Efeito da injeção intratecal (i.t) de inibidor de PKR sobre a
hipernocicepção térmica induzida pela administração subcutânea de CFA em
camundongos C57BL/6.....................................................................................49
FIGURA 19: Inflamação crônica induz a fosforilação de p38 na coluna dorsal
da medula espinal de camundongos C57BL/6/ JUnib...................................... 51
FIGURA 20: Inflamação crônica induz a fosforilação de JNK na coluna dorsal
da medula espinal de camundongos C57BL/6/ JUnib.......................................52
FIGURA 21: Inflamação crônica não induz a fosforilação de p42/44 na coluna
dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6/JUnib.............................53
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................3
1.1. Neurobiologia da dor....................................................................3
1.2. Plasticidade neural induzida por doença inflamatória
crônica...........................................................................................7
1.3. Proteína-quinase ativada por RNA (PKR)...................................9
1.3.1. Regulação da sinalização intracelular a partir da
fosforilação de PKR...........................................................11
2. OBJETIVOS............................................................................................18
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................19
3.1. Animais........................................................................................19
3.2. Modelo experimental de dor crônica de origem inflamatória
periférica....................................................................................20
3.2.1. Grupos experimentais referentes à expressão do
RNAm do gene pkr......................................................20
3.2.2. Grupos experimentais referentes à
Imunohistoquímica...................................................... 21
3.2.3. Grupos experimentais referentes ao comportamento
dos animais PKR+/- e PKR+/+...........................................21
3.2.4. Grupos experimentais referentes à injeção intratecal
do inibidor de PKR.........................................................22
3.2.5. Grupos experimentais relacionados à imunodetecção
do estado de fosforilação das proteínas p38, JNK e
p42/44..............................................................................23
3.3. Monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo
mecânico antes e após a inflamação periférica gerada por
CFA e Óleo Mineral para o monitoramento de
alodínia.......................................................................................24
3.4. Monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo
nociceptivo térmico..................................................................27
3.5. Extração de RNA total...............................................................29
3.6. Transcrição reversa....................................................................30
3.7. Reação em cadeia da polimerase em tempo real....................31
3.8. Imunohistoquímica.....................................................................33
3.9. Técnica de Injeção intratecal.....................................................34
3.10. Imunodetecção do estado de fosforilação da proteína PKR no
gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinhal
durante a doença inflamatória crônica.....................................37
4. RESULTADOS........................................................................................41
5. DISCUSSÃO...........................................................................................55
6. CONCLUSÃO.........................................................................................60
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................61
8. ANEXO I..................................................................................................67
i
Toniolo, E. F.
RESUMO
TONIOLO, E. Ação da proteína-quinase ativada por RNA na neurobiologia da
dor crônica de origem inflamatória. 2010. Dissertação (Mestrado) – Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto,
2010.
A proteína-quinase ativada por RNA de fita dupla (PKR) é uma proteína
quinase que foi caracterizada por induzir a síntese de interferon do tipo I (IFN),
tem um papel importante na regulação na translação, transcrição, e transdução
do sinal em inúmeras vias. PKR pode ser ativada por muitos fatores como
estímulos inflamatórios, fatores de crescimento, citocinas e estresse oxidativo.
Este trabalho teve como objetivos (1) identificar o perfil de expressão do RNAm
e da proteína PKR e na coluna dorsal da medula espinal durante processo
inflamatório crônico, (2) monitorar o efeito da inibição de PKR na medula
espinal sobre as alterações de sensibilidade induzidas por doença inflamatória
crônica e (3) investigar o efeito da inibição de PKR sobre a fosforilação das
proteínas p38, p42/44 e JNK na coluna dorsal da medula espinal durante
processo inflamatório crônico. Observamos que o RNAm para PKR está
presente em células, tanto do gânglio da raiz dorsal, quanto na coluna dorsal
da medula espinal e seu perfil de expressão e sua atividade aumentaram
durante processo inflamatório crônico. A administração subcutânea de CFA
induziu alodínia mecânica e hipernocicepção térmica ipsilateral a injeção
sendo que a administração intratecal do inibidor de PKR (5µM/10µL) reverteu
esta hipernocicepção, mas não teve efeito sobre a alodínia mecânica. Além
disso, animais PKR+/- injetados com CFA apresentaram uma redução na
hipernocicepção térmica quando comparados aos camundongos PKR+/+.
Nossos resultados indicam, ainda, que a atividade pró-nociceptiva de PKR está
associada a um aumento da fosforilação das MAPKs p38 e JNK, mas não de
p42/44, na coluna dorsal da medula espinal. Juntos estes resultados indicam
haver um potencial terapêutico antinociceptivo para compostos que sejam
capazes de inibir ou reduzir a atividade de PKR na medula espinal.
ii
Toniolo, E. F.
ABSTRACT
TONIOLO, E. Action of RNA-activated protein-kinase in neurobiology of
inflammatory chronic pain origin. 2010. Thesis (Master’s degree) – School of
Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo. Ribeirão Preto, 2010.
Double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR), is one of the most
characterized protein induced by type I interferon. PKR has been shown to play
a variety of important roles in the regulating translation, transcription, and signal
transduction pathways. PKR can be activated by many factors like inflammatory
stimulus, growth factors, cytokines and oxidative stress. This work aimed (1) to
identify the expression pattern of PKR mRNA in the dorsal root ganglion and the
spinal cord dorsal horn during chronic inflammatory process, (2) to investigate
the effect of spinal inhibition of PKR on sensory abnormalities induced by
chronic inflammatory disease and (3) to monitor the effect of spinal inhibition of
PKR on p38, JNK and p42/44 phosphorylation in the spinal cord dorsal
horn under chronic inflammation. Our data show that PKR mRNA is expressed
both in the dorsal hoot ganglion and the spinal cord dorsal horn. Its expression
profile and activity increased during chronic inflammation process.
Subcutaneous administration of CFA induced mechanical allodynia and thermal
hyperalgesia ipsilateral to the injected side. Intrathecal injection of PKR inhibitor
(5µM/10µL) reverted CFA-induced hypernociception. Moreover, PKR+/- mice
injected with CFA showed reduced thermal hypernociception as compared the
PKR+/+. Our results also indicate that PKR play a pro-nociceptive role in the
spinal cord associated to an increased phosphorylation of MAPKs p38 e JNK,
but not p42/44. Taken together this results, suggest a potential therapeutic
effect of compounds able to inhibit or reduce the activity the PKR in spinal cord.
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
3
Toniolo, E. F.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Neurobiologia da dor
Segundo o Comitê da Associação Internacional para o Estudo da Dor
(IASP), a dor pode ser definida como “uma experiência sensorial e emocional
desagradável associada à lesão tecidual real ou potencial ou ainda descrita em
termos de tal lesão” (IASP, 1994, Loeser, 2008). Dessa maneira a dor é
essencial para a sobrevivência dos indivíduos e, normalmente, serve como um
instrumento de advertência para a prevenção em respostas à agressão ao
organismo.
O gânglio da raiz dorsal (GRD) e a coluna dorsal da medula espinal são
formados por neurônios e células da glia, cujo sua função primordial está
relacionada ao controle e transmissão da informação sensorial da periferia para
o sistema nervoso central (SNC) (Zimmermann, 2001; Tsuda, Inoue et al.,
2005; Zieglgansberger, Berthele et al., 2005). Tais populações celulares são o
substrato para a transmissão da informação nociceptiva e sua reorganização
morfo-funcional representa a base das alterações em condições
fisiopatológicas em estados de dor crônica (Millan, 1999; Zimmermann, 2001;
Zieglgansberger, Berthele et al., 2005; Ueda, 2006).
As fibras que se projetam dos neurônios nociceptivos são classificadas
em dois tipos: fibras do tipo C, estas são amielínicas, de diâmetro pequeno, e
com velocidade de condução na faixa de 0,5 a 2,0 m/s, as quais respondem a
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
4
Toniolo, E. F.
estímulos térmicos, mecânicos e químicos, sendo, por isso, denominadas de
polimodais. Estas fibras correspondem a 80% do total e estão envolvidas na
condução da mensagem nociceptiva, são responsáveis pela dor de duração
lenta ou secundária, difusa e de difícil localização. Há também as fibras do tipo
Aδ, que são mielinizadas, de diâmetro médio, com velocidade de condução
entre 5 e 30 m/s, e correspondem a 20% do total de fibras. As fibras do tipo Aδ
são responsáveis pela dor rápida ou primária; trata-se da dor aguda, bem
localizada e discriminativa, que resulta do estímulo pontual (Millan, 1999; Julius
e Basbaum, 2001).
Os nociceptores são capazes de detectar estímulos nocivos e convertê-
los em sinais eletroquímicos na forma de potenciais de ação, que por sua vez,
será conduzido para o SNC (Calne et al. 1996; Purves et al. 2002). No interior
da medula espinal, as projeções aferentes dos neurônios sensitivos primários
fazem sinapses com os neurônios sensitivos secundários, os quais ascendem
para o encéfalo formando tratos aferentes, que transmitem a informação
nociceptiva para estruturas rostrais, incluindo a formação reticular, a substância
cinzenta periaquedutal, o tálamo, o hipotálamo e o complexo amigdalóide entre
outras (Almeida, 2004).
A via ascendente de maior relevância da dor é a espinotalâmica, que
compreende os tratos neoespinotalâmico e paleoespinotalâmico. O trato
neoespinotalâmico ascende pela substância branca do funículo ântero-lateral
da medula espinal e alcança os núcleos talâmicos ventral posterior lateral
(VPL) e núcleos talâmicos mediais (VPM), que por sua vez, se projetam para o
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
5
Toniolo, E. F.
córtex somatosensorial (Fig. 1) (Russo et al. 1998; Purves et al. 2002). Na
escala evolutiva, esse trato apareceu somente em mamíferos superiores e, por
apresentar poucas sinapses ao longo do trajeto ascendente, essa via, conduz
as informações nociceptivas com alta velocidade; estando envolvido na
transmissão da dor aguda relacionada com o componente sensorial-
discriminativo da dor (Menescal, 2008). O trato paleoespinotalâmico também
ascende pelo funículo ântero-lateral e seus axônios se projetam por meio de
colaterais para vários níveis do encéfalo como os núcleos da formação reticular
do tronco encefálico inferior (trato espinoreticular), do mesencéfalo, substância
cinzenta periaquedutal (trato espinomesencefálico) e do hipotálamo (trato
espino-hipotalâmico) antes de alcançar os núcleos mediais do tálamo . Assim,
o trato paleoespinotalâmico transmite informações nociceptivas para diversas
regiões supra-espinais relacionadas com diferentes funções. Nos núcleos
mediais do tálamo, ocorrem as sinapses com os neurônios de terceira ordem,
que se projetam para o córtex do cíngulo e da ínsula (Fig. 1). Assim, o trato
paleoespinotalâmico é multissináptico, conduzindo as informações nocivas à
baixa velocidade e está relacionado com a transmissão mais lenta do estímulo
nociceptivo (Russo et al., 1998).
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
6
Toniolo, E. F.
Dale Purves/Neurocience, p. 214 e 217, 2004
Figura 1: Representação esquemática das principais vias ascendentes ântero-laterais de transmissão da dor. Trato paleoespinotalâmico (em vermelho) e Trato neoespinotalâmico (em azul).
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
7
Toniolo, E. F.
1.2. Plasticidade neural induzida por doença inflamatória crônica
No processo inflamatório resultante da lesão tecidual ocorre inicialmente
recrutamento de células do sistema imune que liberam no tecido lesado, pelo
menos, três mediadores importantes: (1) Fator α de necrose tumoral (TNFα),
(2) a interleucina 1β (IL-1β) e (3) o Fator de crescimento neural (NGF). Todos
estes fatores são capazes de ativar e sensibilizar neurônios nociceptivos
periféricos e centrais, contribuindo, assim, para a manutenção da dor e da
hiperalgesia (Garcia, Meurs et al., 2007). Estudos realizados por Kim et al.,
relatam que o dano em neurônio sensorial induz a expressão de TNF-α, IL-1ß,
IL-6 (interleucina-6), e promove a síntese de genes para óxido nítrico em
células da glia na medula espinal.
Tais fatores mobilizam ainda, mediadores citoplasmáticos a partir de
receptores TLR (Toll- like receptor), promovendo a dimerização e
autofosforilação de PKR (Bennett, Blalock et al., 2006; Cole, 2007; Scheuner,
Davies et al., 2003; Williams, 1997). TLRs são proteínas transmembranas
sinalizadoras que são expressas por células do sistema imune inato, sendo
que há mais de dez diferentes TLRs com distintos ligantes específicos (Kim,
Lee, 2007). O SNC, microglia e astrócitos mostraram expressar vários TLRs,
incluindo TLR2 e TLR4, como sugerem o papel das células do sistema imune
inato no SNC. Em modelo de dor neuropática realizado em rato, foi reportado
que TLR4 é requerido para a indução máxima de hipersensibilidade dolorosa
sobre transecção de nervo espinal (Kim, Lee, 2007).
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
8
Toniolo, E. F.
Dados sugerem que moléculas não patogênicas liberadas por trauma
também podem desencadear inflamação via TLR2 e TLR4. Kigerl et al., 2007,
testaram se TLRs eram regulados após lesões na medula espinal e
examinaram os efeitos na recuperação funcional e anatômica. Estes autores
demonstraram que RNAm para TLR1, 2, 4, 5, e 7 estão aumentados após
lesão medular, bem como moléculas associadas com a sinalização TLR.
Ainda hoje há diversos moduladores e mediadores descritos nos
circuitos de transmissão da dor, evidenciando a complexidade do processo da
informação nociceptiva, tanto em neurônios periféricos primários, quanto em
neurônios centrais espinais e supra-espinais (Fig. 2) (Millan, 1999). Assim, é
cada vez mais claro que estes novos mediadores são produzidos e liberados
também por células não neuronais, predominantemente células da glia e do
sistema imune. Modelos experimentais têm revelado, ainda, que a dor crônica
de origem inflamatória é consequência, principalmente, de mudanças
neuroquímicas, fisiológicas e morfológicas nos neurônios sensoriais, tanto
periféricos, quanto centrais, alterando, dramaticamente, suas características
fenotípicas e sua atividade sináptica de forma crônica (Ji, Strichartz, 2005;
Ueda, 2005). Estas mudanças determinam redução da atividade inibitória e
aumento dos eventos excitatórios nos neurônios sensoriais da medula espinal,
reduzindo seus níveis de excitabilidade, resultando na hipersensibilização de
neurônios centrais (Millan, 1999; Moore, Baba et al., 2000; Lever, Cunningham
et al., 2003) e no aparecimento de uma forma de dor recorrente ou permanente
(Marchand, Perretti et al., 2005; Scholz, Woolf, 2002; Zimmermann, 2001; Lai,
Ossipov et al., 2001).
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9
Toniolo, E. F.
Mark J. Millan/ Progress in Neurobiology, p. 361, 2002
Figura 2: Representação esquemática dos múltiplos fatores envolvidos na transmissão e modulação da informação nociceptiva.
1.3. Proteína-quinase ativada por RNA (PKR)
A proteína-quinase ativada por RNA de fita dupla (PKR) é uma proteína
constituída de 551 aminoácidos em humanos e 515 aminoácidos em
camundongos. Tal proteína é caracterizada por dois domínios distintos: um
segmento terminal dominante regulatório NH2, onde se encontram as
sequências de ligação de RNAdf, e um domínio catalítico serina/treonina na
terminação carboxílica (Gunnery, 1998; Kadereit, Galabru et al.,1994; Patel,
Sem, 1994; Williams, 1999; Zhang et al., 2001).
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
10
Toniolo, E. F.
Essa proteína é conhecida como uma quinase serina/treonina,
caracterizada por duas atividades catalíticas diferenciadas: a homodimerização
da proteína e autofosforilação intermolecular (Robertson, Mathews, 1996;
Zhang, Romano et al.,2001), que representa a reação inicial de ativação da
proteína e a fosforilação do Fator de Iniciação Translacional. Esta última,
impede a atividade da proteína eIF2α, resultando dessa forma na inibição da
síntese de proteínas (Cai, Williams, 1998; Taylor, Haste et al.,2005); entretanto
foi relatado recentemente que PKR também fosforila sítios de tirosina e que
este efeito pode influenciar, tanto a ligação com RNAfd, quanto a
autofosforilação e a ativação da proteína eIF-2 (Fig. 3) (Su, Wang et al.,2006;
Su, Wang et al.,2007).
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Toniolo, E. F.
Adaptado de García et al., 2006
Figura 3: Mecanismo de interação PKR/RNAfd. PKR possui um domínio de ligação para RNAdf na sua porção N terminal e um domínio quinásico no terminal carboxílico. Em condições fisiológicas, PKR permanece em um estado latente monomérico, devido ao efeito inibitório dos seus domínios de ligação para o RNA, os quais ocluem o domínio quinásico, impedindo a ativação da enzima. Após sua ligação ao RNA de fita dupla, PKR é dimerizada e autofosforilada, permitindo que esta quinase ative outras proteínas (1). Entre os alvos celulares da PKR, destaca-se, principalmente, a fosforilação da subunidade α do fator 2 de iniciação da translação eucariótica (eIF-2). Esta fosforilação (2) causa o seqüestro do fator de troca do nucleotídeo guanina eIF-2B, impedindo a troca de GDP por GTP em eIF-2 e consequentemente, inibe o início da translação e de síntese proteica.
1.3.1. Regulação da sinalização intracelular a partir da
fosforilação de PKR
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12
Toniolo, E. F.
Foi descoberto na última década que a ativação de PKR pode ocorrer,
não somente em resposta a inúmeros agentes tais como estímulos pró-
inflamatórios, fatores de crescimento, citocinas e estresse oxidativo (Carlson,
Stephens et al.,1992; Clemens, Hershey et al.,1993; Saunders, Barber, 2003;
Williams, 2001; Zang et al.,2001). Mas também é aceito que os principais
ativadores naturais de PKR são produzidos por células infectadas por vírus,
que produzem e liberam RNAdf como produto da replicação viral (Cai, Williams,
1998; Kaempfer, 2003). Por esta razão, reconhece-se que esta enzima
desempenhe papel essencial na resposta imune inata às infecções virais (Cai,
Williams, 1998; Garcia, Gil et al., 2006). Entretanto, esta quinase é também
fosforilada em resposta ao RNAdf de origem celular ou mesmo sintético
(Carlson, Stephens et al.,1992; Garcia, Meurs et al., 2007; Lemaire, Lary et
al., 2005). Phillip Marcus e Margaret Sekellick (Robertson, Mathews, 1996)
propuseram que, além de sua atividade bem estabelecida como regulador
translacional, PKR também desempenharia ação crucial na transdução de
sinais extracelulares. O primeiro indício de sua atividade como mensageiro
intracelular veio da observação de que a inibição química de PKR pela ação do
nucleosídeo 2-aminopirina interferiria na expressão gênica normalmente
ativada por Interferon (IFN) (Clemens, Hershey et al., 1993; Tanaka, Samuel,
1994). Um segundo passo importante foi à identificação de que o RNAdf seria
capaz de, pela ativação de PKR, fosforilar o fator de transcrição NF-κB (Kumar,
Haque et al., 1994; Zamanian-Daryoush, Mogensen et al., 2000).
Desta maneira, a atividade de PKR é associada à regulação de funções
celulares tão diferentes como diferenciação, transcrição, apoptose e
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13
Toniolo, E. F.
crescimento celular (Carlson, Stephens et al., 1992; Garcia, Gil et al., 2006;
Williams, 1999). Assim, inúmeras vias de transdução são afetadas a partir da
ativação de PKR. (Fig. 4). Um dos primeiros alvos descritos para PKR foi o
fator de transcrição IRF-1, que vem a ser um supressor tumoral ausente em
pacientes com leucemia (Der, Yang et al., 1997; Garcia, Meurs et al., 2007;
Kadereit, Galabru, 1994; Niedner, Buzko et al., 2006; Rong, Woolf et al., 2002;
Scheuner, Gromeier et al., 2003), e que, aparentemente, mediaria
mecanismos apoptóticos desencadeados por PKR (Moore, Baba et al., 2000).
Outro alvo da PKR são proteínas da família STAT (signal transducers and
activators of transcription). Estas proteínas estão envolvidas em diversas
funções biológicas e participam ativamente das vias de sinalização intracelular
desencadeadas por interferons (IFN) e outras citocinas (Scheuner, Gromeier et
al., 2003; Rong, Woolf et al., 2002; Scumpia, Kelly et al., 2005). A
associação entre PKR e STAT pode, também, ocorrer de forma indireta, este
parece ser o caso de STAT-1 (Lu, Pang et al., 2005), cujo estado de
fosforilação permanece inalterado pela ação exclusiva de PKR (Lee et al.,
2005; Kaempfer, 1993; Marchand, Perretti et al., 2005; Obata, Noguchi et al.,
2008). Neste caso, PKR controlaria uma cascata de quinases na qual ERK2
estaria sendo responsável pela fosforilação de STAT-1. STAT-1 ainda é um
alvo de PKR em células da glia após estimulação com LPS (Der, Yang et al.,
1997; Rong, Woolf et al., 2002).
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14
Toniolo, E. F.
Adaptado de García et al., 2006
Figura 4: Mecanismos extras e intracelulares de ativação da PKR. RNA de fita dupla, lipopolisacarídeos, citocinas e fatores de crescimento mobilizam mediadores citoplasmáticos a partir de receptores TRL, promovendo a dimerização e autofosforilação de PKR. A ativação desta quinase ocorre também pela ação da proteína citosólica PACT ou seu homólogo murino RAX. Uma vez ativada, PKR age direta ou indiretamente sobre diferentes vias de sinalização intracelular e fatores de transcrição (STAT-1, IRF-1, ATF-3 E NF-ҚB).
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Toniolo, E. F.
Outro alvo de PKR são as MAPK (mitogen-activated protein kinases),
quinases serina/treonina que regulam vários eventos celulares. Em mamíferos,
MAPKs estão classificadas em várias famílias, sendo as principais ERK
(extracellular signal-regulated kinase), p38 e JNK (Scholz, Woolf et al., 2002).
Tanto p38, quanto JNK são dependentes da fosforilação de PKR para uma
efetiva resposta intracelular desencadeada pela ação de LPS ou citocinas do
tipo de IFN-γ, IL-1 ou TNF-α (Bonnet, Weil et al., 2000; Kadereit, Galabru et
al., 1994; Kaempfer, 2003; Marchand, Perretti et al., 2005; Scumpia, Kelly et
al., 2005).
Rong e colaboradores investigaram a ativação de ERK pela inflamação
periférica induzida por injeções de Complete Freund’s Adjuvant (CFA),
demonstrando que a inflamação persistente e consequente ativação
sustentada de ERK, ativam neurônios das camadas superficiais (lâminas I-II)
da medula espinal (Rong, Woolf et al.,2002). O mesmo grupo verificou que a
indução da inflamação periférica após 24 horas ativava p38 no soma de
nociceptores da fibra C. A inflamação também aumentou níveis de proteínas,
mas não níveis de RNAm, para canais iônicos TRPV1 (VR1) sensíveis ao calor
nessas células, onde eram transportado para periferia mas não para terminais
centrais da fibra C. Quando a ativação de p38 foi inibida no GRD, ocorreu
reduções no aumento de TRPV1. Além disso, a ativação de p38 no GRD é
secundária a produção periférica de NGF durante a inflamação e é requerido
para indução de NGF e aumento de TRPV1. A ativação de p38 no GRD
seguido do transporte de NGF retrógrado demonstrou aumento nos níveis de
TRPV1 nos terminais periférico dos nociceptores (Rong, Woolf et al.,2002).
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Toniolo, E. F.
Outro importante fator pró-inflamatório é o Fator Nuclear-κB (NF-κB).
Esta proteína é um fator de transcrição que controla a expressão de uma
grande variedade de genes associados com respostas imunes e inflamatória,
como citocinas e fatores de crescimento, diferenciação celular e apoptose,
representando um dos alvos mais conhecidos de PKR (Lever, Cunningham et
al., 2003; Lu, Pang 2005; Su, Wang et al., 2007; Tanaka, Samuel, 1994) (Fig.
5). O principal mecanismo de regulação da atividade de NF-κB é sua interação
com moléculas inibitórias da família IκB (Su, Wang et al., 2007). Estas
proteínas são fosforiladas pelo complexo IKK, que as degrada, permitindo,
assim, a translocação de NF-κB para o núcleo, onde irá regular a transcrição
de diversos genes (Lever, Cunningham et al., 2003).
O NFkB, que é requerido para transcrição máxima de muitas citocinas,
incluindo TNF-α, IL-1, IL-6, e IL-8, assim como na geração de respostas
inflamatórias. Em geral, as citocinas não são armazenadas intracelularmente e
sua secreção culmina da síntese de novas proteínas, assim como na
consequente elaboração de estímulos inflamatórios que poderia regular a
transcrição de vários genes associados à citocinas (Timothy, Blackwell et
al.,1997; Zammanian, et al., 2002).
Assim este projeto buscou investigar uma possível participação de PKR
nos mecanismos neurobiológicos que contribuam para o entendimento da
fisiopatologia da dor crônica inflamatória para que possibilitem o
desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes no tratamento de
condições tão debilitantes.
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Toniolo, E. F.
PKR(fosforilada)
P
PKR(inativa)
IKK(inativa)
IKK(fosforilada)
P
NFB
IB
NFB
IBP P
NFBdegradação
de IB
núcleo
genelet-7a
miR-let-7a
11
citoplasma
Pol II
Adaptado de García et al., 2007
Figura 5: Mecanismo de ação de PKR sobre a atividade de NFB. A fosforilação de PKR (1) permite sua ação sobre o substrato IKK (2), que uma vez ativado (3) induz a fosforilação do fator inibidor IB (4 e 6). A PKR pode, também atuar diretamente sobre o complexo IB-NFB (5). A fosforilação de IB induz a sua degradação pelo sistema ubiquitina-proteasoma (7) deixando o NFB livre para migrar para o núcleo (8 e 9). Pela ligação com seus promotores (10), NFB participa da transcrição de diferentes genes (11).
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Toniolo, E. F.
2. OBJETIVOS
I) Identificar o perfil de expressão do RNAm e da proteína PKR na coluna
dorsal da medula espinal durante processo inflamatório crônico.
II) Monitorar o efeito da inibição de PKR na medula espinal sobre as alterações
de sensibilidade induzidas por doença inflamatória crônica.
III) Investigar o efeito da inibição de PKR sobre a fosforilação das proteínas
p38, JNK e p42/44 na coluna dorsal da medula espinal durante processo
inflamatório crônico.
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Toniolo, E. F.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6/ JUnib
pesando entre 25-30 gramas, sendo provenientes do Biotério Central da
Prefeitura do Campus da Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão
Preto e camundongos machos da linhagem PKR+/+ e PKR+/- pesando entre 25-
30 gramas, provenientes do Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer de
São Paulo. Ambas as linhagens foram acomodados no Biotério do
Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina do Campus da
Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão Preto onde permaneceram
por pelo menos cinco dias antes de serem utilizados em experimentos.
Os animais foram acomodados em gaiolas menores com 4 animais cada; e
mantidos em ambiente com temperatura (22 ± 1°C), sob luminosidade (ciclo
claro:escuro de 12:12 horas; período claro a partir das 6:00 horas), com livre
acesso a água e ração.
Os protocolos experimentais adotados neste projeto foram previamente
aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
(Processo nº 138/2007) (Anexo I) e pelo Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA).
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Toniolo, E. F.
3.2. Modelo experimental de dor crônica de origem inflamatória
periférica
A doença inflamatória crônica foi induzida pela injeção unilateral na região
dorsal da pata esquerda posterior do animal com 20 µL de Adjuvante
Completo de Freund (CFA - fragmentos da forma inativa de microbactéria,
Mycobacterium tuberculosis), obtido da companhia Sigma. Enquanto que para
o grupo controle foi injetado 20µL de veículo (Óleo Mineral), também obtido da
companhia Sigma.
3.2.1. Grupos experimentais referentes à expressão do RNAm do
gene pkr
Foram feitos 11 grupos experimentais para os experimentos relacionados
à verificação da expressão do RNAm do gene pkr, seguiu-se a seguinte
divisão:
Grupo I: animais intactos;
Grupo II: animais injetados com óleo mineral e sacrificados (abater um animal
em experiências de laboratório (Bueno, 2000)) 3 horas após;
Grupo III: animais injetados com CFA e sacrificados 3 horas após;
Grupo IV: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 12 horas após;
Grupo V: animais injetados com CFA e sacrificados 12 horas após;
Grupo VI: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 1dia após;
Grupo VII: animais injetados com CFA e sacrificados 1dia após;
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Toniolo, E. F.
Grupo VIII: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após;
Grupo IX: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após;
Grupo X: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 7 dias após; e
Grupo XI: animais injetados com CFA e sacrificados 7dias após.
3.2.2. Grupos experimentais referentes à Imunohistoquímica
Para os experimentos relacionados à Imunohistoquímica, foram realizados
6 grupos experimentais, seguindo a seguinte divisão:
Grupo I: animais intactos;
Grupo II: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 1dia após;
Grupo III: animais injetados com CFA e sacrificados 1dia após;
Grupo IV: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após;
Grupo V: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção
intratecal do inibidor de PKR (5µM/10µL) e após 40 minutos foram
sacrificados;
Grupo VI: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção
intratecal do controle negativo de inibidor de PKR (5µM/10µL) e após 40
minutos foram sacrificados;
3.2.3. Grupos experimentais referentes ao comportamento dos
animais PKR+/- e PKR+/+
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Toniolo, E. F.
Para os experimentos relacionados ao comportamento dos animais
heterozigotos, foram realizados 8 grupos experimentais, seguindo a seguinte
divisão:
Grupo I: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 1 dia após;
Grupo II: animais injetados com CFA e sacrificados 1 dia após;
Grupo III: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após;
Grupo IV: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após;
Grupo V: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 7 dias após;
Grupo VI: animais injetados com CFA e sacrificados 7dias após;
Grupo VII: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 14 dias após; e
Grupo VIII: animais injetados com CFA e sacrificados 14dias após.
3.2.4. Grupos experimentais referentes à injeção intratecal do
inibidor de PKR
Para os experimentos relacionados à técnica de injeção intratecal foram
feitos 6 grupos experimentais, seguindo a seguinte divisão:
Grupo I: animais injetados com óleo mineral e após 3 dias receberam injeção
intratecal do Inibidor de PKR na dose de 5µM/10µL;
Grupo II: animais injetados com óleo mineral e após 3 dias receberam injeção
intratecal de Inibidor de PKR na dose de 1µM/10µL;
Grupo III: animais injetados com óleo mineral e após 3 dias receberam injeção
intratecal de Inibidor de PKR na dose de 0.05µM/10µL;
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Toniolo, E. F.
Grupo IV: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção
intratecal de Inibidor de PKR na dose de 5µM/10µL;;
Grupo V: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção
intratecal de Inibidor de PKR na dose de 1µM/10µL; e
Grupo VI: animais injetados com CFA e após 3 dias receberam injeção
intratecal de Inibidor de PKR na dose de 0.05µM/10µL
3.2.5. Grupos experimentais relacionados à imunodetecção do
estado de fosforilação das proteínas p38, JNK e p42/44
Já para os experimentos relacionados à imunodetecção do estado de
fosforilação das proteínas p38, JNK e p42/44, foi seguido a seguinte divisão:
Grupo I: animais intactos;
Grupo II: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após com
posterior verificação do estado de fosforilação das proteínas;
Grupo III: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após com posterior
verificação do estado de fosforilação das proteínas;
Grupo IV: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após e com
injeção intratecal de inibidor de PKR com posterior verificação do estado de
fosforilação das proteínas;
Grupo V: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após e com injeção
intratecal de inibidor de PKR com posterior verificação do estado de
fosforilação das proteínas;
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24
Toniolo, E. F.
Grupo VI: animais injetados com óleo mineral e sacrificados 3 dias após e com
injeção intratecal de controle negativo com posterior verificação do estado de
fosforilação das proteínas; e
Grupo VII: animais injetados com CFA e sacrificados 3 dias após e com
injeção intratecal de controle negativo com posterior verificação do estado de
fosforilação das proteínas.
3.3. Monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo
mecânico antes e após a inflamação periférica gerada por CFA
e óleo mineral para o monitoramento de alodínia
As avaliações da sensibilidade somática ao estímulo mecânico foram
realizadas com a utilização dos filamentos de von Frey, onde todas as
avaliações foram feitas entre 8:00 e 17:00 horas.
Os filamentos de von Frey consistem em filamentos de nylon de diferentes
diâmetros responsáveis por empregar diferentes intensidades de força. Tal
teste consiste em um conjunto de nove filamentos que foram aplicados sobre a
região plantar da pata posterior esquerda de cada animal, sendo que o limiar
de retirada da pata foi determinado pelo aumento ou diminuição seqüencial da
força (de 1,62 mN a 35,59 mN) de cada estímulo (Fig. 6).
O monitoramento da sensibilidade mecânica foi baseado no método de
Dixon (Chaplan, et. al., 1994) e os filamentos utilizados foram: 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12. O teste foi iniciado sempre com o filamento 8 e a contagem da
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25
Toniolo, E. F.
série de respostas foi iniciada quando a primeira resposta foi negativa e a
segunda positiva. A partir desta resposta negativa/positiva, foram registradas
mais quatro respostas, respeitando-se sempre o princípio de que uma resposta
positiva é sempre seguida por um estímulo (filamento) inferior, enquanto que
uma resposta negativa é sempre seguida por um estímulo (filamento) superior.
Sendo que uma resposta é considerada positiva quando o animal retira a pata
ao estímulo mecânico, e negativa quando o animal não possuiu reação alguma.
O limiar de retirada da pata do animal foi analisado observando os padrões
de respostas, onde estes padrões foram inseridos no cálculo a seguir:
50% g = 10 [ Xf + K.γ]
Sendo que:
Xf é o valor do último filamento em gramas que é convertido em log de
base 10;
K: é o valor da seqüência de seis respostas as quais os dados foram
retirados da tabela (Chaplan, et. al., 1994); e
δ: é a média da diferença (em log) entre os filamentos apresentados.
Dessa maneira, o teste de von Frey foi realizado duas vezes em cada
animal, ou seja, antes de sofrer a intervenção que gerasse a dor inflamatória,
para o monitoramento do comportamento basal destes animais, e após o
período de tratamento. A resposta flexora ao estímulo mecânico foi então
monitorada antes do sacrifício e somente os animais com alodínia mecânica
participaram dos experimentos. A comparação entre os diferentes grupos foi
realizada pelo teste estatístico ANOVA de duas vias, seguido do teste de
Bonferroni e as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0.05.
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Toniolo, E. F.
Sendo que após esse procedimento os animais foram sacrificados através do
deslocamento cervical para posterior extração dos tecidos de interesse (gânglio
da raiz dorsal e coluna dorsal da medula espinal entre L4 e L6) (Fig. 7), ambos
foram extraídos do lado esquerdo, onde foram realizadas as injeções de CFA
ou Óleo mineral.
Baseado no método de Dixon (Chaplan et al., 1994)
Figura 6: Fotografia representativa do teste de sensibilidade mecânica (A e B). Fotografia de um filamento de nylon utilizado na realização do teste de sensibilidade mecânica (C).
A B C
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Toniolo, E. F.
Adaptado de Klusa ‘kova’ I. Dubovy P, Annais of Anatomy (2009) (A)
Figura 7: (A) Representação esquemática do gânglio da raiz dorsal e (B) da coluna dorsal da medula espinal entre L4 e L6.
3.4. Monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo
nociceptivo térmico
Inicialmente os animais da linhagem C57BL/6/ JUnib passaram por
processo de habituação no compartimento em que os testes comportamentais
seriam realizados. Assim, os animais foram mantidos por 1 hora em
compartimentos de 15 cm2 com superfície de vidro transparente e temperatura
controlada (300 C) (Figura 8). Este procedimento se repetiu por 3 dias
consecutivos imediatamente anteriores à realização dos experimentos. O vidro
A B
Sural
Tibial Peroneal Comum
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28
Toniolo, E. F.
permitia a passagem de feixe de luz, que era capaz de provocar o estímulo
doloroso térmico, esse feixe foi ajustado a 20% da intensidade máxima de
aquecimento. Após esse período de habituação os animais passaram por um
teste basal no qual o feixe de luz foi dirigido à superfície plantar da pata
posterior esquerda do animal por três vezes com intervalos de cinco minutos
(o estímulo nociceptivo foi aplicado por período máximo de 20 segundos para
evitar lesão na pata do animal). Após a realização do teste basal cada grupo
experimental foi submetido à injeção subcutânea unilateral na região dorsal da
pata esquerda de 20 µL de CFA ou 20µL Óleo Mineral e aguardado o período
respectivo do tratamento de cada grupo experimental. Os animais PKR+/- e
PKR+/+ passaram pelo mesmo processo descrito anteriormente, mas sem ser
necessário passar pelo teste de habituação.
Os animais foram colocados novamente nos compartimentos de 15 cm2
para o monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo
térmico após a indução de inflamação. Assim, foi possível monitorar o período
de latência para a retirada da pata para ser avaliado o aparecimento de
hipernocicepção. Os animais que não apresentaram hipernocicepção após
injeção de CFA foram retirados do experimento.
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29
Toniolo, E. F.
Life Science, p. 53
Figura 8: Fotografia representativa do equipamento para a realização do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico (A), fotografia representando o momento do teste onde os animais são acomodados individualmente em compartimentos de 15 cm2. (B) Superfície do equipamento de vidro transparente que permite a passagem de feixe de luz.
3.5. Extração de RNA total
Após sacrificar por deslocamento cervical os animais, os gânglios da
raiz dorsal e o corno dorsal da medula espinal correspondentes aos segmentos
lombares de L4 a L6 foram rapidamente removidos e homogeneizados em
reagente Trizol® (Invitrogen) dando seqüência à extração de RNA total como
descrito em protocolo padrão deste fornecedor (Fig.10). O êxito da extração foi
verificado pela quantificação de RNA total da amostra em espectrofotômetro
A
B
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30
Toniolo, E. F.
nos comprimentos de onda de 230, 260 e 280; onde foram observadas as
relações de absorbância 230/260 = 2,0 a 2,5 e 260/280 = 1,8 a 2,0 para a
certificação de que todas as amostras estavam livres de fenol e de proteínas,
respectivamente. As amostras que se apresentaram fora destes padrões foram
descartadas.
3.6. Transcrição reversa
Para a verificação da expressão do RNAm do gene pkr, foi utilizada a
técnica da reação da cadeia de polimerase (RT-PCR) a partir da reação de
transcrição reversa (RT) (Fig. 9) do RNA total dos tecidos em questão. A
reação de transcrição reversa foi realizada usando protocolo padrão do
TaqMan® RT Kit (Applied Biosystems). Foi utilizado 2,0 µL de RT primer do
TaqMan® Gene Expression Assays (AppliedBiosystems); 0,8 µL de dNTP
(100mM); 2,0 µL de RT Buffer 10x; 0,20µL de inibidor de RNAse (20U/µL);
1,0µL de Multiscribe RT enzima (50U/µL); 3,2 µL de água livre de nucleases e
10ng de RNA total com volume total de 2,0µL. A reação foi incubada por 30
minutos a 16ºC e 30 minutos a 42ºC. O produto final foi diluído em 4 vezes com
água livre de nucleases. Posterior a esse passo foi realizado a reação em
Cadeia de Polimerase em Tempo Real.
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31
Toniolo, E. F.
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol–Applied Biosystems
Figura 9: Caracterização dos mecanismos envolvidos na reação de transcrição reversa e na reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real.
3.7. Reação em cadeia da polimerase em tempo real
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32
Toniolo, E. F.
Para a reação de amplificação foi utilizado TaqMan® Universal PCR Master
Mix, No AmpErase UNG (Applied Biosystems) e o conjunto de primer e sonda
específicos para PKR (Applied Biosystem) seguindo o protocolo padrão. Todas
as reações foram feitas em duplicatas e normalizadas com a expressão do
controle endógeno. O controle endógeno utilizado foi o gene da β-actina cujos
primers e sondas utilizados foram os do Pré-Developed TaqMan® Assay
Reagents Mouse β-actin (Applied Biosystems). A reação de amplificação
utilizou os seguintes primers para PKR: sense 5-
GCAGTTAGTCCTTTATTATT-3′ e antisense 5-TTGTTCGCTTTCCATCATTT-3.
As amostras foram incubadas simultaneamente por 10 minutos a 95ºC
(1 ciclo); por 15 segundos a 95ºC e por 1 minuto a 60 ºC (40 ciclos). A
expressão relativa ao gene de PKR foi determinada utilizando o método 2-∆∆CT
(Livak e Schmittgen, 2001). O Ct (cycle threshold) foi definido como o número
fracionado de ciclos em que a fluorescência detectada passava pelo limiar
fixado dentro da fase exponencial da curva de amplificação (threshold).
Inicialmente calcularam-se as médias e o desvio padrão dos valores do Ct
obtidos nas duplicadas de cada amostra, sendo que foram consideradas
apenas as duplicatas com desvio padrão ≤ 0,2.
O Ct médio para cada amostra foi normalizado através da subtração do
Ct médio do controle endógeno correspondente (Ct= Ctamostra – Ctß-actina);
enquanto que o valor de Ct para cada amostra de PKR foi normalizado em
relação à amostra calibradora ou de referência (Ctamostra – Ctreferência), sendo que
a amostra referência foi representada pelos animais do grupo Intacto. Esses
valores foram utilizados na expressão 2∆∆CT, o que reflete a proporção da
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33
Toniolo, E. F.
expressão do gene de cada amostra em relação à amostra referência (Figura
11). A análise estatística foi realizada por meio de teste estatístico ANOVA de
uma via seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett e as
diferenças foram consideradas significativas quando p < 0.05.
Teste basal de von Frey Injeção de CFA/ 3h 12h 24h 72h 7d
em todos os grupos Óleo mineral/ Intacto Após injeção de CFA/óleo Mineral
Realização novamente do teste de von Frey
Extração do tecido
Extração do RNA
Leituras Espectrofotométricas
Expressão do RNAm do gene pkr foi analisada pela reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Para a reação de transcrição reversa (RT) foi usando o protocolo padrão do TaqMan® RNA RT Kit (Applied Biosystems). Os resultados foram analisados pelo método 2-ΔΔCt Kenneth J. Livak e Thomas D. Schmittgen, 2001.
Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental empregado para a identificação do perfil de expressão do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinal durante processo inflamatório.
3.8. Imunohistoquímica
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
34
Toniolo, E. F.
Os camundongos foram perfundidos com tampão fosfato por um minuto
(5mL/min) e paraformaldeído (4%) por nove minutos (5mL/min). Após a
perfusão, o corno dorsal da medula espinal (L4-L6), foi dissecado e pós-fixados
na mesma solução de perfusão por 60 minutos, posterirmente os tecidos foram
tamponados com sacarose 30% por 24 horas para crioproteção. Os tecidos
foram cortados em criostato com uma espessura de 60 µm. Para a
imunodetecção por fluorescência, os tecidos foram incubados no anticorpo
primário anti-fosfoPKR na concentração de 1:100 por 24 horas a 40C e em
seguida passaram por 3 lavagens de 10 minutos cada em PBS 0.01M, pH 7.4 e
Triton X-100 0,3%. Posteriormente os tecidos foram incubados em anticorpos
secundários na concentração de 1:500 por 2 horas em temperatura ambiente.
Todos os anticorpos foram diluídos em tampão fosfato 0.01M, pH 7.4 e Triton
X-100 0,3%. Em seguida, os cortes foram montados sobre a as lâminas em
VECTASHIELD com DAPI (Vector) e examinadas em microscópio de
fluorescência convencional.
3.9. Técnica de injeção intratecal
O camundongo foi segurado na região pélvica com uma das mãos por
um experimentador, enquanto um outro experimentador segurava a seringa em
um ângulo de 200 acima da coluna vertebral. A agulha foi enserida entre o
processo espinhoso de L5 e L6, a agulha foi inserida cuidadosamente no
espaço intervertebral diminuindo o ângulo para 100 e por aproximadamente 0,5
cm (Fig. 11), seguindo assim o modelo embregado por Hylden. J e Wilcox. G
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
35
Toniolo, E. F.
em 1980. Tanto o inibidor de PKR, quanto seu controle negativo, foram
dissolvidos em aCSF (fluido cerebrospinal artificial) (NaCl-120mM, KCL-3mM,
NaH2PO4-0.6mM, MgSO4-0.8nM, NaHCO3-18mM, glucose 10mM e CaCl2-
1.1mM) e DMSO 5%. O Inibidor de PKR e o controle negativo de PKR foram
injetados intratecal com os volumes de 5µM/10µL, 1µM/10µL e 0.05µM/10µL.
Adaptado de Hylden e Wilcox, 1980
Figura 11: Diagrama demonstrando a inserção da agulha no espaço intervertebral entre L5 e L6, utilizado na técnica de injeção intratecal.
Inicialmente os animais da linhagem C57BL/6/ JUnib passaram por
processo de habituação no compartimento em que os testes comportamentais
seriam realizados. Assim, os animais foram mantidos por 1 hora em
compartimentos de 15 cm2 com superfície de vidro transparente e temperatura
controlada (300 C). Este procedimento se repetiu por 3 dias consecutivos
imediatamente anteriores à injeção i.t.. O vidro permitia a passagem de feixe
de luz, que era capaz de provocar o estímulo doloroso térmico, esse feixe foi
Processo espinhoso
Processo transverso
Medula espinhal Cauda equina
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
36
Toniolo, E. F.
ajustado a 20% da intensidade máxima de aquecimento do feixe luminoso.
Após esse período de habituação os animais passaram por um teste basal no
qual o feixe de luz foi dirigido à superfície plantar da pata posterior esquerda
do animal por três vezes com intervalos de cinco minutos (o estímulo
nociceptivo foi aplicado por um período máximo de 20 segundos para evitar
lesão na pata do animal). Após a realização do teste basal cada grupo
experimental foi submetido à injeção subcutânea unilateral na região dorsal da
pata esquerda de 20 µL de CFA ou 20µL Óleo Mineral e aguardado o período
respectivo do tratamento de cada grupo experimental.
Os animais foram colocados novamente nos compartimentos de 15 cm2
para o monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo
térmico após a indução de inflamação. Assim, foi possível monitorar o período
de latência para a retirada da pata para avaliar o aparecimento de
hipernocicepção. Os animais que não apresentaram hipernocicepção após
injeção de CFA foram retirados do experimento.
Posteriormente, foi feita a injeção intratecal com a administração de
Inibidor de PKR ou do seu Controle Negativo. O animal foi, então, novamente
colocado no equipamento para que se medisse a latência para a retirada da
pata após o estímulo nociceptivo térmico. O aparecimento de hipernocicepção
foi monitorado 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos após a injeção intratecal (Fig.
12). A comparação entre os diferentes grupos foi realizada pelo teste (ANOVA
de duas vias, seguido do teste de Bonferroni,e as diferenças foram
consideradas significativas quando p < 0.05.
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37
Toniolo, E. F.
Injeção de CFA/ Intacto 1d 3d 7d 14d
Óleo mineral Após injeção de CFA/Óleo Mineral
Figura 12: Representação esquemática do protocolo experimental do monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico. Antes e durante processo inflamatório; e antes e após injeção intratecal de Inibidor de PKR e Controle Negativo de Inibidor de PKR.
3.10. Imunodetecção do estado de fosforilação das proteínas p38,
JNK e p42/44 na coluna dorsal da medula espinhal durante a
doença inflamatória crônica
Teste basal de monitoramento das alterações de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico em todos os grupos
Realização novamente do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico
Injeção Intratecal (Inibidor de PKR (527450-MERCK) ou Controle Negativo de PKR (527455-MERCK)) e após 15/30/45/60 minutos realização do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico
Realização novamente do teste de sensibilidade ao estímulo nociceptivo térmico após 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção intratecal
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
38
Toniolo, E. F.
Os animais foram agrupados aleatoriamente e submetidos à injeção
subcutânea de 20 µL de CFA ou 20 µL de Óleo Mineral. Os tecidos foram
retirados 3 dias, após a injeção, a fim de se investigar a atividade das
respectivas proteínas durante o processo inflamatório periférico (Fig. 13). A
coluna dorsal da medula espinal entre os seguimentos L4-L6 foi dissecada para
extração de proteínas totais, para posterior quantificação das proteínas p38,
JNK e p42/44 em sua forma fosforilada por western blot.
O material coletado foi mantido em gelo-seco, até a adição do tampão de
lise contendo 137 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8, 1% de NP-40, 0,105% de SDS,
10% de glicerol e inibidores de proteases (PMSF, aprotinina e leupeptina) e
fosfatases (NaF, Na2VnO4). Foi então realizada a homogeneização do tecido,
onde o homogenato seguiu para agitação em câmara fria por 10 minutos e foi
então centrifugado a 40000 xg por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido
para dois novos tubos: um tubo contendo o volume de 3 µL que foi armazenado
a -20ºC e foi utilizado para quantificação de proteínas totais e outro tubo com o
restante da amostra foi mantido a -80ºC até a realização da eletroforese. A
quantificação de proteínas totais foi realizada com kit DC-ProteinAssay
(BioRad) baseado no método de Lowry, e a leitura realizada em
espectrofotômetro em 750 nm.
Os volumes de amostra, carregados em cada poço, foram ajustados (a
partir da quantificação) para que a mesma quantidade de proteína fosse
alcançada (20µg para p38 e JNK e 30µg para p42/44). Foi então adicionado
tampão de amostra (contendo 3-βmercaptoetanol como agente desnaturante),
agitado e aquecido a 95ºC por 5 minutos. O gel utilizado na eletroforese foi de
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
39
Toniolo, E. F.
10%. A eletroforese foi realizada com tampão Tris-Glicina, em câmara fria por
3 horas, 110 V e 400 mA. O gel, após ser retirado do aparato, foi mantido em
tampão de Towbin 10% Metanol por aproximadamente 30 minutos, juntamente
com a membrana de PVDF previamente ativada em metanol, afim de que
equilibrassem ao tampão e evitar distorções na transferência. A transferência
foi realizada também em câmara fria, por 01h30min a 100 V e 400 mA (para
p38, JNK e p42/44).
Após a transferência as membranas foram lavadas em tampão TBS por 5
vezes de 5 minutos e incubadas em solução de bloqueio (TBS 0,1% Tween 20
5% albumina bovina) por 1 hora em temperatura ambiente. Após o bloqueio, as
membranas foram lavadas em TBS 0,1% Tween 20 (TBS/T) por 5 minutos e
incubadas com anticorpo primário, para forma fosforilada da proteína, diluído
1:1000 (para p38, JNK e p42/44) em solução de bloqueio, mantido na câmara
fria, por 24 horas, sob agitação. Após a incubação no anticorpo primário, as
membranas foram lavadas em TBS/T por 5 minutos, cinco vezes, e então
incubadas com o anticorpo secundário diluído 1:2000 (para p38, JNK e p42/44)
em solução de bloqueio, por 1 hora à temperatura ambiente, sob agitação. As
membranas foram novamente lavadas por cinco vezes de 5 minutos em TBS/T
e a revelação realizada com substrato quimioluminescente (GE Lifesciences). A
intensidade das bandas foi quantificada em fotodocumentador acoplado à
câmera CCD (Kodak GelLogic 2200) e analisada em software do equipamento.
As membranas foram posteriormente lavadas em TBS/T por 5 minutos e
com tampão de remoção por 30 segundos a 50ºC para retirada do complexo de
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
40
Toniolo, E. F.
anticorpos. Em seguida, as membranas foram lavadas em água corrente por 1
hora, reidratadas em metanol por 1 minuto, lavadas em TBS/T por 5 minutos e
reiniciado o processo de bloqueio e incubação, desta vez com anticorpo
primário para a proteína total 1:1000 (para p38 e JNK), 1:2000 ( para p42/44) e
de anticorpo secundário na concentração de 1:2000 (para p38, JNK e p42/44).
Após a quantificação da proteína total, a intensidade da forma fosforilada foi
normalizada com relação a ela. A análise estatística foi feita por t teste, as
diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.
Teste basal de Injeção de CFA/ Intacto 3 dias
sensibilidade térmica Óleo mineral/ Intacto Após injeção de CFA/Óleo Mineral
Realização novamente do teste de sensibilidade térmica
Extração do tecido
Extração dos extratos protéicos totais
Quantificação da proteína
Western Blot
Figura 13: Representação esquemática do protocolo experimental empregado para a imunodetecção das proteínas p38, JNK e p42/44 e seus resíduos fosforilados no gânglio da raiz dorsal e na coluna dorsal da medula espinal durante processo inflamatório.
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
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Toniolo, E. F.
4. RESULTADOS
4.1. Perfil de expressão do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal e
na coluna dorsal da medula espinal durante processo
inflamatório crônico
Durante a inflamação persistente, ocorreu aumento significativo do RNAm
de PKR, tanto no gânglio da raiz dorsal (Fig. 14A), quanto na coluna dorsal da
medula espinal (Fig. 14B). Entretanto, no gânglio este aumento foi observado
já nas primeiras 3 horas após a injeção de CFA e se manteve aumentado até o
7º dia após a injeção de CFA. Na medula espinal este aumento só foi
observado a partir do 3o dia de investigação e permaneceu elevado até 7 dias
após o início do processo inflamatório.
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
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Toniolo, E. F.
CTL 3h 12h 24h 3 d 7 d0
2
4
6
8
1
*
* **
*Ex
pres
são
rela
tiva
CTL 3h 12h 24h 3 d 7 d0
1
2
3
4
5
* *
Expr
essã
o re
lativ
a
Figura 14: Expressão relativa do RNAm de PKR no gânglio da raiz dorsal (A) e no corno dorsal da medula espinal (B) em animais submetidos a inflamação crônica. Grupo controle (CTL) com animais submetidos à injeção intraplantar de óleo mineral. (ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett, * p < 0,05, n=5).
Tais resultados sugerem que PKR pode desempenhar papéis
importantes nos mecanismos neurobiológicos de manutenção das alterações
de doença inflamatória crônica. Nossos dados indicam, claramente, que o
estímulo nociceptivo induz aumento na expressão de PKR e que as mudanças
A
B
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
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Toniolo, E. F.
no perfil de expressão desta quinase apresentam grande especificidade
tecidual e temporal nos segmentos periférico e central do sistema nervoso.
4.2. Imunohistoquímica para a proteína p-PKR na coluna dorsal da
medula espinal durante processo inflamatório crônico
Podemos sugerir que a injeção de óleo mineral causou pequena alteração
na forma ativa da proteína PKR no corno dorsal da medula espinal quando
comparado com o animal intacto (Fig. 15A e 15B). Já quando foi realizada a
injeção de CFA por um dia (Fig. 15C) podemos observar uma marcação ainda
mais intensa da forma fosforilada de PKR e quando observado o corno dorsal
após o período de três dias de inflamação (Fig. 15D) notamos que há grande
presença da forma ativa da proteína PKR no corno dorsal.
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
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Toniolo, E. F.
Figura 15: Imunohistoquímica para a proteína p-PKR no corno dorsal da medula espinal. (A) Podemos observar a forma ativa da proteína PKR em animal intacto no corno dorsal da medula espinal, já em B observamos que a injeção de óleo mineral causou pequena alteração na forma ativa da proteína PKR no corno dorsal da medula espinal quando comparado com o animal intacto. (C) Quando observado o animal que recebeu 1 dia de injeção de CFA nota-se que há uma marcação ainda mais intensa da forma fosforilada de PKR, e em (D) quando observado o corno dorsal após o período de três dias de inflamação observamos que há grande presença da forma ativa da proteína PKR no corno dorsal.
B
C D
Intacto Veículo 1 d
CFA 1 d CFA 3 d
A
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Toniolo, E. F.
4.3. Monitoramento do efeito do estímulo mecânico e do estímulo
térmico sobre as alterações de sensibilidade induzidas por
doença inflamatória crônica em camundongos PKR+/- e PKR+/+
A injeção de CFA induziu inflamação na pata injetada provocando uma
redução, significativa (***p <0,0001), da latência de retirada da pata para o
estímulo térmico, tanto no animal PKR+/, quanto no PKR+/+, caracterizando
assim, o fenômeno de hipernocicepção (Fig. 16 B). Por outro lado, a injeção
de óleo mineral não exerceu qualquer efeito sobre a latência de retirada da
pata para o mesmo estímulo, tanto no PKR+/-, quanto no PKR+/+ (Fig. 16 A).
Entretanto, a redução do limiar de sensibilidade ao estímulo térmico foi
significativamente menor (**p < 0,01) nos animais PKR+/-, quando comparados
aos animais PKR+/+.
Nos animais PKR+/- e PKR+/+ a injeção de óleo mineral não exerceu
qualquer efeito sobre o limiar de retirada da pata após o estímulo mecânico.
Por outro lado, a injeção de CFA induziu inflamação na pata injetada,
provocando uma redução, significativa p < 0,0001, do limiar de retirada da
pata para o estímulo mecânico, tanto no animal PKR+/, quanto no PKR+/+ (Fig.
17 A e B).
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Toniolo, E. F.
0
3
6
9
12
15
PKR+/-
PKR+/+
Tempo (dias)1 3 7 14
Latê
ncia
(s)
0
3
6
9
12
15
PKR+/-
PKR+/+
Tempo (dias)
*****
**
1 3 7 14
Latê
ncia
(s)
**
Figura 16: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação térmica. (A) A administração de óleo mineral não alterou a latência de retirada da pata após o estímulo térmico tanto para o animal PKR+/+ quanto para o PKR+/- no decorrer do tempo, enquanto que a administração de CFA reduziu, significativamente (***p < 0,0001), a latência de retirada da pata após a estimulação térmica tanto nos animais PKR+/+ quanto para os PKR+/-. Os animais PKR+/- apresentaram um aumento, significativo (**p < 0,01), na latência de retirada da pata quando relacionados com os animais PKR+/+ (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, **p < 0,01 e ***p < 0,0001, n= 8).
A
B
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Toniolo, E. F.
0.0
0.4
0.8
1.2
PKR+/-
PKR+/+
0 1 3 7 14Tempo (dias)
50%
Lim
iar (
g)
0.0
0.4
0.8
1.2
PKR+/-
PKR+/+
0 1 3 7 14Tempo (dias)
50%
Lim
iar
(g)
Figura 17: Efeito da injeção de óleo mineral e CFA observada em animais PKR+/- e PKR+/+ durante a estimulação mecânica. (A) Administração de óleo mineral não alterou o limiar de retirada da pata após a estimulação mecânica para os animais PKR+/+ e nem para os PKR+/-. (B) Já quando foi realizada a administração de CFA, ocorreu uma redução, significativa, onde o limiar de retirada da pata após a estimulação mecânica tanto nos animais PKR+/+ quanto para os PKR+/- perduraram durante os 14 dias que foram avaliados. (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, *** p < 0,0001, n= 8-11).
A
B
*** *** *** ***
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Toniolo, E. F.
4.4. Monitoramento do efeito da inibição de PKR na medula espinal
sobre as alterações de sensibilidade induzidas por doença
inflamatória crônica
A injeção de CFA induziu inflamação na pata injetada provocando redução,
significativa (p < 0,0001), do limiar de retirada da pata para o estímulo térmico
(Fig. 18B). Por outro lado, a injeção de óleo mineral não exerceu qualquer
efeito sobre o limiar de retirada da pata para o mesmo estímulo (Fig. 18 A). A
administração i.t. do Inibidor de PKR na dose de 1µM/10µL reduziu
parcialmente a hipernocicepção térmica, enquanto que a dose de 5µM/10µL
provocou uma reversão total da hiperalgesia nos animais com inflamação
periférica (Fig. 18 B). Já quando foi administrada a dose de 0.05µM/10µL não
ocorreu alteração alguma. Além disso, os animais que receberam óleo mineral
com posterior injeção intratecal de inibidor de PKR nas doses de 5µM/10µL,
1µM/10µL e 0.05µM/10µL também não apresentaram alteração na latência de
retirada da pata (Fig. 18 A).
Nos animais que receberam a injeção com o controle negativo do inibidor
de PKR, não foi observada qualquer alteração no efeito hipernociceptivo
induzido por CFA. Além disso, a administração do controle negativo do
inibidor de PKR nos animais sem inflamação periférica, que receberam a
injeção de óleo mineral, também não demonstrou qualquer alteração da
latência de retirada da pata.
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Toniolo, E. F.
-30 0 30 60 90 120
0
5
10
15
Óleo Mineral 3d + 5M/10L
Óleo Mineral 3d + 0.05M/10L
Óleo Mineral 3d + 1uM/10L
Tempo (min)
Latê
ncia
(s)
-30 0 30 60 90 120
0
5
10
15
CFA 3d + 5M/10L
CFA 3d + 0.05M/10L
CFA 3d + 1 M/10L
Tempo (min)
Latê
ncia
(s)
Figura 18: Efeito da injeção intratecal (i.t.) de inibidor de PKR sobre a hipernocicepção térmica induzida pela administração subcutânea de CFA em camundongos C57BL/6. (A) Três dias após a injeção de óleo mineral, a administração de inibidor de PKR nas diferentes concentrações não alterou a latência de retirada da pata após o estímulo térmico (n= 11). (B) Já a administração de CFA reduziu, significativamente (#p < 0,0001), a latência de retirada da pata após a estimulação térmica em todos os grupos. Por outro lado, a injeção i.t. de inibidor de PKR reverteu totalmente a hipernocicepção induzida pelo estímulo térmico induzida por CFA após
A
B
*** *** ***
* #
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Toniolo, E. F.
30 minutos da realização da injeção (***p < 0,001). Esse efeito perdurou por 60 minutos quando administrada na dose de 5µM/10µL. Quando administrada a dose de 1µM/10µL ocorreu uma redução parcial da hipernocicepção induzida por CFA após 60 minutos quando comparado com os animais que receberam a dose de 0,05µM/10µL (*p < 0,05), enquanto que a dose de 0,05µM/10µL não causou alteração alguma. (ANOVA de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, * p < 0,05 e *** p < 0,001; e teste t de Student, #p < 0,0001, n= 12).
Nossos resultados sugerem que a atividade de PKR está associada com
mecanismos de origem e manutenção da dor crônica de origem inflamatória,
em neurônios ou células da glia na coluna dorsal da medula espinal. Nossos
resultados ressaltam, principalmente, a participação de PKR no
desenvolvimento da hipernocicepção.
4.5. Efeito da inflamação crônica sobre o estado de fosforilação das
proteínas p38, JNK e p42/44 na coluna dorsal da medula espinal
Durante a inflamação crônica de origem inflamatória, há aumento
significativo da fosforilação das proteínas p38 e JNK, mas não de p42/44 na
coluna dorsal da medula espinal (Fig. 19 e 20). Este aumento foi observado no
terceiro dia após a injeção de CFA quando comparado com animais intactos e
com animais que foram administrados óleo mineral. Entretanto, após a
administração de inibidor de PKR (5µM/10µL) nos animais com 3 dias de
inflamação ocorreu diminuição significativa p da expressão de p38 e JNK (Fig.
19, 20). Por outro lado, o inibidor de PKR não teve qualquer efeito sobre a
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia/FMRP/USP
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Toniolo, E. F.
fosforilação de p42/44 (Fig. 21). Já os animais que receberam controle
negativo de inibidor de PKR (5µM/10µL) com 3 dias de inflamação não ocorreu
alteração alguma na fosforilação dessas proteínas quando comparados aos
animais com 3 dias de inflamação. (Fig. 19 e 20).
Intacto
Óleo 3d
CFA 3d
CFA + inib
CFA + cn
Óleo +
inib0
50
100
150
200
250 **
% s
obre
o c
ontr
ole
Figura 19: Inflamação crônica induz a fosforilação de p38 na coluna dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6. Os animais receberam injeção de CFA (20 µl) ou Óleo Mineral (20 µl) na região dorsal da pata posterior esquerda. Os painéis superiores ao gráfico representam um filtro de Western blot dos extratos da coluna dorsal da medula espinal dos animais submetidos à inflamação induzida por CFA ou óleo mineral e o tratamento com inibidor de PKR ou seu controle negativo. Gráfico representa a análise quantitativa de fosfo-p38 nos diferentes grupos experimentais. O resultado está expresso como a porcentagem média da razão dos níveis da intensidade do sinal de fosfo-p38 para p38 total (forma não fosforilada). (*p < 0,05; teste t de Student, n= 6-7).
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Intacto
Óleo 3d
CFA 3d
CFA + inib
CFA + cn
Óleo +
inib0
50
100
150
200
250
*
*
% s
obre
o c
ontr
ole
Figura 20: Inflamação crônica induz a fosforilação de JNK na coluna dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6. Os animais receberam injeção de CFA (20 µl) ou Óleo Mineral (20 µl) na região dorsal da pata posterior esquerda. Os painéis superiores ao gráfico representam um filtro de Western blot dos extratos da coluna dorsal da medula espinal dos animais submetidos à inflamação induzida por CFA ou óleo mineral e o tratamento com inibidor de PKR ou seu controle negativo. Gráfico representa a análise quantitativa de fosfo-JNK nos diferentes grupos experimentais. O resultado está expresso como a porcentagem média da razão dos níveis da intensidade do sinal de fosfo-JNK para JNK total (forma não fosforilada). (*p < 0,05; teste t de Student, n= 4-5).
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Intac
to p42/44
Óleo 3d
-p42/44
CFA 3d-p42
/44
CFA + inib p42
/44
CFA + cn
p42/44
Óleo + in
ib p42/44
0
50
100
150
200
% s
obre
o c
ontr
ole
Figura 21: Inflamação crônica (3 dias) não induz um aumento da fosforilação de p42/44 na coluna dorsal da medula espinal de camundongos C57BL/6. Os animais receberam injeção de CFA (20 µl) ou Óleo Mineral (20 µl) na região dorsal da pata posterior esquerda. Os painéis superiores ao gráfico representam um filtro de Western blot dos extratos da coluna dorsal da medula espinal dos animais submetidos à injeção de CFA ou óleo mineral e o tratamento com inibidor de PKR ou seu controle negativo. Gráfico representa a análise quantitativa de fosfo-p42/44 nos diferentes grupos experimentais. O resultado está expresso como a porcentagem média da razão dos níveis da intensidade do sinal de fosfo-p42/44 para p42/44 total (forma não fosforilada). (*p < 0,05; teste t de Student, n= 6-7).
Esses resultados reforçam a idéia de que PKR pode desempenhar
papel importante nos mecanismos neurobiológicos de manutenção das
alterações de sensibilidade provocadas por processo inflamatório crônico.
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Nossos dados indicam, claramente, que o estímulo nociceptivo induz um
aumento da atividade da proteína PKR na coluna dorsal da medula espinal
onde a informação nociceptiva é inicialmente processada pelo SNC.
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5. DISCUSSÃO:
Nossos resultados indicam que PKR está presente, tanto no gânglio da
raiz dorsal, quanto na coluna dorsal da medula espinal e sua expressão e
atividade estão, significativamente, aumentados durante processo inflamatório
crônico. Demonstramos ainda que PKR desempenha um papel pró-
nociceptivo através de diferentes mecanismos espinais de
transmissão da dor persistente. Dentre esses mecanismos, destacamos a
ativação das MAPKs p38 e JNK, cujo aumento da fosforilação em neurônios
do corno dorsal durante inflamação crônica periférica é bloqueado pela
inibição da atividade de PKR.
Diversos mediadores envolvidos na gênese do processo inflamatório,
os quais podem levar a ativação de inúmeras vias de sinalização, são capazes
de ativar e sensibilizar neurônios nociceptivos periféricos e centrais envolvidos
com os mecanismos de manutenção da dor crônica (Garcia, Meurs et al.,
2007). Tais fatores mobilizam mediadores citoplasmáticos a partir de
receptores TLR, que promovem a dimerização e autofosforilação de PKR que
culminará com ativação de suas vias de transdução (Bennett, Blalock et al.,
2006; Cole, 2007; Scheuner, Davies et al., 2003; Williams, 1997). Dessa
maneira, tanto no gânglio da raiz dorsal, quanto na coluna dorsal da medula
espinal, PKR pode está agindo através de diversos mediadores envolvidos
com os mecanismos intracelulares de sensibilização de populações celulares
envolvidas na manutenção da dor. Por exemplo, membros da família das
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MAPKs (ERK-1 e ERK-2, p38 e JNK) e NF-κB são, possivelmente, os
principais intermediários envolvidos com esses mecanismos, tanto
perifericamente, quanto no sistema nervoso central (Bonnet, Weil et al., 2000;
Kadereit, Galabru et al., 1994; Kaempfer, 2003; Marchand, Perretti et al.,
2005; Scumpia, Kelly et al., 2005). Além disso, Rong et al., investigaram a
ativação de ERK pela inflamação periférica induzida por injeções de CFA,
demonstrando que a inflamação persistente e, consequente, ativação
sustentada de ERK, recrutam neurônios das camadas superficiais (lâminas I-
II) da medula espinal (Rong, Woolf et al.,2002). O mesmo grupo, verificou que
fosfo-p38 está localizado no núcleo e no citoplasma dos neurônios do GRD e
que a indução da inflamação periférica fosforilava p38 no soma de
nociceptores associados a fibras do tipo C. Após 24 horas, com pico em 2
dias, e a atividade de p38 permaneceu elevada até o sétimo dia. Nossos
resultados corroboram com estes resultados demonstrando que durante a
inflamação crônica induzida por CFA, há aumento significativo da fosforilação
das proteínas p38 e JNK, mas não de p42/44, na coluna dorsal da medula
espinal. Este aumento foi observado no terceiro dia após a injeção de CFA
quando comparado com animais intactos e com animais que foram
administrados óleo mineral. Entretanto, durante o processo inflamatório
periférico após a administração de inibidor de PKR (5µM/10µL) ocorreu
diminuição, significativa, na expressão de p38 e JNK. Gao et al.,
demonstraram que CFA induziu um aumento rápido nos níveis de fosfo-JNK1
e fosfo-JNK2 na medula espinal iniciando em 6 h após a injeção e se
mantendo por 14 dias. Ressaltando ainda, que a presença de fosfo-JNK1 na
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medula espinal é muito maior que fosfo-JNK2, sugerindo que fosfo-JNK1
possui um importante papel na manutenção da dor inflamatória persistente
(Gao et al., 2010). Assim, é possível sugerir que a ativação de p38 e JNK na
medula espinal e, eventualmente, no gânglio da raiz dorsal possam ser
dependente, total ou parcialmente, da ativação direta de PKR. Esta
interpretação poderia justificar a mudança no perfil de expressão tecidual e
temporal, tanto do RNAm, quanto da proteína. Além disso, verificamos,
aumento da expressão da PKR logo nas primeiras horas (3 e 12 horas) após a
injeção de CFA, o que pode ser justificado pela atuação aguda de citocinas
do tipo de IFN-γ, IL-1 ou TNF-α presentes no gânglio da raiz dorsal (Bonnet,
Weil et al., 2000; Kadereit, Galabru et al., 1994; Kaempfer, 2003; Marchand,
Perretti et al., 2005; Scumpia, Kelly et al., 2005). O papel preponderante de
PKR na neurobiologia da dor inflamatória fica ainda mais evidente pelos dados
comportamentais. A inibição da atividade de PKR provocou uma redução,
significativa, da hiperalgesia térmica nos animais com inflamação. É
importante ressaltar, que esse efeito só foi observado nos animais submetidos
à inflamação persistente, mas não nos animais que receberam a injeção de
óleo mineral. Esses dados indicam que os efeitos do inibidor de PKR são
dependentes da plasticidade neural induzida pela estimulação crônica de
nociceptores e sugere que PKR não deve influenciar a transmissão da
informação nociceptiva em condições fisiológicas.
Outra hipótese é o envolvimento de receptor de potencial transiente
(TRP) que compreendem seis domínios de proteínas transmembrana que
formam canais de cátion não seletivos especializados na detecção de
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estímulos térmicos ou químicos (DeLeo, Sorkin et al., 2007). Nicol et al., 1997
demonstraram que a aplicação de TNF-α por 4, 12 e 24 horas aumentava
duas vezes a amplitude da corrente produzida pela aplicação de capsaicina.
Esse aumento não foi observado após 10 minutos de aplicação de TNF-α,
indicando que o curso temporal da modulação de TNF-α das correntes TRPV1
observadas nesse estudo foi da ordem de horas. Entretanto, dados
comportamentais consideraram que TNF-α e TRPV1 apontaram que TNF-α
possa causar hiperalgesia térmica mediada por TRPV1 (Cruz et al., 2005; Ji
et al., 1999; Hu et al., 2003; Karim et al., 2001; Kawasaki et al., 2004). Além
disso, estudo realizado em oócito de Xenopus demonstrou que a expressão
de RNAdf dependente de PKR atenuou as correntes de membrana
dependentes da entrada de Ca2+, pela depleção dos estoques para Ca2+,
enquanto que em PKR-/- obteve o efeito oposto. Assim PKR pode ter novos
substratos protéicos e funções celulares no armazenamento de Ca2+ e
sinalização. (Thomas et al., 1998) .
Pode ainda está ocorrendo o envolvimento do NF-kB que é requerido
para transcrição de muitas citocinas, incluindo TNF-α, IL-1, IL-6, e IL-8, assim
como na geração de respostas inflamatórias. Em geral, as citocinas não são
armazenadas intracelularmente e sua secreção depende da síntese de novas
proteínas. Assim, PKR poderia estar ativando NF-kB e, consequentemente,
mantendo a resposta inflamatória adequada através da transcrição dos genes
associados à citocinas (Timothy, Blackwell et al.,1997). A ativação do NF-kB
ocorre, tanto intracelularmente, quanto extracelularmente e o feedback
positivo pode ocorrer por mecanismos extracelulares, amplificando os sinais
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inflamatórios. Desta forma, a ativação de NF-kB realça a transcrição de TNF-α
e IL-1, causando a ativação de NF-kB e gerando amplificação do sinal
inflamatório original (Timothy, Blackwell et al.,1997).
Juntos, estes dados sugerem que PKR pode desempenhar papel
importante nos mecanismos neurobiológicos de indução e manutenção da das
alterações de doença inflamatória crônica. Uma vez que nossos dados indicam,
claramente, que o estímulo nociceptivo induz um aumento da atividade da
proteína PKR na coluna dorsal da medula espinal onde a informação
nociceptiva é inicialmente processada pelo SNC.
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6. CONCLUSÃO:
I) Nossos resultados indicam que PKR está presente em células, tanto do
gânglio da raiz dorsal, quanto na coluna dorsal da medula espinal e seu
perfil de expressão aumenta durante processo inflamatório crônico.
II) Durante inflamação crônica periférica a redução da atividade de PKR
pela manipulação genética ou por ação farmacológica promove uma
redução ou reversão da hipernocicepção térmica, mas não da alodínia
mecânica. Estes dados indicam que PKR desempenha papel pró-
nociceptivo durante o processo inflamatório persistente.
III) A inibição intratecal de PKR reverte na coluna dorsal da medula espinal,
o aumento da fosforilação das MAPKs, p38 e JNK, induzido pela
inflamação periférica crônico. Juntos estes resultados indicam haver um
potencial terapêutico antinociceptivo para compostos que sejam capazes
de inibir ou reduzir a atividade de PKR na medula espinal.
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8. ANEXO I
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