Análises de expressão e de toxicidade em plantas de...
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Análises de expressão e de toxicidade em plantas de algodão contendo o gene cry1Ia
que confere resistência à insetos
Carliane Rebeca Coelho da Silva
Orientação: Prof Dr. Péricles de Albuquerque Melo FilhoCo-orientação: Dra. Roseane Cavalcanti dos Santos
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCODepartamento de Agronomia
Programa de Pós-Graduação em Agronomia Melhoramento Genético de Plantas
Revisão Bibliográfica Aspectos econômicos do algodoeiro
Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada
Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada
Cultivo comercial abrange mais de 100 países, com área anual superior a 40 milhões de hectares;
Aspectos econômicos do algodoeiro
Gossypium hirsutum L. – principal espécie cultivada
Cultivo comercial abrange mais de 100 países, com área anual superior a 40 milhões de hectares;
Situação nacional:
Estimativa para safra 2009/10:
Caroço – 2 milhões de toneladas
Área – 843 mil ha
Aspectos econômicos do algodoeiro
Classificação Taxonômica e Botânica do Gênero Gossypium
Filo: Angiospermae
Classe: Dicotiledoneae
Ordem: Malvales
Família: Malvaceae
Tribo: Hibisceae
Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral
Classificação Taxonômica e Botânica do Gênero Gossypium
Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência
Classificação Taxonômica e Botânica do Gênero Gossypium
Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência A flor é do tipo hermafrodita com sistema de reprodução intermediário
Classificação Taxonômica e Botânica do Gênero Gossypium
Porte arbustivo ou herbáceo: 1,0 – 1,70 m Característica da espécie: presença de bráctea protegendo o botão floral Inicio dos botões florais - 35 a 45 dias após a emergência A flor é do tipo hermafrodita com sistema de reprodução intermediário Fruto: maçã que após a maturação transforma-se em capulho
Classificação Taxonômica e Botânica do Gênero Gossypium
Principais problemas na cultura do algodão
Alto custo de produção: U$ 1,500 - 3,000/ha
Cerca de 40% são destinados a:
mecanização da lavouracontrole de plantas invasorascontrole de pragas e doenças
Principais pragas:
Plutela xylostella (tarças-das-crucíferas)
Spodoptera frugiperda(lagarta do cartucho do milho)
Anthonomus grandis (bicudo do algodoeiro)
Heliothis virescens(lagarta da maçã)
Pectinophora gossypiella (lagarta rosada)
Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja)
Técnica de transferência de gens entre espécies vivas que, em condições naturais, não se cruzam
Transgenia
Técnica de transferência de gens entre espécies vivas que, em condições naturais, não se cruzam
Transgenia
Aplicabilidade da transgenia no melhoramento de plantas
a) Possibilidade de transferir genes sem a limitação imposta pelas barreiras naturais
(ex. Incompatibilidades cromossômicas)
Transgenia
b) Maior controle na transferência de genes específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)
Transgenia
c) Redução de tempo para obtenção da cultivar melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no melhoramento convencional)
b) Maior controle na transferência de genes específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)
Transgenia
c) Redução de tempo para obtenção da cultivar melhorada (ex. Leva-se entre 5 a 15 anos no melhoramento convencional)
d) Possibilidade de transferência de genes exógenos (ex. gene de bactéria para planta)
b) Maior controle na transferência de genes específicos (ex. Alguns genes são transferidos em grupo)
Área com LGM no mundo
Evolução da área cultivada com LGM (em milhões de ha) no período de 1996 a 2008 nos paises industrializados e em crescimento. Fonte: James (2008)
Principais Métodos de Transformação
Absorção de DNA mediada via polietilenoglicol (PEG)
Biobalística
Vetores biológicos (espécies de gênero Agrobacterium)
Transformação via microinjeção
Tecnologia Bt
VANTAGENS
Especificidade
Redução do uso de pesticidas (menor dano ambiental)
Mecanismo de ação da toxina do Bt
Objetivos Objetivo Geral
Avaliar a expressão e a toxicidade da proteína cry1Ia em plantas transformadas de algodão por meio de testes moleculares e bioensaios conduzidos com a lagarta militar.
Metas:
Confirmar a inserção do transgene por meio de ensaios moleculares e análise de seqüenciamento no período de 12 meses
Estimar o nível de expressão da proteína por meio de Dot-ELISA e Western blot no período de 06 meses
Estimar a taxa de mortalidade dos transgenes em Spodoptera por meio de bioensaios de toxicidade no período de 06 meses
Material e Métodos
Material Vegetal
cv BRS 293
Transformação Via microinjeção
Surgimento dos primeiros botões florais
O volume de 10 µL (50 ng/µL).
Foram microinjetadas 20 maçãs/planta
Amplificação dos Fragmentos por PCR
Extração de DNA (Kit DNA Easy)
Ensaios de PCR (Taq polimerase)
Quantificação (Gel de agarose 1%)
Alíquotas 30 ng/μl
Amplificação dos Fragmentos por PCR
Primers (1F/3R, 2F/2R e 1F/2R)
Produtos de PCR (gel de agarose 0,8%)
Syber Green (LGC)
Fotodocumentação (luz ultravioleta).
Análise de Integração do DNA por Southern blot
Formas mais simples de determinar em que altura certos genes estão sendo expressos
DNA genômico digerido com enzimas específicas
Transferência para membrana de nylon
Pré-hibridização
Hibridização com sonda fria (BioNick, Invitrogen)
Southern blot (SAMBROOK, 1989)
Análise do Seqüenciamento
LGBS/UFRPE
Primer 2F/2R (fragmento de 360 pb)
Purificação (Kit SNAP, Invitrogen)
Amostra: 100 ng/ul
MegaBace1000 (Amersham/GE Healthcare) Análise da seqüência (Sequence Analyzer)Edição (BioEdit version 7.0.9.0)Alinhamento (Blastn (Basic Local Alignment Search Tool)
Extração e Quantificação das proteínas
Extração (ARAGÃO, 1998)
Centrifugação (11.000 rpm / 30 min / 4ºC)Separação do sobrenadanteRe-centrifugação (11.000 rpm / 10 min / 4ºC)
Quantificação
Método de Bradford (1976).
Dot-Elisa
Material vegetal
Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)24 transformantes
Ensaio qualitativo
Dac-ELISA
Material vegetal
Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa)24 transformantes
Dac-ELISA
Técnica utilizada para detectar expressão protéica Técnica imunológica: uso de anticorposQuantitativa. Muito sensível. Placa especifica com 96 poços sendo três repetições
Western blot
Estuda o perfil de expressão protéica.
Tecnica comparativa
Os extratos protéicos são separados por eletroforese, sistema SDS-PAGE
As proteínas transferidas para membrana de nitrocelulose.
Os procedimentos posteriores seguirão de acordo com o descrito em Sambrook et al (1989).
Bioensaio
Material vegetal
Controle positivo (Bollgard I, Monsanto )Controle negativo (CNPA BRS 293, Embrapa) 24 transformantes
Bioensaio
Folhas liofilizadas (metodologia descrita por Martins et al., 2001)Larvas de Spodoptera no segundo estágioPlacas com 24 poços, contendo oito repetiçõesLeitura feita a partir de 48h até o sétimo diaTaxa de mortalidade será calculada pela por meio da formula de Abbot (1925).
Resultados esperados
Identificar eventos de elite expressando a proteína CryIa
em uma dosagem igual ou superior a 50 ng/µg de tecido.
Cronograma:Planejamento das atividades e revisão da literatura
xDefesa da dissertação
DNOSAJJMAMFJ
xxxx
xxxElaboração de relatório
xxxxRedação de artigos para eventos científicos
xxxxxxxxxxxxRevisão de literatura
M
x xxxxxEnsaios de toxicidade
xxxWestern blot
xxxDot ELISA
xxxExtração e Quantificação das proteínas
xxxxxAnálise de seqüenciamento
xxxxAnálise de integração do DNA via Southern
xxxEnsaios de PCR
xxxxxx
DNOSAJJMAMFJAtividades moleculares (2010)
JAtividades complementares (2009/2010) F AM JJM NOSA D
Atividades complementares (2011)
Elaboração da dissertação