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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ALINE D’AVILA PEREIRA
INFLUÊNCIA DE UMA DIETA MATERNA CONTENDO ÓLEO DE LINHAÇA SOBRE
A ADIPOSIDADE E ESTRUTURA ÓSSEA DOS FILHOTES NO FINAL DA LACTAÇÃO
NITERÓI - RJ
2016
2
ALINE D’AVILA PEREIRA
INFLUÊNCIA DE UMA DIETA MATERNA CONTENDO ÓLEO DE LINHAÇA SOBRE
A ADIPOSIDADE E ESTRUTURA ÓSSEA DOS FILHOTES NO FINAL DA LACTAÇÃO
Orientador: Prof. Dr. LUIS GUILLERMO COCA VELARDE
Coorientador: Prof. Dr. GILSON TELES BOAVENTURA
NITERÓI - RJ
2016
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ALINE D’AVILA PEREIRA
INFLUÊNCIA DE UMA DIETA MATERNA CONTENDO ÓLEO DE LINHAÇA SOBRE
A ADIPOSIDADE E ESTRUTURA ÓSSEA DOS FILHOTES NO FINAL DA LACTAÇÃO
Aprovado em: 21/06/2016
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Profª Drª Giovanna Aparecida Balarini Lima
Universidade Federal Fluminense
______________________________________________________________________
Profª Drª Gabrielle de Souza Rocha
Universidade Federal Fluminense
______________________________________________________________________
Profª Drª Celly do Nascimento-Saba
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
NITERÓI - RJ
2016
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Ciência Médicas
da Universidade Federal Fluminense
com parte dos requisitos necessários à
obtenção do Grau de Mestre. Área de
Concentração: Ciência Médicas.
4
Pereira, Aline D’Avila.
Influência de uma dieta materna contendo óleo de linhaça sobre a
adiposidade e estrutura óssea dos filhotes no final da lactação / Aline D’Avila
Pereira; orientador: Luis Guillermo Coca Velarde, coorientador: Gilson Teles
Boaventura – Niterói: [s.n.]. 2016.
87 f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal
Fluminense, 2016.
Bibliografia: f. 66-76.
1. Óleo de linhaça. 2. Ratos. 3. Osso. 4. Adiposidade. 5. Lactação I.Velarde,
Luis Guillermo Coca [orien.]. II. Boaventura, Gilson Teles [coorien.]. III. Título.
5
Dedico este trabalho aos meus pais, Ivan e
Marcia, pelo carinho, amor, ensinamentos,
educação e apoio.
Ao meu noivo, Diego, pelo amor,
companheirismo, incentivo e por me ouvir
sempre.
6
AGRADECIMENTO
Em primeiro lugar agradeço a Deus, pois tudo que acontece na minha vida é por vontade Dele.
Aos meus pais, Marcia e Ivan, e aos meus irmãos, André e Adriano, pelo amor, apoio e
incentivo nas horas boas e ruins.
Ao meu noivo Diego pelo amor, companheirismo, paciência, ajuda e compreensão.
À minha sogra, Rejane, e ao meu sogro, Cléber, pela ajuda durante o mestrado inteiro. E à
minha cunhada, Renata, pelas ótimas conversas e incentivo.
Ao meu querido Prof. Gilson Teles Boaventura, pela oportunidade de estar inserida em um
ótimo grupo de pesquisa desde a iniciação científica. Obrigada pelo apoio, ensinamentos e
confiança.
Ao Carlos Alberto Soares da Costa por me ajudar em cada etapa deste trabalho, no projeto,
no experimento, na escrita do artigo científico. Muito obrigada por todo apoio, atenção,
ensinamento, paciência, amizade, ajuda e orientação.
Ao Prof. Luis Guillermo Coca Velarde por me orientar no quesito estatístico e por ter me
dado a oportunidade de ajudar as pessoas a passarem na sua matéria. Obrigada também pela
sua atenção.
À Danielle, Maíra, Letícia, Henrique, Carolina e Bianca que fazem meus dias no laboratório
ficarem mais divertidos. Obrigada pelas conversas, amizade e carinho.
A todos integrantes e ex-integrantes do LabNE pela amizade e carinho.
À Solange, Zoraide e Fernanda por me ajudarem sempre que preciso.
À Celly e Aline pela oportunidade de realização das análises morfológicas na UERJ e pela
ajuda prestada.
Ao LANUFF pela oportunidade de realização do DXA, em especial à Ana Paula pelo carinho.
Ao Professor Jorge Mancini-Filho e Fernanda Santana pela oportunidade de realização da
cromatografia na USP.
À professora Giovanna Balarini pela revisão deste trabalho. Obrigada pela atenção prestada.
7
À Universidade Federal Fluminense, principalmente à Coordenação do curso de Pós-
Graduação em Ciências Médicas pela oportunidade concedida.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio
financeiro.
8
“O futuro pertence àqueles que acreditam na beleza de seus sonhos”.
Eleanor Roosevelt
9
RESUMO
O óleo de linhaça é fonte de ácido α-linolênico que é importante para os estágios de crescimento
e desenvolvimento corporal; além disso, atua no tecido adiposo e na estrutura óssea. Sendo
assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a influência de uma dieta materna contendo óleo de
linhaça na adiposidade e estrutura óssea dos filhotes ao desmame. No nascimento, os filhotes
foram randomizados em dois grupos: grupo controle (GC, n = 12 filhotes) e grupo óleo de
linhaça (GOL, n = 12 filhotes), ratos cujas mães foram alimentadas com dieta contendo óleo de
soja ou óleo de linhaça, respectivamente. Aos 21 dias, os ratos foram desmamados, postos em
2 horas de jejum e a massa e comprimento corporal foram mensurados. Em seguida, ainda
anestesiados, foram submetidos ao DXA, onde foi analisada a composição corporal. Após esse
processo, a eutanásia foi realizada por punção cardíaca e o sangue coletado para análise dos
parâmetros bioquímicos, osteocalcina, leptina, osteoprotegerina e composição de ácidos graxos
do soro do sangue. O tecido adiposo e hepáticos foram dissecados e analisados quanto à massa
absoluta e relativa. Uma amostra de tecido adiposo retroperitoneal e tecido hepático foram
fixadas para análise morfológica da área dos adipócitos e analise morfológica do tecido de
forma geral, respectivamente. O fêmur foi coletado e analisado pelo DXA para obtenção dos
dados de densidade e conteúdo mineral ósseo (DMO e CMO, respectivamente) e área óssea.
Foi utilizado o teste t-Student e foi considerado diferença significativa quando p < 0,05. O GOL
apresentou maior: massa (+12%, p = 0,0051) e comprimento corporal (+9%, p < 0,0001), massa
gorda (g, +45%, p = 0,0021; %, +33%, p = 0,0126), massa de gordura no tronco (+43%, p =
0,0249), DMO total (+8%, p = 0,0018), CMO total (+55%, p = 0,0089) e área óssea total (+35%,
p = 0,0171), DMO da coluna vertebral (+6%, p = 0,0441), CMO da coluna vertebra (+41%, p
= 0,0030) e área óssea da coluna vertebral (+26%, p = 0,0167). No que diz respeito às análises
bioquímicas, observou-se menor concentração de colesterol (-13%, p = 0,0001) e maior nível
de HDL-colesterol (+30%, p = 0,0001), osteocalcina (+173%, p = 0,0093) e osteoprotegerina
(+183%, p = 0,0405). O ácido araquidônico estava menor (p = 0,0145) no GOL quando
comparado ao GC, no entanto, o ácido α-linolênico e eicosapentaenoico estavam maiores (p <
0,0001, p < 0,0001 respectivamente) no GOL. A massa do tecido adiposo intra-abdominal
estava maior (+25%, p = 0,031), mas, a área do adipócito do tecido retroperietoneal estava
menor (-44%, p < 0,0001) no GOL. Em relação às análises ósseas, notou-se que a massa do
fêmur (+10%, p = 0,030), a distância entre as epífises (+4%, p = 0,002) e a DMO (+13%, p =
0,010) estavam maiores no GOL quando comparado ao GC. O estudo demonstra que um
adequado aporte de óleo de linhaça durante a lactação apresenta efeitos positivos na composição
corporal e estrutura óssea, sugerindo que o conteúdo de ácido α-linolênico foi importante para
o desenvolvimento dos filhotes.
Palavras chave: óleo de linhaça; ratos; osso; adiposidade; lactação.
10
ABSTRACT
Flaxseed oil is an alpha linolenic acid source important in the growth and body development
stage; furthermore, this acid acts on adipose tissue and bone structure. Thus, the aim of this
study was to evaluate the influence of maternal flaxseed oil upon adiposity and bone structure
of male rat pups during lactation period. After birth, pups were randomly assigned: control (CG,
n = 12 pups) and flaxseed oil (FOG, n = 12 pups), rats whose mothers were fed with diet
containing soybean or flaxseed oil, respectively. At 21 days, the pups were weaning and body
mass and length were measured. Then, pups were anesthetized and submitted to DXA for body
composition analyzed. After that, pups were euthanized for cardiac puncture and blood was
collected to analyze biochemical parameter, osteocalcin, leptin, osteoprotegerin and blood
serum fatty acids composition. Intra-abdominal fat and liver tissue were dissected and analyzed
as regards absolute and relative mass. A sample of retroperitoneal fat and liver tissue were fixed
for morphological analyses of the sectional adipocytes area and morphological analysis of the
general tissue, respectively. Femur structure were collected and submitted to DXA for obtaining
data bone mineral density (BMD), bone mineral content (BMC) and bone area analyzed. It was
used test t-Student and differences were considered significant with p < 0.05. FOG showed
higher: body mass (+12%, p = 0.0051) and length (+9%, p < 0,0001); body fat mass (g, +45%,
p = 0.0021; %, +33%, p = 0.0126); trunk fat mass (+43%, p = 0.0249); BMD total (+8%, p =
0.0018); BMC total (+55%, p = 0.0089); bone area total (+35%, p = 0.0171); spine BMD (+6%,
p = 0.0441); spine BMC (+41%, p = 0.0030); spine bone area (+ 26%, p = 0.0167). Regarding
the biochemical analyzes, it was observed lower in cholesterol (-13%, p = 0.0001) and higher
in HDL-cholesterol (+30%, p < 0.0001), osteocalcin (+173%, p = 0.0093) and osteoprotegerin
(+183%, p = 0.0405). Arachidonic acid was lower (p = 0.0145) in FOG when compared to CG,
however alpha-linolenic and eicosapentaenoic acids were higher (p < 0.0001 and p < 0.0001,
respectively) in FOG. Intra-abdominal fat absolute mass was higher (+25%, p = 0.031), but,
retroperitoneal adipocytes area was lower (-44%, p < 0.0001) in FOG. In regards to bone
analyses, observed femur mass (+10%, p = 0.030), distance between epiphyses (+4%, p =
0.002) and BMD (+13%, p = 0.010) were higher in FOG when compared to CG. The study
demonstrates that adequate flaxseed oil content during lactating diet bears an important role in
body composition and bone structure, suggesting that alpha-linolenic acid content was
important in pup development.
Keywords: Flaxseed oil; rats; bone; adiposity; lactation.
11
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 1 Metabolismo dos ácidos graxos das famílias n-6 e n-3. 28
Figura 2 Origem dos adipócitos e osteoblastos. 31
Figura 3 Evolução do consumo alimentar durante 21 dias de lactação. 47
Figura 4 Dados hormonais de osteocalcina, osteoprotegerina e leptina dos
filhotes aos 21 dias de idade.
50
Figura 5 Fotomicrografias de secções histológicas de tecido hepático dos
filhotes aos 21 dias de idade. (Objetiva 20X).
55
Figura 6 Massa absoluta e relativa do tecido adiposo intra-abdominal, área
do adipócito e fotomicrografias de secções histológicas de tecido
adiposo retroperitoneal dos filhotes aos 21 dias de idade. (Objetiva
20X).
56
12
LISTA DE ESQUEMAS E QUADROS
Página
Quadro 1 Composição de macronutrientes do colostro e do leite maduro em
100 mL.
22
Quadro 2 Composição de vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis do colostro
e do leite maduro em 100 mL.
23
Quadro 3 Composição de minerais do colostro e do leite maduro em 100 mL. 24
Esquema 1 Delineamento experimental. 41
13
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 Informação nutricional do óleo de linhaça (Giroil ®). 34
Tabela 2 Composição nutricional a cada 1 Kg da ração controle e da ração óleo
de linhaça.
39
Tabela 3 Composição dos macronutrientes da ração controle e da ração óleo
de linhaça.
40
Tabela 4 Massa, comprimento e composição corporal dos filhotes aos 21 dias
de idade.
48
Tabela 5 Dados sorológicos e análises hormonais dos filhotes aos 21 dias de
idade.
49
Tabela 6 Composição de ácidos graxos saturados do soro do sangue dos
filhotes aos 21 dias de idade (mg/100mL).
51
Tabela 7 Composição dos ácidos graxos monoinsaturados do soro do sangue
dos filhotes aos 21 dias de idade (mg/100mL).
52
Tabela 8 Composição dos ácidos graxos poli-insaturados do soro do sangue
dos filhotes aos 21 dias de idade (mg/100mL).
53
Tabela 9 Massa absoluta do coração, fígado, pâncreas, rim direito, testículo
direito e tecido adiposo intra-abdominal dos filhotes aos 21 dias de
idade.
54
Tabela 10 Massa relativa do coração, fígado, pâncreas, rim direito, testículo
direito e tecido adiposo intra-abdominal dos filhotes aos 21 dias de
idade.
54
Tabela 11 Parâmetros ósseos dos filhotes aos 21 dias de idade. 57
14
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Ácido araquidônico
ADA American Dietetic Association
AIN Amercian Institute of Nutrition
ALA Ácido α-linolênico, do inglês alpha linolenic acid
ALT Alanina aminotransferase
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AST Aspartato aminotransferase
BHT Butilhidroxitolueno
CMO Conteúdo mineral ósseo
DHA Ácido docasahexaenoico, do inglês docosahexaenoic acid
DMO Densidade mineral óssea
DXA Absorciomentria com dupla emissão de raios-X, do inglês dual-energy
X-ray absorptiometry
EDTA Etilenodiaminotetracético
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática, do inglês enzyme linked immuno
sorbent assay
EPA Ácido eicosapentanoico, do inglês eicosapentanoic acid
FOSHU Foods for Specified Health Use
GC Grupo controle
GOL Grupo óleo de linhaça
HDL Lipoproteína de alta densidade, do inglês high density lipoprotein
HMG-CoA Enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A redutase
15
i.p Intra peritoneal
IL-6 Interleucina-6
IOM Institute of Medicine
LA Ácido linoleico, do inglês linolenic acid
LabNE Laboratório de Nutrição Experimental
LANUFF Laboratório de Avaliação Nutricional e Funcional
MS Ministério da Saúde
n-3 Ácido graxo ômega-3
n-6 Ácido graxo ômega-6
n-9 Ácido graxo ômega-9
NCHS National Center for Health Statitistic
NIH National Institute Health
OMS Organização Mundial da Saúde
OPG Osteoprotegerina
P0 Nascimento
P21 21 dias de vida
PGE2 Prostaglandinas 2
PESAGRO-Rio Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro
PGE3 Prostaglandinas 3
PPAR-α Receptor ativado por proliferador de peroxissoma alfa, do inglês
peroxisome proliferator-activated receptor alpha
PPAR-γ Receptor ativado por proliferador de peroxissoma gamma, do inglês
peroxisome proliferator-activated receptor gamma
16
PTH Paratormônio
PUFA Ácidos graxos poli-insaturados, do inglês polyunsaturated fatty acids
RANK Receptor ativador de fator nuclear Kappa B, do inglês receptor activator
of nuclear factor Kappa B
RANKL Ligante do receptor ativador Kappa B, do inglês receptor activator of
nuclear factor kappa B ligand
RPM Rotações por minuto
TAGM Total de ácidos graxos monoinsaturados
TAGPI Total de ácidos graxos poli-insaturados
TAGS Total de ácidos graxos saturados
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa, do inglês tumor necrosis fator alpha
UDDO Unidade de Diagnóstico e Densitometria Óssea
UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro
UFF Universidade Federal Fluminense
VET Valor Energético Total
WHO Organização mundial da saúde, do inglês World Health Organization
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19
2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................... 21
2.1 ALEITAMENTO MATERNO ........................................................................................... 21
2.1.1 Composição do leite materno .......................................................................................... 22
2.2. ÁCIDOS GRAXOS, TECIDO ÓSSEO E ADIPOSO ....................................................... 25
2.2.1 Tecido ósseo .................................................................................................................... 25
2.2.2 Integridade óssea e ácidos graxos poli-insaturados ....................................................... 27
2.2.3 Tecido adiposo ................................................................................................................. 29
2.2.4 Obesidade, ácidos graxos poli-insaturados e integridade óssea .................................... 30
2.3. ALIMENTOS FUNCIONAIS ........................................................................................... 32
2.4 ÓLEO DE LINHAÇA ........................................................................................................ 33
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 36
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 36
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 38
4.1 ASPECTOS ÉTICOS ......................................................................................................... 38
4.2 MATERIAL ....................................................................................................................... 38
4.2.1 Animais ............................................................................................................................ 38
4.2.2 Óleo de linhaça ................................................................................................................ 38
4.2.3 Rações experimentais ...................................................................................................... 39
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................................. 40
4.4 ANESTESIA ...................................................................................................................... 41
4.5 COMPOSIÇÃO CORPORAL ............................................................................................ 41
4.6 EUTANÁSIA E COLETA DO SANGUE ......................................................................... 42
4.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ............................................................................................. 42
4.7.1 Análises sorológicas ........................................................................................................ 42
4.7.2 Análises hormonais ......................................................................................................... 42
4.7.3 Cromatografia ................................................................................................................. 43
4.8 COLETA DOS TECIDOS ................................................................................................. 44
4.9 ANÁLISE DO TECIDO HEPÁTICO ................................................................................ 44
4.10 ANÁLISE DO TECIDO ADIPOSO ................................................................................ 44
4.11 ANÁLISES ÓSSEAS ....................................................................................................... 45
18
4.12 COMPOSIÇÃO ÓSSEA .................................................................................................. 45
4.13 CARCAÇAS ..................................................................................................................... 45
4.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................... 46
5 RESULTADOS .................................................................................................................... 47
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 58
7 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 65
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 66
9 ANEXOS .............................................................................................................................. 77
9.1 APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL ............................. 78
9.2 RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS ....................................................... 79
9.3 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO ....................................................................... 80
9.3.1 Lipids ............................................................................................................................... 80
19
1 INTRODUÇÃO
O aleitamento materno é de suma importância para a promoção de um adequado
crescimento e desenvolvimento infantil, além disso, apresenta efeitos na prevenção de
obesidade em crianças e adultos, osteoporose e dislipidemia (Harder et al., 2005; Spatz, 2014;
Langley-Evans, 2015). O leite materno oferece nutrientes essenciais, como vitaminas
lipossolúveis e ácidos graxos, porém, sua composição varia de acordo com a dieta materna
(Mcmanaman & Neville, 2003; Innis, 2005). A nutrição materna pode afetar o crescimento e
desenvolvimento do recém-nascido, uma vez que, durante a lactação, os lipídios ingeridos pela
mãe são passados para a criança através do leite (Innis, 2005; Langley-Evans, 2015). Sendo
assim, é essencial que a lactante consuma uma dieta saudável e equilibrada para ofertar os
nutrientes e energia necessários para o lactente (Dangat et al., 2011; Langley-Evans, 2015).
No estágio de crescimento e desenvolvimento é importante que a mãe tenha uma dieta
rica em ácido linoleico (linolenic acid, LA, 18:3 n-6) e ácido α-linolênico (alpha-linolenic acid,
ALA, 18:3 n-3), pois estes são necessários para o desenvolvimento dos tecidos (Green et al.,
2004). Além disso, estudos experimentais e epidemiológicos avaliaram que ácidos graxos poli-
insaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFA) atuam no tecido adiposo e na estrutura óssea
(Watkins et al., 2000; Weiss et al., 2005; Costa et al., 2011; Aguirre et al., 2014).
A baixa razão de LA/ALA, por volta de 4-10:1, está relacionada com uma melhor
manutenção da estrutura óssea, contribuindo para a sua formação (Corwin, 2003; Martin et al.,
2006; Kruger et al., 2010). Em adição, a alta razão de LA/ALA, com valores mais altos que
10:1, está associada a um efeito negativo na fisiologia óssea, visto que ocorre maior estímulo
para a reabsorção óssea (Dirienzo et al., 2008); ademais, a baixa razão de LA/ALA atua nos
pré-adipócitos contribuindo para um menor desenvolvimento do tecido adiposo (Ghibaudi et
al., 2002).
20
Assim, LA e ALA têm um papel fundamental no tecido adiposo e no crescimento ósseo,
sendo uma área de pesquisa em ascensão (Costa et al., 2011). Nesse contexto, o óleo de linhaça,
extraído da parte interna da semente de linhaça, é considerado um alimento com alegação de
propriedades funcionais, pois apresenta a maior fonte de ALA do reino vegetal e baixa razão
de LA/ALA, apresentando 13% de LA e 52% de ALA (Riediger et al., 2008; Sales et al., 2010;
Goyal et al., 2014; Lane et al., 2014).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) preconiza supervisão por
profissionais de saúde para a ingestão de ALA durante o período de lactação, visto que há
poucos dados na literatura avaliando o efeito desse ácido graxo na saúde do lactente (Silveira
et al., 2009). Sendo assim, a proposta deste estudo, foi avaliar a influência de uma dieta materna
contendo óleo de linhaça na adiposidade e estrutura óssea dos ratos filhotes durante a lactação.
21
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ALEITAMENTO MATERNO
A Organização Mundial da Saúde (OMS) e o Ministério da Saúde (MS) recomendam
que o aleitamento materno seja exclusivo até 6 meses de vida e, a partir deste momento,
complementado por outros alimentos até 2 anos de idade ou mais (WHO, 2001; MS, 2009).
Isso se deve ao fato do leite materno apresentar diversos benefícios à saúde do recém-nascido,
devido a sua composição nutricional balanceada e suficiente para suprir as necessidades
nutricionais de recém-nascidos durante os seis primeiros meses de vida (Uauy et al., 2001; MS,
2010).
Entre os benefícios encontrados, observa-se a prevenção de mortalidade infantil,
doenças na infância e vida adulta, causadas por desnutrição, anemia, infecção respiratória,
alergias, doenças intestinais, osteoporose, obesidade, doenças cardiovasculares e diabetes
mellitus (WHO, 2000; Dewey, 2003; Stuebe et al., 2005; Horta et al., 2007; MS, 2009; Teruya
& Coutinho, 2009). Isto acontece pelo fato do leite materno apresentar nutrientes, enzimas e
substâncias imunológicas, como anticorpos e linfócitos importantes para a prevenção destas
doenças (Teruya & Coutinho, 2009).
Outro benefício está relacionado com o estado nutricional, uma vez que, o aleitamento
materno proporciona uma excelente e adequada nutrição ao lactente, dependendo da
alimentação e estado nutricional da nutriz, além de influenciar no crescimento e
desenvolvimento, acarretando em um peso para a idade, estatura para a idade e peso para a
estatura de acordo com a normalidade das curvas de crescimento estabelecidas pela OMS e
National Center for Health Statitistic (NCHS) (Hamill et al., 1979; WHO, 2006; Teruya &
Coutinho, 2009). Este fato também está relacionado com a prevenção de mortalidade e
22
morbidade infantil, visto que o lactente por ter uma nutrição adequada terá um desenvolvimento
e crescimento satisfatórios, assim como, a capacidade de reagir às infecções, possibilitando
melhor chance de sobreviver (Teruya & Coutinho, 2009).
2.1.1 Composição do leite materno
O leite materno é uma mistura homogênea com três frações: emulsão, suspensão e
solução. A emulsão corresponde à parte lipídica, sendo concentrado em óleos, gorduras, ácidos
graxos livres e vitaminas lipossolúveis. Na suspensão encontram-se as proteínas, cálcio e
fósforo. E na solução, temos os carboidratos, vitaminas hidrossolúveis, minerais, proteínas do
soro, enzimas, hormônios e água, estes caracterizando o soro do leite (Lamounier et al., 2009).
Existem três secreções lácteas, o colostro, o leite de transição e o maduro os quais
apresentam diferenças quanto à sua composição (Quadro 1, 2 e 3). O colostro, rico em caroteno,
é o primeiro a ser secretado e contém mais proteínas, sódio, potássio e cloro do que o leite
maduro, no entanto, apresenta menos carboidrato e lipídios (Carmo et al., 2002; Lamounier et
al., 2009). Dentre as proteínas, a mais abundante são as imunoglobulinas que desempenham
papel fundamental, pois contém anticorpos do sangue materno, responsáveis pela transmissão
de imunidade ao recém-nascido (Cury, 2012). O leite de transição é produzido entre o sétimo e
o décimo quarto dia de amamentação e vai sofrendo modificações até se tornar leite maduro
(Carmo et al., 2002; Lamounier et al., 2009).
Quadro 1 – Composição de macronutrientes do colostro e do leite maduro em 100
mL.
Constituintes Colostro Leite Maduro
Energia (kcal) 58 70
Lactose (g) 5,3 7,3
Proteína total (g) 2,3 0,9
Gordura total (g) 2,9 4,2
Fonte: Adaptado de Worthington-Roberts & Williams, 1997.
23
Quadro 2 – Composição de vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis do colostro e
do leite maduro em 100 mL.
Constituintes Colostro Leite Maduro
Vitaminas lipossolúveis
A (µg) 89 47
D (µg) - 0,04
E (µg) 1,28 3
K (µg) 0,23 0,21
Vitaminas hidrossolúveis
C (mg) 4,4 4,0
Tiamina (mg) 0,015 0,016
Riboflavina (mg) 2,5 3,5
Niacina (mg) 7,5 20
Folato (mg) - 5,2
B6 (mg) 1,2 2,8
B12 (mg) 20,0 2,6
Fonte: Adaptado de Worthington-Roberts & Williams, 1997.
24
Quadro 3 – Composição de minerais do colostro e do leite maduro em 100 mL.
Constituintes Colostro Leite Maduro
Minerais
Cálcio (mg) 23 28
Fósforo (mg) 14 15
Magnésio (mg) 3,4 3,0
Sódio (mg) 48 15
Potássio (mg) 74 58
Cloro (mg) 91 40
Fonte: Adaptado de Worthington-Roberts & Williams, 1997.
O leite maduro apresenta 70 kcal/100 mL, sendo 54% proveniente de lipídios, 42% de
carboidrato e 5% de proteínas. O lipídio além de fornecer calorias e saciedade, também
desempenha papel fundamental na fisiologia e estrutura corporal, na absorção de vitaminas
lipossolúveis e ainda oferece ácidos graxos essenciais para o desenvolvimento e crescimento
do neonato (Tinoco et al., 2007).
O consumo de macronutrientes não interfere na concentração de proteína, carboidrato e
lipídio no leite humano, mas a deficiência de micronutrientes pode afetar seu teor e como
consequência causar depleção nutricional no lactente (Allen, 2005). No entanto, a dieta é um
dos fatores que determina a qualidade das gorduras do leite, ou seja, a dieta materna pode afetar
os níveis de ácidos graxos do leite (IOM, 1991; Cunha et al., 2005; Innis, 2005). Se a dieta for
composta, principalmente, de gordura animal, o leite terá um aumento de ácidos graxos
saturados; se for rica em lipídios de origem vegetal haverá um aumento na concentração de
ALA e LA, ácidos graxos essenciais; mas, se tiver uma alta ingestão de carboidratos, o leite
terá mais ácido graxo de cadeia média e curta (Martin et al., 2006; Lamounier et al., 2009)
A presença destes ácidos graxos essenciais no leite materno é importante para a fluidez
da membrana citoplasmática e também são necessários para o desenvolvimento cerebral, pois
participam da mielinização e proliferação celular, além de melhorar a função retiniana e
25
cerebral (Innis, 2003; Lima et al., 2004; Jensen et al., 2005). Além disso, o ácido graxo
influencia na fisiologia óssea e do tecido adiposo (Hsu et al., 2006; Kruger et al., 2010).
2.2. ÁCIDOS GRAXOS, TECIDO ÓSSEO E ADIPOSO
2.2.1 Tecido ósseo
O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo que se difere dos outros
devido ao seu elevado conteúdo mineral (Schwartz et al., 2001; Junqueira & Carneiro, 2013a;
Moraes, 2006). Tem como função dar suporte ao corpo, proteger os órgãos vitais, alojar e
proteger a medula óssea, dar apoio ao músculo esquelético para proporcionar a locomoção,
estocar cálcio corporal, produção de células sanguíneas, entre outros (Tres & Kierszenbaum,
2012).
O osso é composto por um substrato orgânico, que consiste de ampla quantidade de
colágeno tipo I (aproximadamente 40% do volume), intercalado com cristais de hidroxiapatita
(aproximadamente 45%). O restante do volume é preenchido por água (Tres & Kierszenbaum,
2012).
Em relação à arquitetura, existe uma diferenciação entre osso cortical e osso trabecular
(Wehrli, 2007). O osso cortical é a camada compacta que forma a porção externa ao osso
trabecular e por ser mais compacto é responsável por contribuir para a manutenção da
integridade estrutural, por esse motivo, a sua remodelação é mais lenta (UDDO, 1997;
Anderson, 2010). O osso trabecular, que também é conhecido como osso esponjoso, é
caracterizado por ter menos densidade do que o osso cortical e apresentar uma estrutura aberta
de espículas ósseas interligadas que delimitam o espaço da medula óssea (Anderson, 2010; Tres
& Kierszenbaum, 2012). Este é resistente a cargas mecânicas e é continuamente remodelado
(Kalfas, 2001).
26
Segundo a sua morfologia, os ossos são classificados como ossos longos, curtos, planos
e irregulares. Os ossos longos, como o fêmur, têm as extremidades denominadas epífise, sua
extensão diáfise e a parte dilatada da diáfise próxima a epífise é chamada de metáfise e, além
disso, apresentam mais osso cortical do que trabecular (Moraes, 2006). Os ossos irregulares,
como as vértebras, são caracterizados por apresentarem formas complexas e apresentam mais
osso trabecular do que osso compacto.
Esse tecido é formado por células e matriz extracelular calcificada, denominada matriz
óssea e os componentes celulares do osso são os osteoblastos, que são responsáveis pela
formação e produção do tecido ósseo e os osteoclastos, que promovem a reabsorção óssea
(Anderson, 2010; Junqueira & Carneiro, 2013a).
Na fase de crescimento os osteoblastos estão mais metabolicamente ativos do que os
osteoclastos, para que assim haja maior formação óssea do que reabsorção para atingir o pico
de massa óssea, que é o nível mais alto de massa óssea (Cobayashi et al., 2005; Anderson,
2010). O pico de massa óssea nos seres humanos é atingido por volta de 30 anos de idade,
porém a idade em que a densidade mineral óssea (DMO) atinge o valor máximo depende de
fatores como, dieta, atividade física, gênero, fatores genéticos, ambientais e hormonais (Wosje
& Specker, 2000; Anderson et al., 2002).
Cessado o crescimento ósseo, há um equilíbrio constante entre a reabsorção e a
formação óssea, processo conhecido como remodelação óssea, que termina por volta dos 40
anos, quando há início da perda de massa óssea (Gali, 2001; Sohrabi et al., 2015). Essa
remodelação ocorre devido a esforços sobre o esqueleto, alterações no estilo de vida e ingestão
alimentar e reparo de microlesões. Segundo Anderson (2010), a remodelação é iniciada a partir
da ativação de células pré-osteoclásticas, que migram para a superfície dos ossos e se
diferenciam em osteoclastos maduros. Em contato com o osso, os osteoclastos liberam ácidos
e enzimas proteolíticas para que haja a reabsorção da parte mineral e da matriz óssea. Para a
formação óssea, os osteoblastos liberam colágeno, que é polimerizado para formar fibras
maduras, e proteínas da matriz. Com o tempo, o cálcio e fósforo se precipitam nessas fibras de
colágeno e formam os cristais de hidroxiapatita.
A perda óssea começa a ocorrer por volta dos 30-35 anos de idade, em ambos os sexos,
porém é mais rápida em mulheres, ainda mais depois da menopausa. No entanto, por volta dos
70, a perda óssea entre homens e mulheres é equiparada (Anderson, 2010). Em idade mais
27
avançada, o processo de formação óssea se torna menos eficiente e em contrapartida, a
remodelação óssea encontra-se mais ativa, aumentando a possibilidade de desenvolver a
osteopenia seguida de osteoporose, que é uma doença caracterizada pela diminuição da massa
óssea, que leva a uma fragilidade óssea (Orimo, 2010).
Uma boa nutrição oferecida por uma dieta balanceada está relacionada a um melhor
desenvolvimento da massa óssea, assim como está associada a melhor obtenção de pico de
massa óssea, ajudando então na prevenção e tratamento da osteoporose (NIH, 2000).
2.2.2 Integridade óssea e ácidos graxos poli-insaturados
Estudos experimentais têm evidenciado que uma dieta rica em ômega-3 (n-3) e ômega-6
(n-6), ácidos graxos poli-insaturados, é benéfica à integridade óssea (Watkins et al., 2000;
Green et al., 2004). Porém, para que haja uma melhor manutenção óssea, é de suma importância
que a quantidade de cada ácido graxo esteja apropriada, ou seja, quanto menor for a razão de
n-6/n-3 melhor será essa manutenção (Corwin, 2003; Weiss et al., 2005). Além disso, a maior
proporção n-6/n-3 está associada com efeitos negativos sobre a fisiologia óssea, com maior
estímulo para a reabsorção óssea, via osteoclastos (Corwin, 2003; Weiss et al., 2005).
Os ácidos graxos poli-insaturados são divididos em duas classes, de acordo com a sua
estrutura, sendo eles o n-3 e o n-6, precursores do ALA e LA, respectivamente, classificados
como ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (Dirienzo et al., 2008).
O LA e o ALA dão origem a outros ácidos de cadeias mais longas, uma vez que são
desaturados (pela inserção de dupla ligação) e alongados (pela adição de 2 unidades de carbono)
(Dirienzo et al., 2008). Enquanto que o LA pode ser metabolizado em ácidos gama-linolênico,
dihomo-gama-linolênico e araquidônico (AA), o ALA pode ser metabolizado em outros da série
ômega-3, sendo eles o ácido eicosapentaenoico (EPA) e docosaexaenoico (DHA) (Salem, 1999;
Valenzuela et al., 2011) (Figura 1).
28
Figura 1 – Metabolismo dos ácidos graxos das famílias n-6 e n-3.
Fonte: adaptado de Kruger et al., 2010.
O AA é convertido em prostaglandina 2 (PGE2) e leucotrienos da série 4, ambos com
ação pró-inflamatória. A PGE2 é um potente modulador da remodelação óssea, afetando assim
a reabsorção e a formação óssea (Jee & Ma, 1997; Albertazzi & Coupland, 2002). A excessiva
produção de PGE2 estimula a reabsorção óssea, uma vez que reduz a diferenciação dos pré-
osteoblastos e aumenta o recrutamento de pré-osteclastos e sua maturação, assim uma baixa
ingestão de alimentos ricos em n-6 reduz a sua produção podendo proporcionar a manutenção
da formação óssea (Watkins et al., 2000; Liu & Denbow, 2001).
O EPA é convertido em prostaglandina 3 (PGE3) e leucotrienos da série 5, que
contribuem para a redução da síntese de PGE2, por competição de enzimas, apresentando assim
ação anti-inflamatória. Com a redução da síntese de PGE2, é possível recrutar pré-osteoblastos
e promover sua maturação, favorecendo assim a formação óssea (Kruger et al., 2010). Além
disso, a PGE3 inibe a produção de fator de necrose tumoral alfa (tumor necrosis fator alpha,
TNF-α) e interleucina 6 (IL-6), citocinas pró-inflamatórias que promovem reabsorção óssea
(Gilsanz et al., 2009; Halade et al., 2010), assim, sugere-se que com a diminuição dessas
Ômega-6 (n-6) Ômega-3 (n-3)
Ácido gama-linolênico EPA
Ácido linoleico Ácido α-linolênico
Ácido dihomo-gama-linolênico Ácido docosapentanoico
Ácido araquidônico DHA
PGE2
Leucotrienos
série 4
PGE3
Leucotrienos
série 5
29
citocinas, haja uma diminuição na reabsorção óssea e consequente formação óssea (Garfólo &
Petrilli, 2006).
Outros fatores que relacionam a estrutura óssea com os ácidos graxos poli-insaturados
são: a expressão do ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa B (RANKL), um
receptor presente nos osteoblastos, responsável pelo equilíbrio entre a reabsorção e a formação
óssea; a quantidade de osteoprotegerina (OPG), um receptor chamariz do RANKL que regula
negativamente a osteoclastogênese (Ferrer et al., 2002). Outro receptor, relacionado com a
reabsorção óssea é o receptor ativador de fator nuclear Kappa B (RANK), que também se liga
ao RANKL, porém esse receptor está presente na membrana plasmática dos pré-osteoclastos,
logo, quando ocorre a ligação do RANK ao RANKL ocorre o estímulo para a síntese de
osteoclastos. Quando a OPG se liga ao RANKL ocorre a inibição tanto da diferenciação celular
como da função do osteoclasto, pois a OPG inibe a ligação do RANK ao RANKL. O ácido
graxo poli-insaturado n-6, percursor de PGE2, está relacionado com o aumento da expressão de
RANKL, diminuição da quantidade de OPG e ainda aumento da expressão de RANK,
favorecendo assim a reabsorção óssea. No entanto, o n-3 por ser convertido em PGE3, que inibe
a síntese de PGE2, ajuda na manutenção dos níveis de OPG e diminuição dos níveis de RANK.
Além disso, o n-3 atua diminuindo o tempo de vida dos osteoclastos, promovendo a apoptose
destas células (Kruger et al., 2010).
2.2.3 Tecido adiposo
O tecido adiposo é um tipo de tecido conjuntivo onde pode-se observar predominância
de adipócitos. Em pessoas de peso normal, o tecido adiposo representa de 20 a 25 % do peso
corporal das mulheres e de 15 a 20% do peso corporal de homens (Junqueira & Carneiro,
2013b).
Este tecido é o maior depósito de energia do corpo, sob forma de triglicerídeos, sendo
assim, é a principal reserva de energia do organismo. Além da função energética, o tecido
adiposo é isolante térmico, mecânico e participa da síntese de hormônios esteroides (Junqueira
& Carneiro, 2013b).
O tecido adiposo é dividido em duas variedades que apresentam distribuição corporal,
estrutural e fisiológica distintas. Um dos tipos é o tecido adiposo branco, também conhecido
como unilocular, cujas células, quando desenvolvidas por completo, apresentam apenas uma
30
gotícula de gordura a qual ocupa quase todo o citoplasma. A outra variedade é o tecido adiposo
marrom ou multilocular, constituído por células que contêm numerosas gotículas lipídicas e
muitas mitocôndrias (Tres & Kierszenbaum, 2012; Junqueira & Carneiro, 2013b).
O tecido adiposo branco está mais presente em indivíduos adultos do que o marrom.
Porém em recém-nascidos, este apresenta uma localização bem definida e não cresce, o que
explica o fato de nos adultos ele estar extremamente reduzido. Este tecido tem como função
produzir calor, ajudando na termorregulação do recém-nascido, protegendo-o do frio (Tres &
Kierszenbaum, 2012; Junqueira & Carneiro, 2013b).
2.2.4 Obesidade, ácidos graxos poli-insaturados e integridade óssea
Obesidade é considerada uma doença crônica não transmissível, definida como o
acúmulo excessivo de tecido adiposo que compromete a saúde dos indivíduos, afetando o
sistema respiratório, locomotor, esquelético, cardíaco, além de favorecer o surgimento de
dislipidemia, diabetes tipo 2, entre outras doenças (WHO, 2011; Pinheiro et al., 2004).
Apresenta etiologia complexa, com caráter multifatorial, associado a aspectos culturais,
ambientais, genéticos, socioeconômicos e biológicos (Popkin, 2001).
A prevalência da obesidade é um problema de saúde pública com caráter epidêmico
(Mendonça & Anjos, 2004), devido ao crescimento nas últimas décadas, tanto nos países em
desenvolvimento como nos países desenvolvidos (Nunes et al., 2007; Leão & Santos, 2012).
De acordo com a OMS em 2025 estima-se que 300 milhões de pessoas sejam diagnosticadas
com obesidade (WHO, 2011).
O aumento desta doença está associado às mudanças ocorridas nos hábitos alimentares
e no estilo de vida (Leal et al., 2012). Atualmente o perfil alimentar da população inclui a
diminuição do consumo de alimentos de origem vegetal e aumento dos de origem animal, logo,
ocorreu um aumento da ingestão de gordura saturada, sal, açúcar simples e alimentos
industrializados (Silva et al., 2010; MS, 2014)
A obesidade interfere no sistema esquelético, uma vez que o hipotálamo modula a
reserva de gordura e de osso, por meio do sistema nervoso simpático, regulando o apetite, a
sensibilidade da insulina e remodelação do esqueleto (Rosen & Klibanski, 2009). Além disso,
os adipócitos e os osteoblastos são originados das células-tronco mesenquimais, visto que
31
ambos são tipos de tecido conjuntivo (Junqueira & Carneiro, 2013c). Ademais, um estudo
epidemiológico demonstrou que a adiposidade central está relacionada com uma qualidade
óssea inferior, além de alterar o turnover ósseo (Cohen et al., 2013)
Alguns nutrientes, como o n-3 e o n-6 podem influenciar na síntese, tanto do adipócito
como do osteoblasto. Como dito anteriormente, uma dieta contendo baixa razão de n-6/n-3 é
benéfica para a integridade óssea, devido à diminuição da formação de PGE2. Além disso, uma
dieta contendo altas concentrações de n-6, leva ao recrutamento do receptor ativado por
proliferadores de peroxissoma gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma,
PPAR-γ), que converte pré-adipócitos em adipócitos, o que acarreta em acúmulo de gordura
(Kruger et al., 2010). O n-3, por outro lado, diminui o recrutamento de pré-adipócitos, além de
diminuir a hipertrofia dos adipócitos, devido ao estímulo de genes relacionados com a oxidação
dos ácidos graxos, através do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma alfa
(peroxisome proliferator-activated receptor alfa, PPAR-α), causando a redução da área dos
adipócitos (Figura 2) (Raclot & Groscolas, 1994; Hsu et al, 2006).
Figura 2 – Origem dos adipócitos e osteoblastos.
Fonte: Adaptado de Junqueira & Carneiro, 2013c. Ativação da via; Inibição da via.
Ômega-6:
Via PPAR-γ
Ômega-3:
Via PPAR-α
Ômega-6:
Via PG2
Ômega-3:
Via PG3, inibe PG2
CÉLULA
MESENQUIMAL
INDIFERENCIADA
OSTEOBLASTO
TECIDO
ADIPOSO
32
Além disso, a adiposidade atua na estrutura óssea de forma indireta, devido à secreção
de insulina, uma vez que os seus níveis séricos estão aumentados em indivíduos obesos. A
insulina atua diretamente na proliferação e na atividade dos osteoblastos, dessa forma
estimulando a formação óssea (Gilsanz et al., 2009; Zillikens et al., 2010), demonstrando que a
obesidade pode trazer benefícios para a estrutura óssea.
Carvalho et al. (2002) evidenciaram que com o aumento da massa corporal há um
aumento da ação mecânica no osso e com isso causa microdeformações neste, assim ocorre um
estímulo às células osteoblásticas, que estão relacionadas com uma menor reabsorção óssea e
um aumento na formação óssea local.
Esse aumento da ação mecânica ocorre devido ao trabalho muscular aumentado para
sustentar e/ou locomover os indivíduos com maior massa corporal, assim estimulando a
formação óssea (Lewin et al., 1997). Reddy et al. (2009) observaram que a DMO é maior em
indivíduos com sobrepeso, apesar da qualidade óssea não ser necessariamente boa (Bandeira F,
2007; Lecka-Czernik et al., 2015). Em modelo experimental a mesma relação positiva foi
observada entre a obesidade, massa e arquitetura óssea (Iwaniec et al., 2009).
No entanto, a massa corporal pode apresentar um efeito negativo em relação aos
parâmetros ósseos. Taes et al. (2009) investigaram a influência da adiposidade, que é a
quantidade ou depósito de gordura em determinada parte do corpo, no caso desse estudo, na
região intra-abdominal na DMO e CMO de homens adultos que atingiram o pico de massa óssea
e observou que esses dados foram menores em homens com maior adiposidade. Tal fato é
devido ao tecido adiposo intra-abdominal estar relacionado com a expressão de citocinas pró-
inflamatórias, como TNF-α e IL-6, que promovem reabsorção óssea (Gilsanz et al., 2009;
Halade et al., 2010).
2.3. ALIMENTOS FUNCIONAIS
O conceito de alimentos funcionais varia de acordo com a regulamentação local ou
regional (Stringheta et al., 2007). No Japão, é utilizado o termo alimentos para uso específico
da saúde (FOSHU – foods for specified health use), fazendo referência a alimentos consumidos
juntos a uma dieta normal que, além das funções básicas nutricionais, proporciona benefícios
fisiológicos e/ou reduzem o risco de doenças crônicas (Stringheta et al., 2007). A associação
33
dietética americana (ADA – American Dietetic Association) considera alimento funcional,
aquele que tem ação metabólica ou fisiológica no crescimento, desenvolvimento, manutenção
e em outras funções normais do organismo (ADA Reports, 1999). No Brasil, a ANVISA é o
órgão responsável pela regulamentação de alimentos e ingredientes chamados de alimentos com
alegação de propriedades funcionais e/ou de saúde, alimentos ou nutriente que além das funções
nutricionais básicas, causa efeito benéfico à saúde (Brasil, 1999).
O ácido graxo n-3 está na lista de alegações aprovadas pela ANVISA, tendo como
benefício o auxílio na manutenção de níveis saudáveis de triglicerídeos (Brasil, 2008). No
entanto, apresenta uma observação no que diz respeito às mulheres grávidas e nutrizes, pois
elas deverão consultar o médico antes de usar o ômega-3, uma vez que não há um consenso
sobre a recomendação desse nutriente para o período gestacional e de lactação, além do fato de
haver poucos dados na literatura avaliando o efeito desse ácido graxo na saúde do feto e do
lactente (Silveira et al., 2009). Dessa forma, é importante o estudo de alimentos fonte de ALA,
como o óleo de linhaça, em animais, para certificação da segurança alimentar desse nutriente
durante os primeiros meses de vida.
2.4 ÓLEO DE LINHAÇA
A linhaça (Linum usitatissimum) é uma semente oleaginosa originada da planta do linho,
pertencente à família Linaceae (Morris & Vaisey-Genser, 2003; Trucom, 2006), considerada
um alimento com alegação de propriedades funcionais, visto que é a maior fonte conhecida de
ácido graxo ômega-3 do reino vegetal (Brasil, 2008; Sales et al., 2010) ajudando na prevenção
de doenças, promovendo a saúde.
É uma planta que varia de 30 a 130 cm de altura, que apresenta talos eretos, folhas
estreitas e flores de coloração azul, vermelha ou branca. As dimensões das sementes varias de
cerca de 3,0 – 6,4 mm de comprimento, 1,8 – 3,4 mm de largura e 0,5 – 1,6 mm de espessura
(Freeman, 1995). A parte interna da semente, chamada de embrião é protegido pela casca, que
é utilizada como ingrediente funcional (Oomah & Mazza, 1997; Wiesenborn et al., 2002). Sua
semente apresenta duas variedades, a marrom e a dourada, sendo a variedade marrom mais
cultivada em regiões de clima quente e úmido, como o Brasil, e a dourada em regiões frias
como nos Estados Unidos e no Canadá. Em relação à composição química, não há muita
34
divergência entre essas variedades, o que diferencia é o local de plantio e cultivo e a utilização
de agrotóxicos (Novello & Pollonio, 2011).
A linhaça pode ser utilizada tanto como farinha, servindo de ingrediente na elaboração
de pães e biscoitos (Maciel et al., 2008), macarrão (Lee & Lip, 2003), bolos (Lee et al., 2004),
como na forma de óleo, disponível em emabalgens engarrafadas à prova de luz para evitar a
oxidação fotoquímica (Morris & Vaisey-Genser, 2003; Roy et al., 2007), podendo ser utilizado
em saladas ou em cápsulas para suplementação (Novello & Pollonio, 2011). O óleo de linhaça
é produzido a uma temperatura máxima permitida de 35 ºC, em que a parte interna da semente
sofre uma “pressão a frio” e o óleo é extraído (Novello & Pollonio, 2011). As informações
nutricionais do óleo de linhaça se encontram na tabela 1.
Tabela 1 – Informação nutricional do óleo de linhaça (Giroil ®).
Informação nutricional (porção de 13mL – 1 colher de sopa)
Quantidade por porção %VD (*)
VET 117 Kcal/491 KJ 8
Carboidrato 0 g 0
Proteína 0 g 0
Gorduras totais, das quais: 13 g 24
Gordura saturada 1,2 g 6
Gordura monoinsaturada 2,3 g -
Gordura poli-insaturada 9 g -
Gordura trans 0 g -
Colesterol 0 mg -
Fibra 0 g 0
Sódio 3,2 mg 0
n-3 6,8 g -
n-6 1,6 g -
n-9 2,7 g -
(*) Valores diários recomendados com base em uma dieta de 2000 Kcal ou 9400 KJ. Seus valores diários podem
ser maiores ou menores dependendo de suas necessidades energéticas. VET – Valor energético total; n-3 – ácido
graxo ômega-3; n-6 – ácido graxo ômega-6; n-9 – ácido graxo ômega-9.
Fonte: Rótulo do óleo de linhaça (Giroil®), utilizado no presente estudo.
35
Como pode ser observado na tabela 1, o óleo de linhaça apresenta 6,8g de n-3 e 1,6 g de
n-6, apresentando baixa razão de n-6/n-3, uma vez que apresenta maior quantidade de n-3 do
que n-6. Diversos estudos populacionais têm relatado que um aumento na ingestão de n-3 ajuda
na prevenção de doenças inflamatórias e na perda óssea, visto que auxilia na redução de
marcadores de reabsorção óssea, contribuindo então para a formação óssea (Corwin, 2003;
Kruger et al., 2010).
36
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência de uma dieta materna contendo óleo de linhaça na adiposidade e
estrutura óssea dos filhotes de ratas Wistar ao final da lactação.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Comparar o consumo de ração durante a lactação entre os grupos;
Comparar a massa e comprimento corporal entre os grupos;
Comparar a composição corporal, através de técnica radiológica, como o método de
absorciomentria com dupla emissão de raios-X (DXA), entre os grupos;
Comparar níveis séricos de cálcio, fósforo e magnésio, assim como o colesterol total,
HDL-colesterol e triglicerídeos entre os grupos;
Comparar as concentrações de osteocalcina, osteoprotegerina e leptina entre os grupos;
Comparar as concentrações dos ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poli-
insaturados presentes no soro do sangue, com auxílio da técnica de cromatografia, entre
os grupos;
37
Comparar a massa absoluta e relativa dos tecidos entre os grupos;
Comparar o aspecto geral do tecido hepático e a área do adipócito, através da técnica
histomorfológica de tecido, entre os grupos;
Comparar os parâmetros anatômicos, como a distância entre as epífises e largura da
diáfise, com auxílio de um paquímetro digital, entre os grupos.
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Ciência Médicas da
Universidade Federal Fluminense com
parte dos requisitos necessários à
obtenção do Grau de Mestre. Área de
Concentração: Ciência Médicas.
38
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ASPECTOS ÉTICOS
Esse projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de
Animais da Pró-Reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação da Universidade Federal
Fluminense (UFF) com o número: 474 (Anexo 9.1). Todos os procedimentos atenderam às
exigências previstas no projeto de lei nº 11.794/2008, que estabelece procedimentos para o uso
científico de animais.
4.2 MATERIAL
4.2.1 Animais
Foram utilizadas ratas Rattus norvegicus, variedade Albinus, linhagem Wistar, obtidas
a partir de colônias do Laboratório de Nutrição Experimental (LabNE) da Faculdade de
Nutrição da UFF, que foram mantidos em condições controladas de temperatura (22 ± 2ºC) e
umidade (60 ± 10%), com ambiente submetidos a ciclos de 12:12h claro-escuro.
4.2.2 Óleo de linhaça
O óleo de linhaça utilizado foi o da marca Giroil Agroindustria LTDA (Santo Ângelo,
RS, Brasil), o qual apresenta embalagem de vidro e de cor escura, visando evitar a oxidação
dos ácidos graxos pela luz. Foi adquirido em mercado local e armazenado em local apropriado
39
para o mesmo fim. No momento da confecção das rações ele foi pesado e logo utilizado no
preparo das mesmas.
4.2.3 Rações experimentais
As rações utilizadas ao longo do experimento foram preparadas no LabNE da Faculdade
de Nutrição da UFF.
A composição nutricional e o valor energéticos da dieta controle e da dieta contendo
óleo de linhaça se encontram nas Tabelas 2 e 3 respectivamente, sendo que o conteúdo de
vitaminas e minerais seguiu as recomendações da AIN-93G (Reeves et al., 1993). O
acompanhamento da ingestão foi realizado a cada 3 dias.
Tabela 2 – Composição nutricional a cada 1 Kg da ração controle e da ração óleo
de linhaça.
Ingrediente (g em 1 Kg) Ração controle Ração óleo de linhaça
Caseína ¹ 200 200
Amido de milho ² 529 529
Açúcar ³ 100 100
Óleo de soja 4 70 -
Óleo de linhaça 5 - 70
Celulose ¹ 50 50
Mix de Minerais (AIN-93G) 6 35 35
Mix de Vitaminas 6 10 10
L-cistina ¹ 3,0 3,0
Bitartarato de colina ¹ 2,5 2,5
BHT ¹ 0,014 0,014
Total 1000 1000
1 – Rhoster Indústria e Comércio LTDA®; 2 – Maisena; 3 – União®; 4 – Liza®; 5 – Giroil®; 6 – PragSoluções.
40
Tabela 3 – Composição dos macronutrientes da ração controle e da ração óleo de
linhaça.
Macronutrientes (g) Ração controle Ração óleo de linhaça
Proteína 170 170
Lipídio 70 70
Carboidrato 540,6 540,6
Kcal/Kg 3472 3472
4.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Foram utilizadas seis ratas com aproximadamente três meses de idade que foram
acasaladas e colocadas em gaiolas individuais com acesso à água e ração comercial ad libitum.
No nascimento dos filhotes (P0), houve um ajuste do número de filhotes, visando a
maximização do desempenho lactotrófico, sendo assim cada mãe ficou com 6 filhotes (Fishbeck
& Rasmussen, 1987). Nesse momento, a massa corporal da ninhada foi mensurada em balança
digital (sensibilidade 0,5g Filizola MF-3, Brasil).
No P0, as mães e suas ninhadas foram divididas em dois grupos, sendo um grupo
controle (GC), que recebeu dieta controle e um grupo óleo de linhaça (GOL), que recebeu dieta
contendo óleo de linhaça. Ao final de 21 dias de vida (P21), cada filhote do GC e GOL foi
desmamado e, após duas horas de jejum, anestesiado. Nesse momento, a massa e comprimento
corporal desses animais foram aferidos em balança digital (sensibilidade 0,5g Filizola MF-3,
Brasil) e em fita métrica, respectivamente (Esquema 1).
41
Esquema 1 – Delineamento experimental
P0 – dia do nascimento, filhotes com 0 dias de vida e início do consumo da ração controle ou óleo de linhaça; P21
– filhotes com 21 dias de vida; GC – grupo controle; GOL – grupo óleo de linhaça.
4.4 ANESTESIA
No P21, os filhotes foram anestesiados com injeção intraperitoneal de Thiopentax®
(Tiopental sódico 1G, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos LTDA, Brasil) a 5% (0,15
mL/100g p.c., i.p.) sendo a diluição de 50 mL de água destilada para 1 g de anestésico e então
foram submetidos à avaliação da composição corporal.
4.5 COMPOSIÇÃO CORPORAL
A composição corporal foi realizada no Laboratório de Avaliação Nutricional e
Funcional (LANUFF) da Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro da UFF. A análise foi
feita por absorciomentria com dupla emissão de raios-x (dual-energy X-ray absorptionmetry,
DXA), através do densitômetro LUNAR – IDXA (GE ®), que tem um software específico para
animais de pequeno porte (encore 2008. Version 13.40 GE Healthcare).
Foram analisados em cada rato os seguintes parâmetros: massa magra (g), massa gorda
(g), percentual de gordura (%), massa de gordura do tronco (g), densidade mineral óssea – DMO
(g/cm²), conteúdo mineral ósseo – CMO (g) e área óssea (cm²) total e da coluna vertebral.
Mãe com 6
filhotes cada
GC
(n = 12 filhotes)
GOL
(n = 12 filhotes)
P0
LACTAÇÃO DESMAME (P21)
FILHOTES
FORAM
ANESTESIADOS
RAÇÃO
CONTROLE
RAÇÃO ÓLEO DE
LINHAÇA
42
4.6 EUTANÁSIA E COLETA DO SANGUE
Após o DXA, os animais, ainda anestesiados, foram submetidos à incisão meto-pubiana
com subsequente abertura das cavidades torácicas e abdominal. A abertura da cavidade
abdominal foi feita removendo-se a pele e o peritônio e expondo as vísceras. Em seguida o
sangue foi coletado por punção cardíaca até exsanguinação total.
O sangue coletado foi transferido para tubos sem anticoagulante e com anticoagulante
(etilenodiaminotetracético, EDTA), em seguida centrifugados (Centrifuga Sigma) a 3500 RMP
durante 15 minutos para a obtenção do soro, que foi armazenado a -80ºC, para posteriores
análises.
4.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
4.7.1 Análises sorológicas
No soro foram analisados o colesterol (mg/dL), HDL-colesterol (lipoproteína de alta
densidade, high density lipoprotein, mg/dL), triglicerídeos (mg/dL), creatinina (mg/dL), ureia
(mg/dL), ácido úrico (mg/dL), albumina (g/dL), proteína total (g/dL), cálcio (mg/dL), fósforo
(mg/dL), magnésio (mg/dL), aspartato aminotransferase (AST, U/L), alanina aminotransferase
(ALT, U/L). Essas dosagens foram realizadas com o auxílio de um analisador automático de
bioquímica (Bioclin BS120, Quibasa - Química Básica Ltda/Belo Horizonte-MG), localizado
no LabNE/UFF.
4.7.2 Análises hormonais
Foram feitas analises de osteocalcina (ng/mL), osteoprotegerina (ng/mL) e leptina
(ng/mL). Tais dosagens foram realizadas no Instituto Genese de Análises Científicas – São
Paulo, pelo método de ensaio de imunoabsorção enzimática (enzyme linked immuno sorbent
assay, ELISA), utilizando o painel (RBN1MAG-31K-03, Elisa Multiplex ® Millipore,
Billerica, MA, USA).
43
4.7.3 Cromatografia
A determinação da composição de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poli-
insaturados foi realizada por cromatografia gasosa das amostras sorológicas no laboratório de
lipídios da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. A
derivatização de extrato de lipídios foi realizada de acordo com AOAC Official Methods 996,06
(AOAC, 2002; AOAC, 2005) com algumas modificações. Alíquotas de 0,2 mL de cada amostra
de soro, adicionados a um tubo de ensaio com tampa de rosca e ácido pirogálico 5 mg, 0,025
ml de padrão (5 mg / mL tritridecanoin C13: 0 em clorofórmio), 0,1 mL de etanol, 0,5 mL de
HCl 8,3 M e em alguns foram adicionadas esferas de vidro. Os tubos foram colocados em um
banho de água a 75 °C durante 40 min e depois arrefecida à temperatura ambiente.
Subsequentemente, 1 ml de éter etílico e 1 ml de éter de petróleo foram adicionados e as
amostras foram centrifugadas a 10.000rpm durante 5 min. A seguir as amostras foram
transferidas para outro tubo e o éter foi evaporado sob N2 em um banho de água (abaixo de
40°C). A metilação foi realizada por adição de 1 mL de BF3 (7% em metanol) e 0,5 mL de
tolueno e subsequente ebulição a 100°C durante 45 min. Após arrefecimento à temperatura
ambiente, 2,5 mL de água, 1 ml de hexano e aproximadamente 0,5 g de Na2SO4 anidro foram
adicionados. Os tubos foram deixados de repouso para permitir a separação de fases e em
seguida uma amostra desta fase foi transferida para um frasco contendo Na2SO4 anidro e onde
evaporou-se sob N2. Antes da injeção no cromatógrafo, 0,1 mL de hexano foram adicionados a
cada amostra. As amostras foram analisadas por cromatografia a gás (Shimadzu GC 17A)
equipado com um detector de ionização de chama (FID), injetor automático COA-20 e uma de
Classe GC10 Workstation. A separação de ácidos graxos foi realizada utilizando uma coluna
de sílica fundida SP-2560 (bis-cianopropilo polissiloxano) (100 m x 0,25 mm x 0,2 mm;
Supelco, Bellefonte, EUA). A temperatura da coluna foi programada como se segue: 140 °C
durante 5 min; aquecimento a 4°C / min até 240 °C; 240 °C durante 30 min. O injetor e o
detector era de 250°C, e foi usado hélio como gás transportador, a um caudal / min 1 mL. A
razão de separação foi de 1/10. Dois microlitros de extrato de lipídio derivatizado foi injetado
e os picos correspondentes aos ésteres metílicos dos ácidos graxos foram identificados por
comparação dos tempos de retenção dos padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos e os
cromatogramas forneceram Ce 1 h-05.
44
4.8 COLETA DOS TECIDOS
Após a coleta do sangue, o pâncreas, fígado, coração, rim direito, testículo direito, tecido
adiposo intra-abdominal (retroperitoneal, mesentérico e epididimal) foram retirados e pesados
em balança analítica (precisão 0,0001 Bosch S2000, Brasil), para análise quanto a massa
absoluta (g) e relativa (g/100g). O fêmur foi coletado e armazenado a -20 °C, para posteriores
análises.
4.9 ANÁLISE DO TECIDO HEPÁTICO
Após a coleta e pesagem do fígado, uma amostra deste tecido foi fixada em formol
tamponado e submetida aos processos de desidratação em uma série crescente de álcool etílico,
xilol e inclusão em parafina para a avaliação do seu estado geral. Os blocos de parafina com os
fragmentos de tecido hepático foram cortados em micrótomo rotativo (Microtec-CUT 4050),
com cortes semi-seriados de 5 µm e em seguida montados em lâmina de vidro para coloração
morfológica de hematoxilina-eosina (HE). A análise foi realizada no laboratório de técnica
histológica, localizado no Departamento de Ciências Fisiológicas/UERJ. A avaliação foi
determinada a partir da análise de imagens digitais adquiridas pela câmera digital Olympus
DP72 acoplada ao microscópio Olympus BX51 com ocular 20X. A análise foi realizada com o
auxílio de programa Image J - Pro versão 4.5.0.29.
4.10 ANÁLISE DO TECIDO ADIPOSO
Depois da coleta e pesagem do tecido adiposo intra-abdominal, uma amostra de gordura
retroperitoneal foi fixada em formol tamponado e submetida aos processos de desidratação em
uma série crescente de álcool etílico, xilol e inclusão em parafina para a avaliação da área dos
adipócitos, através de análise morfológica (Costa et al., 2011). Os blocos de parafina com os
fragmentos de tecido retroperitoneal foram cortados em micrótomo rotativo (Microtec-CUT
4050), com cortes semi-seriados de 5 µm e em seguida montados em lâmina de vidro para
coloração morfológica de hematoxilina-eosina (HE). Tais análises foram realizadas no
laboratório de técnica histológica, localizado no Departamento de Ciências Fisiológicas/UERJ.
A área seccional (µm²) dos adipócitos foi determinada a partir da avaliação de imagens digitais
45
adquiridas pela câmera digital Olympus DP72 acoplada ao microscópio Olympus BX51 com
ocular 20X e analisada com o auxílio de programa Image J - Pro versão 4.5.0.29.
4.11 ANÁLISES ÓSSEAS
Depois de limpo, o fêmur foi pesado em balança analítica (precisão 0,0001g Bosch
S2000, Brasil) e mensurado quanto ao comprimento através do paquímetro digital (JOMARCA,
0,01 mm) a partir da distância entre as epífises. Com a obtenção do comprimento, foi calculado
o ponto médio do fêmur e a partir desse valor mediu-se a largura da diáfise.
4.12 COMPOSIÇÃO ÓSSEA
A composição óssea do fêmur foi realizada no LANUFF da Faculdade de Nutrição
Emília de Jesus Ferreiro da UFF através do DXA. Foi analisada a DMO (g/cm²), CMO (g) e
área óssea (cm²). Seguindo protocolo descrito anteriormente (Costa et al., 2011).
4.13 CARCAÇAS
As carcaças foram armazenas em freezer -20 °C para descarte como lixo biológico e
foram recolhidas pela UFF e encaminhadas para PESAGRO-Rio (Empresa de Pesquisa
Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro) onde foram incineradas.
46
4.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O número de animais em cada grupo não permitiu realizar um teste de normalidade,
porém, geralmente as variáveis biológicas costumam ter distribuições simétricas e por isto foi
assumida a normalidade destas, assim, foi utilizado o teste t-Student para análise dos dados
relativos à ingestão alimentar, massa, comprimento corporal, resultados da composição
corporal, dados bioquímicos e resultados das análises do tecido adiposo e ósseo. Todos os
resultados foram expressos como média ± desvio padrão, considerando significativos os testes
que tiveram p < 0,05. A análise estatística foi realizada usando o programa S-Plus 8.0.
47
5 RESULTADOS
A figura 3 apresenta a evolução do consumo alimentar médio por grupo durante os 21
dias de lactação. Durante o período experimental, não foi observado nenhuma diferença
significativa entre os grupos.
Figura 3 – Evolução do consumo alimentar médio por grupo durante 21 dias de
lactação.
0 5 10 15 2060
80
100
120
140GC
GOL
Dias
Co
nsu
mo
alim
en
tar
(g)
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) durante a lactação.
Ao observar o peso dos filhotes ao nascer, notou-se que não houve diferença
significativa entre os grupos. No entanto, no final da lactação, pode-se observar diferença
significativa no que diz respeito à massa (+12%, p = 0,0051) e ao comprimento corporal (+10%,
p < 0,0001), visto que a estes fatores estavam maiores no GOL quando comparados ao GC. Em
48
relação à composição corporal analisada pelo DXA, observou-se um aumento percentual, mas
não significativo da massa magra (+10%). A massa gorda (+45%, p = 0,0021), percentual de
gordura (+33%, p = 0,0126), massa de gordura do tronco (+43%, p = 0,0249), DMO total (+8%,
p = 0,0018), CMO total (+55%, p = 0,0089), área óssea total (+35%, p = 0,0171), DMO da
coluna vertebral (+6%, p = 0,0441), CMO da coluna vertebral (+41%, p = 0,0030) e área óssea
da coluna vertebral (+26%, p = 0,0167) estavam mais altos no GOL quando comparado ao GC
(Tabela 4).
Tabela 4 – Massa, comprimento e composição corporal dos filhotes aos 21 dias de
idade.
Resultados, unidade de medida GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
Massa corporal da ninhada P0, g 38,93 ± 1,76 38,64 ± 2,92 0,4574
Massa corporal dos filhotes P21, g 54,42 ± 6,21 61,08 ± 4,05 0,0051
Comprimento corporal, cm 18,79 ± 0,78 20,58 ± 0,46 < 0,0001
Massa magra, g 31,82 ± 4,57 35,17 ± 3,07 0,0503
Massa gorda, g 14,42 ± 4,50 21,00 ± 4,76 0,0021
Percentual de gordura, % 30,40 ± 8,69 40,46 ± 9,42 0,0126
Massa de gordura do tronco, g 5,91 ± 2,99 8,50 ± 2,19 0,0249
DMO total, g/cm² 0,059 ± 0,002 0,064 ± 0,003 0,0018
CMO total, g 0,69 ± 0,19 1,07 ± 0,28 0,0089
Área óssea total, cm2 12,83 ± 4,26 17,42 ± 4,44 0,0171
DMO da coluna vertebral, g/cm2 0,076 ± 0,001 0,081 ± 0,001 0,0441
CMO da coluna vertebral, g 0,24 ± 0,07 0,34 ± 0,06 0,0030
Área óssea da coluna vertebral, cm2 3,16 ± 0,71 4,00 ± 0,85 0,0167
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias de idade. P0 – nascimento dos
filhotes; P21 – filhotes com 21 dias de vida; DMO – densidade mineral óssea; CMO – conteúdo mineral ósseo.
Ao analisar os resultados sorológicos, pode-se observar que o colesterol estava
significativamente menor (-13%, p = 0,0001) e o HDL-colesterol estava maior (+29%, p <
0,0001) no GOL quando comparado ao GC. Os valores de triglicerídeos, ureia, creatinina, ácido
úrico, albumina, proteínas totais, cálcio, fósforo, magnésio, AST e ALT não apresentaram
diferença significativa entre os grupos (Tabela 5).
49
No que diz respeito às análises hormonais, pode-se observar níveis significativamente
mais altos da osteocalcina (+173%) e osteoprotegerina (+183%) no GOL quando comparado
ao GC. Os valores de leptina não apresentaram diferença significativa entre os grupos (Tabela
5 e Figura 4).
Tabela 5 - Dados sorológicos e análises hormonais dos filhotes aos 21 dias de idade.
Resultados, unidade de medida GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
Colesterol, mg/dL 124,7 ± 10,7 107,9 ± 5,8 0,0001
HDL-colesterol, mg/dL 36,08 ± 2,84 46,83 ± 2,51 < 0,0001
Triglicerídeos, mg/dL 78,55 ± 20,79 65,45 ± 20,61 0,1536
Creatinina, mg/dL 0,24 ± 0,12 0,16 ± 0,04 0,0644
Ureia, mg/dL 22,50 ± 5,17 22,92 ± 3,05 0,8126
Ácido úrico, mg/dL 1,35 ± 0,30 1,10 ± 0,33 0,0834
Albumina, g/dL 3,02 ± 0,24 3,18 ± 0,17 0,0683
Proteínas Totais, g/dL 5,00 ± 0,46 4,77 ± 0,31 0,1763
Cálcio, mg/dL 11,11 ± 1,09 10,53 ± 0,50 0,1067
Fósforo, mg/dL 11,68 ± 1,05 10,72 ± 0,56 0,0710
Magnésio, mg/dL 2,70 ± 0,46 2,37 ± 0,24 0,0521
AST, U/L 190,2 ± 58,85 180,6 ± 31,99 0,6279
ALT, U/L 29,08 ± 18,18 21,42 ± 7,14 0,1877
Osteocalcina, ng/mL 88,01 ± 12,00 240,30 ± 36,63 0,0093
OPG, ng/mL 1,19 ± 0,38 3,38 ± 0,73 0,0405
Leptina, ng/mL 6,19 ± 1,18 7,62 ± 1,37 0,0611
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias de idade. AST – alanina
aminotransferase; ALT – alanina aminotransferase; OPG – osteoprotegerina.
50
Figura 4 – Dados hormonais de osteocalcina, osteoprotegerina e leptina dos filhotes
aos 21 dias de idade.
A - Osteocalcina (p = 0,0093), B- osteoprotegerina (p = 0,0405) e C- leptina (p = 0,0611) do grupo controle (GC,
n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias de idade.
GC GOL
0
100
200
300
400
500
Ost
eoca
lcin
a (
ng/m
L)
GC GOL
0
2
4
6
8
Oste
op
rote
ge
rin
a (
ng
/mL
)
GC GOL
0
5
10
15
20
Le
ptin
a (
ng
/mL
)
A
B
C
51
As Tabelas 6 e 7 mostram os resultados da composição de ácidos graxos saturados e
monoinsaturados do soro dos filhotes aos 21 dias de idade. Nota-se que não houve diferença
significativa entre os grupos.
Tabela 6 – Composição de ácidos graxos saturados do soro dos filhotes aos 21 dias
de idade (mg/100mL).
Fórmula Nome GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
12 : 0 Láurico 13,07 ± 9,02 3,67 ± 0,71 0,0832
14 : 0 Mirístico 10,29 ± 4,86 7,03 ± 0,68 0,2344
15 : 0 Pentadecanoico 1,03 ± 0,76 0,72 ± 0,01 0,4523
16 : 0 Palmítico 104,46 ± 25,53 97,86 ± 4,26 0,6284
17 : 0 Margárico 1,08 ± 0,24 0,98 ± 0,25 0,5864
18 : 0 Esteárico 63,70 ± 10,15 63,23 ± 1,71 0,9300
20 : 0 Eicosanoico 0,85 ± 0,15 0,54 ± 0,01 0,0880
22 : 0 Docosanoico 0,87 ± 0,31 0,50 ± 0,001 0,0948
24 : 0 Lignocérico 1,87 ± 0,23 1,71 ± 0,14 0,2942
TAGS 197,22 ± 35,87 176,26 ± 4,08 0,2898
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias de idade. TAGS – total de ácidos
graxos saturados
52
Tabela 7 – Composição dos ácidos graxos monoinsaturados do soro aos 21 dias de
idade (mg/100 mL).
Fórmula Nome GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
16 : 1 (n-7) Palmitoleico 1,61 ± 0,34 2,05 ± 0,19 0,1086
18 : 1 (n-9) Oléico 43,69 ± 14,89 37,11 ± 3,75 0,4245
18 : 1 (n-7) Vacênico 3,25 ± 0,43 2,92 ± 0,40 0,2571
20 : 1 (n-9) Eicosenoico 0,56 ± 0,13 0,37 ± 0,06 0,1817
24 : 1 Nervônico 4,53 ± 3,28 1,84 ± 0,18 0,2003
TAGM 53,67 ± 12,57 44,32 ± 4,30 0,2088
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias. TAGM – total de ácidos graxos
monoinsaturados.
Em relação aos ácidos graxos poli-insaturados (Tabela 8), observou-se valores mais altos
de ácido -linolênico (ALA, p < 0,0001) e ácido eicosapentaenoico (EPA, p < 0,0001) e valores
mais baixos do ácido araquidônico (AA, p = 0,0145) no GOL quando comparados ao GC.
53
Tabela 8 – Composição dos ácidos graxos poli-insaturados do soro dos filhotes aos
21 dias de idade (mg/100 mL).
Fórmula Nome GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
18 : 2 (n-6) Linoleico 84,91 ± 14,14 78,41 ± 7,21 0,4442
18 : 3 (n-6) -Linolênico 0,34 ± 0,23 0,62 ± 0,20 0,1263
18 : 3 (n-3) -Linolênico 3,26 ± 1,20 20,93 ± 1,71 < 0,0001
20 : 2 Eicosadienoico 1,37 ± 0,35 1,15 ± 0,29 0,3869
20 : 3 Ácido dihomo-
gama-linolênico 2,31 ± 0,47 2,22 ± 0,25 0,7550
20 : 4 (n-6) Araquidônico 74,37 ± 16,62 44,88 ± 4,99 0,0145
20 : 5 (n-3) Eicosapentaenoico 1,45 ± 0,54 11,85 ± 0,95 < 0,0001
22 : 5 (n-3) Docosapentaenoico 3,19 ± 0,74 6,71 ± 0,86 0,0800
22 : 6 (n-3) Docosa-hexaenoico 13,69 ± 4,71 14,54 ± 1,42 0,7419
TAGPI 184,93 ± 36,42 181,32 ± 12,38 0,8575
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias. TAGPI – total de ácidos graxos
poliinsaturado.
Na Tabela 9, encontra-se a massa absoluta dos tecidos corporais. Notou-se que a massa
absoluta do coração, fígado, pâncreas, rim direito e testículo direito, não apresentou diferença
significativa entre os grupos, no entanto, a massa do tecido adiposo intra-abdominal foi maior
no GOL quando comparado ao GC.
54
Tabela 9 – Massa absoluta do coração, fígado, pâncreas, rim direito, testículo
direito e tecido adiposo intra-abdominal dos filhotes aos 21 dias de idade.
Resultados, unidade de medida GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
Coração, g 0,278 ± 0,067 0,302 ± 0,0163 0,252
Fígado, g 2,174 ± 0,334 2,383 ± 0,217 0,083
Pâncreas, g 0,201 ± 0,029 0,227 ± 0,038 0,090
Rim direito, g 0,281 ± 0,028 0,305 ± 0,029 0,073
Testículo direito, g 0,140 ± 0,031 0,160 ± 0,026 0,080
Tecido adiposo intra-abdominal, g 0,687 ± 0,210 0,855 ± 0,139 0,031
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias.
A tabela 10 apresenta os valores da massa relativa dos tecidos corporais. Pode-se observar
que a massa relativa do coração, fígado, pâncreas, rim direito, testículo direito e tecido adiposo
intra-abdominal não diferiu significativamente entre os grupos.
Tabela 10 – Massa relativa do coração, fígado, pâncreas, rim direito, testículo
direito e tecido adiposo intra-abdominal dos filhotes aos 21 dias de idade.
Resultados, unidade de medida GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
Coração, g/100g 0,524 ± 0,131 0,499 ± 0,029 0,458
Fígado, g/100g 3,985 ± 0,274 4,000 ± 0,411 0,897
Pâncreas, g/100g 0,341 ± 0,077 0,384 ± 0,097 0,217
Rim direito, g/100g 0,492 ± 0,086 0,538 ± 0,043 0,094
Testículo direito, g/100g 0,245 ± 0,077 0,268 ± 0,036 0,305
Tecido adiposo intra-abdominal, g/100g 1,248 ± 0,273 1,361 ± 0,109 0,195
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias.
55
A figura 5 demonstra as fotomicrografias de secção histológica do tecido hepático do
GC e do GOL. Observou-se que não há uma diferença entre os grupos, ambos sem esteatose.
Figura 5 - Fotomicrografias de secções histológicas do tecido hepático dos filhotes
aos 21 dias de idade. (Objetiva 20X).
Fotomicrografia de secções histológicas do tecido hepático do GC (A) e do GOL (B).
A figura 6 apresenta os valores da massa absoluta e relativa do tecido adiposo intra-
abdominal, a área do adipócito e as fotomicrografias de secções histológicas de tecido adiposo
retroperitoneal aos 21 dias de idade. Devido à dificuldade de processamento, a gordura
mesentérica e epididimal não foram analisadas. Como dito anteriormente, o GOL apresentou
maior massa absoluta do tecido adiposo intra-abdominal em relação ao GC e a massa relativa
não diferiu entre os grupos. No entanto, quando comparada ao GC, a área do adipócito estava
menor no GOL (p < 0,0001).
A B
56
Figura 6 – Massa absoluta e relativa do tecido adiposo intra-abdominal, área do
adipócito e fotomicrografias de secções histológicas de tecido adiposo retroperitoneal dos
filhotes aos 21 dias de idade. (Objetiva 20X).
A - Massa absoluta do tecido adiposo intra-abdominal (p = 0,031); B - massa relativa do tecido adiposo intra-
abdominal (p = 0,1959); C - morfometria do adipócito (área seccional) (p < 0,0001) do grupo controle (GC, n =
12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12), dos filhotes aos 21 dias de idade. Fotomicrografia do tecido adiposo
retroperitoneal do GC (D), aspecto usual do tecido adiposo e do GOL (E), que apresentou menor área do adipócito.
GC GOL
500
1500
2500
3500
Áre
a d
o a
dip
ócito
(µ
m²)
GC GOL
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Ma
ssa
re
lativa
do
te
cid
o a
dip
oso
in
tra
-ab
do
min
al (g
/10
0g
)
D
GC GOL
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Ma
ssa
ab
so
luta
do
te
cid
o a
dip
oso
in
tra
-ab
do
min
al (g
)
E
A
B
C
57
Em relação aos dados ósseos, o GOL mostrou maior massa do fêmur (+10%, p = 0,030)
e distância entre as epífises (+4%, p = 0,002). A largura da diáfise não apresentou diferença
entre os grupos. Na composição óssea realizadas pelo DXA, observou-se maior DMO (+13%,
p = 0,010) mas não foi houve diferença significativa no CMO e área óssea (Tabela 11).
Tabela 11 – Parâmetros ósseos dos filhotes aos 21 dias de idade.
Resultados, unidade de medida GC (n = 12) GOL (n = 12) p-valor
Massa do fêmur, g 0,176 ± 0,023 0,194 ± 0,013 0,030
Distância entre as epífises, mm 17,87 ± 0,70 18,70 ± 0,40 0,002
Largura da diáfise, mm 2,46 ± 0,12 2,46 ± 0,11 0,898
DMO, g/cm2 0,035 ± 0,004 0,040 ± 0,004 0,010
CMO, g 0,39 ± 0,27 0,50 ± 0,42 0,476
Área óssea, cm2 12,58 ± 7,46 15,82 ± 9,31 0,839
Grupo controle (GC, n = 12) e grupo óleo de linhaça (GOL, n = 12) aos 21 dias de idade. DMO – densidade
mineral óssea; CMO – conteúdo mineral ósseo.
58
6 DISCUSSÃO
A ingestão de óleo de linhaça durante a lactação contribuiu para uma maior massa e
comprimento corporal, HDL-colesterol, osteocalcina, OPG, massa gorda e densidade mineral
óssea nos filhotes. Provavelmente, a composição dos ácidos graxos do soro, durante este
período, contribuiu para os desfechos observados na composição corporal, desenvolvimento
ósseo e perfil lipídico dos filhotes no final da lactação no presente estudo.
O consumo alimentar não diferiu entre os grupos durante os 21 dias, isto pode ser
explicado pelo fato das dietas serem normoglicídicas, normolipídicas, normoproteícas e
normocalóricas, e ainda apresentarem a mesma quantidade de fibra. A diferença entre as rações
é a qualidade do lipídio, visto que o óleo de soja, utilizado na confecção da ração controle, é
fonte de LA e o óleo de linhaça, da ração óleo de linhaça, fonte de ALA.
Tinoco et al. (2009) observaram que as concentrações elevadas de ALA no leite estão
associadas com maior massa e comprimento corporal em prematuros. Corroborando com este
dado epidemiológico, no atual estudo, os filhotes do grupo óleo de linhaça apresentaram maior
massa e comprimento corporal. Este fato pode ser explicado devido ao óleo de linhaça ser uma
fonte relevante de ALA, como dito anteriormente. Este ácido graxo está envolvido no
crescimento e desenvolvimento celular (Korotkova et al. 2004; Innis, 2005), assim,
contribuindo para o desenvolvimento físico da prole. Em modelo experimental utilizando a
farinha de linhaça, Fernandes et al. (2011) encontram menor massa corporal nos filhotes que
receberam esta dieta durante a gestação e lactação, indicando que é preciso ter atenção ao
indicar a ingestão de linhaça durante essas fases da vida. No entanto, no presente estudo, as
mães receberam óleo de linhaça somente no período de lactação e seus filhotes apresentaram
maior massa corporal, o que também foi encontrado por Costa et al. (2015) ao utilizar farinha
de linhaça no mesmo período. Estudos anteriores (Dirienzo et al., 2008; Kruger et al., 2010)
59
demostraram que a baixa razão de LA/ALA contribui para a formação óssea e a alta razão
estimula a reabsorção óssea. A partir da análise da composição dos ácidos graxos do soro do
sangue, foi observado uma baixa razão de LA/ALA no GOL, o que pode ter contribuído para o
melhor desenvolvimento corporal e ósseo desse grupo.
A absorciometria com dupla emissão de raio-X é considerado um método validado para
determinar a composição corporal e tem sido utilizada com sucesso em estudos que avaliam o
corpo como um todo e a região óssea dos ratos (Lukaski et al., 2001; Glickman et al., 2004;
Tsujio et al., 2009). Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que avalia a composição
corporal de filhotes aos 21 dias de vida, cujas mães receberam dieta contendo óleo de linhaça
durante o período de lactação. Anteriormente, Costa et al. (2015) reportaram que filhotes
alimentados com farinha de linhaça durante a lactação mostraram maior massa gorda e massa
magra aos 21 dias, o que também foi observado no atual estudo. Neste, o óleo de linhaça
contribuiu para o aumento dos compartimentos corporais, visto que, o GOL demonstrou, além
de massa gorda, maior massa magra (10%, p = 0,0503) e massa óssea. A dieta com óleo de
linhaça contém baixa concentração de LA comparada ao óleo de soja (13% vs. 54%,
respectivamente) (Goyal et al., 2014); apesar da concentração de LA na dieta contendo óleo de
linhaça ser menor do que o recomendado pela AIN-93G (-40%, aproximadamente), observou-
se que o GOL teve um desenvolvimento corporal adequado e maior do que o GC, evidenciando
que a composição de ácidos graxos do soro do GOL, com baixa razão de LA/ALA, está
associado com o aumento dos compartimentos corporais nos primeiros períodos da vida.
Estudos prévios demonstram um efeito benéfico da farinha de linhaça no perfil lipídico
em modelos epidemiológicos e experimentais (Cardozo et al., 2010; Pacheco et al., 2011;
Ribeiro et al., 2014; Costa et al., 2015; Cassani et al, 2015). De fato, o presente estudo corrobora
com esses efeitos da farinha de linhaça, visto que houve menor valor do colesterol sérico,
triglicerídeos (-16%, p = 0,01536) e maior nível de HDL-colesterol. Akpolat et al. (2010)
utilizaram óleo de linhaça associado a uma dieta rica em gordura e observaram redução do
colesterol total. Riediger et al. (2008) ofereceram óleo de linhaça a camundongos e notaram
que os triglicerídeos e o colesterol estavam menores neste grupo, explicando que isto está
relacionado a baixa razão de LA/ALA. Pirillo & Catapano (2015) e Choi & Choi-Kwon (2015)
relatam que ALA diminui a concentração de triglicerídeos devido a inibição da enzima 3-
hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A redutase (HMG-CoA), enzima relacionada com a síntese
de colesterol. Em relação ao HDL-colesterol, está bem descrito na literatura que o aumento da
sua concentração sérica está diretamente relacionado a diminuição do risco de desenvolver
60
doenças cardiovasculares, visto que ele recolhe o excesso de colesterol e leva para ser
metabolizado no fígado (Tan, 1980; Van Gaal et al., 2006; Mooradian et al., 2008; Tablet &
Rye, 2009). No entanto, o efeito do ALA na concentração de HDL-colesterol ainda não é
consistente (Goyal et al., 2014).
A creatinina, ureia e ácido úrico são compostos indesejáveis para o organismo, por este
motivo, devem ser excretados pelos rins (Haase et al, 2009). Sendo assim, quando aumentados
no sague demonstram prejuízo da função renal. Os valores séricos de ureia também estão
relacionados com a eficiência da utilização de nitrogênio pelo organismo, sendo um bom
indicador para deficiência proteica devido à alimentação inadequada (Teixeira et al., 2000;
Khon et al., 2005). No atual estudo, os níveis destas substâncias não apresentaram diferença
significativa entre os grupos, sugerindo que os filhotes possuem boa função renal e bom aporte
proteico proveniente do leite materno. Este fato era esperado visto que o leite materno tem o
aporte proteico necessário para o desenvolvimento adequado do lactente (Uauy et al., 2001).
A albumina, proteína sintetizada pelo fígado, é a mais abundante no sangue e quando
está abaixo dos níveis normais, pode indicar diminuição da sua síntese e/ou aumento da
excreção urinária, revelando, neste caso, doenças como insuficiência hepática e/ou doenças
renais, respectivamente. A albumina tem papel fundamental na manutenção da pressão
coloidosmótica e no transporte sanguíneo de substâncias (Kaneco et al., 2008; Litchford, 2010).
Neste estudo, os valores de albumina estavam por volta de 3 mg/dL, o que também foi
encontrado por outros estudos com ratos disponíveis na literatura (El Hendy et al., 2001; Zhou
& Han, 2006), demonstrando assim que os filhotes apresentam boa função hepática e renal.
Quando os valores séricos de proteínas totais estão abaixo do valor de referência
indicam desnutrição proteica, devido à restrição do aporte de aminoácidos, que pode ser devido
ao baixo consumo de proteína de alto valor biológico ou devido à ingestão de alimentos com
aminograma satisfatório, mas com algum fator que impeça a sua digestão e/ou absorção
(Pinheiro, 2005). No presente estudo, os valores de proteínas totais não diferiram entre os
grupos. Isto se deve ao fato da dieta controle e óleo de linhaça estarem balanceadas de acordo
com as recomendações da AIN-93 G, responsável pela oferta de macro e micronutrientes para
crescimento adequado do filhote (Reeves et al., 1993).
O osso é o maior depósito de cálcio do organismo, mineral que desempenha importantes
funções, entre elas, contração muscular, sinalização celular, transmissão neural e coagulação
sanguínea. Visto sua grande importância, quando seus níveis estão abaixo dos valores
61
recomendados, o paratormônio (PTH) é liberado, atuando diretamente no osso, aumentando a
taxa de reabsorção óssea, assim, elevando os níveis de cálcio no sangue. Quando a concentração
está acima do recomendado, os níveis de PTH diminuem, assim como a reabsorção óssea,
aumentando a deposição de cálcio no osso. Além de atuar no osso, o PTH atua nos rins,
promovendo reabsorção de cálcio nos túbulos renais reduzindo sua excreção urinária, e na
ativação da vitamina D, no rim, aumentando a absorção de cálcio a nível intestinal (Suzuki et
al., 2008; Guyton & Hall, 2011; Shaker & Deftos, 2014). Neste estudo, os níveis de cálcio não
diferiram entre os grupos, o que já era esperado, visto que as rações estavam balanceadas de
acordo com a AIN-93G (Reeves et al., 1993), ou seja, com aporte ideal desse mineral, além do
fato, do cálcio ser regulado de forma precisa, como descrito anteriormente, não sofrendo
grandes variações. Devido limitações técnicas não foi possível avaliar o PTH e a vitamina D,
mas pode-se sugerir que houve uma manutenção da homeostase via estes compostos.
O fósforo sérico é utilizado para analisar a quantidade de fosfato, visto que esta
determinação é difícil. Está presente na adenosina trifosfato, relacionado com a geração de
energia, além de compor as membranas plasmáticas, integrado com os lipídios, formando os
fosfolipídios, proporcionando polaridade. As variações dos níveis de fosfato não causam efeitos
imediatos no organismo, diferente do cálcio, mas também é influenciado pelo PTH, que atua
aumentando ou diminuindo a sua absorção via tecido ósseo. No entanto, a baixa concentração
de fosfato, a nível crônico, está diretamente relacionada com a diminuição da mineralização
óssea (Gayton & Hall, 2011). No presente estudo, não houve diferença significativa nos valores
de fósforo.
O magnésio, outro mineral que tem sua reserva no tecido ósseo, desempenha inúmeras
funções, como contração muscular, impulso nervoso. Quando está abaixo dos valores de
referência pode determinar doença renal, visto que ocorre alta excreção deste mineral
(Rapisarda et al., 2016). No presente estudo, os valores de magnésio não diferiram entre os
grupos.
A aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase, assim como outros
marcadores, são importantes para a monitoração da função hepática, uma vez que, quando
aumentadas no soro indicam hepatotocidade ou injúria hepatocelular, mas quando abaixo do
valor de referência, não indicam desordens orgânicas (Borges et al, 2005; Litchford, 2010). No
atual estudo, os seus níveis não diferiram entre os grupos, demonstrando boa função hepática,
o que também pode ser justificado pela fotomicrografia de secção histológicas do fígado, na
62
qual nota-se ausência de esteatose. Um estudo experimental realizado com ratos Wistar analisou
o efeito do n-3, administrado por gavagem, no fígado, e observaram uma diminuição de AST e
ALT, justificando estes achados devido à ação antioxidante deste ácido graxo (Abdou &
Hassan, 2014). Além disso,
A leptina é um hormônio proteico, secretado pelo tecido adiposo branco e atua no
hipotálamo diminuindo a ingestão de alimentos e aumentando o gasto energético. Está
relacionado com a obesidade, visto que sem esse hormônio ocorre a ingestão de calorias acima
das necessidades normais de um indivíduo, já que está associado com a saciedade (Zhang et al.,
1994). No presente estudo, os valores de leptina não deferiram entre os grupos. Figueiredo et
al. (2012) observaram que os filhotes alimentados com dieta contendo farinha de linhaça,
também no período de lactação, apresentaram hiperleptinemia e justificou este resultado devido
ao aumento da leptina no leite materno. No entanto, Costa et al. (2015) estudaram a influência
da farinha de linhaça na adiposidade dos filhotes cujas mães receberam 25% de farinha de
linhaça durante a lactação e encontraram resultados semelhantes aos valores de leptina do
presente estudo.
Osteocalcina é uma proteína secretada pelo osteoblasto, que regula a mineralização
óssea (Wei & Karsenty, 2015), um processo cíclico de formação e reabsorção óssea, que nos
primeiros períodos da vida, predomina a formação sobre a reabsorção óssea (Khan et al., 2001).
A baixa concentração de osteocalcina está relacionada com redução do turnover ósseo, o que
pode acarretar em alterações na deposição óssea, podendo ocasionar osteoporose na vida adulta
(Dawson-Hughes & Harris, 2002). No presente estudo, a concentração sanguínea de
osteocalcina estava maior no GOL do que no GC, isso pode ter acarretado em maior massa
óssea, maior distância entre as epífises e maior DMO no GOL. O que também pode ter
contribuído para estes desfechos foi a maior concentração de osteoprotegerina no GOL, um
receptor chamariz do RANKL que regula negativamente a osteoclastogênese (Ferrer et al.,
2002), assim, diminuindo a síntese de osteoclastos favorecendo a formação óssea.
Como esperado, a composição de ácidos graxos do soro do GOL apresentou maior
concentração de ALA e EPA e menor AA, pois a composição de ácidos graxos do soro está
relacionada com a composição destes na dieta (Lands, 1995). O ALA e o LA competem pelas
mesmas enzimas, a delta-6-dessaturase, para serem convertidos em EPA e AA, respectivamente
(Salem, 1999; Valenzuela et al., 2011) e segundo Almeida et al. (2011), esta enzima tem maior
especificidade pelo ALA, quando este está em altas concentrações. Como dito anteriormente,
63
o óleo de linhaça é fonte de ALA, sendo assim, este contribuiu para o aumento de ALA e EPA
e diminuição da conversão de LA em AA no soro dos filhotes cujas mães foram alimentadas
com dieta contendo óleo de linhaça.
A massa absoluta e relativa do coração, fígado, pâncreas, rim direito e testículo direito
não diferiram entre os grupos, no entanto, foi observado que o GOL apresentou maior massa
absoluta da gordura intra-abdominal, justificado pelo aumento do compartimento corporal e
similar massa relativa, visto que os filhotes do GOL apresentam maior massa e comprimento
corporal, sendo assim, o óleo de linhaça contribuiu para uma manutenção da adiposidade
proporcional às dimensões corporais
Ainda assim, ao observar a gordura retroperitoneal morfologicamente, notou-se uma
diminuição da área do adipócito. Este fato pode estar associado com o aumento da concentração
de EPA no soro dos filhotes do GOL. Estudos têm evidenciado que este ácido graxo é um
potente agonista do PPAR-α, que, como dito anteriormente, está relacionado com a oxidação
de lipídios (Iwami et al., 2011; Wei & Jacobson, 2011). Além disso, Nielsen et al. (2013)
observou que o conteúdo de PUFA no tecido adiposo está diretamente relacionado com a
concentração destes no soro. O AA é identificado como um composto adipogênico, estimulando
o crescimento do tecido adiposo, enquanto o ALA demonstra efeitos contrários na adiposidade
(Massiera et al., 2003). Este achado está de acordo com os resultados de Baranowski et al.
(2012), no qual eles avaliaram o efeito do ALA oriundo do óleo de linhaça em ratos obesos e
observaram que houve uma redução da hipertrofia dos adipócitos. LeMieux et al. (2015) e Costa
et al. (2015) também encontraram menor área do adipócito em camundongos obesos que
recebiam dieta high-fat adicionada com EPA e em ratos wistar com 90 dias de vida alimentados
com dieta contendo farinha de linhaça desde o período de lactação, respectivamente.
O tecido ósseo é rígido, mas é continuamente modelado e reparado. Durante a infância
e adolescência, a formação óssea excede a reabsorção, resultando na aquisição óssea (Lukas et
al., 2011). Porém, alguns fatores, como estilo de vida e composição de ácidos graxos da dieta
são importantes para determinar a integridade óssea (Thorsen et al., 1999; Boyle et al., 2003;
Farquharson & Staines, 2011). O ALA está associado com o recrutamento e manutenção dos
pré-osteoblastos, promovendo formação óssea (Kruger et al, 2010). Além disso, o ALA ajuda
na manutenção dos níveis de osteocalcina e OPG e diminui RANK, receptor encontrado nos
pré-osteoclastos que ao se ligar ao RANKL promove maturação dos osteoclastos. Em adição,
o ALA também está relacionado com o tempo de vida dos osteoclastos, visto que induz sua
64
apoptose, assim diminuindo a reabsorção óssea (Kruger et al, 2010). Assim, estes achados
ajudam a explicar que um maior nível de OPG, osteoclacina e parâmetros ósseos observados
no GOL são importantes para a integridade óssea, ressaltando o benefício de uma dieta materna
contendo óleo de linhaça, que é fonte de n-3, durante a lactação na estrutura óssea. Ao observar
os resultados provenientes do DXA, observou-se maior DMO, CMO e área óssea confirmando
a importância do óleo de linhaça ao desmame. Tais resultados foram encontrados por Costa et.
al (2015) que estudaram a influência da farinha de linhaça na estrutura óssea de filhotes aos 21
dias de vida.
Outro fator que pode ter contribuído para a estrutura óssea foi o maior nível do HDL-
colesterol e menor concentração do colesterol. Quando relacionado à estrutura óssea, diversos
estudos têm sugerido que a diminuição de HDL e aumento de colesterol e triglicerídeos podem
diminuir a DMO (Cui et al., 2005; Jeong et al, 2010; Pirilä et al., 2014; Mandal, 2015), mas
existem contradições (Brownbill & Ilich, 2006). Estudos experimentais relataram que a
oxidação de colesterol interfere na diferenciação do osteoblasto, proporcionando menor
formação óssea e maior razão de reabsorção óssea e tempo de vida médio do osteoclasto, com
consequente redução da DMO (Raclot & Groscolas, 1994; Riccardi et al., 2004; Hsu et al.,
2006). Filhotes cujas mães foram alimentadas com dieta contendo óleo de linhaça durante a
lactação apresentaram menor nível de colesterol e maior de HDL. Sugere-se que o menor nível
do colesterol sérico e maior valor do HDL podem ter contribuído para um melhor
desenvolvimento ósseo, como observado no GOL.
65
7 CONCLUSÕES
O consumo de ração durante a lactação não diferiu entre os grupos;
A massa e comprimento corporal do GOL foram maiores quando comparado ao GC.
O GOL apresentou maior massa gorda, percentual de gordura, massa de gordura do
tronco, DMO, CMO e área óssea total e da coluna vertebral do GOL comparado ao GC;
Não houve diferença significativa em relação ao triglicerídeos, creatinina, ureia, ácido
úrico, albumina, proteínas totais, cálcio, fósforo, magnésio, AST e ALT, mas notou-se
menor concentração de colesterol e maior nível de HDL-colesterol no GOL;
Notou-se maiores níveis de osteocalcina e osteoprotegerina no GOL e a leptina, no
entanto, não diferiu entre os grupos;
Ocorreu diferença significativa apenas nos ácidos graxos poli-insaturados, no qual pode-
se notar maior concentração de ALA e EPA e menor teor de AA no GOL;
Não foi encontrada diferença significativa em relação a massa absoluta e relativa dos
tecidos, exceto o tecido adiposo intra-abdominal, cuja massa absoluta estava maior no
GOL;
A fotomicrografia do tecido hepático não diferiu entre os grupos e a área do adipócito
estava menor no GOL;
A massa do fêmur, distâncias entre as epífises e DMO da peça óssea estava maior no
GOL.
66
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77
9 ANEXOS
78
9.1 APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL
79
9.2 RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS
1. Composição corporal de ratos Wistar com 21 dias oriundos de mães alimentadas com
ração a base de óleo de linhaça. Henrique Saldanha Melo, Aline D’Avila Pereira,
Danielle Cavalcante Ribeiro, Carlos Alberto Soares da Costa, Luis Guillermo Coca
Velarde, Gilson Teles Boaventura. XXIII Congresso Brasileiro de Nutrição e V
Congresso Ibero-americano de Nutrição, CONBRAN 2014.
2. Avaliação da composição corporal e da estrutura óssea de ratos wistar machos, no
momento do desmame, cujas mães foram alimentadas com ração contendo óleo de
linhaça durante o período de lactação. Aline D’Avila Pereira, Bianca Ferolla da Camara
Boueri, Danielle Cavalcante Ribeiro, Paula Cristina Alves da Silva, Carolina Ribeiro
Pessanha, Maíra Duque Coutinho de Abreu, Luis Guillermo Coca Velarde, Carlos
Alberto Soares da Costa, Gilson Teles Boaventura. VI Encontro de Nutrição Clínica
Funcional e Medicina do Rio de Janeiro & IV Simpósio de Nutrição Esportiva,
2014.
3. Avaliação da adiposidade intra-abdominal de ratos Wistar machos cujas mães foram
alimentadas com ração contendo óleo de linhaça durante a lactação. Aline D’Avila
Pereira, Danielle Cavalcante Ribeiro, Fernanda Carvalho de Santana, Aline de Sousa
dos Santos, Bianca Ferolla da Camara Boueri, Carolina Ribeiro Pessanha, Maíra Duque
Coutinho de Abreu, Henrique Saldanha Melo, Letícia Rozeno Pessoa, Jorge Mancini-
Filho, Celly Cristina Alves do Nascimento-Saba, Luis Guillermo Coca Velarde, Carlos
Alberto Soares da Costa, Gilson Teles Boaventura.4º Prêmio NutriGEN, 2015.
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9.3 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO
9.3.1 Lipids
“Maternal flaxseed oil during lactation enhances bone development in male rats”
Aline D’Avila Pereira, Danielle Cavalcante Ribeiro, Fernanda Carvalho de Santana, Aline de
Sousa dos Santos, Jorge Mancini-Filho, Celly Cristina Alves do Nascimento-Saba, Luis
Guillermo Coca Velarde, Carlos Alberto Soares da Costa, Gilson Teles Boaventura.
Artigo científico aceito pela revista Lipids (Qualis B2; Fator de impacto: 1,854) em 18 de maio
de 2016.