A li ã Q tit ti dAvaliação Quantitativa das Preparações EnzimáticasPreparações Enzimáticas

Como diferenciar enzimas?Quando não podemos determinar a concentração de uma enzima devemos diferenciar as enzimas por sua atividade (moléculas não podem ser contadas) 

Reproduz se em laboratório sob condições controladas a Reproduz-se em laboratório , sob condições controladas a catálise enzimática

Problemas Clássicos na determinação da atividade de preparaçõesda atividade de preparações 

enzimáticas• 1‐ Não se conhece a estrutura completa e, consequentemente, o peso molecular da maioria q pdas enzimas.

• 2‐ Nas preparações enzimáticas moléculas distintas podem exercer efeitos semelhantes, por 

l f ã d dexemplo, formação de grupos redutores.

• 3‐ Pode haver enzimas inativas que aumentam o conteúdo proteico na preparação.

‐ Para que avaliação  seja eficiente, o d d d í lprocedimento deve ser reprodutível.

‐ Também deve‐se saber qual é o substrato natural da enzima.

Exemplo:  xilose que por ação da glicose isomerasepassa a xilulose (mesmo glicose a frutose)

‐Como provar quem  é o substrato natural? Através d did d t t d Mi h li Kda medida da constante de Michaelis, Km. Quanto maior o valor de Km menor a afinidade da enzima por aquele substrato Assim oda enzima por aquele substrato. Assim o substrato natural da enzima deve apresentar baixo valor de Km.

Uso de Substratos não NaturaisUso de Substratos não NaturaisAl b t t ã t l dAlgumas vezes o substrato não natural pode ser muito mais bem catalisado pela enzima que o substrato natural.

Exemplo: 1‐ Enzima beta‐galactosidase – hidrolisa lactose a g

galactose + glicose que não absorvem no UV visível.Por esta razão usa‐se substrato não natural que pode ser 

catalisado pela enzima beta galactose ortonitrofenilcatalisado pela enzima beta galactose ortonitrofenil.Hidrolise gera o ortonitrofenilgalactosidico que quando 

hidrolisado forma o ortonitrofenol que em pHhidrolisado forma o ortonitrofenol que em pH alcalino e desprotonado (perde H) e absorvido no UV‐visivel. 

2‐ Ação da pepsina (tripsina) sobre a hemoglobina ç p p ( p ) gproduzindo peptideos e medida da seguinte forma: os peptideos de cadeia pequena formados pela ação p p p q p çenzimatica  não precipitam pela ação da TCA. As cadeias pequenas são absorvidas  a 280 nm e esta p qtende a aumentar. Atividade enzimatica – unidade produzida a delta absorbância por 0,001 minuto.p p

Montagem do Ensaio de Determinação da Atividade Enzimatica

1 E lh d S b t t1‐ Escolha do SubstratoPode‐se constituir um grande problema a escolha

do melhor e mais adequado substrato para odo melhor e mais adequado substrato para oensaio.

Um polimero ou substâncias não definidas como aUm polimero ou substâncias não definidas, como acelulose, proteinas, pectinas, entre outros.

Normalmente o que se observa e a ação de umNormalmente o que se observa e a ação de umconjunto de enzimas atuando sobre umsubstrato complexo.p

Escolha substrato que garanta a reprodutibilidadedo método.

2‐ Concentração do Substrato‐ Modelo de Henri‐Michaelis e Menten‐ excesso de substrato em relação‐ Modelo de Henri‐Michaelis e Menten‐ excesso de substrato em relação 

a concentração de enzima, de forma que a hipótese de estado estacionário seja valida (velocidade de relação linear).

‐ Um excesso de substrato pode proporcionar uma saturação da enzima reduzindo assim sua atividade. Determina‐se a velocidade em t próximo de zero, de modo que a concentração não se modifique consideravelmente.

k1 k2

E + S ↔ ES  ↔ E + Pk‐1 k‐2‐1 ‐2

‐ As determinações devem ser feitas nas condições iniciais, onde a velocidade de E + P → ES pode ser desprezada e ainda que, o que de p p q , q[ES] é produzido na unidade do tempo é imediatamente consumido.

v = k2 [E]T [S] / Km + [S]     onde      v = Vm [S] / Km + [S]2 [ ]T [ ] / [ ] [ ] / [ ]

sendo Vm =  k2 [E]T

3‐ Tempo de reação

• A unidade do tempo e fundamental na pexpressão e tambem  na determinação da atividade enzimática.

‐ Deve‐se ter formado quantidade mensurável de produto ou ter desaparecido quantidadede produto, ou ter desaparecido quantidade significativa de substrato.A ã P + E ES li i d‐ A reação P + E      ES  possa ser negligenciada

Velocidade = consumo de S ou surgimento de Punidade de tempounidade de tempo 

4‐ pHpH controlado – necessidade de manter grupos críticospH controlado  necessidade de manter grupos críticos 

do centro ativo no estado de ionização  correto para que a reação ocorra, conduzida em velocidade á i H ó i á imáxima. pH ótimo e necessário:

‐ Efeito reversivel do pH na velocidade máxima de reaçãoreação.

‐ Mudança na afinidade enzima/substrato – reflete noMudança na afinidade enzima/substrato  reflete no valor de Km.

‐ Mudança na estabilidade da enzima – desnaturação irreversivel em um ou em ambos extremos do ponto de pH para a atividade Este ultimo efeito dependede pH para a atividade. Este ultimo efeito depende do tempo usado para medir a taxa de reacao.Todos os 3 efeitos podem ocorrer em conjunto.Todos os 3 efeitos podem ocorrer em conjunto.

‐ pH mantido constante durante a reação –dmeio tamponado.

‐ A concentração da solução – tampão , seu pH, co ce t ação da so ução ta pão , seu p ,mais adequados a catálise.

5‐ TemperaturaReações enzimaticamente catalisadas são‐ Reações enzimaticamente catalisadas – sãoinfluenciadas pela temperatura .

‐ Quando a temperatura se eleva, a taxa de reaçãoaumenta.

‐ Como a medida da taxa de reação efetuada em umtempo finito, a reação devera apresentar umatemperatura ótima.

A limitada estabilidade térmica das enzimas resulta em inativação a elevadasresulta em inativação a elevadas 

temperaturas.

6‐ Inibidores

E ã d ti id d i átiExpressão da atividade enzimática • Modulação positiva – ativação – interação ç p ç çmodulador com a enzima favorece a reação.

• Modulação negativa – inibição ‐ interação modulador com a enzima envenena a reação.

Inibição por excesso de substrato ‐( Inibição Acompetitiva)( Inibição Acompetitiva)

I ibid d li t ó t d d b t t UInibidor pode se ligar somente após a entrada do substrato. Uma concentração elevada de substrato conduz a união de uma segunda molécula a enzima.

ks kpE  +  S  ↔ ES  → E + P

+S↓ ki↓ kiESS

Como P vem de ES eu considero a reação elementar como dP/dt = v = k2 [ES]

v= Vm [S] / km + S ( 1 + S/ki)

Inibição pelo produto‐ Inibição CompetitivaPara inibição pelo Produto este deve ter estrutura semelhante aPara inibição pelo Produto, este deve ter estrutura semelhante a 

do substrato para competir com ele.Sendo neste caso, inibição do tipo competitiva. E t ti d i ibi ã d t t d t d d tEste tipo de inibição conduz a eventos extrudentes, quando o produto se 

liga a enzima o substrato não se liga, devido a modificações estruturais.

Inibidor pode se ligar somente após a entrada do substrato

ks kpE  +  S  ↔ ES  → E + P

++P↓ kiEP

Como P vem de ES eu considero a reação elementar como dP/dt = v = k2 [ES]k2 [ES]

v= Vm [S] / S + km ( 1 + [P]/ki)

Expressao da Atividade Enzimatica1 Unidade Internacionalçã UI quantidade de enzima que catalisa a1‐ Unidade Internacionalçã UI – quantidade de enzima que catalisa  a 

transformacao de 1 micromol de substrato por minuto a 25 oC , sob condições otimizadas.

Atividade específica _ número de unidades de atividade de enzima por miligrama de proteína ‐ indicador da pureza de uma enzima –

ti id d di idid id d d t í t t latividade dividida por unidade de massa proteíca total. 

Atividade molar ou molecular ou numero de turnover ‐ número de unidades de atividade por micromol de enzima ou seja , numero de moléculas de substrato transformado por uma única molécula 

de enzima em um minuto.

Uma unidade alternativa foi sugerida pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica, mas raramente usada, que é o katal (SI), definida q , , q ( ),como a quantidade de enzima capaz de causar a transformação 

de 1 mmol de substrato por segundosob condições específicas.ç p

Formas específicas de expressar a atividade de uma enzima

ou unidade Soxhlet/ mL, é definida como o número demililitros de leite que podem ser coagulados em 40 minutos a 35°C.q p g

Atividade lipásica: é a quantidade de enzima necessária para produzir certaquantidade de ácido graxo determinada por titulação em pH stat quer dizer oquantidade de ácido graxo, determinada por titulação em pH-stat, quer dizer, opH é mantido constante por certo período de tempo com a adição de soda. Doispadrões podem ser utilizados: ésteres solúveis ou óleo de oliva (azeite) em uma

l ã d i demulsão padronizada.

Analise Quantitativa da atividade enzimatica

A áli tit ti d d id d á iA análise quantitativa pode ser conduzida de várias maneiras:

 Ensaios diretos: medida direta da concentração do substrato ou produto em função do tempo.

 Ensaios indiretos: quando a medida da concentração do substrato e do produto são próximas, a geração dosubstrato e do produto são próximas, a geração do produto pode ser acoplada a outra reação não enzimática, que produza um sinal mais conveniente.

 Ensaios acoplados: a reação enzimática de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, que pode ser p g ç , q pconvenientemente medida, tendo como exemplo a reação da glicose oxidase

Analise Quantitativa da atividade enzimaticaenzimatica

Para a obtenção de uma análise quantitativa é necessário saber:

‐ Toda estequiometria de uma reação catalíticaSe a enzima requer adição de cofatores como um íon ou‐ Se a enzima requer adição de cofatores como um íon oucoenzima.

‐ A dependência da enzima sob a concentração do cofatorp çou substrato.

‐ O pH ótimo.A t t l l i t tá l‐ A temperatura pela qual a enzima esta estável eapresenta alta atividade.

‐ O procedimento para determinação do aparecimento ep p ç pdesaparecimento do produto de reação ou substrato,respectivamente, ou de um intermediário (especialmentequando estes são coloridos ou absorvidos em luz UV)quando estes são coloridos ou absorvidos em luz UV).

Determinação da quantidade de proteínas.

• Realiza por diferentes métodos – os mais precisos são aqueles que determinam as p q qligações peptídicas existentes nas moléculas proteícas (Lowry Bradford)proteícas (Lowry, Bradford).

• Outros determinam elementos naturais a natureza proteíca , tal como nitrogênionatureza proteíca , tal como nitrogênio orgânico (Keldhjal)

Técnicas empregadas no Estudo das Enzimas

1 Análise da velocidade de reação catalítica existem duas formas1‐ Análise da velocidade de reação catalítica – existem duas formas –medições sob condições que mantenham o estado de equilíbrio –aplicando a equação de Michaelis e Menten e determinar a velocidade de reação pela concentração de S ou E .ç p ç

2‐ Análise do equilíbrio de Reação Estabelecido em segundos ou pouco minutosEstabelecido em segundos ou pouco minutos .

Espectrofotometria – Método simples ‐ onde a medida da absorção deluz na faixa do ultravioleta e do visível é feita de acordo com a lei deluz na faixa do ultravioleta e do visível é feita de acordo com a lei deLambert‐Beer, que correlaciona diretamente a absorbância em dadocomprimento de onda com a concentração do analito (substrato ouproduto formado)

Ex : alfa ‐amilases que clivam o amido em glicose e sacarose, que sãodetectadas pelo método do DNS (ácido 3,5‐dinitrosalicílico), onde o DNSreage com os grupos redutores da glicose e da sacarose, gerando umgrupo cromóforo detectável emgrupo cromóforo, detectável em540 nm.

Fluorescência ‐ quantificação dos produtos das õ i áti b i t õ dreações enzimáticas ‐ em baixas concentrações de 

analito, a intensidade de emissão fluorescente é diretamente proporcional a concentração ‐maisdiretamente proporcional a concentração ‐mais seletivo já que é necessário utilizar comprimentos de onda de excitação e emissão do analito.çEx: proteases que utilizam como substratoumaproteína (transferrina) modificada covalentementecom moléculas deisotiocianato de fluoresceína,exibindo absorbância em 495 nm e emissão em525 C t ã d t lé l d525nm. Com a atuação da protease, as moléculas deisotiocianto de fluoresceína são liberadas, permitindoum aumento da intensidade de emissão em 525 nmum aumento da intensidade de emissão em 525 nm.

Bioluminescência ‐ Os métodos deb l ê d dbioluminescência contam com a produção deluz durante a reação enzimática, diferentementedos outros métodos óticos a quantidade de luzdos outros métodos óticos, a quantidade de luzmedida é transiente ‐ durante a velocidadeinicial de reação enzimática há um nívelinicial de reação enzimática há um nívelconstante de luz detectada, de baixaintensidade, que depois é integrada por váriosi i fó ãminutos no instrumento. E como os fótons são

o produto da reação, estes são proporcionais aquantidade de substrato consumidoquantidade de substrato consumido.

Ex : a luciferase, proviente de vagalumes, que agecomo um indicador para qualquer reaçãocomo um indicador para qualquer reaçãoenzimática primária que gere ATP, catalisandoadescarboxilação oxidativa da luciferina.ç

• Nefelometria‐ Também conhecido comoespalhamento de luz, este método consisteem monitorar a alteração da turbidez no meioem monitorar a alteração da turbidez no meiodurante a reação enzimática. Em baixaturbidez a intensidade de luz espalhada éturbidez, a intensidade de luz espalhada éproporcional à concentração.

Ex: lipase, que hidrolisa os lipídios em ácidos graxos, gerando uma diminuição na turbidezgraxos, gerando uma diminuição na turbidez em meios aquosos.

• ‐Métodos Eletroquímicos de detecção –amperométricos (em reações com oxidases e desidrogenases, para medir a produção dedesidrogenases, para medir a produção de H2O2 e fosfato inorgânico), potenciometricos (empregam eletrodos para detecção de gases(empregam eletrodos para detecção de gases, como a NH3 e o CO2, ou eletrodos específicos para íons, como na reação da penicilinase, que é medida do por I‐ ou CN‐) e condutimetricos (é a urease, que ao hidrolisar a uréia, uma molécula neutra,libera 4 íons (2 NH4+, HCO3‐,molécula neutra,libera 4 íons (2 NH4+, HCO3 , OH‐) e aumenta a condutividade da solução.

• Outros Métodos de Detecção ç‐ Análise Radioativa‐ É avaliado quando osubstrato é marcado com isótopo radioativo osubstrato é marcado com isótopo radioativo, oqual será perdido ou transferido durante areação a ser estudada É um métodoreação a ser estudada. É um métodoextremamente sensível para análise cinéticaenzimáticaenzimática.

Ex: é o ensaio para determinar a concentraçãod GTP( i 5’ t if f t ) GDPde GTP(guanosina‐5’‐trifosfato) e GDP(guanosina‐5’‐difosfato), que estão envolvidos

l ã d h ô i í dna regulação de hormônios, síntese deproteínas e gluconeogênese.

• Titulação Automática tu ação uto át caÉ utilizada quando a reação produz ou consome á id b Tit l l ã á idácido ou base. Titula‐se na solução ácido ou base para que o pH continue constante. A quantidade de ácido ou base consumido é o valor da reação catalítica enzimática.ç

ál d l l d dAnálises de reações com alta velocidade Stopped FlowStopped Flow Temperature Jump ‐

Relações não‐lineares dev versus [E]t

A preparação en imática estocada sob condições deA preparação enzimática estocada sob condições depH ou força iônica significativamente diferentes doótimo de reação podem levar ao “carreamento” destesparâmetros para a análise cinética.

De forma semelhante a presença de certos agentes deDe forma semelhante, a presença de certos agentes deestabilização (EDTA, tióis ou cátions específicos) podem inibir areação.

A medida de velocidade pode não ser uma medidaverdadeira da velocidade inicial. Isto pode ocorrer quando a

f (concentração de substrato diminui significativamente (i.e., nãosegue uma cinética de primeira ordem) antes da medida doproduto formado.

A preparação enzimática pode conter enzimas queconvertam o produto a outro composto que fogeda detecção do método empregado.A enzima pode ser instável sob as condiçõesdeanálise (pH, temperatura, força iônica, etc.).(p , p , ç , )A preparação enzimática pode conter enzimasproteolíticas que se encontram inativas sob asproteolíticas que se encontram inativas sob ascondições de estocagem.O método de análise pode ser impreciso em altasO método de análise pode ser impreciso em altasconcentrações do produto.O t d tOs reagentes empregados para converter oproduto em uma forma mensurável podem estar

di õ li it tem condições limitantes.