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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ALDOSTERONA E HORMÔNIOS TIREÓIDEOS
REGULAM A EXPRESSÃO DO CANAL DE CLORETO
ClC-2 EM RIM DE RATOS
DÉBORA DOS SANTOS ORNELLAS
TESE DE DOUTORADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE
FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO
GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Centro de Ciências da Saúde Universidade Federal do Rio de Janeiro
AGOSTO / 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Ornellas, Débora dos Santos
Aldosterona e Hormônios Tireóideos regulam a expressão do canal de
cloreto ClC-2 em rim de ratos
Rio de Janeiro: UFRJ; IBCCF; 2006.
xviii ; 151 fls
Orientador: Marcelo Marcos Morales
Monografia de Doutorado – UFRJ / IBCCF/ Programa de Ciências Biológicas
(Fisiologia)
Referência Bibliográfica: f. 121 – 132
Área de concentração – Fisiologia Renal
1.Expressão gênica 2.Rim 3.Canal de cloreto ClC-2
4.Aldosterona 5.Hormônios tireóideos 6.Volume do fluido
extracelular
I. Morales, Marcelo Marcos II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro
na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico (CNPq), Financiador de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação Carlos
Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
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“Deus escolheu as coisas loucas do mundo para confundir os sábios; e Deus escolheu as coisas fracas do mundo para confundir as fortes (...) para que, como está escrito: Aquele que se gloria, glorie-se no Senhor.” I Coríntios cap.1 vers 28 e 31. NT. Bíblia Sagrada
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”Porque d’Ele e por Ele e para Ele são todas as coisas.”
A minha Mãe, uma mulher inconfundível e maravilhosa.
A minha família,
Aos meus amigos
Ao meu orientador,
Meu amor e gratidão.
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AGRADECIMENTOS Mãe, Pai tudo começou por vocês, meu sincero carinho.
Irmãos, amo vocês dois, Juliana e Felipe Mateus Ornellas.
Vó, não precisa chorar...
Tia Vera Lúcia , você é especial para mim.
A toda minha família, um enorme beijo.
Aos amigos que nunca entenderam o que eu faço, mas sempre me apoiaram. Obrigada!
Em especial a todos da Comunidade Paz e Vida.
Aos amigos Ilma Dayse, Cíntia e Fábio por fazerem parte da minha história.
Ao meu orientador que apostou em mim e tornou-se meu amigo durante esta caminhada.
Marcelo, a tese acabou, mas a amizade é para sempre.
Horacio, Ana Carolina e Aline, vocês têm meu carinho especial, porque sou fã de vocês.
Bruno Botelho, meu amigo dos olhos azuis. Consegui !!!
Danielle, minha amiga “chorona”. Conseguimos!!!
Roberta, Vera Tostes e Caroline, minhas queridas “estressadas” amigas. Beijos.
A todos que entendem e compartilham o mesmo sentimento de “tesesofrimento”: Felipe
Prota (cômico), Carolzinha (enfezada), Sabrina (Miss biofísica), Graziela (divertida),
Jackson (sabe Tudo), Juliana (juju festeira), André (faz tudo), Raquel &Tatiana (as
siamesas), Helber (semi-altista),
A todos que passaram pelo laboratório e conseqüentemente por mim, meu sincero obrigada.
A Edna e Luiza por todo apoio, ajuda, alegria, etc, etc. Sem palavras...
Aos professores que colaboraram com esta tese: Tânia Ortiga-Carvalho, Carmem Pazos-
Moura, Denise Pires Carvalho e Regina Goldenberg.
Dizer muito obrigada é “não significativo”. OBRIGADAAAAAA!!!!!!!!!!!!!!!!!
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ALDOSTERONA E HORMÔNIOS TIREÓIDEOS REGULAM A EXPRESSÃO DO CANAL DE CLORETO ClC-2 EM RIM DE RATOS Débora dos Santos Ornellas Orientador: Marcelo Marcos Morales Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia).
A expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 foi estudada em rim de ratos
submetidos a dieta hipersódica, a adrenalectomia com e sem reposição de
aldosterona, e em ratos hiper e hipotireóideos. O RNAm do ClC-2 foi encontrado ao
longo do néfron, com exceção dos segmentos ducto coletor cortical e alça espessa
de Henle medular externa. O RNAm do ClC-2 diminuiu em 64% na alça espessa de
Henle cortical e 43% na alça espessa de Henle medular em dieta hipersódica; em
animais hipertireóideos, aumentou 47% e 56% nos túbulos proximal convoluto e reto,
respectivamente. A proteína do ClC-2 diminuiu 41% em rim de ratos com dieta
hipersódica, 62% em ratos hipotireóideos; e aumentou 63% em ratos hipertireóideos.
A tiroxina aumentou o RNAm do ClC-2, dose-dependente, em cultura primária de
células de túbulo proximal. O promotor do ClC-2 foi estimulado em células de túbulo
proximal em resposta aos hormônios tireóideos.
Camundongos com mutação ∆337T no receptor TRβ que apresentam
características da síndrome de resistência dos hormônios tireóideos apresentaram
menor expressão renal do RNAm do ClC-2 (41% em heterozigotos e 45% em
homozigotos) e da proteína ClC-2 (40% em heterozigotos e 43% em homozigotos)
em rim de camundongos. Esta redução não foi alterada pela indução do
hipotireoidismo.
Concluímos que a expressão gênica do ClC-2 é estimulada por aldosterona e por
hormônios tireóideos em rim de ratos. O estímulo por hormônios tireóideos ocorre
por aumento da transcrição do gene com possível participação do receptor TRβ.
Palavras-chave: Aldosterona, hormônios tireóideos, T3, T4, ClC-2, canal de cloreto,
rim, túbulo proximal, RNAm, RT-PCR, RPA.
Rio de Janeiro
Agosto / 2006
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ABSTRACT
ClC-2 chloride channel is modulate by aldosterone and thyroid hormones in rat kidney Débora dos Santos Ornellas Orientador: Marcelo Marcos Morales
Gene expression of the chloride channel ClC-2 was studied in rat kidneys under
high sodium diet, adrenalectomy with and without aldosterone supply and in hyper
and hypothyroid rats. ClC-2 mRNA was found along the nephron with exception of
the cortical collecting duct and outer collecting duct. Under high sodium diet, ClC-2
mRNA decreased 64% in the cortical thick ascending limb of Henle loop and 43% in
the medullar thick ascending limb of Henle loop, respectively; in hyperthyroid rats it
increased 47% and 56% in the proximal convolute and straight tubules, respectively.
ClC-2 protein expression decreased 41% in rat kidneys under high sodium diets and
62% in hypothyroid rats; but increased 63% in hyperthyroid rats. Thyroxin increased
ClC-2 mRNA in primary cell culture of rat proximal tubules, dose-dependent manner.
ClC-2 promoter was stimulated in proximal tubule cells when exposed at the thyroid
hormones.
∆337T TRβ receptor mutate mice, that showed characteristics of the Thyroid
Hormones Resistance Syndrome, had ClC-2 mRNA expression decreased (41%,
heterozygous and 45%, homozygous). A similar decrease was observed in the
protein expression (45%, heterozygous and 44%, homozygous) in mutate mice
kidneys. Hypothyroidism induced in TRβ receptor mutate mice did not interfere in the
standard of ClC-2 expression that continued diminished in mice, without additional
effect.
We can conclude that ClC-2 gene expression is stimulated by aldosterone and
thyroid hormones in rat kidneys. Thyroid hormones increase the gene transcription
with probable participation of the TRβ receptor.
Key words: Aldosterone, thyroid hormones, T3, T4, ClC-2, chloride channel, kidney,
proximal tubule, mRNA, RT-PCR, RPA.
Rio de Janeiro
August / 2006
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Ficha catalográfica........................................................................................................ii
Agradecimentos...........................................................................................................vi
Resumo.......................................................................................................................vii
Abstract......................................................................................................................viii
Sumário........................................................................................................................ix
Índice de figuras.........................................................................................................xiii
Lista de abreviaturas..................................................................................................xvi
I – INTRODUÇÃO
I.1) Regulação do volume do fluido extracelular.......................................................... 2
I.2) A família CLC de canais de cloreto...................................................................... 7
I.3) O canal de cloreto ClC-2..................................................................................... 10
I.4) Problemática 1: Seria o canal de cloreto ClC-2 modulado pela aldosterona em
rins de ratos?........................................................................................................ 18
I.5) Problemática 2: Seria a expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 modulada
pelos hormônios tireóideos em rins de ratos?....................................................... 21
I.6) Problemática 3: Estaria o receptor de hormônio tireóideo do tipo β envolvido na
expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 em rins de ratos?............................ 27
II – OBJETIVOS
II.1) Objetivo geral.......................................................................................................34
III – MATERIAIS E MÉTODOS
III.1) Grupos Experimentais........................................................................................36
III-1.1)Preparação dos ratos adrenalectomizados tratados ou não com
aldosterona.............................................................................................................36
III-1.2) Preparação dos ratos tratados com furosemida..............................................37
III-1.3) Preparação dos ratos hipotireóideos e hipertireóideos...................................38
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III-1.4)Preparação dos camundongos hipotireóideos e hipertireóideos......................39
III-1.5) Camundongos com mutação TRβ...................................................................40
III-2) Métodos
III-2.1) Genotipagem dos animais...............................................................................40
III-3) Excisão Renal.....................................................................................................41
III-4) Microdissecção de túbulos renais......................................................................41
III-5) Extração de RNA-total........................................................................................44
III-6) Transcrição Reversa (RT)..................................................................................44
III-7) Reação de Polimerização em Cadeia (PCR).....................................................44
III-8) Ensaio de proteção contra a RNAse (RNase Protection Assay - RPA)............46
III-8.1) Síntese da Sonda de RNA Marcada...............................................................48
III-8.2) Hibridização da Sonda Marcada com o RNA..................................................49
III-9) “Southern Blotting”..............................................................................................50
III-10)Immunoblotting”...............................................................................................51
III-11) Cultura primária de células de túbulo proximal de ratos..................................52
III-12) Estudo da região promotora do ClC-2..............................................................53
III-13) Análise dos parâmetros sanguíneos e urinários dos grupos experimentais da
fração de eletrólitos................................................................................................55
III-14) Radioimunoensaio............................................................................................55
III-15) Densitometria...................................................................................................56
III-16) Análise estatística.............................................................................................56
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IV- RESULTADOS......................................................................................................58
VI-1) Expressão do RNAm do ClC-2 nas regiões corticais e medulares de rins de
ratos normais através da técnica de ensaio de proteção contra RNAse (RPA).....58
VI-2) Detecção da expressão do RNAm do gene do ClC-2 em diferentes segmentos
do néfron de rato................................................................................................. .60
VI -3) Análise da fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com dieta rica
em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona.................62
VI-4) Expressão do RNAm do ClC-2 em córtex e medula rim de ratos submetidos a
dieta hipersódica através da técnica de ensaio de proteção contra RNAse
(RPA)......................................................................................................................63
VI-5) Análise da expressão da proteína do ClC-2 em rim total de ratos através da
técnica de “immunoblotting”.................................................................,.................63
VI-6) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos submetidos a diferentes
tratamentos através da técnica de ensaio de proteção contra RNase (RPA)........66
VI-7) Experimentos preliminares à técnica de RT-PCR semiquantitativo...................66
VI-7.1) Determinação do comprimento do néfron necessário para a amplificação ideal
do gene do ClC-2 por RT-PCR..............................................................................66
VI-7.2) Determinação do número ideal de ciclos de PCR a ser utilizado para a
amplificação do RNAm do ClC-2 a partir de 3mm de PST de rato........................67
VI-8) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos em
dieta rica em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona
por RT-PCR............................................................................................................70
VI-9) Modulação do RNAm de ClC-2 nos segmentos cTAL e mTAL de ratos tratados
com furosemida......................................................................................................74
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VI-10) Determinação das concentrações séricas dos Hormônios Tireóideos em
ratos.......................................................................................................................77
VI-11) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim total de ratos hipotireóideos com ou
sem reposição e hipertireóideos avaliados por RPA..............................................78
VI-12) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos
hipotireóideos com ou sem reposição e hipertireóideos avaliados por RT-
PCR........................................................................................................................79
VI-13) Cultura primária de células de túbulo proximal de rato tratadas com Hormônio
Tireóideo...............................................................................................................84
VI-14) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos controle,
hipotireóideos com ou sem reposição e hipertireóideos.......................................84
VI-15) Análise da região promotora do ClC-2 em cultura de células tratadas com
Hormônio Tireóideo...............................................................................................87
VI-16) Comparação dos parâmetros urinários dos camundongos com mutação no
receptor TRβ.........................................................................................................89
VI-17) Determinação das concentrações séricas dos Hormônios Tireóideos em
camundongos........................................................................................................90
VI-18) Modulação do RNAm do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos com
ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por RT-PCR..................................90
VI-19) Modulação da proteína do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos com
ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por “immunoblotting”.....................91
VI-20) Modulação do RNAm em camundongos com mutação no receptor TRβ........95
VI-21) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TRβ......................................................................................95
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VI-22) Modulação da expressão RNAm do ClC-2 em camundongos com mutação no
receptor TRβ tratados com metimazol..................................................................98
VI-23) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor TR-β tratados com metimazol.............................................98
V – DISCUSSÃO
V-1) Ação do hormônio aldosterona sobre a expressão gênica dos canais de cloreto
ClC-2 em rim de rato.................................................................................................102
V-2) Ação dos hormônios tireóideos sobre a expressão gênica do canal de cloreto
ClC-2 em rim de rato.................................................................................................106
VI – CONCLUSÃO...................................................................................................115
VIII – SOLUÇÕES UTILIZADAS..............................................................................117
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................121
VII –TRABALHOS PUBLICADOS...........................................................................134
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FIGURAS E TABELAS
FIGURAS
Figura 1: Figura representativa do ClC-2.................................................................. 11
Figura 2. Conformação de abertura e fechamento do canal de cloreto ClC-2.......... 13
Figura 3: Ligação dos receptores de hormônios Tireóideos...................................... 29
Figura 4: Estrutura primaria representando os domínios funcionais dos receptores
nucleares ...............................................................................................................29
Figura 5: Estrutura primaria das diferentes isoformas codificadas pelos genes
receptores do hormônio tireóideo ..........................................................................31
Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação do receptor do
hormônio tireóideo .................................................................................................32
Figura 7: Figura representativa do néfron...................................................................43
Figura 8: Clonagem e linearização do DNA............................................................... 47
Figura 9: Distribuição do RNAm do ClC-2 entre córtex, medula externa e medula
interna de rim de rato por Ensaio de Proteção contra Rnase
(RPA)......................................................................................................................59
Figura 10: Detecção do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de rato por RT-PCR....61
Figura 11: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos controle e 5d-Na+ por RPA....64
Figura 12: Expressão da proteína do ClC-2 em ratos tratados 5d-Na+ por
“immunoblotting”.....................................................................................................65
Figura 13: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos controle, ADX e ADX+ALDO
por RPA..................................................................................................................68
Figura 14: Determinação do comprimento do néfron para amplificação ideal do ClC-2
e β-actina na mesma reação de RT-PCR..............................................................69
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Figura 15: Determinação do número de ciclos necessários néfron para amplificação
ideal do ClC-2 e β-actina na mesma reação de RT-PCR......................................69
Figura 16: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo proximal reto
(PST)......................................................................................................................71
Figura 17: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção espessa medular
da alça de Henle (mTAL).......................................................................................72
Figura 18: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção espessa cortical
da alça (cTAL)........................................................................................................73
Figura 19: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em cTAL tratados com
furosemida..............................................................................................................75
Figura 20: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em mTAL tratados com
furosemida..............................................................................................................76
Figura 21: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos por
RPA........................................................................................................................78
Figura 22: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em diferentes segmentos do
néfron por RT-PCR................................................................................................80
Figura 23: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo proximal
convoluto (PCT).......................................................................... ..........................81
Figura 24: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em PST............................82
Figura 25: Segmentos sem a expressão de ClC-2: ducto coletor cortical (CCD) e
medular externo (OMCD).......................................................................................83
Figura 26: Modulação da expressão do ClC-2 em cultura primária de PCT..............85
Figura 27: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de rato................86
Figura 28: Análise da região promotora do ClC-2......................................................90
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Figura 29: Determinação da concentração necessária para amplificação por RT-PCR
em camundongos.......................................................................................................91
Figura 30: Determinação do número de ciclos necessário para amplificação por RT-
PCR em camundongos...............................................................................................91
Figura 31: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim de
camundongos.............................................................................................................92
Figura 32: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de
camundongos.............................................................................................................93
Figura 33: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor β................................................................................................94
Figura 34: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de camundongos
com mutação no receptor β........................................................................................96
Figura 35: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em camundongos com
mutação no receptor β tratados com metimazol.........................................................98
Figura 36: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de camundongos
com mutação no receptor β tratados com metimazol.................................................99
TABELAS
Tabela 1: as seqüências e localizações dos oligonucleotídeos..................................49
Tabela 2: Fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com dieta
hipersódica, adrenalectomizados com ou sem reposição..........................................62
Tabela 3: Concentrações séricas de Hormônios Tireóideos em ratos.......................77
Tabela 4: Fração de excreção de eletrólitos de camundongos com mutação no
receptor TRβ...............................................................................................................89
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Tabela 5: Concentrações plasmáticas de Hormônios Tireóideos em camundongos
com mutação no receptor TRβ...................................................................................92
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LISTA DE ABREVIATURAS
Na+-5d – dieta rica em sódio por cinco dias
ADX – adrenalectomia
ADX+ALDO – adrenalectomia com reposição de aldosterona
AMPc – adenosina monofosfato cíclico
ATP – adenosina trifosfato
CaCo-2 – células intestinais tumorais humanas
CFTR – canal de cloreto transmembrana regulador da condutância e envolvido na
doença fibrose cística (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)
ClC-2 – canal de cloreto – 2 (chloride channel – 2)
cTAL – porção cortical espessa ascendente da alça de Henle
DCC – ducto coletor cortical
DEPC – Dietil pirocarbonato
ENaC – canal de Na+ epitelial
FAN – Fator natriurético atrial
FEC – fluido extracelular
GMPc – guanosina monofosfato cíclico
HETE – heterozigoto
HOMO - homozigoto
HIPO – hipotireóideo
HIPO + T4 – hipotireóideo com reposição de T4
HIPER - hipertireoideo
HL – alça de Henle
IMCD – duto coletor medular interno
LBD – Domínio de Ligação ao Ligante
kDa - quilodalton
MBL –membrana basolateral
ML – membrana luminal
MMI - metimazol
NBD – domínio de ligação de nucleotídeo
NKCC – co-transportador Na+/K+/2Cl-
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OMCD – ducto coletor medular externo
PKA – proteína quinase dependente de AMPc
PKC – proteína quinase dependente de Ca+2
PKG – proteína quinase dependente de GMPc
pS – pico Siemens. Unidade de dimensão da condutância elétrica que leva em
consideração: distância percorrida (em metros), pela massa de uma partícula (em
quilos), por tempo (em segundos) e a corrente elétrica (em ampére).
PCT – túbulo proximal convoluto
PST – Túbulo proximal reto
RNAm – RNA mensageiro
RPA – Ensaio de Proteção contra RNases
RT-PCR – transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase
T3 – 3,3’,5 - triiodotironina
T4 – 3,3’,5,5’ – tetraiodotironina ou tiroxina
TMD – domínio transmembrana
TRα – Receptor de hormônio tireóideo alfa
TRβ – Receptor de hormônio tireóideo beta
TSH – Hormônio Estimulante da Tireóide
TRH – Hormônio Liberador de Tireotrofina
RHT - Resistência ao Hormônio Tireóideo
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INTRODUÇÃO
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I-1) Regulação do volume do fluido extracelular
Em indivíduos normais, a composição do fluido corporal, seu volume e a sua
distribuição entre os diversos compartimentos devem permanecer dentro de faixas
estreitas de variações (Jacobson & Rector, 1990). Esse equilíbrio depende do
balanço de água e sais que são ingeridos e excretados diariamente pelo organismo.
Assim, os principais órgãos envolvidos com a regulação do volume do fluido
extracelular (VFEC) são o trato gastro-intestinal e os rins, por serem os principais
responsáveis, respectivamente, pela absorção e pela excreção de sais e água
(Cowley & Roman, 1996).
O volume do fluido extracelular compreende o volume de fluidos contidos nos
compartimentos intersticiais, linfáticos e vasculares. A regulação do volume contido
dentro dos vasos está relacionada com o controle de um dos mais importantes
parâmetros hemodinâmicos, a pressão arterial sistêmica que deve ser mantida
dentro dos limites normais para a devida irrigação dos vários tecidos e órgãos. Além
do controle do volume intravascular circulante, a pressão arterial também pode ser
alterada por variações do tônus vascular e da força de contração cardíaca.
Sabemos que o volume do fluido extracelular é mantido através da regulação da
massa de sódio contida nesse compartimento, pois o sódio (Na+) é o cátion
osmoticamente ativo mais abundante nesse meio. Cerca de 20% do peso corpóreo
corresponde ao fluido extracelular (FEC), sendo que mais de 90% de sua
osmolaridade é devida aos sais de sódio, posto que este é um íon tipicamente
extracelular que, geralmente está acompanhado por quantidades equimolares de
cloreto (Cl-). (Macknight & cols., 1977).
Alterações na ingestão de cloreto de sódio (NaCl), ou dos mecanismos de sua
excreção através do epitélio renal, podem estar relacionadas com a gênese de
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distúrbios do volume do fluido extracelular tais como a hipertensão arterial sistêmica
ou a hipotensão, entre outras doenças (Chonko & cols., 1977).
Nos rins, a excreção do NaCl filtrado pelos glomérulos depende, em grande
parte, de fatores endócrinos e parácrinos que agem sobre transportadores iônicos
presentes ao longo do néfron (Yucha & Keen, 1996). Alterações dos níveis
circulantes e locais de substâncias natriuréticas (fator atrial natriurético, bradicinina,
adenosina) e anti-natriuréticas (angiotensina, vasopressina, aldosterona, hormônios
tireóideos) estão associadas a mudanças do volume extracelular e a modificações na
atividade e na expressão dos transportadores iônicos renais (Repke & cols., 1995;
Morales & cols. 1996).
Os mineralocorticóides, que são representados primordialmente pela aldosterona,
possuem ação importante na dinâmica de transporte de Na+ no epitélio renal
diminuindo a excreção de Na+ pela urina, mas também pela saliva, pelo suor e pelas
fezes (Guyton, 1989). Em condições normais, a massa de Na+ eliminada pelo suor e
pelas fezes é desprezível, sendo os rins os principais efetores dessa excreção
(Dusing & cols., 1976). A liberação da aldosterona, produzida no córtex adrenal,
depende de um refinado controle que envolve a liberação da renina pelas células
justaglomerulares. A renina liberada age sobre o substrato angiotensinogênio,
produzido no fígado, dando origem a um decapeptídeo, a angiotensina-I que, sob a
ação da enzima conversora de angiotensina, localizada em endotélio, principalmente
pulmonar, é transformada no octapeptídeo angiotensina-II. A angiotensina II, além de
agir no rim promovendo a reabsorção de sódio no segmento do túbulo proximal,
promove no córtex adrenal a liberação da aldosterona. A aldosterona tem como
função principal estimular a reabsorção de sódio, principalmente, através dos
segmentos distais do néfron (Work & Jamison, 1987), onde promove o aumento da
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permeabilidade luminal ao Na+ através de canais de sódio conhecidos como Canais
de Sódio Epiteliais (ENaC) (Garthy & Palmer, 1997) concomitantemente, à secreção
de potássio (K+) e hidrogênio (H+). A reabsorção de Na+ leva ao aumento da
osmolaridade plasmática com conseqüente estímulo à liberação e secreção do
hormônio antidiurético e a maior reabsorção de água nos túbulos distais convolutos e
ductos coletores, além de estimular a ingestão hídrica.
Por outro lado, o principal hormônio relacionado com a excreção de sódio pelos
rins é o fator natriurético atrial (FAN). Este peptídeo é produzido pelos miócitos
atriais e o estímulo para a sua liberação na corrente sanguínea é o aumento do
volume efetivo de sangue que chega aos átrios. A expansão dos átrios em situações,
como o aumento do volume do fluido extracelular, promove a liberação e a produção
do FAN pelos miócitos atriais. O fator atrial natriurético circulante tem como principal
ação inibir a reabsorção de Na+ na porção medular interna (IMCD) e medular
externa (OMCD) do ducto coletor e, desta forma, favorece a diurese (Aires, 1999).
Além disso, o FAN promove a vasodilatação sistêmica dos vasos (com exceção da
arteríola eferente), aumenta a filtração glomerular devido ao relaxamento das células
mesangiais que compõe o tufo glomerular e inibe a liberação de renina e
aldosterona.
No entanto, os hormônios tireóideos a tiroxina (3,5,3’,5’–tetraiodo-L-tironina ou T4)
e a triiodotironina (3,5,3’ - triiodo-L-tironina ou T3) (Griffin, 2000), também estão
relacionados com a regulação do volume do fluido extracelular.
Os hormônios tireóideos são conhecidos por participarem de maneira bastante
importante durante o crescimento e desenvolvimento e também por serem
hormônios envolvidos com o metabolismo (Griffin, 2000).
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Por outro lado, os hormônios tireóideos também participam do controle do
equilíbrio hidroeletrolítico modulando a reabsorção de NaCl pelos rins, por aumento
ou diminuição de suas concentrações séricas (Azuma & cols., 1996). Alterações no
balanço hidroeletrolítico foram observadas em indivíduos hipertireóideos (aumento
da concentração plasmática circulante de T3 e T4) e hipotireóideos (diminuição da
concentração plasmática circulante de T3 e T4). Os efeitos da disfunção da tireóide
sobre os rins incluem mudanças no fluxo sanguíneo renal (por aumento do débito
cardíaco), ritmo de filtração glomerular (por aumento do fluxo), capacidade de
absorção e de secreção tubular (por aumento da permeabilidade paracelular),
transporte de eletrólitos (por aumento da atividade dos transportadores de Na+) e
estrutura renal (Katz, 1975; Kinsella, 1985; Davis, 1983; Baum & Quigley, 2003;
Morales & cols., 1996; Alcade & cols. 1999; Klein & cols., 2001).
A presença no rim dos receptores nucleares específicos para hormônios
tireóideos (TRα1,TRβ1 e TRβ2,) indica a existência de uma ação direta destes sobre
a função renal (Shahrara & cols., 1999). No rim, foi observado que os hormônios
tireóideos podem agir sobre a atividade e expressão da Na+/K+-ATPase, enzima
importante na reabsorção de grande massa de Na+ pelos rins (Katz & cols.,1975).
Outros transportadores renais de Na+, tais como o trocador Na+/H+, e o transportador
Na+-Pi também possuem suas atividades e expressões aumentadas no
hipertireoidismo e diminuídas no hipotireoidismo (Morales & cols., 1996; Alcalde &
cols., 1999).
Watanabe e colaboradores, utilizando a técnica de ensaio de proteção contra
RNases e “patch-clamp”, observaram diminuição da expressão do RNAm e da
atividade do canal de Ca+2 tipo L no coração de ratos hipertireóideos, o que pode
acarretar o aumento do tempo de duração do potencial da ação dos miócitos,
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retardando a propagação do impulso elétrico no miocárdio, e pode originar uma
arritmia (desordem da condução do impulso elétrico no miocárdio) (Watanabe &
cols., 2003).
Como vimos até o momento, várias evidências experimentais mostram a ação de
hormônios sobre o transporte renal de Na+ que é o principal cátion osmoticamente
ativo presente no meio extracelular. Porém, o Cl- é o principal ânion do fluido
extracelular e assim, os mesmos mecanismos que controlam o transporte de Na+
devem estar relacionados com o transporte de Cl- (Hamlyn & Blaustein, 1986;
Gottschalk, 1988; Terry, 1994).
Neste trabalho será enfatizada a possível ação da aldosterona e dos hormônios
tireóideos sobre os transportadores de Cl- presentes nas células do epitélio renal. É
importante ressaltar que grande parte do Cl- filtrado pelo glomérulo é reabsorvida
juntamente com o Na+ ao longo do néfron por mecanismos ativos e passivos.
A maior parte do NaCl é reabsorvida ao longo do túbulo proximal (50 –70%). No
segmento espesso da alça de Henle ocorre a reabsorção de 20 – 25% do NaCl, e no
segmento distal há reabsorção de cerca de 5%. Ao longo do ducto coletor ocorre a
reabsorção de aproximadamente 4% do NaCl e essa porcentagem pode variar
dependendo das necessidades do organismo através da ação, principalmente, de
hormônios. Assim, menos de 1% de Cl-, filtrado pelo glomérulo, é excretado através
da urina (Gögelein, 1988; Strange & cols., 1996; Franciolini & Petris, 1990; Fong &
Jentsch, 1995).
A reabsorção de Cl- ao longo do néfron dá-se por duas vias principais: a
paracelular e a transcelular. O transporte transcelular de Cl- através do epitélio renal
acontece a favor de gradiente eletroquímico, e é mediado por proteínas existentes
tanto nas membranas luminais como nas basolaterais. Esse transporte pode estar
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acoplado ao de Na+, ao de K+ ou ao de bicarbonato (HCO3-), ocorrendo também
através de canais iônicos (Rocha & Kudo, 1990; Singh & cols., 1995). Dentre os
vários transportadores de Cl- destacamos os canais que, no rim, estão presentes em
diversos tipos celulares (Jentsch & cols., 1990; Linsdell & cols., 1997; Jentsch &
cols., 2002;). Estes canais têm sido caracterizados com a ajuda de técnicas
eletrofisiológicas, bioquímicas e de biologia molecular, o que tem permitido a
compreensão de suas funções e dos fatores que os modulam (Franciolini & Petris,
1990; Fong & Jentsch, 1995; Strange & cols., 1996 & Gögelein, 1998).
Neste trabalho, dentre os diversos canais de cloreto presentes no rim,
destacamos um canal bastante expresso ao longo do epitélio renal e que não possui
função fisiológica totalmente esclarecida neste órgão, o canal de cloreto ClC-2. O
ClC-2 foi primeiramente associado ao desenvolvimento pulmonar fetal (Murray &
cols., 1995) e, posteriormente, à participação na regulação do volume celular
(Thiermann & cols.,1992).
I-2) A família CLC de canais de cloreto
O ClC-2 é um canal de cloreto pertencente à família CLC de transportadores que
foram identificados pela equipe do Dr. Thomas Jentsch no início da década de 90
(Jentsch & cols., 1990). O primeiro canal desta família foi clonado a partir do órgão
elétrico do peixe Torpedo denominado de ClC-0; em mamíferos, apresenta a
expressão bastante abundante no músculo esquelético, onde participa da
estabilização da voltagem celular.
Os membros da família CLC foram encontrados em diferentes espécies, tais
como, bactérias, leveduras, plantas e animais invertebrados e vertebrados.
Atualmente, já foram encontrados nove subtipos de genes da família CLC em seres
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humanos. Os canais pertencentes à família CLC podem estar expressos no mesmo
tecido, simultaneamente, tal como ocorre com o ClC-2, ClC–3, ClC-4, ClC-5, ClC-6 e
ClC-7, enquanto outros, tais como o ClC-1 e o ClC-Kb estão expressos de maneira
específica em alguns tecidos de mamíferos (Thiermann & cols., 1992; Wills e cols.,
2000; Maduke & cols., 2000). Os canais de Cl- dependentes de voltagem regulam a
passagem transcelular do Cl-, participando de várias funções incluindo-se a
regulação de volume celular (através de estrita regulação da concentração
intracelular de íons), a estabilização do potencial de membrana e a transdução de
sinal elétrico. As mutações nos genes da família CLC têm sido associadas a várias
doenças como as miotonias, síndrome de Bartter do tipo III, Doença de Dent,
nefrolitíase recessiva ligada ao cromossomo-X e diabetes insípidus.
O canal ClC-1, abundantemente expresso em músculo esquelético, está
associado à forma recessiva e dominante de miotomia (ou distrofia muscular) (Pusch
& Jentsch, 1994; Jentsch & Grünther, 1997). Acredita-se que a causa da miotonia
distrófica, pelo menos em parte, é devida a uma anormalidade ou redução na
expressão dos canais de cloreto ClC-1 das células musculares (Mandoki & cols.,
2002). A disfunção nos canais de cloreto aumenta o tempo de relaxamento muscular
após uma contração voluntária causando sucessivos disparos de potenciais de ação
levando as fibras musculares a um estado de hiper-excitabilidade.
O canal ClC-K, apresenta-se exclusivamente expresso no rim e trato urinário,
sendo as isoformas ClC-K1 e ClC-K2 encontrados em epitélio renal de rato e as
isoformas ClC-Ka e ClC-Kb encontrados em humanos, e podem estar envolvidos na
fisiologia e fisiopatologias renais. A equipe do Dr. Simon (Simon & cols., 1997),
através do uso de técnicas de biologia molecular, descobriu o envolvimento de
mutações do ClC-Kb com o surgimento da síndrome de Bartter do tipo III, que tem
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como características principais à perda urinária de sal, alcalose hipocalêmica e a
hipotensão.
A função fisiológica do canal ClC-K1 foi estudada em modelos de camundongos
com mutação inativante neste gene. Os camundongos homozigotos são
aparentemente normais, porém produziram cinco vezes mais urina que os
camundongos heterozigotos e os normais. Estes camundongos homozigotos,
quando submetidos à privação de água por 24h sofreram severa desidratação, com
perda de 27% do peso corporal, e após receberem um agonista da vasopressina (ou
hormônio antidiurético) via intraperitoneal, apresentaram um mínimo aumento na
osmolaridade da urina, um quadro bastante parecido com o apresentado no diabete
insípidus nefrogênico (Matsumura & cols., 1999).
O ClC-5, a princípio, acreditava-se estar expresso exclusivamente no rim, porém
ele foi encontrado, também, em epitélio de vias aéreas, da retina, da aorta e em
células de músculo liso (Silva & cols., 2000; Wills & cols., 2000). A função do canal
ClC-5 tem sido estudada em camundongos nocautes para o gene do ClC-5, que
apresentam fenótipo similar a Doença de Dent (caracterizada por proteinúria de
baixo peso molecular, calciúria e formação de cálculos renais em humanos) ou
nefrolitíase hereditária. Porém, os mecanismos fisiológicos que resultam nesta
síndrome ainda não estão bem estabelecidos (Silva & cols., 2000; Waldegger &
Jentsch, 2000; Wills & cols., 2000).
O canal de cloreto ClC-7 está presente em tecidos diferentes, porém, em
contraste com os demais membros de sua família, encontra-se principalmente em
membranas de organelas intracelulares tais como os lisossomos e os endossomos
(Kornak & cols., 2001). Sua deficiência está associada ao aumento da deposição de
cálcio nos ossos, pois as células do tecido ósseo ficam incapazes de realizar a
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reabsorção óssea (Pusch & Jentsch, 1994; Jentsch & Grünther, 1997). Kornak e
colaboradores (2001), construíram um camundongo que possui uma mutação
inativante no gene ClC-7 que apresentou todas as características de osteopetrose,
doença caracterizada pelo aumento generalizado da densidade óssea devido à
deficiência do processo fisiológico de sua reabsorção (Smith, 1982). Além disso, este
camundongo, devido a essa deficiência, não forma medula óssea capaz de produzir
células hematopoiéticas. Também foram realizados estudos em lisossomos de
osteoclastos (células do tecido ósseo responsáveis pela reabsorção óssea) destes
camundongos mutantes para ClC-7, e foi observado que esses osteoclastos foram
incapazes de acidificar o espaço extracelular. A prova cabal do envolvimento do ClC-
7 com a osteopetrose ocorreu com os estudos que demonstraram mutações no gene
ClC-7 em pacientes portadores de osteopetrose maligna infantil (Kornak & cols.,
2001).
No entanto, alguns destes canais como, o ClC-3, o ClC-4, o ClC-K2 e o ClC-2 não
possuem funções fisiológicas completamente elucidadas (Jentsch & cols., 1995).
I-3) O canal de cloreto ClC-2
Através das técnicas de “northen blotting” e imuno-histoquímica, foi possível
observar que o canal de cloreto ClC-2, alvo de nosso estudo, é abundante em
diversos tecidos, tais como: músculo esquelético, coração, cérebro, pulmão,
pâncreas, rim, estômago e intestino (Landry & cols., 1989). Além disso, a localização
deste canal de Cl- em células polarizadas pode ser tanto nas membranas apicais
quanto nas basolaterais (Thiemann & cols., 1992). Dr. Thiemann e colaboradores,
em 1992, através de métodos envolvendo biologia molecular e imuno-histoquímica,
mostraram que este canal possui uma expressão bastante abundante no rim, tanto
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de seu RNAm quanto da sua proteína correspondente. A proteína correspondente ao
gene ClC-2 é um homodímero de 99 KDa que possui 907 aminoácidos (Jentsch &
Grünther, 1997). A estrutura molecular, atualmente aceita, descreve uma proteína
composta por onze domínios transmembranais, um domínio extracelular e um
domínio intracelular sendo que suas porções tanto amino quanto carboxi-terminais
encontram-se no citoplasma (Figura 1) (Jentsch & Grünther, 1997; Wills & Fong,
2001). No entanto, alguns autores divergem sobre a exata posição do quarto
domínio da proteína do ClC-2. Enquanto uns postulam que este domínio esteja
inserido na membrana plasmática (Jentsch & cols., 1990) outros sugerem que esteja
presente extracelularmente (Schmidt-Rose & Jentsch, 1997), porém a exata
localização deste domínio ainda não foi determinada.
O ClC-2 possui características moleculares e eletrofisiológicas distintas que o
identificam. Dentre as principais características eletrofisiológicas desse canal
podemos citar a maior permeabilidade ao cloreto em relação aos outros íons
halogênios, tais como o brometo e o iodeto (Cl>>Br >I) (Pusch & Jentsch, 1994).
Experimentos envolvendo técnicas eletrofisiológicas de “patch-clamp” mostraram que
o canal de cloreto ClC-2 tem uma condutância de 2 a 3 pS (pico Siemens) para o Cl-
(Lorenz & cols., 1996) e essa condutância está vinculada à região N-terminal
(Gründer & cols., 1992b). Esses autores, ainda sugeriram, através desse
experimento, que o mecanismo de abertura e inativação do ClC-2 pode ser
dependente de um domínio N-terminal que se ligaria como uma “bola” na alça
citoplasmática entre as regiões transmembranais D7 e D8 (Para melhor
compreensão ver figura 2). Este modelo seria semelhante ao proposto para os
canais de potássio, onde o domínio citoplasmático funciona como uma bola aderida
a uma corrente que ao ser movimentada pode bloquear e desbloquear o canal
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(modelo conhecido como “ball-and-chain”) (Hoffmann & Simonsen, 1989; Gründer &
cols., 1992a; Jentsch & cols., 1995).
ClC-2
Figura 1: Figura representativa do modelo atualmente aceito para a
proteína correspondente ao canal de cloreto ClC-2 e sua disposição na
membrana plasmática (Wills & Fong, 2001).
Figura 2. Provável conformação de abertura e fechamento do canal de cloreto ClC-2. Molecular Biology of the Cell ed 4th.
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O ClC-2 também pode ter 50% de sua condutância bloqueada por alguns dos
conhecidos inibidores de canais de cloreto tais como o ácido carboxílico antracênico
(9-AC) e o difenilaminocarboxilato na concentração de 1mM. Porém, o DIDS (ácido
2, 2’ disulfônico – 4, 4’ diisotiociano), outro conhecido bloqueador de condutâncias
de Cl-, na concentração de 1mM, não provoca alteração da condutância do ClC-2
(Thiermann & cols., 1992). Outra característica da corrente elétrica gerada pela
permeabilidade ao Cl- através do ClC-2 é a linearidade da relação entre corrente e
voltagem quando células são submetidas a voltagens menores de –50 mV. Acima de
–50 mV não há aumentos consideráveis de corrente através do canal e, portanto,
não obedece ao padrão linear. Esse padrão é mantido quando células são
submetidas a meios hipotônicos (Gründer & cols., 1992a).
Outra característica do ClC-2 é o comportamento de sua condutância que pode
ser estimulada pelo aumento do volume celular, pela diminuição do pH no meio
extracelular, pela hipotonicidade, pela hiperpolarização ou pelo aumento das
concentrações intracelulares de cloreto (Jentsh & cols., 1999).
Foi observado, através de clampeamento de voltagem realizado em oócitos de
“Xenopus” injetados com RNAm do ClC-2 de rato, que a condutância do ClC-2 em
situação de hiperpolarização se mostra aumentada em voltagens bastante negativas
(entre -90 mV e -180 mV) (Thiermann & cols., 1992). No entanto, estes valores estão
fora dos padrões fisiológicos e o ClC-2 tenderia a estar sempre fechado. Dessa
forma, sugeriram-se outras formas de estímulo ao aumento da condutância por este
canal.
A condutância ao cloreto pelo ClC-2 encontrava-se aumentada em oócitos de
Xenopus injetados com RNAm do ClC-2 de ratos quando esses foram submetidos a
um banho com solução hipotônica (Gründer & cols., 1992a). A condutância ao
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cloreto, através do ClC-2, também se mostrou aumentada quando oócitos que
expressavam o ClC-2 murino foram submetidos a pH ácidos (6,5 e 7,0). Porém,
quando os oócitos que expressavam o ClC-2 murino foram submetidos a pHs mais
alcalinos (8,0 e 8,5) a condutância através do ClC-2 mostrou-se inibida em relação
ao controle submetido ao pH de 7,5 (Jordt & Jentsch, 1997). Estes experimentos
foram realizados dentro da mesma faixa de voltagem fisiológica do experimento
realizado por Gründer e colaboradores.
Assim, a abertura do canal pode ser induzida em valores de voltagem
considerados dentro da faixa fisiológica. Logo, é plausível considerar o ClC-2 como
tendo papel relevante ao longo do epitélio renal o qual é constantemente submetido
a variações tanto de voltagem transepitelial quanto de pH.
A ativação do ClC-2, em presença pH ácido, dependente da fosforilação por
PKA foi observada em epitélio renal de humano e coelhos, mas não em epitélio de
ratos (Cuppoletti & cols., 2004).
Murray e colaboradores sugeriram um possível papel fisiológico para o ClC-2
quando observaram que a proteína localizava-se ao longo da superfície apical das
vias aéreas fetais de rato era abundante do meio até o final da gestação, no entanto,
diminuía bruscamente após o nascimento. Devido à sua localização apical e
abundância no epitélio pulmonar, o ClC-2 pode estar envolvido na secreção de fluido
durante a morfogênese normal do pulmão. Os estudos por eles realizados
demonstram a importância do ClC-2 no desenvolvimento embrionário dos pulmões
de ratos (Murray & cols., 1995).
Huber e colaboradores (1998) mostraram a importância do ClC-2 no
desenvolvimento do sistema urinário através de técnicas de biologia molecular em
cultura primária de células de ducto ureteral e ducto coletor cortical de diferentes
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estágios embrionário e pós-natal de ratos. Eles observaram que o RNAm para o
ClC-2 aumentou entre o estágio embrionário do dia 15 até o dia 17, ocorrendo um
pico da expressão do RNAm do ClC-2 entre o dia 17 do estágio embrionário e o dia 3
após o nascimento, e ainda que o RNAm diminui entre os dias 3 e 6 após o
nascimento, sugerindo a participação do ClC-2 na morfogênese de estruturas do
sistema urinário.
Em experimentos de ensaio de “Whole-Cell Patch-Clamp” realizados em
culturas de células IB3-1 (células epiteliais imortalizadas oriundas das vias
respiratórias de pacientes com fibrose cística) transfectadas com o gene do ClC-2,
foi possível observar que as variações de pH e tonicidade estimularam o transporte
de Cl- pelo ClC-2 (Schwiebert & cols., 1998). Este trabalho sugeriu que o canal de
cloreto ClC-2 poderia ser uma possível via alternativa no tratamento da doença
pulmonar denominada fibrose cística que é causada pela mutação de um outro canal
de cloreto pertencente à família ABC de transportadores (ATP binding cassete
proteins). Em camundongos nocautes para ambos os genes, CFTR e ClC-2,
surpreendentemente, não há piora das alterações que normalmente são encontrados
nos tecidos severamente afetados pela doença fibrose cística. E, ao contrário do
esperado, estes animais sobreviveram por mais tempo que os animais com
disfunção somente para o gene do CFTR (Zdebik & cols., 2004).
Outros experimentos, agora utilizando, células da linhagem CaCo-2 (células de
carcinoma de cólon humano) demonstraram que o ClC-2 é capaz de contribuir para a
secreção de Cl- no epitélio intestinal humano. As células da linhagem CaCo-2 foram
transfectadas com RNAm antisense do ClC-2 (fitas antisense de RNAm tem a
capacidade de inibir a tradução do produto normal de RNAm da célula) e, após
análise por “patch clamp”, exibiram menor secreção de Cl-. Neste mesmo trabalho,
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através de microscopia confocal, foi possível demonstrar que o ClC-2 está localizado
na membrana apical das células epiteliais do intestino (Mohammad-Panah & cols.,
2001).
Também foi evidenciado que o ClC-2 pode influenciar na concentração
citoplasmática de Cl- em neurônios, e influenciar nos potenciais de ação neuronais,
especulando-se que o funcionamento inadequado deste canal causaria epilepsia,
embora os animais nocautes para ClC-2 não apresentem convulsões. No entanto a
mutação do ClC-2 foi encontrada em três famílias que apresentavam o distúrbio. Em
astrócitos de camundongos nocautes para ClC-2, a corrente de Cl- foi abolida,
mostrando que esse canal pode ser importante na função no sistema nervoso
(Nobile & cols., 2000).
A evolução das técnicas de biologia molecular tem auxiliado na determinação do
real papel dos diversos genes. A construção de um camundongo nocaute para o
gene do ClC-2 pelo grupo de Bösl, em 2001, tem auxiliado na caracterização do
papel do ClC-2 no organismo. Os animais nocaute para o ClC-2 são viáveis,
possuem desenvolvimento normal, são férteis, apresentam concentrações hormonais
idênticas às dos animais selvagens e não mostram alterações físicas ou qualquer
alteração de comportamento (Bösl & cols., 2001). Também foram avaliadas, nesses
animais as concentrações séricas dos diferentes eletrólitos, com as concentrações
séricas de marcadores de função renal, pancreática e hepática. Todos esses
parâmetros mostraram-se normais, comparáveis aos encontrados nos animais
selvagens. Entretanto, há duas alterações que são mais pronunciadas em animais
nocautes do ClC-2: as degenerações dos túbulos seminíferos, assim como
diminuição do calibre desses túbulos, apesar de apresentarem espermatogênese
normal até a terceira semana de vida; e uma intensa e rápida degeneração das
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células fotorreceptoras da retina, o que leva os animais à cegueira 30 dias após o
nascimento.
Isoformas do ClC-2 podem ser vias alternativas de transporte de Cl- em alguns
tecidos. A formação de “splicing” alternativos é uma opção de transportadores
provindos do mesmo gene com algumas funções alteradas. Um “splicing” alternativo
do ClC-2 menor em 20 pb (10 aminoácidos), comparado com o ClC-2 nativo, foi
identificado em intestino de porco. As diferenças funcionais entre ambos foram
detectadas por expressão heteróloga em células HEK-293 (linhagem de células
imortalizadas embrionárias de rim), sendo observado uma diferença na desativação
do canal. O canal truncado é mais rápido no transporte de Cl- porque possui uma
modificação no seu domínio NH2-terminal o que parece alterar seu funcionamento
(Cid & cols., 2000). Um outro “splicing” alternativo do ClC-2, identificado no coração
de rato (Britton & cols., 2005), tem menos 45pb (15 aminoácidos) e tem propriedades
cinéticas muito similares ao ClC-2 nativo.
I-4) Problemática 1: Seria o canal de cloreto ClC-2 modulado pela
aldosterona em rins de ratos?
A maior parte de NaCl filtrado nos glomérulos é reabsorvida ao longo dos vários
segmentos do néfron, sendo que nos túbulos proximais, distais e alça de Henle a
reabsorção de NaCl é proporcional à quantidade filtrada. Em contrapartida, ao longo
do sistema coletor, composto pelas porções cortical, medular externa e medular
interna, a reabsorção de NaCl é dependente de uma fina regulação hormonal e tem
papel muito importante na manutenção da volemia (Reineck & Stein, 1997). Essa
regulação se dá através de vários hormônios, dentre os quais destaca-se o papel da
aldosterona, que atua aumentando a reabsorção renal de Na+. A liberação deste
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hormônio pelo córtex da adrenal depende, principalmente, do sistema renina-
angiotensina (Aires, 1999). O estímulo para a liberação de renina após a ativação do
sistema renina-angiotensina nas células renais ocorre em estado de hipovolemia (por
percepção de baixa pressão de perfusão renal) e também por estímulos do sistema
nervoso autônomo agindo de maneira direta sobre as células justaglomerulares
através de sinapses (Barajas & Muller, 1973, Barajas e Wang, 1979).
O aparelho justaglomerular é responsável pela liberação de renina e é formado
pelas células que compõem a parede da arteríola aferente e pelas células da parede
do túbulo distal. Estas células formam um sincício, devido à presença junções
comunicantes na membrana plasmática, permitindo a interligação entre seus
citoplasmas (Barajas, 1979). Duas teorias são utilizadas para explicar os
mecanismos de liberação de renina pelo aparelho justaglomerular: a teoria da
sobrecarga de sal no túbulo distal e a teoria do receptor de estiramento. Segundo a
primeira teoria, a diminuição na carga de NaCl que chega no túbulo distal, onde as
células são sensíveis a alterações da concentração de Na+, sensibiliza as células
justaglomerulares a liberarem renina. Já a teoria do receptor de estiramento defende
que as células da arteríola aferente (células justaglomerulares) são sensíveis a
variação da volemia, e, portanto, ao estiramento das paredes do vaso, liberando
renina após este estímulo (Fray, 1976).
A renina liberada na circulação age sobre um pré-pró-hormônio denominado
angiotesinogênio, produzido e secretado, principalmente, pelas células do fígado.
Este é clivado e transformado no pré-hormônio, angiotensina I que ainda não tem
atividade biológica potente quando comparada com seu subproduto, a angiotensina
II. A angiotensina II surge da clivagem da angiotensina I pela enzima conversora de
angiotensina (ECA), presente em grande abundância no epitélio pulmonar. A
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angiotensina II, além de agir de maneira sistêmica nos receptores presentes na
musculatura lisa dos vasos levando à vasoconstricção, é responsável pela liberação
de aldosterona pelas células da glândula adrenal, na zona glomerulosa, através de
ação sobre receptores específicos de membrana, AT1.
O principal sítio de ação da aldosterona corresponde aos segmentos
ascendentes grosso da alça de Henle (TAL) (Work & Jamison, 1987), túbulo distal
(DT) e ducto coletor (CD) (Schwartz & Burg, 1978), onde leva ao aumento na
reabsorção do íon Na+ (Malnic & cols., 1966). Isso se deve primeiramente pela
ação da aldosterona sobre a atividade dos ENaCs existentes na membrana luminal
dos segmentos distais do néfron (Canessa e cols., 1994). O aumento da
permeabilidade dos EnaCs e o conseqüente aumento das concentrações
intracelulares de Na+ estimulam a atividade das Na+/K+-ATPases localizadas nas
membranas basolaterais e, portanto, a reabsorção de Na+ (Palmer e cols., 1990).
Numa etapa posterior a aldosterona estimula a transcrição dos genes codificadores
tanto dos canais de sódio quanto da Na+/K+-ATPase (Horisberger & Rossier, 1992).
Nasemann e colaboradores, em 1987, através de técnicas de microperfusão em
ductos coletor cortical isolado de coelhos recém-nascidos, observaram que a
reabsorção de cloreto foi estimulada após tratamento com aldosterona, no entanto,
quando o néfron tornou-se maduro este efeito foi reduzido, porém continua presente
(Nasemann & cols., 1987). Em ratos adrenalectomizados foi observada uma redução
significativa no fluxo de NaCl em segmento medular espesso da alça de Henle
quando eles foram comparados com animais normais ou com aqueles que foram
adrenalectomizados e que receberam reposição de aldosterona via intra-peritoneal
nas doses de 5 µg/100 g P/C dia, consideradas fisiológicas (Martin & cols., 1983,
Work & Jamison, 1987). A ação da aldosterona sobre o transporte de Cl- em néfron
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distal foi analisada em células imortalizadas de ducto coletor cortical. Estas células
expressam os genes para os canais de sódio sensíveis a amiloride e para os canais
de cloreto tais como o CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).
A adição de aldosterona ao meio de cultura destas células durante 24h, estimulou a
corrente de curto-circuito e o fluxo de Na+ do lado apical da membrana para o lado
basal, que foi aproximadamente três vezes maior que em células não tratadas
(Duong & cols., 1998).
Porém, até o presente momento pouco é sabido sobre as bases moleculares do
transporte de Cl- modulado pela aldosterona no rim.
I-5) Problemática 2: Seria a expressão gênica do canal de cloreto ClC-2
modulada pelos hormônios tireóideos em rins de ratos?
É sabido que vários hormônios podem modular o transporte de sódio ao longo
do néfron, os quais estão envolvidos com o aumento (natriurese) e redução (anti-
natriurese) de excreção de NaCl e, conseqüentemente de água na urina. Em
situações de redução de volume são desencadeados, principalmente, efeitos anti-
natriuréricos que envolvem o sistema renina-angiotensina-aldosterona, destacando-
se a angiotensina II e a aldosterona. O efeito diurético ocorre em situação de
expansão de volume. O principal fator natriurético envolvido é o FAN. Esse peptídeo
é liberado na circulação quando os miócitos atriais são distendidos sendo que este
peptídeo promove a diminuição da pressão sistêmica pelo seu efeito vasodilatador
além de favorecer a excreção renal de sódio através do bloqueio de canais de Na+
no ducto coletor renal (Reineck & Stein, 1997). No entanto, há evidências que outros
hormônios estão relacionados com a modulação do volume do fluido extracelular
(VFEC), além dos clássicos citados acima. Os hormônios tireóideos têm sido
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relacionados com várias alterações da função renal, inclusive influenciando a
excreção de Na+ na urina. Essas alterações foram observadas principalmente
quando os hormônios tireóideos apresentam-se acima ou abaixo das concentrações
plasmáticas consideradas normais (Katz & cols., 1975).
Experimentos realizados em ratos infundidos com doses fisiológicas (2,5 ng/
100g – PC.dia) de T3 e T4 marcado com iodo radioativo (I125) permitiram a
visualização da distribuição dos hormônios tireóideos em diversos órgãos através da
técnica de cromatografia líquida de alta e baixa pressão (HPLC E LPLC). O rim
recebeu cerca de 0,2% por 100g/PC da carga total de T3 e T4 circulantes no plasma
sanguíneo provavelmente, por apresentar uma alta taxa metabólica (Nguyen & cols,
1993). Essa demanda metabólica é necessária para que o rim realize suas funções,
por exemplo, a manutenção da volemia através da reabsorção da carga de NaCl ao
longo do néfron, a favor de um gradiente eletroquímico, dependente de energia,
gerados pela presença da Na+/K+-ATPase na membrana basolateral das células do
túbulo renal.
Está bem estabelecida a alteração no balanço hidroeletrolítico que ocorre em
indivíduos com hipertireoidismo (caracteriza-se pelo aumento da concentração
plasmática circulante de T3 e T4) ou hipotireoidismo (caracteriza-se pelas baixas
concentrações plasmáticas de T3 e T4 circulantes ou pelo defeito na ligação dos
hormônios tireóideos aos seus respectivos receptores: síndrome da resistência ao
hormônio tireóideo).
A função renal de pacientes hipertireóideos apresenta alterações
hemodinâmicas ligadas a alterações do fluxo sanguíneo que geralmente apresenta-
se aumentado (Aas & Blegen, 1949). Por esse motivo observa-se, nesses pacientes,
um aumento do ritmo de filtração glomerular e do fluxo plasmático renal (Ford &
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cols., 1961). A capacidade de transporte tubular também se apresenta maior tanto
para secreção, como acontece com o transporte de para-amino-hipurato de sódio,
quanto para reabsorção tendo como exemplo o transporte de glicose no túbulo
proximal (Eiler & cols., 1944; Ford & cols., 1961).
As alterações encontradas na função renal no hipotireoidismo são, geralmente,
opostas àquelas observadas no hipertireoidismo, com exceção da retenção de sódio
que ocorre em ambos os casos, porém por motivos diferentes. Enquanto o aumento
da massa corporal de Na+ no hipotireoidismo é atribuído principalmente à diminuição
do ritmo de filtração glomerular, em conseqüência da diminuição da perfusão renal
(White & cols., 1947; Aikawa, 1956; Ford & cols., 1961), no hipertireoidismo ocorre o
aumento da reabsorção tubular de Na+, como discutido anteriormente.
Os parâmetros relacionados com a função renal de 77 pacientes hipertireóideos,
tratados e não tratados foram analisados. Os pacientes não tratados apresentaram
uréia sanguínea elevada e diminuição na creatinina sérica. O tratamento dos
pacientes que restaura ao estado de eutireoidismo acompanha a normalização dos
níveis séricos avaliados. O RFG apresentou um leve aumento mas não significativo
nos pacientes hipertireóideos. Também foi observado o aumento significativo da
atividade plasmática da renina nos hipertireóideos, provavelmente, em conseqüência
a transpiração excessiva e freqüente defecação que leva a depleção de volume
corporal (Shirota & cols., 1992).
Os achados em seres humanos são corroborados em experimentos realizados
com animais. Em 1985, Capasso e colaboradores utilizaram ratos induzidos ao
hipotireoidismo por tireoidectomia e ratos tireoidectomizados com reposição
hormonal de T3 por três dias ou 10 dias (10µg/Kg PC.dia), e através da técnica de
microperfusão analisou a taxa de reabsorção do fluxo luminal em túbulo proximal,
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(maior sítio de reabsorção de fluido tubular do néfron). A taxa de reabsorção no
túbulo proximal de ratos tratados com reposição de hormônios tireóideos teve um
aumento de aproximadamente 65% em relação aos ratos hipotireóideos. Os rins
destes mesmos animais após os estudos in vivo foram extraídos e transformados em
preparação de membranas isoladas de borda luminal (membrana borda em escova).
Estas membranas tiveram a permeabilidade ao Na+ estudadas na presença de Na+
marcado com isótopo radioativo no meio de incubação, onde foi observado um
pequeno aumento não significativo da permeabilidade luminal, o que pode indicar o
estímulo dos hormônios tireóideos sobre a atividade da Na+/K+ ATPase presente na
membrana basolateral. Essa conclusão foi baseada no fato de que a Na+/K+ ATPase
é responsável pela formação do gradiente eletroquímico que torna favorável a
entrada de Na+ pela membrana luminal.
O RNAm e a proteína correspondente à Na+/K+ ATPase em ratos hipotireóideos
com reposição de tri-iodotironina aumentaram significativamente em relação aos
ratos hipotireóideos (McDonough & cols., 1988). Também foram observados o
aumento das subunidades catalíticas α e β da Na+/K+ ATPase em rins de ratos
submetidos à reposição hormonal de T3 em relação aos hipotireóideos. Esses
experimentos sugeriram que a atividade da enzima, e não somente a sua expressão,
é estimulada pelo hormônio tireóideo.
DiBartola e colaboradores (1996) observaram, em gatos hipertireóideos, o
aumento do fluxo plasmático renal e do ritmo de filtração glomerular em relação a
gatos normais medindo os "clearances" de para-amino-hipurato de sódio e de
creatinina. Este efeito foi atribuído ao aumento do débito cardíaco mediado pelo
hormônio tireóideo e pela vasodilatação intra-renal. O tratamento destes gatos
hipertireóideos com metimazol (agente farmacológico que inibe a síntese e a
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secreção de hormônios tireóideos) ou por tireoidectomia reverteu os efeitos
observados.
Azuma e colaboradores (1996) estudaram em túbulo proximal de ratos o
envolvimento dos hormônios tireóideos sobre a expressão de quatro isoformas
(NHE1, NHE2, NHE3 e NHE4) do trocador Na+/H+ (abundantemente expressos na
membrana luminal das células do túbulo renal). Estudos envolvendo a técnica de
“northen blot” indicaram que o RNAm das isoformas NHE2 e NHE3 presente no
túbulo proximal do rim dos animais hipertireóideos apresentaram aumento
significativo em relação aos animais hipotireóideos. Por outro lado, as isoformas
NHE1 e NHE4 não apresentaram diferença significativa da expressão de seus
RNAms entre os grupos estudados.
A ação dos hormônios tireóideos sobre a permeabilidade dada pelo trocador
Na+/H+ foi avaliada através de técnicas de microperfusão in vivo em túbulo proximal
e distal por Morales e colaboradores, em 1996. Os ratos foram induzidos ao
hipotireoidismo por tireoidectomia e comparados a ratos falsamente operados. O
parâmetro analisado foi à cinética de acidificação no túbulo proximal, onde foi
observado que a reabsorção de HCO3-, bem como o pH intratubular apresentaram
tendência a diminuição, porém não significativa, em ratos tireoidectomizados.
Enquanto o tempo de acidificação tubular tanto proximal quanto distal aumentou
significativamente em ratos hipotireóideos. Esses dados sugeriram uma menor
expressão do trocador Na+/H+ , principalmente em túbulos proximais de animais
hipotireóideos.
Outros autores mostraram a diferença da ação renal dos hormônios tireóideos
entre animais jovens e velhos através do estudo da expressão do RNAm e da
proteína correspondente ao co-transportador Na+/Fosfato. Ambos os grupos de ratos
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foram tireoidectomizados e divididos em subgrupos que receberam reposição
hormonal com doses fisiológicas e supra-fisiológicas. Os ratos, jovens e velhos,
tireoidectomizados apresentaram redução significativa da expressão gênica do
trocador Na+/Fosfato. Quando foi administrada dose supra-fisiológica em ambos os
grupos (jovens e velhos) houve aumento significativo da expressão do co-
transportador em túbulos proximais. No entanto, os ratos velhos com reposição
hormonal, apesar de responderem ao estímulo, apresentaram menor resposta ao
estímulo por hormônio tireóideo do que ratos jovens.
Todos esses dados, apresentados anteriormente, estão de acordo com o fato de
que o rim apresenta as isoformas mais conhecidas de receptores nucleares
específicos para hormônios tireóideos (TRα1 e TRβ1) (Shahrara & cols., 1999).
Possivelmente, há ação direta destes hormônios sobre as células do tecido renal.
Até aqui vimos que são bem estudadas as ações dos hormônios tireóideos
sobre transportadores de Na+. Porém, o íon Cl- é o principal co-íon do Na+ (Hamlyn &
Blaustein, 1986; Terry, 1994). Assim, seria válido postular que os mesmos
mecanismos que modulam o transporte de Na+ também estariam modulando o
transporte transcelular de Cl- (Gottschalk, 1988), já que grande parte do Cl- filtrado
pelo glomérulo é reabsorvida juntamente com o Na+ ao longo do néfron por
mecanismos ativos e passivos.
Dentre os vários transportadores de Cl- existentes ao longo do néfron propomos
estudar a influência dos hormônios tireóideos, da aldosterona e das dietas ricas em
NaCl sobre a expressão do ClC-2 em rim de rato.
I-6) Problemática 3: Estaria o receptor de hormônio tireóideo do tipo β
envolvido na expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 em rins de ratos?
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Os efeitos dos hormônios tireóideos são mediados através de receptores de
hormônios tireóideos (TRs). Os TRs foram identificados em 1986, como um produto
do proto-oncogene c-erbA, o precursor celular do oncogene viral erbA (Weinberger &
cols.,1986). Os TRs são membros da superfamília dos receptores nucleares, os
quais funcionam como fatores de transcrição dependentes de ligantes (Mangelsdorf
& cols., 1995). Estes TRs ligam-se a seqüências especificas no DNA chamadas de
elementos responsivos ao hormônio tireóideo (TRE). As seqüências TREs,
geralmente, estão localizadas na região promotora dos genes alvo e são especificas
para cada receptor. Os TREs possuem duas cópias de um hexanucleotídeo que
podem ser arranjadas em diferentes orientações (AGGTCA N AGGTCA; sendo N o
número de bases nucleotídicas que separa cada hexâmero) (Ribeiro & cols.,1998).
Os TRs ligam-se as seqüências TREs na forma de monômeros, homodímeros
(TR/TR) ou, preferencialmente, heterodímeros (TR/RXR) formados por associação a
outro membro da superfamília de receptores nucleares, o receptor de ácido retinóico
(RXR) (Glass, 1994). (Figura 3).
Os membros da superfamília de receptores nucleares exibem uma estrutura
com três principais domínios: amino-terminal, de ligação ao DNA (DBD) e de ligação
ao ligante (LBD), e uma pequena região que conecta o DBD ao LBD que forma uma
dobradiça chamada de “hinge” (Ribeiro & cols.,1998). (Figura 4).
Em mamíferos, dois genes distintos, o TRα e o TRβ, codificam diferentes
proteínas (TRα1, TRα2, ∆TRα1, ∆TRα2, TRβ1, TRβ2, TRβ3 e ∆TRβ3) que são
resultado do processamento alternativo do RNAm (“splicing” alternativo) ou da
utilização de promotores alternativos no ato da transcrição do gene (Figura 5). Os
TRs ligam-se ao DNA mesmo na ausência do ligante. O complexo TR-DNA sem a
presença de T3 associa-se a outras proteínas conhecidas como correpressores
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porque atuam reprimindo a transcrição gênica. As proteínas correpressoras
interagem com as histonas desacetilases que impedem o “desenrolar” da fita de
DNA, portanto, compactam a cromatina na região promotora e inibem a maquinaria
de transcrição basal. Na presença do ligante, o complexo TR-DNA dissocia-se dos
correpressores e associa-se a proteínas co-ativadoras que interagem com as
histonas acetil-transferases que atuam hiperacetilando a fita de DNA, relaxando a
cromatina. Portanto, facilita o acesso dos fatores transcricionais, estimulando a
transcrição gênica (Figura 6).
Os TRs medeiam as ações de T3, assim como, mantêm as concentrações do
hormônio em níveis plasmáticos constantes através da alça de regulação do eixo
hipotálamo – pituitária – tireóide. Os hormônios tireóideos fazem uma alça negativa
de regulação na pituitária e no hipotálamo inibindo a síntese e secreção do hormônio
estimulante da tireóide (TSH) e do hormônio liberador de tireotrofina (TRH),
respectivamente (Lezoualc’h & cols., 1992).
A presença de mutações no TRβ o impede de ligar-se à molécula do T3. Estas
mutações geralmente ocorrem no domínio de ligação ao ligante (LBD), sendo que já
foram identificadas em seres humanos mais de 100 mutações diferentes em TRβ1.
O receptor mutado mantém a propriedade de se ligar à região TRE no DNA,
porém, o T3 não se liga ao receptor. Além disso, o receptor mutado permanece ligado
a fatores correpressores exercendo um efeito dominante negativo, que é
característica da mutação ∆337T utilizada neste trabalho, interferindo com a ação do
receptor normal. Os animais com mutação no TRβ apresentam tanto sinais de
hipotireoidismo, como sinais de hipertireoidismo porque a quantidade de receptores
de hormônios tireóideos nos tecidos não é uniforme, ressaltando que há
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predominância do TRα em coração e músculos esqueléticos e TRβ em rim, fígado e
cérebro (Flamant & Samurat, 2003; Willians, 2000; Lazar, 1993).
Figura 3: Ligação dos receptores de hormônios tireóideos, (TR) a seqüência especificas do DNA, formando homodímeros (A) ou heterodímeros com o receptor de ácido retinóico (B). Adaptado de Barra & cols, 2004.
TR A
B
Figura 4: Estrutura primária representando os domínios funcionais dos receptores nucleares: Domínio amino-terminal (NH2-t), domínio de ligação ao DNA (DBD), dobradiça (Hinge), domínio de ligação ao ligante (LBD) e sua respectivas funções. Adaptado de Barra & cols, 2004.
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Figura 5: Estrutura primária das diferentes isoformas codificadas pelos genes receptores do hormônio tireóideo: as isoformas TRβ1, TRβ2, TRβ3 e TRβ∆3 são codificadas pelo gene THRB através da utilização de promotores alternativos. O gene THRA, por “splicing” alternativo e também pela utilização de promotores alternativos, produz as proteínas TRα1, TRα2, TR∆α1 e TR∆α2. Adaptado de Barra & cols, 2004.
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Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação do receptor do hormônio tireóideo: na ausência de T3, o TR se encontra ligado ao TRE como homodímero (Representado) ou heterodímero associado a proteínas correpressoras, que compactam a cromatina na região promotora e inibem a maquinaria de transcrição basal (MTB). A ligação do T3 (círculo) ao TR promove uma mudança conformacional que induz a liberação dos correpressores e associação do TR com proteínas co-ativadoras. A associação do TR com proteínas co-ativadoras relaxam a cromatina na região promotora e recrutam a maquinaria de transcrição basal (MTB), ativando a transcrição de genes alvo. Adaptado de Barra & cols, 2004.
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Refetoff e colaboradores, em 1967, foram os primeiros a descrever os
sintomas causados por estas mutações denominada de Síndrome de Resistência ao
Hormônio Tireóideo (RHT). Esta síndrome é caracterizada por redução na resposta
dos tecidos-alvos ao hormônio tireóideo, apesar dos altos níveis séricos de T3 e T4
livres, apresentando um TSH elevado ou inadequadamente normal característico da
sensibilidade reduzida do tireotrofo (Beck-Peccoz & Chatterjee, 1994). Os indivíduos
apresentam bócio, deficiência auditiva, deficiência de aprendizado, retardo mental,
atraso no crescimento ósseo.
O modelo animal construído por Hashimoto e colaboradores (2001), no qual foi
retirado um aminoácido treonina na posição 337 no exon 6, apresenta fenótipo
similar a Síndrome de Resistência ao Hormônio Tireóideo. Camundongos
trangênicos mutados para o gene TRβ apresentam fenótipo similar a esta síndrome
porém relativamente moderado quando comparados a animais feitos hipotireóideos
por retirada da tireóide. Paradoxalmente, estes animais apresentam sinais
característicos de hipertireoidismo em alguns tecidos como, por exemplo, aumento
da freqüência cardíaca.
Estes modelos de camundongos com mutação no gene TRβ são úteis para
observar o mecanismo de ação dos hormônios tireóideos em tecidos-alvo. Nesta
tese, estes animais foram usados para identificar a possível participação do TRβ na
ação dos hormônios T3 e T4 sobre a modulação da expressão gênica do ClC-2 em
rim de ratos.
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OBJETIVOS
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II-Objetivo Geral:
O objetivo do presente trabalho é verificar se a expressão gênica do canal de cloreto
ClC-2 é modulada pelos hormônios tireóideos e pela aldosterona em rim de ratos.
II-1-Objetivos específicos:
1. Estudar a distribuição do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos.
2. Estudar se o RNAm do ClC-2 é modulado em rim total e em segmentos
dissecados do néfron de ratos submetidos a dietas hipersódicas e
adrenalectomizados, adrenalectomizados com reposição de aldosterona,
hipotireóideos e hipertireóideos.
3. Estudar a modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos
submetidos dieta hipersódica, hipotireóideos e hipertireóideos.
4. Estudar a possível modulação do RNAm do ClC-2 pelos hormônios da tireóide
em cultura de células de túbulo proximal de ratos in vitro.
5. Estudar o possível mecanismo de ação dos hormônios tireóideos sobre a
expressão gênica do ClC-2 através do envolvimento da região promotora do
deste canal e via receptor TRβ, utilizando camundongos trangênicos para
esse receptor.
III-1) Grupos Experimentais
Todos os protocolos utilizados nesta tese e relacionados abaixo foram
aprovados pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa
(CAUAP) do IBCCFo da UFRJ.
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III-1.1) Preparação dos ratos adrenalectomizados tratados ou não com
aldosterona
Para os experimentos de modulação de RNAm foram utilizados ratos da
linhagem Wistar, de 3 meses de idade (adultos jovens), pesando cerca de 150-
250g que foram mantidos em sala com controle de luminosidade (12h luz / 12h
escuro, iluminação a