UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ALDOSTERONA E HORMÔNIOS TIREÓIDEOS

REGULAM A EXPRESSÃO DO CANAL DE CLORETO

ClC-2 EM RIM DE RATOS

DÉBORA DOS SANTOS ORNELLAS

TESE DE DOUTORADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE

FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO

GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Centro de Ciências da Saúde Universidade Federal do Rio de Janeiro

AGOSTO / 2006

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FICHA CATALOGRÁFICA

Ornellas, Débora dos Santos

Aldosterona e Hormônios Tireóideos regulam a expressão do canal de

cloreto ClC-2 em rim de ratos

Rio de Janeiro: UFRJ; IBCCF; 2006.

xviii ; 151 fls

Orientador: Marcelo Marcos Morales

Monografia de Doutorado – UFRJ / IBCCF/ Programa de Ciências Biológicas

(Fisiologia)

Referência Bibliográfica: f. 121 – 132

Área de concentração – Fisiologia Renal

1.Expressão gênica 2.Rim 3.Canal de cloreto ClC-2

4.Aldosterona 5.Hormônios tireóideos 6.Volume do fluido

extracelular

I. Morales, Marcelo Marcos II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

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O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro

na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico (CNPq), Financiador de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação Carlos

Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

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“Deus escolheu as coisas loucas do mundo para confundir os sábios; e Deus escolheu as coisas fracas do mundo para confundir as fortes (...) para que, como está escrito: Aquele que se gloria, glorie-se no Senhor.” I Coríntios cap.1 vers 28 e 31. NT. Bíblia Sagrada

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”Porque d’Ele e por Ele e para Ele são todas as coisas.”

A minha Mãe, uma mulher inconfundível e maravilhosa.

A minha família,

Aos meus amigos

Ao meu orientador,

Meu amor e gratidão.

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AGRADECIMENTOS Mãe, Pai tudo começou por vocês, meu sincero carinho.

Irmãos, amo vocês dois, Juliana e Felipe Mateus Ornellas.

Vó, não precisa chorar...

Tia Vera Lúcia , você é especial para mim.

A toda minha família, um enorme beijo.

Aos amigos que nunca entenderam o que eu faço, mas sempre me apoiaram. Obrigada!

Em especial a todos da Comunidade Paz e Vida.

Aos amigos Ilma Dayse, Cíntia e Fábio por fazerem parte da minha história.

Ao meu orientador que apostou em mim e tornou-se meu amigo durante esta caminhada.

Marcelo, a tese acabou, mas a amizade é para sempre.

Horacio, Ana Carolina e Aline, vocês têm meu carinho especial, porque sou fã de vocês.

Bruno Botelho, meu amigo dos olhos azuis. Consegui !!!

Danielle, minha amiga “chorona”. Conseguimos!!!

Roberta, Vera Tostes e Caroline, minhas queridas “estressadas” amigas. Beijos.

A todos que entendem e compartilham o mesmo sentimento de “tesesofrimento”: Felipe

Prota (cômico), Carolzinha (enfezada), Sabrina (Miss biofísica), Graziela (divertida),

Jackson (sabe Tudo), Juliana (juju festeira), André (faz tudo), Raquel &Tatiana (as

siamesas), Helber (semi-altista),

A todos que passaram pelo laboratório e conseqüentemente por mim, meu sincero obrigada.

A Edna e Luiza por todo apoio, ajuda, alegria, etc, etc. Sem palavras...

Aos professores que colaboraram com esta tese: Tânia Ortiga-Carvalho, Carmem Pazos-

Moura, Denise Pires Carvalho e Regina Goldenberg.

Dizer muito obrigada é “não significativo”. OBRIGADAAAAAA!!!!!!!!!!!!!!!!!

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ALDOSTERONA E HORMÔNIOS TIREÓIDEOS REGULAM A EXPRESSÃO DO CANAL DE CLORETO ClC-2 EM RIM DE RATOS Débora dos Santos Ornellas Orientador: Marcelo Marcos Morales Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia).

A expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 foi estudada em rim de ratos

submetidos a dieta hipersódica, a adrenalectomia com e sem reposição de

aldosterona, e em ratos hiper e hipotireóideos. O RNAm do ClC-2 foi encontrado ao

longo do néfron, com exceção dos segmentos ducto coletor cortical e alça espessa

de Henle medular externa. O RNAm do ClC-2 diminuiu em 64% na alça espessa de

Henle cortical e 43% na alça espessa de Henle medular em dieta hipersódica; em

animais hipertireóideos, aumentou 47% e 56% nos túbulos proximal convoluto e reto,

respectivamente. A proteína do ClC-2 diminuiu 41% em rim de ratos com dieta

hipersódica, 62% em ratos hipotireóideos; e aumentou 63% em ratos hipertireóideos.

A tiroxina aumentou o RNAm do ClC-2, dose-dependente, em cultura primária de

células de túbulo proximal. O promotor do ClC-2 foi estimulado em células de túbulo

proximal em resposta aos hormônios tireóideos.

Camundongos com mutação ∆337T no receptor TRβ que apresentam

características da síndrome de resistência dos hormônios tireóideos apresentaram

menor expressão renal do RNAm do ClC-2 (41% em heterozigotos e 45% em

homozigotos) e da proteína ClC-2 (40% em heterozigotos e 43% em homozigotos)

em rim de camundongos. Esta redução não foi alterada pela indução do

hipotireoidismo.

Concluímos que a expressão gênica do ClC-2 é estimulada por aldosterona e por

hormônios tireóideos em rim de ratos. O estímulo por hormônios tireóideos ocorre

por aumento da transcrição do gene com possível participação do receptor TRβ.

Palavras-chave: Aldosterona, hormônios tireóideos, T3, T4, ClC-2, canal de cloreto,

rim, túbulo proximal, RNAm, RT-PCR, RPA.

Rio de Janeiro

Agosto / 2006

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ABSTRACT

ClC-2 chloride channel is modulate by aldosterone and thyroid hormones in rat kidney Débora dos Santos Ornellas Orientador: Marcelo Marcos Morales

Gene expression of the chloride channel ClC-2 was studied in rat kidneys under

high sodium diet, adrenalectomy with and without aldosterone supply and in hyper

and hypothyroid rats. ClC-2 mRNA was found along the nephron with exception of

the cortical collecting duct and outer collecting duct. Under high sodium diet, ClC-2

mRNA decreased 64% in the cortical thick ascending limb of Henle loop and 43% in

the medullar thick ascending limb of Henle loop, respectively; in hyperthyroid rats it

increased 47% and 56% in the proximal convolute and straight tubules, respectively.

ClC-2 protein expression decreased 41% in rat kidneys under high sodium diets and

62% in hypothyroid rats; but increased 63% in hyperthyroid rats. Thyroxin increased

ClC-2 mRNA in primary cell culture of rat proximal tubules, dose-dependent manner.

ClC-2 promoter was stimulated in proximal tubule cells when exposed at the thyroid

hormones.

∆337T TRβ receptor mutate mice, that showed characteristics of the Thyroid

Hormones Resistance Syndrome, had ClC-2 mRNA expression decreased (41%,

heterozygous and 45%, homozygous). A similar decrease was observed in the

protein expression (45%, heterozygous and 44%, homozygous) in mutate mice

kidneys. Hypothyroidism induced in TRβ receptor mutate mice did not interfere in the

standard of ClC-2 expression that continued diminished in mice, without additional

effect.

We can conclude that ClC-2 gene expression is stimulated by aldosterone and

thyroid hormones in rat kidneys. Thyroid hormones increase the gene transcription

with probable participation of the TRβ receptor.

Key words: Aldosterone, thyroid hormones, T3, T4, ClC-2, chloride channel, kidney,

proximal tubule, mRNA, RT-PCR, RPA.

Rio de Janeiro

August / 2006

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Ficha catalográfica........................................................................................................ii

Agradecimentos...........................................................................................................vi

Resumo.......................................................................................................................vii

Abstract......................................................................................................................viii

Sumário........................................................................................................................ix

Índice de figuras.........................................................................................................xiii

Lista de abreviaturas..................................................................................................xvi

I – INTRODUÇÃO

I.1) Regulação do volume do fluido extracelular.......................................................... 2

I.2) A família CLC de canais de cloreto...................................................................... 7

I.3) O canal de cloreto ClC-2..................................................................................... 10

I.4) Problemática 1: Seria o canal de cloreto ClC-2 modulado pela aldosterona em

rins de ratos?........................................................................................................ 18

I.5) Problemática 2: Seria a expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 modulada

pelos hormônios tireóideos em rins de ratos?....................................................... 21

I.6) Problemática 3: Estaria o receptor de hormônio tireóideo do tipo β envolvido na

expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 em rins de ratos?............................ 27

II – OBJETIVOS

II.1) Objetivo geral.......................................................................................................34

III – MATERIAIS E MÉTODOS

III.1) Grupos Experimentais........................................................................................36

III-1.1)Preparação dos ratos adrenalectomizados tratados ou não com

aldosterona.............................................................................................................36

III-1.2) Preparação dos ratos tratados com furosemida..............................................37

III-1.3) Preparação dos ratos hipotireóideos e hipertireóideos...................................38

x

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III-1.4)Preparação dos camundongos hipotireóideos e hipertireóideos......................39

III-1.5) Camundongos com mutação TRβ...................................................................40

III-2) Métodos

III-2.1) Genotipagem dos animais...............................................................................40

III-3) Excisão Renal.....................................................................................................41

III-4) Microdissecção de túbulos renais......................................................................41

III-5) Extração de RNA-total........................................................................................44

III-6) Transcrição Reversa (RT)..................................................................................44

III-7) Reação de Polimerização em Cadeia (PCR).....................................................44

III-8) Ensaio de proteção contra a RNAse (RNase Protection Assay - RPA)............46

III-8.1) Síntese da Sonda de RNA Marcada...............................................................48

III-8.2) Hibridização da Sonda Marcada com o RNA..................................................49

III-9) “Southern Blotting”..............................................................................................50

III-10)Immunoblotting”...............................................................................................51

III-11) Cultura primária de células de túbulo proximal de ratos..................................52

III-12) Estudo da região promotora do ClC-2..............................................................53

III-13) Análise dos parâmetros sanguíneos e urinários dos grupos experimentais da

fração de eletrólitos................................................................................................55

III-14) Radioimunoensaio............................................................................................55

III-15) Densitometria...................................................................................................56

III-16) Análise estatística.............................................................................................56

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IV- RESULTADOS......................................................................................................58

VI-1) Expressão do RNAm do ClC-2 nas regiões corticais e medulares de rins de

ratos normais através da técnica de ensaio de proteção contra RNAse (RPA).....58

VI-2) Detecção da expressão do RNAm do gene do ClC-2 em diferentes segmentos

do néfron de rato................................................................................................. .60

VI -3) Análise da fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com dieta rica

em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona.................62

VI-4) Expressão do RNAm do ClC-2 em córtex e medula rim de ratos submetidos a

dieta hipersódica através da técnica de ensaio de proteção contra RNAse

(RPA)......................................................................................................................63

VI-5) Análise da expressão da proteína do ClC-2 em rim total de ratos através da

técnica de “immunoblotting”.................................................................,.................63

VI-6) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos submetidos a diferentes

tratamentos através da técnica de ensaio de proteção contra RNase (RPA)........66

VI-7) Experimentos preliminares à técnica de RT-PCR semiquantitativo...................66

VI-7.1) Determinação do comprimento do néfron necessário para a amplificação ideal

do gene do ClC-2 por RT-PCR..............................................................................66

VI-7.2) Determinação do número ideal de ciclos de PCR a ser utilizado para a

amplificação do RNAm do ClC-2 a partir de 3mm de PST de rato........................67

VI-8) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos em

dieta rica em sódio, adrenalectomizados com ou sem reposição de aldosterona

por RT-PCR............................................................................................................70

VI-9) Modulação do RNAm de ClC-2 nos segmentos cTAL e mTAL de ratos tratados

com furosemida......................................................................................................74

xii

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VI-10) Determinação das concentrações séricas dos Hormônios Tireóideos em

ratos.......................................................................................................................77

VI-11) Expressão do RNAm do ClC-2 em rim total de ratos hipotireóideos com ou

sem reposição e hipertireóideos avaliados por RPA..............................................78

VI-12) Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos

hipotireóideos com ou sem reposição e hipertireóideos avaliados por RT-

PCR........................................................................................................................79

VI-13) Cultura primária de células de túbulo proximal de rato tratadas com Hormônio

Tireóideo...............................................................................................................84

VI-14) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos controle,

hipotireóideos com ou sem reposição e hipertireóideos.......................................84

VI-15) Análise da região promotora do ClC-2 em cultura de células tratadas com

Hormônio Tireóideo...............................................................................................87

VI-16) Comparação dos parâmetros urinários dos camundongos com mutação no

receptor TRβ.........................................................................................................89

VI-17) Determinação das concentrações séricas dos Hormônios Tireóideos em

camundongos........................................................................................................90

VI-18) Modulação do RNAm do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos com

ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por RT-PCR..................................90

VI-19) Modulação da proteína do ClC-2 em rim de camundongos hipotireóideos com

ou sem reposição hormonal e hipertireóideos por “immunoblotting”.....................91

VI-20) Modulação do RNAm em camundongos com mutação no receptor TRβ........95

VI-21) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com

mutação no receptor TRβ......................................................................................95

xiii

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VI-22) Modulação da expressão RNAm do ClC-2 em camundongos com mutação no

receptor TRβ tratados com metimazol..................................................................98

VI-23) Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em camundongos com

mutação no receptor TR-β tratados com metimazol.............................................98

V – DISCUSSÃO

V-1) Ação do hormônio aldosterona sobre a expressão gênica dos canais de cloreto

ClC-2 em rim de rato.................................................................................................102

V-2) Ação dos hormônios tireóideos sobre a expressão gênica do canal de cloreto

ClC-2 em rim de rato.................................................................................................106

VI – CONCLUSÃO...................................................................................................115

VIII – SOLUÇÕES UTILIZADAS..............................................................................117

IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................121

VII –TRABALHOS PUBLICADOS...........................................................................134

xiv

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FIGURAS E TABELAS

FIGURAS

Figura 1: Figura representativa do ClC-2.................................................................. 11

Figura 2. Conformação de abertura e fechamento do canal de cloreto ClC-2.......... 13

Figura 3: Ligação dos receptores de hormônios Tireóideos...................................... 29

Figura 4: Estrutura primaria representando os domínios funcionais dos receptores

nucleares ...............................................................................................................29

Figura 5: Estrutura primaria das diferentes isoformas codificadas pelos genes

receptores do hormônio tireóideo ..........................................................................31

Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação do receptor do

hormônio tireóideo .................................................................................................32

Figura 7: Figura representativa do néfron...................................................................43

Figura 8: Clonagem e linearização do DNA............................................................... 47

Figura 9: Distribuição do RNAm do ClC-2 entre córtex, medula externa e medula

interna de rim de rato por Ensaio de Proteção contra Rnase

(RPA)......................................................................................................................59

Figura 10: Detecção do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de rato por RT-PCR....61

Figura 11: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos controle e 5d-Na+ por RPA....64

Figura 12: Expressão da proteína do ClC-2 em ratos tratados 5d-Na+ por

“immunoblotting”.....................................................................................................65

Figura 13: Expressão do RNAm do ClC-2 em grupos controle, ADX e ADX+ALDO

por RPA..................................................................................................................68

Figura 14: Determinação do comprimento do néfron para amplificação ideal do ClC-2

e β-actina na mesma reação de RT-PCR..............................................................69

xv

xv

Figura 15: Determinação do número de ciclos necessários néfron para amplificação

ideal do ClC-2 e β-actina na mesma reação de RT-PCR......................................69

Figura 16: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo proximal reto

(PST)......................................................................................................................71

Figura 17: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção espessa medular

da alça de Henle (mTAL).......................................................................................72

Figura 18: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em porção espessa cortical

da alça (cTAL)........................................................................................................73

Figura 19: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em cTAL tratados com

furosemida..............................................................................................................75

Figura 20: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em mTAL tratados com

furosemida..............................................................................................................76

Figura 21: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim de ratos por

RPA........................................................................................................................78

Figura 22: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em diferentes segmentos do

néfron por RT-PCR................................................................................................80

Figura 23: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em túbulo proximal

convoluto (PCT).......................................................................... ..........................81

Figura 24: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em PST............................82

Figura 25: Segmentos sem a expressão de ClC-2: ducto coletor cortical (CCD) e

medular externo (OMCD).......................................................................................83

Figura 26: Modulação da expressão do ClC-2 em cultura primária de PCT..............85

Figura 27: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de rato................86

Figura 28: Análise da região promotora do ClC-2......................................................90

xvi

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Figura 29: Determinação da concentração necessária para amplificação por RT-PCR

em camundongos.......................................................................................................91

Figura 30: Determinação do número de ciclos necessário para amplificação por RT-

PCR em camundongos...............................................................................................91

Figura 31: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em rim de

camundongos.............................................................................................................92

Figura 32: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de

camundongos.............................................................................................................93

Figura 33: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em camundongos com

mutação no receptor β................................................................................................94

Figura 34: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de camundongos

com mutação no receptor β........................................................................................96

Figura 35: Modulação da expressão do RNAm do ClC-2 em camundongos com

mutação no receptor β tratados com metimazol.........................................................98

Figura 36: Modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de camundongos

com mutação no receptor β tratados com metimazol.................................................99

TABELAS

Tabela 1: as seqüências e localizações dos oligonucleotídeos..................................49

Tabela 2: Fração de excreção de eletrólitos em animais tratados com dieta

hipersódica, adrenalectomizados com ou sem reposição..........................................62

Tabela 3: Concentrações séricas de Hormônios Tireóideos em ratos.......................77

Tabela 4: Fração de excreção de eletrólitos de camundongos com mutação no

receptor TRβ...............................................................................................................89

xvii

xvii

Tabela 5: Concentrações plasmáticas de Hormônios Tireóideos em camundongos

com mutação no receptor TRβ...................................................................................92

xviii

xviii

LISTA DE ABREVIATURAS

Na+-5d – dieta rica em sódio por cinco dias

ADX – adrenalectomia

ADX+ALDO – adrenalectomia com reposição de aldosterona

AMPc – adenosina monofosfato cíclico

ATP – adenosina trifosfato

CaCo-2 – células intestinais tumorais humanas

CFTR – canal de cloreto transmembrana regulador da condutância e envolvido na

doença fibrose cística (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

ClC-2 – canal de cloreto – 2 (chloride channel – 2)

cTAL – porção cortical espessa ascendente da alça de Henle

DCC – ducto coletor cortical

DEPC – Dietil pirocarbonato

ENaC – canal de Na+ epitelial

FAN – Fator natriurético atrial

FEC – fluido extracelular

GMPc – guanosina monofosfato cíclico

HETE – heterozigoto

HOMO - homozigoto

HIPO – hipotireóideo

HIPO + T4 – hipotireóideo com reposição de T4

HIPER - hipertireoideo

HL – alça de Henle

IMCD – duto coletor medular interno

LBD – Domínio de Ligação ao Ligante

kDa - quilodalton

MBL –membrana basolateral

ML – membrana luminal

MMI - metimazol

NBD – domínio de ligação de nucleotídeo

NKCC – co-transportador Na+/K+/2Cl-

xix

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OMCD – ducto coletor medular externo

PKA – proteína quinase dependente de AMPc

PKC – proteína quinase dependente de Ca+2

PKG – proteína quinase dependente de GMPc

pS – pico Siemens. Unidade de dimensão da condutância elétrica que leva em

consideração: distância percorrida (em metros), pela massa de uma partícula (em

quilos), por tempo (em segundos) e a corrente elétrica (em ampére).

PCT – túbulo proximal convoluto

PST – Túbulo proximal reto

RNAm – RNA mensageiro

RPA – Ensaio de Proteção contra RNases

RT-PCR – transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase

T3 – 3,3’,5 - triiodotironina

T4 – 3,3’,5,5’ – tetraiodotironina ou tiroxina

TMD – domínio transmembrana

TRα – Receptor de hormônio tireóideo alfa

TRβ – Receptor de hormônio tireóideo beta

TSH – Hormônio Estimulante da Tireóide

TRH – Hormônio Liberador de Tireotrofina

RHT - Resistência ao Hormônio Tireóideo

INTRODUÇÃO

2

2

I-1) Regulação do volume do fluido extracelular

Em indivíduos normais, a composição do fluido corporal, seu volume e a sua

distribuição entre os diversos compartimentos devem permanecer dentro de faixas

estreitas de variações (Jacobson & Rector, 1990). Esse equilíbrio depende do

balanço de água e sais que são ingeridos e excretados diariamente pelo organismo.

Assim, os principais órgãos envolvidos com a regulação do volume do fluido

extracelular (VFEC) são o trato gastro-intestinal e os rins, por serem os principais

responsáveis, respectivamente, pela absorção e pela excreção de sais e água

(Cowley & Roman, 1996).

O volume do fluido extracelular compreende o volume de fluidos contidos nos

compartimentos intersticiais, linfáticos e vasculares. A regulação do volume contido

dentro dos vasos está relacionada com o controle de um dos mais importantes

parâmetros hemodinâmicos, a pressão arterial sistêmica que deve ser mantida

dentro dos limites normais para a devida irrigação dos vários tecidos e órgãos. Além

do controle do volume intravascular circulante, a pressão arterial também pode ser

alterada por variações do tônus vascular e da força de contração cardíaca.

Sabemos que o volume do fluido extracelular é mantido através da regulação da

massa de sódio contida nesse compartimento, pois o sódio (Na+) é o cátion

osmoticamente ativo mais abundante nesse meio. Cerca de 20% do peso corpóreo

corresponde ao fluido extracelular (FEC), sendo que mais de 90% de sua

osmolaridade é devida aos sais de sódio, posto que este é um íon tipicamente

extracelular que, geralmente está acompanhado por quantidades equimolares de

cloreto (Cl-). (Macknight & cols., 1977).

Alterações na ingestão de cloreto de sódio (NaCl), ou dos mecanismos de sua

excreção através do epitélio renal, podem estar relacionadas com a gênese de

3

3

distúrbios do volume do fluido extracelular tais como a hipertensão arterial sistêmica

ou a hipotensão, entre outras doenças (Chonko & cols., 1977).

Nos rins, a excreção do NaCl filtrado pelos glomérulos depende, em grande

parte, de fatores endócrinos e parácrinos que agem sobre transportadores iônicos

presentes ao longo do néfron (Yucha & Keen, 1996). Alterações dos níveis

circulantes e locais de substâncias natriuréticas (fator atrial natriurético, bradicinina,

adenosina) e anti-natriuréticas (angiotensina, vasopressina, aldosterona, hormônios

tireóideos) estão associadas a mudanças do volume extracelular e a modificações na

atividade e na expressão dos transportadores iônicos renais (Repke & cols., 1995;

Morales & cols. 1996).

Os mineralocorticóides, que são representados primordialmente pela aldosterona,

possuem ação importante na dinâmica de transporte de Na+ no epitélio renal

diminuindo a excreção de Na+ pela urina, mas também pela saliva, pelo suor e pelas

fezes (Guyton, 1989). Em condições normais, a massa de Na+ eliminada pelo suor e

pelas fezes é desprezível, sendo os rins os principais efetores dessa excreção

(Dusing & cols., 1976). A liberação da aldosterona, produzida no córtex adrenal,

depende de um refinado controle que envolve a liberação da renina pelas células

justaglomerulares. A renina liberada age sobre o substrato angiotensinogênio,

produzido no fígado, dando origem a um decapeptídeo, a angiotensina-I que, sob a

ação da enzima conversora de angiotensina, localizada em endotélio, principalmente

pulmonar, é transformada no octapeptídeo angiotensina-II. A angiotensina II, além de

agir no rim promovendo a reabsorção de sódio no segmento do túbulo proximal,

promove no córtex adrenal a liberação da aldosterona. A aldosterona tem como

função principal estimular a reabsorção de sódio, principalmente, através dos

segmentos distais do néfron (Work & Jamison, 1987), onde promove o aumento da

4

4

permeabilidade luminal ao Na+ através de canais de sódio conhecidos como Canais

de Sódio Epiteliais (ENaC) (Garthy & Palmer, 1997) concomitantemente, à secreção

de potássio (K+) e hidrogênio (H+). A reabsorção de Na+ leva ao aumento da

osmolaridade plasmática com conseqüente estímulo à liberação e secreção do

hormônio antidiurético e a maior reabsorção de água nos túbulos distais convolutos e

ductos coletores, além de estimular a ingestão hídrica.

Por outro lado, o principal hormônio relacionado com a excreção de sódio pelos

rins é o fator natriurético atrial (FAN). Este peptídeo é produzido pelos miócitos

atriais e o estímulo para a sua liberação na corrente sanguínea é o aumento do

volume efetivo de sangue que chega aos átrios. A expansão dos átrios em situações,

como o aumento do volume do fluido extracelular, promove a liberação e a produção

do FAN pelos miócitos atriais. O fator atrial natriurético circulante tem como principal

ação inibir a reabsorção de Na+ na porção medular interna (IMCD) e medular

externa (OMCD) do ducto coletor e, desta forma, favorece a diurese (Aires, 1999).

Além disso, o FAN promove a vasodilatação sistêmica dos vasos (com exceção da

arteríola eferente), aumenta a filtração glomerular devido ao relaxamento das células

mesangiais que compõe o tufo glomerular e inibe a liberação de renina e

aldosterona.

No entanto, os hormônios tireóideos a tiroxina (3,5,3’,5’–tetraiodo-L-tironina ou T4)

e a triiodotironina (3,5,3’ - triiodo-L-tironina ou T3) (Griffin, 2000), também estão

relacionados com a regulação do volume do fluido extracelular.

Os hormônios tireóideos são conhecidos por participarem de maneira bastante

importante durante o crescimento e desenvolvimento e também por serem

hormônios envolvidos com o metabolismo (Griffin, 2000).

5

5

Por outro lado, os hormônios tireóideos também participam do controle do

equilíbrio hidroeletrolítico modulando a reabsorção de NaCl pelos rins, por aumento

ou diminuição de suas concentrações séricas (Azuma & cols., 1996). Alterações no

balanço hidroeletrolítico foram observadas em indivíduos hipertireóideos (aumento

da concentração plasmática circulante de T3 e T4) e hipotireóideos (diminuição da

concentração plasmática circulante de T3 e T4). Os efeitos da disfunção da tireóide

sobre os rins incluem mudanças no fluxo sanguíneo renal (por aumento do débito

cardíaco), ritmo de filtração glomerular (por aumento do fluxo), capacidade de

absorção e de secreção tubular (por aumento da permeabilidade paracelular),

transporte de eletrólitos (por aumento da atividade dos transportadores de Na+) e

estrutura renal (Katz, 1975; Kinsella, 1985; Davis, 1983; Baum & Quigley, 2003;

Morales & cols., 1996; Alcade & cols. 1999; Klein & cols., 2001).

A presença no rim dos receptores nucleares específicos para hormônios

tireóideos (TRα1,TRβ1 e TRβ2,) indica a existência de uma ação direta destes sobre

a função renal (Shahrara & cols., 1999). No rim, foi observado que os hormônios

tireóideos podem agir sobre a atividade e expressão da Na+/K+-ATPase, enzima

importante na reabsorção de grande massa de Na+ pelos rins (Katz & cols.,1975).

Outros transportadores renais de Na+, tais como o trocador Na+/H+, e o transportador

Na+-Pi também possuem suas atividades e expressões aumentadas no

hipertireoidismo e diminuídas no hipotireoidismo (Morales & cols., 1996; Alcalde &

cols., 1999).

Watanabe e colaboradores, utilizando a técnica de ensaio de proteção contra

RNases e “patch-clamp”, observaram diminuição da expressão do RNAm e da

atividade do canal de Ca+2 tipo L no coração de ratos hipertireóideos, o que pode

acarretar o aumento do tempo de duração do potencial da ação dos miócitos,

6

6

retardando a propagação do impulso elétrico no miocárdio, e pode originar uma

arritmia (desordem da condução do impulso elétrico no miocárdio) (Watanabe &

cols., 2003).

Como vimos até o momento, várias evidências experimentais mostram a ação de

hormônios sobre o transporte renal de Na+ que é o principal cátion osmoticamente

ativo presente no meio extracelular. Porém, o Cl- é o principal ânion do fluido

extracelular e assim, os mesmos mecanismos que controlam o transporte de Na+

devem estar relacionados com o transporte de Cl- (Hamlyn & Blaustein, 1986;

Gottschalk, 1988; Terry, 1994).

Neste trabalho será enfatizada a possível ação da aldosterona e dos hormônios

tireóideos sobre os transportadores de Cl- presentes nas células do epitélio renal. É

importante ressaltar que grande parte do Cl- filtrado pelo glomérulo é reabsorvida

juntamente com o Na+ ao longo do néfron por mecanismos ativos e passivos.

A maior parte do NaCl é reabsorvida ao longo do túbulo proximal (50 –70%). No

segmento espesso da alça de Henle ocorre a reabsorção de 20 – 25% do NaCl, e no

segmento distal há reabsorção de cerca de 5%. Ao longo do ducto coletor ocorre a

reabsorção de aproximadamente 4% do NaCl e essa porcentagem pode variar

dependendo das necessidades do organismo através da ação, principalmente, de

hormônios. Assim, menos de 1% de Cl-, filtrado pelo glomérulo, é excretado através

da urina (Gögelein, 1988; Strange & cols., 1996; Franciolini & Petris, 1990; Fong &

Jentsch, 1995).

A reabsorção de Cl- ao longo do néfron dá-se por duas vias principais: a

paracelular e a transcelular. O transporte transcelular de Cl- através do epitélio renal

acontece a favor de gradiente eletroquímico, e é mediado por proteínas existentes

tanto nas membranas luminais como nas basolaterais. Esse transporte pode estar

7

7

acoplado ao de Na+, ao de K+ ou ao de bicarbonato (HCO3-), ocorrendo também

através de canais iônicos (Rocha & Kudo, 1990; Singh & cols., 1995). Dentre os

vários transportadores de Cl- destacamos os canais que, no rim, estão presentes em

diversos tipos celulares (Jentsch & cols., 1990; Linsdell & cols., 1997; Jentsch &

cols., 2002;). Estes canais têm sido caracterizados com a ajuda de técnicas

eletrofisiológicas, bioquímicas e de biologia molecular, o que tem permitido a

compreensão de suas funções e dos fatores que os modulam (Franciolini & Petris,

1990; Fong & Jentsch, 1995; Strange & cols., 1996 & Gögelein, 1998).

Neste trabalho, dentre os diversos canais de cloreto presentes no rim,

destacamos um canal bastante expresso ao longo do epitélio renal e que não possui

função fisiológica totalmente esclarecida neste órgão, o canal de cloreto ClC-2. O

ClC-2 foi primeiramente associado ao desenvolvimento pulmonar fetal (Murray &

cols., 1995) e, posteriormente, à participação na regulação do volume celular

(Thiermann & cols.,1992).

I-2) A família CLC de canais de cloreto

O ClC-2 é um canal de cloreto pertencente à família CLC de transportadores que

foram identificados pela equipe do Dr. Thomas Jentsch no início da década de 90

(Jentsch & cols., 1990). O primeiro canal desta família foi clonado a partir do órgão

elétrico do peixe Torpedo denominado de ClC-0; em mamíferos, apresenta a

expressão bastante abundante no músculo esquelético, onde participa da

estabilização da voltagem celular.

Os membros da família CLC foram encontrados em diferentes espécies, tais

como, bactérias, leveduras, plantas e animais invertebrados e vertebrados.

Atualmente, já foram encontrados nove subtipos de genes da família CLC em seres

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8

humanos. Os canais pertencentes à família CLC podem estar expressos no mesmo

tecido, simultaneamente, tal como ocorre com o ClC-2, ClC–3, ClC-4, ClC-5, ClC-6 e

ClC-7, enquanto outros, tais como o ClC-1 e o ClC-Kb estão expressos de maneira

específica em alguns tecidos de mamíferos (Thiermann & cols., 1992; Wills e cols.,

2000; Maduke & cols., 2000). Os canais de Cl- dependentes de voltagem regulam a

passagem transcelular do Cl-, participando de várias funções incluindo-se a

regulação de volume celular (através de estrita regulação da concentração

intracelular de íons), a estabilização do potencial de membrana e a transdução de

sinal elétrico. As mutações nos genes da família CLC têm sido associadas a várias

doenças como as miotonias, síndrome de Bartter do tipo III, Doença de Dent,

nefrolitíase recessiva ligada ao cromossomo-X e diabetes insípidus.

O canal ClC-1, abundantemente expresso em músculo esquelético, está

associado à forma recessiva e dominante de miotomia (ou distrofia muscular) (Pusch

& Jentsch, 1994; Jentsch & Grünther, 1997). Acredita-se que a causa da miotonia

distrófica, pelo menos em parte, é devida a uma anormalidade ou redução na

expressão dos canais de cloreto ClC-1 das células musculares (Mandoki & cols.,

2002). A disfunção nos canais de cloreto aumenta o tempo de relaxamento muscular

após uma contração voluntária causando sucessivos disparos de potenciais de ação

levando as fibras musculares a um estado de hiper-excitabilidade.

O canal ClC-K, apresenta-se exclusivamente expresso no rim e trato urinário,

sendo as isoformas ClC-K1 e ClC-K2 encontrados em epitélio renal de rato e as

isoformas ClC-Ka e ClC-Kb encontrados em humanos, e podem estar envolvidos na

fisiologia e fisiopatologias renais. A equipe do Dr. Simon (Simon & cols., 1997),

através do uso de técnicas de biologia molecular, descobriu o envolvimento de

mutações do ClC-Kb com o surgimento da síndrome de Bartter do tipo III, que tem

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como características principais à perda urinária de sal, alcalose hipocalêmica e a

hipotensão.

A função fisiológica do canal ClC-K1 foi estudada em modelos de camundongos

com mutação inativante neste gene. Os camundongos homozigotos são

aparentemente normais, porém produziram cinco vezes mais urina que os

camundongos heterozigotos e os normais. Estes camundongos homozigotos,

quando submetidos à privação de água por 24h sofreram severa desidratação, com

perda de 27% do peso corporal, e após receberem um agonista da vasopressina (ou

hormônio antidiurético) via intraperitoneal, apresentaram um mínimo aumento na

osmolaridade da urina, um quadro bastante parecido com o apresentado no diabete

insípidus nefrogênico (Matsumura & cols., 1999).

O ClC-5, a princípio, acreditava-se estar expresso exclusivamente no rim, porém

ele foi encontrado, também, em epitélio de vias aéreas, da retina, da aorta e em

células de músculo liso (Silva & cols., 2000; Wills & cols., 2000). A função do canal

ClC-5 tem sido estudada em camundongos nocautes para o gene do ClC-5, que

apresentam fenótipo similar a Doença de Dent (caracterizada por proteinúria de

baixo peso molecular, calciúria e formação de cálculos renais em humanos) ou

nefrolitíase hereditária. Porém, os mecanismos fisiológicos que resultam nesta

síndrome ainda não estão bem estabelecidos (Silva & cols., 2000; Waldegger &

Jentsch, 2000; Wills & cols., 2000).

O canal de cloreto ClC-7 está presente em tecidos diferentes, porém, em

contraste com os demais membros de sua família, encontra-se principalmente em

membranas de organelas intracelulares tais como os lisossomos e os endossomos

(Kornak & cols., 2001). Sua deficiência está associada ao aumento da deposição de

cálcio nos ossos, pois as células do tecido ósseo ficam incapazes de realizar a

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reabsorção óssea (Pusch & Jentsch, 1994; Jentsch & Grünther, 1997). Kornak e

colaboradores (2001), construíram um camundongo que possui uma mutação

inativante no gene ClC-7 que apresentou todas as características de osteopetrose,

doença caracterizada pelo aumento generalizado da densidade óssea devido à

deficiência do processo fisiológico de sua reabsorção (Smith, 1982). Além disso, este

camundongo, devido a essa deficiência, não forma medula óssea capaz de produzir

células hematopoiéticas. Também foram realizados estudos em lisossomos de

osteoclastos (células do tecido ósseo responsáveis pela reabsorção óssea) destes

camundongos mutantes para ClC-7, e foi observado que esses osteoclastos foram

incapazes de acidificar o espaço extracelular. A prova cabal do envolvimento do ClC-

7 com a osteopetrose ocorreu com os estudos que demonstraram mutações no gene

ClC-7 em pacientes portadores de osteopetrose maligna infantil (Kornak & cols.,

2001).

No entanto, alguns destes canais como, o ClC-3, o ClC-4, o ClC-K2 e o ClC-2 não

possuem funções fisiológicas completamente elucidadas (Jentsch & cols., 1995).

I-3) O canal de cloreto ClC-2

Através das técnicas de “northen blotting” e imuno-histoquímica, foi possível

observar que o canal de cloreto ClC-2, alvo de nosso estudo, é abundante em

diversos tecidos, tais como: músculo esquelético, coração, cérebro, pulmão,

pâncreas, rim, estômago e intestino (Landry & cols., 1989). Além disso, a localização

deste canal de Cl- em células polarizadas pode ser tanto nas membranas apicais

quanto nas basolaterais (Thiemann & cols., 1992). Dr. Thiemann e colaboradores,

em 1992, através de métodos envolvendo biologia molecular e imuno-histoquímica,

mostraram que este canal possui uma expressão bastante abundante no rim, tanto

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de seu RNAm quanto da sua proteína correspondente. A proteína correspondente ao

gene ClC-2 é um homodímero de 99 KDa que possui 907 aminoácidos (Jentsch &

Grünther, 1997). A estrutura molecular, atualmente aceita, descreve uma proteína

composta por onze domínios transmembranais, um domínio extracelular e um

domínio intracelular sendo que suas porções tanto amino quanto carboxi-terminais

encontram-se no citoplasma (Figura 1) (Jentsch & Grünther, 1997; Wills & Fong,

2001). No entanto, alguns autores divergem sobre a exata posição do quarto

domínio da proteína do ClC-2. Enquanto uns postulam que este domínio esteja

inserido na membrana plasmática (Jentsch & cols., 1990) outros sugerem que esteja

presente extracelularmente (Schmidt-Rose & Jentsch, 1997), porém a exata

localização deste domínio ainda não foi determinada.

O ClC-2 possui características moleculares e eletrofisiológicas distintas que o

identificam. Dentre as principais características eletrofisiológicas desse canal

podemos citar a maior permeabilidade ao cloreto em relação aos outros íons

halogênios, tais como o brometo e o iodeto (Cl>>Br >I) (Pusch & Jentsch, 1994).

Experimentos envolvendo técnicas eletrofisiológicas de “patch-clamp” mostraram que

o canal de cloreto ClC-2 tem uma condutância de 2 a 3 pS (pico Siemens) para o Cl-

(Lorenz & cols., 1996) e essa condutância está vinculada à região N-terminal

(Gründer & cols., 1992b). Esses autores, ainda sugeriram, através desse

experimento, que o mecanismo de abertura e inativação do ClC-2 pode ser

dependente de um domínio N-terminal que se ligaria como uma “bola” na alça

citoplasmática entre as regiões transmembranais D7 e D8 (Para melhor

compreensão ver figura 2). Este modelo seria semelhante ao proposto para os

canais de potássio, onde o domínio citoplasmático funciona como uma bola aderida

a uma corrente que ao ser movimentada pode bloquear e desbloquear o canal

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(modelo conhecido como “ball-and-chain”) (Hoffmann & Simonsen, 1989; Gründer &

cols., 1992a; Jentsch & cols., 1995).

ClC-2

Figura 1: Figura representativa do modelo atualmente aceito para a

proteína correspondente ao canal de cloreto ClC-2 e sua disposição na

membrana plasmática (Wills & Fong, 2001).

Figura 2. Provável conformação de abertura e fechamento do canal de cloreto ClC-2. Molecular Biology of the Cell ed 4th.

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O ClC-2 também pode ter 50% de sua condutância bloqueada por alguns dos

conhecidos inibidores de canais de cloreto tais como o ácido carboxílico antracênico

(9-AC) e o difenilaminocarboxilato na concentração de 1mM. Porém, o DIDS (ácido

2, 2’ disulfônico – 4, 4’ diisotiociano), outro conhecido bloqueador de condutâncias

de Cl-, na concentração de 1mM, não provoca alteração da condutância do ClC-2

(Thiermann & cols., 1992). Outra característica da corrente elétrica gerada pela

permeabilidade ao Cl- através do ClC-2 é a linearidade da relação entre corrente e

voltagem quando células são submetidas a voltagens menores de –50 mV. Acima de

–50 mV não há aumentos consideráveis de corrente através do canal e, portanto,

não obedece ao padrão linear. Esse padrão é mantido quando células são

submetidas a meios hipotônicos (Gründer & cols., 1992a).

Outra característica do ClC-2 é o comportamento de sua condutância que pode

ser estimulada pelo aumento do volume celular, pela diminuição do pH no meio

extracelular, pela hipotonicidade, pela hiperpolarização ou pelo aumento das

concentrações intracelulares de cloreto (Jentsh & cols., 1999).

Foi observado, através de clampeamento de voltagem realizado em oócitos de

“Xenopus” injetados com RNAm do ClC-2 de rato, que a condutância do ClC-2 em

situação de hiperpolarização se mostra aumentada em voltagens bastante negativas

(entre -90 mV e -180 mV) (Thiermann & cols., 1992). No entanto, estes valores estão

fora dos padrões fisiológicos e o ClC-2 tenderia a estar sempre fechado. Dessa

forma, sugeriram-se outras formas de estímulo ao aumento da condutância por este

canal.

A condutância ao cloreto pelo ClC-2 encontrava-se aumentada em oócitos de

Xenopus injetados com RNAm do ClC-2 de ratos quando esses foram submetidos a

um banho com solução hipotônica (Gründer & cols., 1992a). A condutância ao

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cloreto, através do ClC-2, também se mostrou aumentada quando oócitos que

expressavam o ClC-2 murino foram submetidos a pH ácidos (6,5 e 7,0). Porém,

quando os oócitos que expressavam o ClC-2 murino foram submetidos a pHs mais

alcalinos (8,0 e 8,5) a condutância através do ClC-2 mostrou-se inibida em relação

ao controle submetido ao pH de 7,5 (Jordt & Jentsch, 1997). Estes experimentos

foram realizados dentro da mesma faixa de voltagem fisiológica do experimento

realizado por Gründer e colaboradores.

Assim, a abertura do canal pode ser induzida em valores de voltagem

considerados dentro da faixa fisiológica. Logo, é plausível considerar o ClC-2 como

tendo papel relevante ao longo do epitélio renal o qual é constantemente submetido

a variações tanto de voltagem transepitelial quanto de pH.

A ativação do ClC-2, em presença pH ácido, dependente da fosforilação por

PKA foi observada em epitélio renal de humano e coelhos, mas não em epitélio de

ratos (Cuppoletti & cols., 2004).

Murray e colaboradores sugeriram um possível papel fisiológico para o ClC-2

quando observaram que a proteína localizava-se ao longo da superfície apical das

vias aéreas fetais de rato era abundante do meio até o final da gestação, no entanto,

diminuía bruscamente após o nascimento. Devido à sua localização apical e

abundância no epitélio pulmonar, o ClC-2 pode estar envolvido na secreção de fluido

durante a morfogênese normal do pulmão. Os estudos por eles realizados

demonstram a importância do ClC-2 no desenvolvimento embrionário dos pulmões

de ratos (Murray & cols., 1995).

Huber e colaboradores (1998) mostraram a importância do ClC-2 no

desenvolvimento do sistema urinário através de técnicas de biologia molecular em

cultura primária de células de ducto ureteral e ducto coletor cortical de diferentes

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estágios embrionário e pós-natal de ratos. Eles observaram que o RNAm para o

ClC-2 aumentou entre o estágio embrionário do dia 15 até o dia 17, ocorrendo um

pico da expressão do RNAm do ClC-2 entre o dia 17 do estágio embrionário e o dia 3

após o nascimento, e ainda que o RNAm diminui entre os dias 3 e 6 após o

nascimento, sugerindo a participação do ClC-2 na morfogênese de estruturas do

sistema urinário.

Em experimentos de ensaio de “Whole-Cell Patch-Clamp” realizados em

culturas de células IB3-1 (células epiteliais imortalizadas oriundas das vias

respiratórias de pacientes com fibrose cística) transfectadas com o gene do ClC-2,

foi possível observar que as variações de pH e tonicidade estimularam o transporte

de Cl- pelo ClC-2 (Schwiebert & cols., 1998). Este trabalho sugeriu que o canal de

cloreto ClC-2 poderia ser uma possível via alternativa no tratamento da doença

pulmonar denominada fibrose cística que é causada pela mutação de um outro canal

de cloreto pertencente à família ABC de transportadores (ATP binding cassete

proteins). Em camundongos nocautes para ambos os genes, CFTR e ClC-2,

surpreendentemente, não há piora das alterações que normalmente são encontrados

nos tecidos severamente afetados pela doença fibrose cística. E, ao contrário do

esperado, estes animais sobreviveram por mais tempo que os animais com

disfunção somente para o gene do CFTR (Zdebik & cols., 2004).

Outros experimentos, agora utilizando, células da linhagem CaCo-2 (células de

carcinoma de cólon humano) demonstraram que o ClC-2 é capaz de contribuir para a

secreção de Cl- no epitélio intestinal humano. As células da linhagem CaCo-2 foram

transfectadas com RNAm antisense do ClC-2 (fitas antisense de RNAm tem a

capacidade de inibir a tradução do produto normal de RNAm da célula) e, após

análise por “patch clamp”, exibiram menor secreção de Cl-. Neste mesmo trabalho,

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através de microscopia confocal, foi possível demonstrar que o ClC-2 está localizado

na membrana apical das células epiteliais do intestino (Mohammad-Panah & cols.,

2001).

Também foi evidenciado que o ClC-2 pode influenciar na concentração

citoplasmática de Cl- em neurônios, e influenciar nos potenciais de ação neuronais,

especulando-se que o funcionamento inadequado deste canal causaria epilepsia,

embora os animais nocautes para ClC-2 não apresentem convulsões. No entanto a

mutação do ClC-2 foi encontrada em três famílias que apresentavam o distúrbio. Em

astrócitos de camundongos nocautes para ClC-2, a corrente de Cl- foi abolida,

mostrando que esse canal pode ser importante na função no sistema nervoso

(Nobile & cols., 2000).

A evolução das técnicas de biologia molecular tem auxiliado na determinação do

real papel dos diversos genes. A construção de um camundongo nocaute para o

gene do ClC-2 pelo grupo de Bösl, em 2001, tem auxiliado na caracterização do

papel do ClC-2 no organismo. Os animais nocaute para o ClC-2 são viáveis,

possuem desenvolvimento normal, são férteis, apresentam concentrações hormonais

idênticas às dos animais selvagens e não mostram alterações físicas ou qualquer

alteração de comportamento (Bösl & cols., 2001). Também foram avaliadas, nesses

animais as concentrações séricas dos diferentes eletrólitos, com as concentrações

séricas de marcadores de função renal, pancreática e hepática. Todos esses

parâmetros mostraram-se normais, comparáveis aos encontrados nos animais

selvagens. Entretanto, há duas alterações que são mais pronunciadas em animais

nocautes do ClC-2: as degenerações dos túbulos seminíferos, assim como

diminuição do calibre desses túbulos, apesar de apresentarem espermatogênese

normal até a terceira semana de vida; e uma intensa e rápida degeneração das

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células fotorreceptoras da retina, o que leva os animais à cegueira 30 dias após o

nascimento.

Isoformas do ClC-2 podem ser vias alternativas de transporte de Cl- em alguns

tecidos. A formação de “splicing” alternativos é uma opção de transportadores

provindos do mesmo gene com algumas funções alteradas. Um “splicing” alternativo

do ClC-2 menor em 20 pb (10 aminoácidos), comparado com o ClC-2 nativo, foi

identificado em intestino de porco. As diferenças funcionais entre ambos foram

detectadas por expressão heteróloga em células HEK-293 (linhagem de células

imortalizadas embrionárias de rim), sendo observado uma diferença na desativação

do canal. O canal truncado é mais rápido no transporte de Cl- porque possui uma

modificação no seu domínio NH2-terminal o que parece alterar seu funcionamento

(Cid & cols., 2000). Um outro “splicing” alternativo do ClC-2, identificado no coração

de rato (Britton & cols., 2005), tem menos 45pb (15 aminoácidos) e tem propriedades

cinéticas muito similares ao ClC-2 nativo.

I-4) Problemática 1: Seria o canal de cloreto ClC-2 modulado pela

aldosterona em rins de ratos?

A maior parte de NaCl filtrado nos glomérulos é reabsorvida ao longo dos vários

segmentos do néfron, sendo que nos túbulos proximais, distais e alça de Henle a

reabsorção de NaCl é proporcional à quantidade filtrada. Em contrapartida, ao longo

do sistema coletor, composto pelas porções cortical, medular externa e medular

interna, a reabsorção de NaCl é dependente de uma fina regulação hormonal e tem

papel muito importante na manutenção da volemia (Reineck & Stein, 1997). Essa

regulação se dá através de vários hormônios, dentre os quais destaca-se o papel da

aldosterona, que atua aumentando a reabsorção renal de Na+. A liberação deste

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hormônio pelo córtex da adrenal depende, principalmente, do sistema renina-

angiotensina (Aires, 1999). O estímulo para a liberação de renina após a ativação do

sistema renina-angiotensina nas células renais ocorre em estado de hipovolemia (por

percepção de baixa pressão de perfusão renal) e também por estímulos do sistema

nervoso autônomo agindo de maneira direta sobre as células justaglomerulares

através de sinapses (Barajas & Muller, 1973, Barajas e Wang, 1979).

O aparelho justaglomerular é responsável pela liberação de renina e é formado

pelas células que compõem a parede da arteríola aferente e pelas células da parede

do túbulo distal. Estas células formam um sincício, devido à presença junções

comunicantes na membrana plasmática, permitindo a interligação entre seus

citoplasmas (Barajas, 1979). Duas teorias são utilizadas para explicar os

mecanismos de liberação de renina pelo aparelho justaglomerular: a teoria da

sobrecarga de sal no túbulo distal e a teoria do receptor de estiramento. Segundo a

primeira teoria, a diminuição na carga de NaCl que chega no túbulo distal, onde as

células são sensíveis a alterações da concentração de Na+, sensibiliza as células

justaglomerulares a liberarem renina. Já a teoria do receptor de estiramento defende

que as células da arteríola aferente (células justaglomerulares) são sensíveis a

variação da volemia, e, portanto, ao estiramento das paredes do vaso, liberando

renina após este estímulo (Fray, 1976).

A renina liberada na circulação age sobre um pré-pró-hormônio denominado

angiotesinogênio, produzido e secretado, principalmente, pelas células do fígado.

Este é clivado e transformado no pré-hormônio, angiotensina I que ainda não tem

atividade biológica potente quando comparada com seu subproduto, a angiotensina

II. A angiotensina II surge da clivagem da angiotensina I pela enzima conversora de

angiotensina (ECA), presente em grande abundância no epitélio pulmonar. A

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angiotensina II, além de agir de maneira sistêmica nos receptores presentes na

musculatura lisa dos vasos levando à vasoconstricção, é responsável pela liberação

de aldosterona pelas células da glândula adrenal, na zona glomerulosa, através de

ação sobre receptores específicos de membrana, AT1.

O principal sítio de ação da aldosterona corresponde aos segmentos

ascendentes grosso da alça de Henle (TAL) (Work & Jamison, 1987), túbulo distal

(DT) e ducto coletor (CD) (Schwartz & Burg, 1978), onde leva ao aumento na

reabsorção do íon Na+ (Malnic & cols., 1966). Isso se deve primeiramente pela

ação da aldosterona sobre a atividade dos ENaCs existentes na membrana luminal

dos segmentos distais do néfron (Canessa e cols., 1994). O aumento da

permeabilidade dos EnaCs e o conseqüente aumento das concentrações

intracelulares de Na+ estimulam a atividade das Na+/K+-ATPases localizadas nas

membranas basolaterais e, portanto, a reabsorção de Na+ (Palmer e cols., 1990).

Numa etapa posterior a aldosterona estimula a transcrição dos genes codificadores

tanto dos canais de sódio quanto da Na+/K+-ATPase (Horisberger & Rossier, 1992).

Nasemann e colaboradores, em 1987, através de técnicas de microperfusão em

ductos coletor cortical isolado de coelhos recém-nascidos, observaram que a

reabsorção de cloreto foi estimulada após tratamento com aldosterona, no entanto,

quando o néfron tornou-se maduro este efeito foi reduzido, porém continua presente

(Nasemann & cols., 1987). Em ratos adrenalectomizados foi observada uma redução

significativa no fluxo de NaCl em segmento medular espesso da alça de Henle

quando eles foram comparados com animais normais ou com aqueles que foram

adrenalectomizados e que receberam reposição de aldosterona via intra-peritoneal

nas doses de 5 µg/100 g P/C dia, consideradas fisiológicas (Martin & cols., 1983,

Work & Jamison, 1987). A ação da aldosterona sobre o transporte de Cl- em néfron

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20

distal foi analisada em células imortalizadas de ducto coletor cortical. Estas células

expressam os genes para os canais de sódio sensíveis a amiloride e para os canais

de cloreto tais como o CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).

A adição de aldosterona ao meio de cultura destas células durante 24h, estimulou a

corrente de curto-circuito e o fluxo de Na+ do lado apical da membrana para o lado

basal, que foi aproximadamente três vezes maior que em células não tratadas

(Duong & cols., 1998).

Porém, até o presente momento pouco é sabido sobre as bases moleculares do

transporte de Cl- modulado pela aldosterona no rim.

I-5) Problemática 2: Seria a expressão gênica do canal de cloreto ClC-2

modulada pelos hormônios tireóideos em rins de ratos?

É sabido que vários hormônios podem modular o transporte de sódio ao longo

do néfron, os quais estão envolvidos com o aumento (natriurese) e redução (anti-

natriurese) de excreção de NaCl e, conseqüentemente de água na urina. Em

situações de redução de volume são desencadeados, principalmente, efeitos anti-

natriuréricos que envolvem o sistema renina-angiotensina-aldosterona, destacando-

se a angiotensina II e a aldosterona. O efeito diurético ocorre em situação de

expansão de volume. O principal fator natriurético envolvido é o FAN. Esse peptídeo

é liberado na circulação quando os miócitos atriais são distendidos sendo que este

peptídeo promove a diminuição da pressão sistêmica pelo seu efeito vasodilatador

além de favorecer a excreção renal de sódio através do bloqueio de canais de Na+

no ducto coletor renal (Reineck & Stein, 1997). No entanto, há evidências que outros

hormônios estão relacionados com a modulação do volume do fluido extracelular

(VFEC), além dos clássicos citados acima. Os hormônios tireóideos têm sido

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21

relacionados com várias alterações da função renal, inclusive influenciando a

excreção de Na+ na urina. Essas alterações foram observadas principalmente

quando os hormônios tireóideos apresentam-se acima ou abaixo das concentrações

plasmáticas consideradas normais (Katz & cols., 1975).

Experimentos realizados em ratos infundidos com doses fisiológicas (2,5 ng/

100g – PC.dia) de T3 e T4 marcado com iodo radioativo (I125) permitiram a

visualização da distribuição dos hormônios tireóideos em diversos órgãos através da

técnica de cromatografia líquida de alta e baixa pressão (HPLC E LPLC). O rim

recebeu cerca de 0,2% por 100g/PC da carga total de T3 e T4 circulantes no plasma

sanguíneo provavelmente, por apresentar uma alta taxa metabólica (Nguyen & cols,

1993). Essa demanda metabólica é necessária para que o rim realize suas funções,

por exemplo, a manutenção da volemia através da reabsorção da carga de NaCl ao

longo do néfron, a favor de um gradiente eletroquímico, dependente de energia,

gerados pela presença da Na+/K+-ATPase na membrana basolateral das células do

túbulo renal.

Está bem estabelecida a alteração no balanço hidroeletrolítico que ocorre em

indivíduos com hipertireoidismo (caracteriza-se pelo aumento da concentração

plasmática circulante de T3 e T4) ou hipotireoidismo (caracteriza-se pelas baixas

concentrações plasmáticas de T3 e T4 circulantes ou pelo defeito na ligação dos

hormônios tireóideos aos seus respectivos receptores: síndrome da resistência ao

hormônio tireóideo).

A função renal de pacientes hipertireóideos apresenta alterações

hemodinâmicas ligadas a alterações do fluxo sanguíneo que geralmente apresenta-

se aumentado (Aas & Blegen, 1949). Por esse motivo observa-se, nesses pacientes,

um aumento do ritmo de filtração glomerular e do fluxo plasmático renal (Ford &

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cols., 1961). A capacidade de transporte tubular também se apresenta maior tanto

para secreção, como acontece com o transporte de para-amino-hipurato de sódio,

quanto para reabsorção tendo como exemplo o transporte de glicose no túbulo

proximal (Eiler & cols., 1944; Ford & cols., 1961).

As alterações encontradas na função renal no hipotireoidismo são, geralmente,

opostas àquelas observadas no hipertireoidismo, com exceção da retenção de sódio

que ocorre em ambos os casos, porém por motivos diferentes. Enquanto o aumento

da massa corporal de Na+ no hipotireoidismo é atribuído principalmente à diminuição

do ritmo de filtração glomerular, em conseqüência da diminuição da perfusão renal

(White & cols., 1947; Aikawa, 1956; Ford & cols., 1961), no hipertireoidismo ocorre o

aumento da reabsorção tubular de Na+, como discutido anteriormente.

Os parâmetros relacionados com a função renal de 77 pacientes hipertireóideos,

tratados e não tratados foram analisados. Os pacientes não tratados apresentaram

uréia sanguínea elevada e diminuição na creatinina sérica. O tratamento dos

pacientes que restaura ao estado de eutireoidismo acompanha a normalização dos

níveis séricos avaliados. O RFG apresentou um leve aumento mas não significativo

nos pacientes hipertireóideos. Também foi observado o aumento significativo da

atividade plasmática da renina nos hipertireóideos, provavelmente, em conseqüência

a transpiração excessiva e freqüente defecação que leva a depleção de volume

corporal (Shirota & cols., 1992).

Os achados em seres humanos são corroborados em experimentos realizados

com animais. Em 1985, Capasso e colaboradores utilizaram ratos induzidos ao

hipotireoidismo por tireoidectomia e ratos tireoidectomizados com reposição

hormonal de T3 por três dias ou 10 dias (10µg/Kg PC.dia), e através da técnica de

microperfusão analisou a taxa de reabsorção do fluxo luminal em túbulo proximal,

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(maior sítio de reabsorção de fluido tubular do néfron). A taxa de reabsorção no

túbulo proximal de ratos tratados com reposição de hormônios tireóideos teve um

aumento de aproximadamente 65% em relação aos ratos hipotireóideos. Os rins

destes mesmos animais após os estudos in vivo foram extraídos e transformados em

preparação de membranas isoladas de borda luminal (membrana borda em escova).

Estas membranas tiveram a permeabilidade ao Na+ estudadas na presença de Na+

marcado com isótopo radioativo no meio de incubação, onde foi observado um

pequeno aumento não significativo da permeabilidade luminal, o que pode indicar o

estímulo dos hormônios tireóideos sobre a atividade da Na+/K+ ATPase presente na

membrana basolateral. Essa conclusão foi baseada no fato de que a Na+/K+ ATPase

é responsável pela formação do gradiente eletroquímico que torna favorável a

entrada de Na+ pela membrana luminal.

O RNAm e a proteína correspondente à Na+/K+ ATPase em ratos hipotireóideos

com reposição de tri-iodotironina aumentaram significativamente em relação aos

ratos hipotireóideos (McDonough & cols., 1988). Também foram observados o

aumento das subunidades catalíticas α e β da Na+/K+ ATPase em rins de ratos

submetidos à reposição hormonal de T3 em relação aos hipotireóideos. Esses

experimentos sugeriram que a atividade da enzima, e não somente a sua expressão,

é estimulada pelo hormônio tireóideo.

DiBartola e colaboradores (1996) observaram, em gatos hipertireóideos, o

aumento do fluxo plasmático renal e do ritmo de filtração glomerular em relação a

gatos normais medindo os "clearances" de para-amino-hipurato de sódio e de

creatinina. Este efeito foi atribuído ao aumento do débito cardíaco mediado pelo

hormônio tireóideo e pela vasodilatação intra-renal. O tratamento destes gatos

hipertireóideos com metimazol (agente farmacológico que inibe a síntese e a

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secreção de hormônios tireóideos) ou por tireoidectomia reverteu os efeitos

observados.

Azuma e colaboradores (1996) estudaram em túbulo proximal de ratos o

envolvimento dos hormônios tireóideos sobre a expressão de quatro isoformas

(NHE1, NHE2, NHE3 e NHE4) do trocador Na+/H+ (abundantemente expressos na

membrana luminal das células do túbulo renal). Estudos envolvendo a técnica de

“northen blot” indicaram que o RNAm das isoformas NHE2 e NHE3 presente no

túbulo proximal do rim dos animais hipertireóideos apresentaram aumento

significativo em relação aos animais hipotireóideos. Por outro lado, as isoformas

NHE1 e NHE4 não apresentaram diferença significativa da expressão de seus

RNAms entre os grupos estudados.

A ação dos hormônios tireóideos sobre a permeabilidade dada pelo trocador

Na+/H+ foi avaliada através de técnicas de microperfusão in vivo em túbulo proximal

e distal por Morales e colaboradores, em 1996. Os ratos foram induzidos ao

hipotireoidismo por tireoidectomia e comparados a ratos falsamente operados. O

parâmetro analisado foi à cinética de acidificação no túbulo proximal, onde foi

observado que a reabsorção de HCO3-, bem como o pH intratubular apresentaram

tendência a diminuição, porém não significativa, em ratos tireoidectomizados.

Enquanto o tempo de acidificação tubular tanto proximal quanto distal aumentou

significativamente em ratos hipotireóideos. Esses dados sugeriram uma menor

expressão do trocador Na+/H+ , principalmente em túbulos proximais de animais

hipotireóideos.

Outros autores mostraram a diferença da ação renal dos hormônios tireóideos

entre animais jovens e velhos através do estudo da expressão do RNAm e da

proteína correspondente ao co-transportador Na+/Fosfato. Ambos os grupos de ratos

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foram tireoidectomizados e divididos em subgrupos que receberam reposição

hormonal com doses fisiológicas e supra-fisiológicas. Os ratos, jovens e velhos,

tireoidectomizados apresentaram redução significativa da expressão gênica do

trocador Na+/Fosfato. Quando foi administrada dose supra-fisiológica em ambos os

grupos (jovens e velhos) houve aumento significativo da expressão do co-

transportador em túbulos proximais. No entanto, os ratos velhos com reposição

hormonal, apesar de responderem ao estímulo, apresentaram menor resposta ao

estímulo por hormônio tireóideo do que ratos jovens.

Todos esses dados, apresentados anteriormente, estão de acordo com o fato de

que o rim apresenta as isoformas mais conhecidas de receptores nucleares

específicos para hormônios tireóideos (TRα1 e TRβ1) (Shahrara & cols., 1999).

Possivelmente, há ação direta destes hormônios sobre as células do tecido renal.

Até aqui vimos que são bem estudadas as ações dos hormônios tireóideos

sobre transportadores de Na+. Porém, o íon Cl- é o principal co-íon do Na+ (Hamlyn &

Blaustein, 1986; Terry, 1994). Assim, seria válido postular que os mesmos

mecanismos que modulam o transporte de Na+ também estariam modulando o

transporte transcelular de Cl- (Gottschalk, 1988), já que grande parte do Cl- filtrado

pelo glomérulo é reabsorvida juntamente com o Na+ ao longo do néfron por

mecanismos ativos e passivos.

Dentre os vários transportadores de Cl- existentes ao longo do néfron propomos

estudar a influência dos hormônios tireóideos, da aldosterona e das dietas ricas em

NaCl sobre a expressão do ClC-2 em rim de rato.

I-6) Problemática 3: Estaria o receptor de hormônio tireóideo do tipo β

envolvido na expressão gênica do canal de cloreto ClC-2 em rins de ratos?

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Os efeitos dos hormônios tireóideos são mediados através de receptores de

hormônios tireóideos (TRs). Os TRs foram identificados em 1986, como um produto

do proto-oncogene c-erbA, o precursor celular do oncogene viral erbA (Weinberger &

cols.,1986). Os TRs são membros da superfamília dos receptores nucleares, os

quais funcionam como fatores de transcrição dependentes de ligantes (Mangelsdorf

& cols., 1995). Estes TRs ligam-se a seqüências especificas no DNA chamadas de

elementos responsivos ao hormônio tireóideo (TRE). As seqüências TREs,

geralmente, estão localizadas na região promotora dos genes alvo e são especificas

para cada receptor. Os TREs possuem duas cópias de um hexanucleotídeo que

podem ser arranjadas em diferentes orientações (AGGTCA N AGGTCA; sendo N o

número de bases nucleotídicas que separa cada hexâmero) (Ribeiro & cols.,1998).

Os TRs ligam-se as seqüências TREs na forma de monômeros, homodímeros

(TR/TR) ou, preferencialmente, heterodímeros (TR/RXR) formados por associação a

outro membro da superfamília de receptores nucleares, o receptor de ácido retinóico

(RXR) (Glass, 1994). (Figura 3).

Os membros da superfamília de receptores nucleares exibem uma estrutura

com três principais domínios: amino-terminal, de ligação ao DNA (DBD) e de ligação

ao ligante (LBD), e uma pequena região que conecta o DBD ao LBD que forma uma

dobradiça chamada de “hinge” (Ribeiro & cols.,1998). (Figura 4).

Em mamíferos, dois genes distintos, o TRα e o TRβ, codificam diferentes

proteínas (TRα1, TRα2, ∆TRα1, ∆TRα2, TRβ1, TRβ2, TRβ3 e ∆TRβ3) que são

resultado do processamento alternativo do RNAm (“splicing” alternativo) ou da

utilização de promotores alternativos no ato da transcrição do gene (Figura 5). Os

TRs ligam-se ao DNA mesmo na ausência do ligante. O complexo TR-DNA sem a

presença de T3 associa-se a outras proteínas conhecidas como correpressores

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porque atuam reprimindo a transcrição gênica. As proteínas correpressoras

interagem com as histonas desacetilases que impedem o “desenrolar” da fita de

DNA, portanto, compactam a cromatina na região promotora e inibem a maquinaria

de transcrição basal. Na presença do ligante, o complexo TR-DNA dissocia-se dos

correpressores e associa-se a proteínas co-ativadoras que interagem com as

histonas acetil-transferases que atuam hiperacetilando a fita de DNA, relaxando a

cromatina. Portanto, facilita o acesso dos fatores transcricionais, estimulando a

transcrição gênica (Figura 6).

Os TRs medeiam as ações de T3, assim como, mantêm as concentrações do

hormônio em níveis plasmáticos constantes através da alça de regulação do eixo

hipotálamo – pituitária – tireóide. Os hormônios tireóideos fazem uma alça negativa

de regulação na pituitária e no hipotálamo inibindo a síntese e secreção do hormônio

estimulante da tireóide (TSH) e do hormônio liberador de tireotrofina (TRH),

respectivamente (Lezoualc’h & cols., 1992).

A presença de mutações no TRβ o impede de ligar-se à molécula do T3. Estas

mutações geralmente ocorrem no domínio de ligação ao ligante (LBD), sendo que já

foram identificadas em seres humanos mais de 100 mutações diferentes em TRβ1.

O receptor mutado mantém a propriedade de se ligar à região TRE no DNA,

porém, o T3 não se liga ao receptor. Além disso, o receptor mutado permanece ligado

a fatores correpressores exercendo um efeito dominante negativo, que é

característica da mutação ∆337T utilizada neste trabalho, interferindo com a ação do

receptor normal. Os animais com mutação no TRβ apresentam tanto sinais de

hipotireoidismo, como sinais de hipertireoidismo porque a quantidade de receptores

de hormônios tireóideos nos tecidos não é uniforme, ressaltando que há

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predominância do TRα em coração e músculos esqueléticos e TRβ em rim, fígado e

cérebro (Flamant & Samurat, 2003; Willians, 2000; Lazar, 1993).

Figura 3: Ligação dos receptores de hormônios tireóideos, (TR) a seqüência especificas do DNA, formando homodímeros (A) ou heterodímeros com o receptor de ácido retinóico (B). Adaptado de Barra & cols, 2004.

TR A

B

Figura 4: Estrutura primária representando os domínios funcionais dos receptores nucleares: Domínio amino-terminal (NH2-t), domínio de ligação ao DNA (DBD), dobradiça (Hinge), domínio de ligação ao ligante (LBD) e sua respectivas funções. Adaptado de Barra & cols, 2004.

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Figura 5: Estrutura primária das diferentes isoformas codificadas pelos genes receptores do hormônio tireóideo: as isoformas TRβ1, TRβ2, TRβ3 e TRβ∆3 são codificadas pelo gene THRB através da utilização de promotores alternativos. O gene THRA, por “splicing” alternativo e também pela utilização de promotores alternativos, produz as proteínas TRα1, TRα2, TR∆α1 e TR∆α2. Adaptado de Barra & cols, 2004.

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Figura 6: Representação esquemática do mecanismo de ação do receptor do hormônio tireóideo: na ausência de T3, o TR se encontra ligado ao TRE como homodímero (Representado) ou heterodímero associado a proteínas correpressoras, que compactam a cromatina na região promotora e inibem a maquinaria de transcrição basal (MTB). A ligação do T3 (círculo) ao TR promove uma mudança conformacional que induz a liberação dos correpressores e associação do TR com proteínas co-ativadoras. A associação do TR com proteínas co-ativadoras relaxam a cromatina na região promotora e recrutam a maquinaria de transcrição basal (MTB), ativando a transcrição de genes alvo. Adaptado de Barra & cols, 2004.

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Refetoff e colaboradores, em 1967, foram os primeiros a descrever os

sintomas causados por estas mutações denominada de Síndrome de Resistência ao

Hormônio Tireóideo (RHT). Esta síndrome é caracterizada por redução na resposta

dos tecidos-alvos ao hormônio tireóideo, apesar dos altos níveis séricos de T3 e T4

livres, apresentando um TSH elevado ou inadequadamente normal característico da

sensibilidade reduzida do tireotrofo (Beck-Peccoz & Chatterjee, 1994). Os indivíduos

apresentam bócio, deficiência auditiva, deficiência de aprendizado, retardo mental,

atraso no crescimento ósseo.

O modelo animal construído por Hashimoto e colaboradores (2001), no qual foi

retirado um aminoácido treonina na posição 337 no exon 6, apresenta fenótipo

similar a Síndrome de Resistência ao Hormônio Tireóideo. Camundongos

trangênicos mutados para o gene TRβ apresentam fenótipo similar a esta síndrome

porém relativamente moderado quando comparados a animais feitos hipotireóideos

por retirada da tireóide. Paradoxalmente, estes animais apresentam sinais

característicos de hipertireoidismo em alguns tecidos como, por exemplo, aumento

da freqüência cardíaca.

Estes modelos de camundongos com mutação no gene TRβ são úteis para

observar o mecanismo de ação dos hormônios tireóideos em tecidos-alvo. Nesta

tese, estes animais foram usados para identificar a possível participação do TRβ na

ação dos hormônios T3 e T4 sobre a modulação da expressão gênica do ClC-2 em

rim de ratos.

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OBJETIVOS

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II-Objetivo Geral:

O objetivo do presente trabalho é verificar se a expressão gênica do canal de cloreto

ClC-2 é modulada pelos hormônios tireóideos e pela aldosterona em rim de ratos.

II-1-Objetivos específicos:

1. Estudar a distribuição do RNAm do ClC-2 ao longo do néfron de ratos.

2. Estudar se o RNAm do ClC-2 é modulado em rim total e em segmentos

dissecados do néfron de ratos submetidos a dietas hipersódicas e

adrenalectomizados, adrenalectomizados com reposição de aldosterona,

hipotireóideos e hipertireóideos.

3. Estudar a modulação da expressão da proteína do ClC-2 em rim de ratos

submetidos dieta hipersódica, hipotireóideos e hipertireóideos.

4. Estudar a possível modulação do RNAm do ClC-2 pelos hormônios da tireóide

em cultura de células de túbulo proximal de ratos in vitro.

5. Estudar o possível mecanismo de ação dos hormônios tireóideos sobre a

expressão gênica do ClC-2 através do envolvimento da região promotora do

deste canal e via receptor TRβ, utilizando camundongos trangênicos para

esse receptor.

III-1) Grupos Experimentais

Todos os protocolos utilizados nesta tese e relacionados abaixo foram

aprovados pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em Pesquisa

(CAUAP) do IBCCFo da UFRJ.

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III-1.1) Preparação dos ratos adrenalectomizados tratados ou não com

aldosterona

Para os experimentos de modulação de RNAm foram utilizados ratos da

linhagem Wistar, de 3 meses de idade (adultos jovens), pesando cerca de 150-

250g que foram mantidos em sala com controle de luminosidade (12h luz / 12h

escuro, iluminação a