AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE E MUTAGENICIDADE DE GÉIS

EXPERIMENTAIS INDICADOS COMO MEDICAÇÃO INTRACANAL NA

ENDODONTIA

Aluna: Thais Akemi Sako

Orientadora: Profa. Dra. Graziela Garrido Mori Panucci

Colaboradoras: Profa. Dra. Gisele Alborgheti Nai

Mestranda - Nathália Evelyn da Silva Machado

Instituição: Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente - UNOESTE

Área de conhecimento: Ciências da Saúde – Odontologia - Endodontia

RESUMO

O estudo de géis experimentais contendo substâncias antimicrobianas tem demonstrado

resultados promissores, pois permitem a eliminação de contaminação presente no interior dos

canais radiculares, que permitirá reparo dos tecidos periapicais e re-estabelecerá a saúde do

paciente. No entanto, para o uso clínico, é fundamental a determinação da capacidade

genotóxica ou mutagênica destes géis. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar a

genotoxicidade e mutagenicidade de géis experimentais indicados como medicação intracanal

na Endodontia. Para isso, serão utilizados 42 ratos machos, com peso corporal entre 200 a

250g. Esses animais serão divididos em 4 grupos: nos grupos I e II, os animais receberam, em

seus dorsos, um implante subcutâneo contendo o gel experimental I e II, respectivamente; no

grupo III (controle negativo), os implantes serão com tubos vazios; e, no grupo IV (controle

positivo), os animais receberam uma dose única de ciclofosfamida. Após 1 dia, seis animais

de cada grupo e aos 7 dias, seis animais dos grupos I, II e III serão eutanaziados, sendo que a

medula óssea dos fêmures serão coletadas para análise por meio dos testes do Cometa e do

Micronúcleo. Os dados obtidos serão anotados em tabelas e submetidos a teste estatístico,

com grau de significância de 5% (p<0,05). Espera-se determinar se os géis experimentais

apresentam ou não atividade genotóxica e/ou mutagênica, para o estabelecimento ou não de

novos protocolos clínicos endodônticos.

PALAVRAS-CHAVES: clorexidina, doxicilcina, genotoxicidade, minociclina, testes de

mutagenicidade

INTRODUÇÃO

A Endodontia tem como objetivo o tratamento das infecções pulpares e periapicais, a

fim de manter o dente em suas condições funcionais1. O sucesso do tratamento

está intimamente relacionado à remoção de restos pulpares e detritos e eliminação de

microrganismos e seus subprodutos1,2. Na rotina prática endodôntica, o profissional pode lidar

com três condições clínicas e que necessitam de intervenções: dentes com pulpite irreversível

tendo como tratamento a biopulpectomia, dentes com necrose pulpar que requerem

uma necropulpectomia, e em casos de retratamento do tratamento endodôntico3. 

As periodontites apicais estão vinculadas a presença de microrganismos no interior

do sistema de canais radiculares e a remoção desses é considerado um dos passos mais

importantes na terapia endodôntica4,5. O sistema de canais radiculares possui uma morfologia

complexa, contendo canais principal, acessórios e secundários, além de

numerosas ramificações e irregularidades anatômicas como deltas apicais e istmos; essa

complexidade anatômica pode limitar a ação dos procedimentos de limpeza e modelagem

química-mecânica5,6-8. 

A instrumentação mecânica facilita a remoção da dentina infectada,

porém é necessário o uso de substâncias seja durante a irrigação, seja como medicação

intracanal entre sessões, que maximizem a desinfecção do sistema de canais

radiculares infectados; o uso dessas substâncias auxilia na redução dos microrganismos

remanescentes levando à um ambiente adequado para o reparo tecidual periapical3,4,6,7,10-12.

O endodontista lida com dois tipos de infecções: infecção primária e secundária ou

persistente3,13. A infecção endodôntica primária é encontrada em dentes que não foram

submetidos ao tratamento endodôntico, sendo caracterizada pela presença de uma microbiota

endodôntica polimicrobiana com predomínio de bactérias anaeróbias Gram-negativas3,14.

Já a infecção endodôntica secundária ou persistente tem como característica a presença de

microrganismos resistentes, constituída especialmente por bactérias anaeróbias estritas ou

facultativas Gram-positivas3,13. O tratamento desse tipo de infecção é complicado devido

crescimento lento das bactérias, por sua natureza polimicrobiana e ter resistências crescente

aos antibióticos3,14. 

O Enterococcus  faecalis é considerado a principal espécie bacteriana encontrada nos

casos de canais radiculares já manipulados e com lesões perirradiculares, estando presente

em 90% dos casos6,10,15. Esse coco Gram-positivo é comumente isolado em casos de

insucessos assintomáticos6,10,15, podendo ser a causa de várias infecções sistemáticas graves16. 

A resistência do Enterococcus faecalis está principalmente relacionada aos seguintes

fatores: alta capacidade de invasão dos túbulos dentários e a habilidade de sobreviver em

condições inadequadas dentro do sistema de canais radiculares17. A viabilidade destes

microrganismos é mantida por extensos períodos, sendo progressivo à duração da supressão

de nutrientes e ao calor18. A capacidade de sobrevivência é extensa, podendo atingir até 12

meses, mesmo sem nutrientes adicionais18,19. É capaz de se desenvolver tanto em aerobiose

quanto em anaerobiose18, podendo facilitar a aderência de células hospedeiras e matriz

extracelular, a invasão teciduais e causar dano mediado pela toxina20.

Todas as propriedades citadas, conferem ao Enterococcus faecalis, grande poder

agressivo aos tecidos perirradiculares e maior resistência ao controle

das infecções endodônticas21.

Quando o tratamento mecânico é realizado, ocorre uma severa desorganização

microbiana; entretanto, algumas vezes após o selamento do canal,

o Enterococcus faecalis persiste e auxilia na reorganização de um novo biofilme22. 

Uma estratégia antimicrobiana importante foca-se no emprego de agentes

antimicrobianos que exibam eficácia contra os microrganismos mais prevalentes

nas infecções endodônticas primária e persistente/secundária, para minimizar a disseminação

local e sistêmica dos patógenos anaeróbios23. 

O uso de uma substância química auxiliar é essencial na remoção de microrganismos,

com isso, é de extrema relevância clínica a busca por medicamentos intracanais com

substâncias potentes e com um amplo espectro antimicrobiano, além de baixa citotoxicidade23-

25.

Atualmente o agente antimicrobiano de escolha para a eliminação

do Enterococcus faecalis é a clorexidina a 2%. Esta é um anti-séptico catiônico sintético,

usado na endodontia como irrigante e medicação intracanal, devido seu amplo espectro de

ação, substantividade e excelente capacidade de atuar sobre os microrganismos presentes nas

infecções pulpares e periapicais3,14,20,22,26,27.  A clorexidina apresenta um bom potencial para

uso como medicação intracanal, pois atende aos requisitos de atividade antimicrobiana

satisfatória associada à baixa toxicidade, por conta do efeito de substâncias neutralizantes

encontradas em biofilmes e células mortas28,29. É efetiva contra bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas30, sendo bacteriostática em concentrações baixas e, bactericida

em concentrações elevadas31. 

A aplicação da solução de digluconato de clorexidina a 2% por 10 minutos,

previamente à obturação endodôntica, é capaz de penetrar no tecido dentinário radicular e

manter a eficiência antimicrobiana por mais de 12 semanas, embora a capacidade reduza em

função do tempo32. Assim, a utilização da clorexidina a 2% pode colaborar com a remoção

da infecção microbiana32. 

Apesar de todas as boas propriedades, em concentrações iguais ou maiores que

0,5%, a clorexidina produz necrose tecidual e exacerba o processo inflamatório, retardando o

processo de reparação tecidual do periodonto apical; e, na concentração de 2% chega a

promover irritação na pele33, gerando possibilidade de risco sistêmicos na sua utilização por

causa da decomposição da clorexidina em radicais livres32.

O uso rotineiro da clorexidina 2% pode gerar subprodutos, como a paracloroanilina e

espécies reativas de oxigênio (ROS)32,33. A sua instabilidade à alterações de tempo,

temperatura e pH, também, podem alterar sua composição, degradando-a em subprodutos

reativos32,33. A paracloroanilina é um dos subprodutos gerados pela hidrólise da clorexidina

em função do tempo, do pH e do aquecimento. A paracloroanilina é uma amina aromática que

pode causar Metahemoglobinemia e cianose, além de ter ação carcinogênica em

humanos32,34,35. O ROS é um subproduto que age nas estruturas da membrana e paredes

celulares de microrganismos e, após isso, libera agentes carcinogênicos e citotóxicos28,32,34. 

Buscando uma alternativa inovadora para uma medicação efetiva e buscando eliminar

os inconvenientes da clorexidina a 2%, Cruz et al.36 avaliaram a diferentes medicamentos

associados na forma de dois géis experimentais. No referido trabalho, verificou-se que os géis

são eficientes para a eliminação de Enterococcus  faecalis, quando em teste

de contato direto. Ao estudar a ação dos géis experimentais sobre biofilme microbiano

de Enterococcus  faecalis presente no interior de dentina bovina, verificou-se que os géis

foram efetivos para a eliminação daqueles de forma semelhante à clorexidina37. A ação dos

géis pode ser justificada pela ação conjunta dos componentes dos mesmos, apresentando boa

ação antimicrobiana e sendo eficaz sobre biofilme de Enterococcus  faecalis37. 

Os géis são compostos pela associação de três substâncias: clorexidina a

0,2%, metronidazol a 2,5% e derivados da tetraciclina, sendo que no gel I, usa-se

a minociclina a 2% e no gel II, a doxiciclina a 2%36,37. 

O uso da clorexidina utilizada nestes géis é justificada pela sua excelente capacidade

em inativar o Enterococcus  faecalis20,24,28, porém a concentração utilizada foi de 0,2%,

evitando o problema relacionado à liberação de subprodutos38.

O metronidazol é um agente antimicrobiano sistêmico, conseguindo penetrar na célula

bacteriana por difusão e por meio de produtos tóxicos intermediários ou radicais livres que

são liberados, há a destruição do DNA bacteriano39,40. Possui capacidade anti-inflamatória39,

substantividade41, além de ser biocompatível com os tecidos periapicais, justificando a sua

presença na composição dos géis experimentais.

A tetraciclina é um antibiótico de amplo espectro que atua sobre espécies gram-

positivas, gram-negativas, anaeróbias e aeróbias, espiroquetas e alguns protozoários.

Apresenta uma meia vida plasmática e uma solubilidade maiores em lipídios, baixa toxicidade

e é de baixo custo42. Seu mecanismo de ação se dá pela sua habilidade em ligar-se ao 30S

do ribossomo da cadeia da síntese proteica43. Alterações estruturais na molécula da

droga, em especial no anel D onde os carbonos 7-9 foram realizadas, produzindo, assim, dois

medicamentos semi-sintéticos mais eficazes, conhecidos como minociclina e doxiciclina43.

A minociclina apresenta efeito anti-inflamatório, imunossupresor e inibir

da colagenase, apresentando amplo espectro de ação43,44. Sua efetividade é maior que a

tetraciclina devido a alta lipofilicidade43. A doxiciclina apresenta as mesmas características

da minociclina, porém com uma ação antimicrobiana diminuída quando comparada a esta44.

Atua sobre várias bactérias, sendo eficaz no tratamento de lesões orais, devido sua atuação na

síntese proteica, por meio da degradação da matriz extracelular45. 

Apesar da excelente capacidade antimicrobiana do géis experimentais, para o uso

rotineiro deste, há a necessidade da avaliação das propriedades biológicas

relacionadas à citotoxicidade e genotoxicidade.  

Citotoxicidade é o grau ao qual um agente tem ação destrutiva específica em

determinadas células, enquanto genotoxicidade está relacionada aos danos que determinadas

substâncias promovem no DNA, demonstrando potencial mutagênico ou carcinogênico46.

Inúmeras técnicas que detectam danos no DNA têm sido utilizadas para identificar

substâncias com atividade genotóxica47, identificando carcinogênicos e mutagenicidade48. Os

principais testes utilizados para este fim são os testes do cometa e do micronúcleo46.

O teste do Cometa consiste na quantificação de danos em DNA de células embebidas

em gel de agarose, permitindo a detecção de danos e reparos em uma única célula46,48; além

disso, permite detectar mutações ou defeitos na reparação do material genético

celular49. Durante o teste, partes do DNA são arrastadas do seu núcleo e fragmentos

produzidos por ligações cruzadas e quebras duplas na fita de DNA, migram resultando na

imagem de um cometa, o que caracteriza o resultado do teste46. 

O teste do micronúcleo é identificado pela formação de um núcleo adicional e

separado do núcleo principal da célula durante a sua divisão. Materiais ou substâncias podem

promover alterações estruturais cromossômicas ou falhas no fuso celular, fazendo com que

um novo núcleo adicional seja formado e excluído do interior celular durante a telófase46,49.

É uma técnica valiosa por permitir a detecção de diferenças intercelulares de mutações e

reparo de material genético em qualquer célula eucariótica48. 

Considerando a importância do controle das infecções endodônticas e

dos índices de resistência dos Enterococcus  faecallis, Machado et al.37 trouxeram uma

alternativa à Clorexidina à 2%, devido a excelente ação antimicrobiana dos géis experimentais

analisados. No entanto, o presente estudo torna-se fundamental para a determinação

da genotoxicidade e mutagenicidade destes géis experimentais, para o estabelecimento de

novos protocolos clínicos endodônticos.

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Este trabalho tem como objetivo geral analisar a ação biológica genotóxica e/ou

mutagênica dos géis experimentais.

Objetivos específicos

Os objetivos específicos serão:

a) determinar o grau de alteração do DNA celular quando em contato com os géis

experimentais, comparando com os grupos controles, por meio do teste do

Cometa;

b) identificar potencial de mutação celular quando em contato com os géis

experimentais, comparando com os grupos controles, por meio do teste do

Micronúcleo.

MATERIAL E MÉTODOS

O presente estudo será baseado na metodologia publicada por Nai et al.46, em 2016.

Os géis experimentais serão os mesmos analisados por Cruz et al.36 e Machado et al.37, sendo

o gel experimental I composto pela associação de clorexidina a 0,2%, metronidazol a 2,5% e

minociclina a 2% (Pharmacotécnicas Fórmulas, Tupã, São Paulo, Brasil) e o gel experimental

II composto pela associação de clorexidina a 0,2%, metronidazol a 2,5% e doxiciclina a 2%

(Pharmacotécnicas Fórmulas, Tupã, São Paulo, Brasil).

Para este estudo, serão utilizados 42 ratos Wistar albinos, adultos, machos, com peso

entre 200 a 250 gramas. Os animais serão obtidos no biotério central da Universidade do

Oeste Paulista (UNOESTE) após aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA

– UNOESTE). Os ratos serão mantidos em caixas individuais, as quais serão limpas

diariamente. Os ratos serão mantidos em biotério climatizado, sendo alimentados, antes e

durante o experimento, com ração sólida, com exceção das primeiras doze horas pré-

operatórias, e água à vontade.

Para a realização das intervenções cirúrgicas, os animais serão anestesiados com uma

associação de cloridrato de ketamina (Dopalen – Sespo Indústria e Comércio Ldta, Jacareí,

São Paulo, Brasil) e cloridrato de xilazina (Anasedan – Agribrands do Brasil Ldta, Jacareí,

São Paulo, Brasil) por via intraperitoneal, na dosagem de 0,05ml/100g de peso animal para

cada substância citada. A anestesia será realizada com o auxílio de uma seringa descartável

para insulina.

Após isso, os animais serão divididos em 4 grupos:

• Grupo I – gel experimental I (n=12): os animais terão os seus dorsos tricotomizados e a

anti-sepsia da área, realizada com clorexidina a 2% (FGM Produtos Odontológicos,

Joinville, Santa Catarina, Brasil), seguida de neutralização com solução fisiológica (Darrow

Laboratórios S.A, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil). Na sequência, cada animal

receberá uma incisão na região mediana do dorso com o auxílio de uma lâmina de bisturi

número 15 (Embramac Exportação e Importação, Campinas São Paulo, Brasil).

Lateralmente à incisão, o tecido cutâneo será pinçado e divulsionado com uma tesoura de

ponta romba. Após isso, um tubo de polietileno estéril medindo 2 mm de diâmetro x 10 mm

de altura será preenchido completamente com o gel experimental I e será introduzido no

tecido subcutâneo do animal. As incisões serão suturadas com fio de nylon 5-0 (Ethicon,

São José dos Campos, SP, Brasil);

• Grupo II - gel experimental II (n=12): semelhante ao grupo I, com excessão do gel

experimental, que neste grupo será utilizado o gel experimental II;

• Grupo III - controle negativo (n=12): semelhante ao grupo I, com excessão do uso do gel

experimental, visto que os tubos de polietileno estarão vazios;

• Grupo IV - controle positivo (n=6): os animais receberão ciclofosfamida (Genuxal, Baxter

Oncology GmbH, Halle/Westfalen, Alemanha) em dose única subcutânea (50mg/kg) no

primeiro dia do experimento.

Os animais receberão 2mg/ml de Acetominofenol [Tylenol®] na água do bebedouro

por 7 dias (50), para o controle da dor, visto que na clínica odontológica, esse analgésico é

frequentemente recomendado.

Após 1 dia, seis animais de cada grupo e aos 7 dias, seis animais dos grupos I, II e III

serão eutanaziados em câmara de gás com inalação de CO2. Os indicativos de morte serão a

ausência de movimentos respiratórios, batimentos cardíacos e perda dos reflexos. Os dois

fêmures dos animais serão retirados logo após o óbito e imediatamente seccionados para

coleta da medula óssea. Para coleta do material medula óssea, o fêmur será seccionado nas

duas extremidades. Os materiais coletados serão submetidos ao teste do Cometa e ao teste do

micronúcleo.

Para a realização do teste do Cometa, o material da medula óssea será obtido

injetando-se 1 ml de soro fetal bovino em uma das extremidades dos fêmures direitos com o

auxílio de uma agulha hipodérmica, promovendo descolamento daquele. As células da medula

óssea serão ressuspensas em criotubos de 2ml de solução contendo 40% de soro fetal bovino,

50% de RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co. LLC. - EUA) e 10% de DMSO (dimetil sulfóxido –

Merck - EUA) e, estes serão armazenados a –80oC. De posse de lâminas para microscopia

embebidas com agarose a 1,5%, colocar-se-á sobre esta, uma gota da mistura de 5 μl das

células coletadas da medula óssea com 75 μl de agarose low melting; com o auxílio de uma

lamínula grande, realizar-se-á o espalhamento da mistura. Após solidificação em geladeira e

remoção da lamínula, as lâminas serão colocadas em cubeta de vidro vertical contendo

solução de lise gelada e protegida da luz, por 1 hora. Na sequência, as serão colocadas

horizontal de eletroforese contendo tampão de eletroforese por 20 minutos. A eletroforese

será realizada na mesma solução a 25V e 300 mA por 15 minutos. Após isso, as lâminas serão

neutralizadas, secas e fixadas para posterior coloração com solução específica contendo prata.

As imagens obtidas analisadas com um microscópio de transmissão de luz (Leica

Microsystem, Wetzlar, Germany).

Para a realização do teste do micronúcleo, o material da medula óssea será obtido

injetando-se 1 ml de soro fetal bovino em uma das extremidades dos fêmures esquerdos com

o auxílio de uma agulha hipodérmica, promovendo descolamento daquele. O material

coletado será ressuspenso em 3ml de soro fisiológico e centrifugado a 1000 rpm por 5

minutos. O sobrenadante será descartado e o precipitado será ressuspenso em 0,5ml de soro

fisiológico. Os esfregaços serão preparados pingando-se duas gotas da suspensão na

extremidade de uma lâmina e realizados por extensão com auxílio de outra lâmina. As

preparações são secas ao ar. Na sequência, o material presente nas lâminas serão coradas pelo

corante de Giemsa (Dolles, São Paulo, Brasil) e analisadas com um microscópio de

transmissão de luz.

FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS

Para a análise do teste do Cometa, duas lâminas serão confeccionadas por amostra, as

quais serão observadas com uma magnificação de 400x. O parâmetro utilizado para a análise

será o comprimento da cauda formada e sua relação com o dano do DNA, conforme figura 1.

A indicação da classe dos danos do DNA, especificadas acima, será realizada por avaliar

experiente e cego.

Figura 1 – Classificação das imagens das “células cometa”, segundo Villela et al.51.

Para a análise do teste do micronúcleo, duas lâminas serão confeccionadas por

amostra, as quais serão observadas com uma magnificação de 400x. Para a determinação da

quantidade de micronúcleos, serão contados 2000 eritrócitos policromáticos por animal (1000

em cada lâmina). Serão considerados micronúcleos, as estruturas que apresentassem um halo

circundante sugestivo de membrana, menores que um terço do diâmetro do núcleo associado,

intensidade de coloração semelhante ao núcleo e mesmo plano focal a microscopia, conforme

figura 2. A contagem será realizada por um

avaliador experiente e cego.

Figura 2 – Eritrócito com micronúcleo (seta), segundo imagem publicada por Nai et al.46.

Para a análise estatística, será considerado o padrão de distribuição dos resultados,

para a aplicação de teste adequado, tendo grau de significância de 5% (p<0,05).

RESULTADOS ESPERADOS

Espera-se determinar se os géis experimentais apresentam ou não atividade

genotóxica e/ou mutagênica, para o estabelecimento ou não de novos protocolos clínicos

endodônticos.

CRONOGRAMA

Período Atividade a ser realizada

Setembro e

outubro/2017

Solicitação dos animais e organização dos materiais a serem usados

na pesquisa

Leitura de artigos científicos

Novembro e

Dezembro/2017

Cirurgia dos animais, coleta do material para análise e realização dos

testes do Cometa e do Micronúcleo

Janeiro e

Fevereiro/2018

Leitura dos resultados

Março/2018 Relatório parcial

Abril/2018 Análise estatística

Maio a Agosto/2018 Redação do manuscrito para publicação em revista científica

especializada, além de apresentação em congresso da área

Setembro/2018 Apresentação dos trabalhos (preparatória) e entrega do Relatório

Final

Outubro/2018 Redação do relatório final e Apresentação do trabalho no Simpósio

de Iniciação Científica (SIC) da UNOESTE

Outubro/2018 Inserção no SGP do Relatório Final e certificado de apresentação no

SIC

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