CONTROLE DE MICRORGANISMOS:

FUNDAMENTOS E AGENTES FÍSICOS

INTRODUÇÃO

Controle: manutenção em níveis aceitáveis (destruir, inibir ou remover)

Agentes físicos e químicos – escolha ? OBJETIVOS(antimicrobianos)

Destruir ou remover todos (esterilização)

Destruir somente certos tipos

Prevenir a multiplicação daqueles já existentes

CONDIÇÕES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A eficiência de um agente pode ser afetada por:

1) Tamanho da população: (população >, tempo >)2) [ ] do agente: (concentração >, tempo <)3) Tempo de exposição: (tempo >, população <)4) Temperatura de exposição: (geral T>, população <)5) Natureza do material: (meio fluido < tempo que

viscoso, pH 5 < tempo que pH 7)6) Características dos microrganismos: resistência

variada (Gram+ mais resistentes ao calor, Gram-mais resistentes a antibióticos)

MECANISMO DE DESTRUIÇÃO DAS CÉLULAS

Como o agente atua seleção do mais efetivo

• Parede celular – proteção

• Membrana plasmática – integridade do citoplasma, controle da passagem de substâncias e enzimas do metabolismo celular

• Citoplasma – estado coloidal com DNA, RNA, ribossomos, proteínas e centenas de enzimas

Perda de funções: alteração do estado físico do citoplasma, inativação de enzimas, rompimento da membrana ou parede celular

MORTE

A) ALTAS TEMPERATURASUm dos métodos mais eficientes e mais usados

Calor em condições ÚMIDAS (vapor ou água)Calor em condições SECAS e INCINERAÇÃO

I) CALOR ÚMIDO

Mais eficiente (T e tempo <) que o seco (oxidação –queima lenta) por desnaturar e coagular proteínas vitais como enzimas

Ex. Bacillus anthracis – endosporos (alta resistência)

• Calor úmido: de 2 a 15 min a 100oC

• Calor seco: mais de 180 min a 140oC

Eficiência do calor úmido:

• Células vegetativas de bactérias: 5-10 min a 60-70oC

• Células vegetativas de leveduras e outros fungos:5-10 min a 50-60oC

• Esporos de fungos: 5-10 min a 70-80oC

• Protozoários e vírus = >> das células vegetativas

Formas do calor úmido:

1) Vapor d´água sob pressão: AUTOCLAVE

Mais prático e seguro método com calor úmido.

A pressão permite desenvolvimento de maior T de ebulição da água (121oC a 1 atm ou 1 kgf/cm2)

Tempo necessário em f (material) ...

Tempos de exposição para esterilização, em 121oC (Perskins, 1983)

Tubos de ensaio 18x150 mm 12-14 min

Tubos de ensaio 32x200 mm 13-17 min

Tubos de ensaio 38x200 mm 15-20 min

Erlenmeyer de 50 mL 12-14 min

Erlenmeyer de 500 mL 17-22 min

Erlenmeyer de 1000 mL 20-25 min

Erlenmeyer de 2000 mL 30-35 min

2) Água fervente (T de ebulição)

• Morte de microrganismos vegetativos no líquido• Em objetos: morte duvidosa (endosporos resistem a

mais de 1h a 100oC, etc.)• Não considerado método de esterilização

3) Pasteurização

• Uso de calor controlado (Pasteur, 1860 – vinhos)Ex. T de 62,8oC por 30min ou em esteiras quentes a 71,7oC por 15s e depois resfriamento rápido.

• Morte de células vegetativas (patogênicas ou não), sem esterilização

CONSERVAÇÃO (qualidade)

II) CALOR SECO (ou ar quente)

Menos eficiente que o calor úmido...

Esterilização de vidrarias em estufa 2h a 160-180oCEsterilização em autoclave 15 min a 121oC

Somente em material que não pode ser exposto à U e resistentes a altas T!

1) Incineração (“fogo direto” e incineradores)

Ex. alças de platina ou agulhas, lixo hospitalar, etc.

Cuidados com emissão de gotículas, aerossóis e partículas carregadas com microrganismos !

2) Estufa de esterilização e secagem: morte por oxidação

B) BAIXAS TEMPERATURAS1) CongelamentoBactérias psicrófilas – crescimento a 0oCT < 0oC: inibição do metabolismo, mas não MORTE !Freezer doméstico: -20oC

Conservação/ManutençãoFreezer a -70oC

Nitrogênio líquido a -196oC

2) Radiações eletromagnéticasEnergia em forma de ondas (quanto >, energia <)• Ionizantes (gama e X): rompimento de moléculas em átomos e alto poder de penetração

• Não-ionizantes (UV): absorção e excitação de e-(DNA mais afetado: união de C ou G adjacentes). Morte ou mutações.

3) Filtração (Processo físico e não agente físico)

• Esterilização usada em materiais que não podem ser autoclavados (vitaminas ou proteínas sensíveis ao calor)

• Separação de microrganismos ou de vírus

Filtros de membranas de celulose (memb. filtrantes)

Discos muito finos (cerca de 150 µµµµm), com poros que impedem a passagem de microrganismos

4) Filtros de partículas de ar de alta eficiência

Cabine de segurança biológica (mais simples): entrada/saída com filtros (lab. de Microbiologia)

5) Dessecação

Retirada de água – interrupção do metabolismo

Ex. carnes (charques), frutas, pães, grãos (milho...)

Tempo de sobrevivência depende:

• Tipo de microrganismo• Material a ser dessecado• Intensidade do processo de dessecação• Condições externas como luz, T e umidade

Ex. Gram+ maior resistência (h) que as Gram- (min)

Altas [ ] sais e açúcares: Osmose = efeito Dessecação

6) Liofilização: desidratação extrema e manutenção a vácuo, em ampolas (anos)

CONTROLE DE MICRORGANISMOS:

AGENTES QUÍMICOS

AGENTES QUÍMICOS (AGENTES ANTIMICROBIANOS)

Compostos podem matar (bactericida) ou inibir o crescimento (bacteriostático)...

Definição dos termos:

• Esterilização (agente esterilizante): destruição ou remoção de todos os microrganismos de um objeto (passa a ser estéril).

• Desinfestação (agente desinfestante/desinfetante): destruição das formas vegetativas de microrganismos patogênicos ou não. As formas esporuladas não são destruídas.

• Germicidas: sinônimo de desinfetante, mas pode não matar os patogênicos.

• Anti-sépticos: aplicados na superfície do corpo para matar ou inibir crescimento microbiano (feridas...)

Características de um agente químico “ideal”:

1) Atividade antimicrobiana: destruir o maior número possível de espécies microbianas

2) Solubilidade: em água ou álcool

3) Estabilidade: permitir armazenamento

4) Ausência de toxicidade: ao Homem ou animais

5) Homogeneidade: não precipitação (uniforme)

6) Atividade em T ambiente

7) Poder de penetração: meio interno e externo

8) Não corrosão ou corante

9) Poder desodorizante: sem odor ou agradável

10) Capacidade detergente: + remoção mecânica

11) Disponibilidade e baixo custo

Principais grupos de agentes antimicrobianos

1) Fenol e compostos fenólicos (ex. Lysol):Contra formas vegetativas: alteração da permeabilidade da membrana, desnaturação e inativação de enzimasTóxico e odor desagradável (não usado como desinfestante ou anti-séptico)

2) Álcoois (etílico entre 60-90% e isopropílico 90%):Contra formas vegetativas: desnaturação de proteínas, solubilização de lipídeos e remoção mecânica (detergente)

3) Halogênios (cloro, iodo):Iodo (solúvel em álcool etílico): oxidação de metabólitos essenciais (enzimas, aminoácidos): bactericida, esporicida, fungicida, viricida e amebicida

Cloro e compostos clorados:

a) Cl2: universalmente usado para purificação de águas, embora de difícil manipulação.

b) Hipocloritos (cálcio e sódio): A 1% - higiene pessoal e desinfestante domésticoA 5-12% - indústrias de alimentos e laticínios

Cl2 + H2O HCl + HClO

HClO HCl + O (oxigênio nascente)

Fortíssimo agente oxidante: destruição de substâncias e proteínas celulares

4) Metais pesados (Hg, Pb, Zn, Ag e Cu):HgCl2: desinfestante geral, tóxico e corrosivoCompostos mercuriais orgânicos (menos tóxicos):Mercurocromo, mertiolate e metafenAgNO3 1%: substituição por antibióticosCuSO4: ação algicida e fungicidaMetais pesados: inativação de enzimas (combinação)

5) Detergentes (surfactantes): são anfipáticos -reduzem a tensão superficial e limpam superfíciesEx. sabões (gordura + base forte)

6) Compostos quaternários de amônio (NH4Cl):Bactericidas a baixas concentrações (1:30.000)Bacteriostáticas a concentrações menores (1:200.000)

Baixa toxicidade, alta solubilidade em água, alta estabilidade e não corrosivos: desnaturação de proteínas e lesão na membrana.

Baixo0,1-0,2%Compostos quaternários

BaixoMertiolate ou mercuriocromo 1,0%

Compostos mercuriais

BaixoHipocloritos: 0,5-5,0g de cloro livre por L

Compostos clorados

IntermediárioIodóforo: 1,0%Tintura de iodo: iodo a 2%+iodeto de sódio a 2% + álcool 70%

Iodo

IntermediárioEtílico: 70-90%+Iodo: 0,5-2,0%

Álcoois

Intermediário a baixo0,5-3,0%Compostos fenólicos

Atividade microbicida*

ConcentraçãoDesinfestante

Alguns desinfestantes comumente usados (Pelczar et al., 1996).

*Alta= mata todas as formas de vida, inclusive endosporos; Intermediário = mata a bactéria da tuberculose, fungos e vírus, mas não endosporos; Baixo = não mata endosporos, bactérias da tuberculose ou vírus não-lipídicos em tempo aceitável.

Esterilizantes químicos

Indicação: esterilização de materiais sensíveis ao calor (bolsas de sangue, seringas plásticas, etc.

1) Óxido de etileno: altamente irritante para olhos e mucosas, inflamável a baixas concentrações – morte de todas as formas de vida (horas de exposição) por inativação de enzimas.

2) Formaldeído (líquido ou gasoso): estável a altas concentrações e T, extremamente tóxico e irritante de mucosas – inativação de enzimas e ácidos nucléicos

Parede celular

Membrana citoplasmática

Ribossomos

Material Nuclear (DNA)

Citoplasma

Fenol, hipoclorito de sódio, mertiolate (baixas [ ]) causam

lise celular

Fenóis, álcoois e detergentes afetam a membrana, causando

liberação de constituintes internos

Óxido de etileno combina com grupamentos –NH3

Hipocloritos, iodo, óxido de etileno e sais de metais pesados combinam com grupamentos –

SH

Sais de mercúrio e [ ] de fenóis coagulam as proteínas

Resumo esquemático dos sítios e mecanismos de ação de vários compostos químicos antimicrobianos

Pelczar et al. (1996)

Morte de células: não ocorre mais divisão celular...

Se 1 milhão de bactérias

1 min de ação

Morte de 90% (morrem 900.000 e restam 100.000)

1 min de ação

Morte de 90% (morrem 90.000 e restam 10.000)

3o minuto: 9.000 mortas e 1.000 sobreviventes4o minuto: 900 mortas e 100 sobreviventes5o minuto: 90 mortas e 10 sobreviventes6o minuto: 9 mortas e 1 sobrevivente

Última morte ?! ....... Importância do tempo de ação!