6B Proteínas des físicas

PROTEÍNASPROTEÍNAS

Albumina do sangue

PROTEÍNASPROTEÍNAS São polímeros de aminoácidos cujas principais funções São polímeros de aminoácidos cujas principais funções

nos organismos vivos são:nos organismos vivos são: Papel informativoPapel informativo

EstruturalEstrutural QuímicoQuímico

O papel informativo está relacionado com a função das O papel informativo está relacionado com a função das hormonas proteicas. O papel Estrutural diz respeito à hormonas proteicas. O papel Estrutural diz respeito à constituição dos organismos vivos. O papel Químico constituição dos organismos vivos. O papel Químico desenrola-se pela acção das Enzimas, proteínas que desenrola-se pela acção das Enzimas, proteínas que desempenham o papel de Catalisadores biológicos.desempenham o papel de Catalisadores biológicos.

As proteínas podem classificar-se de acordo com o seu As proteínas podem classificar-se de acordo com o seu trabalho, estrutura, solubilidade, produtos obtidos por trabalho, estrutura, solubilidade, produtos obtidos por hidrólise e estado de degradação.hidrólise e estado de degradação.


Propriedades FísicasPropriedades Físicas 1-Estado físico1-Estado físico São substâncias sólidas, brancas, podendo São substâncias sólidas, brancas, podendo

algumas quando puras cristalizarem. São algumas quando puras cristalizarem. São decomponíveis pelo calor.decomponíveis pelo calor.

2-Solubilidade2-Solubilidade As proteínas formam quando solúveis, As proteínas formam quando solúveis,

soluções coloidais.soluções coloidais.

PROTEÍNASPROTEÍNAS A solubilidade de uma proteína determina-se em A solubilidade de uma proteína determina-se em

relação a:relação a: ÁguaÁgua Soluções de sais neutrosSoluções de sais neutros Ácidos diluídosÁcidos diluídos Bases diluídasBases diluídas Alcool étílico diluído Alcool étílico diluído Todas as proteínas são insolúveis em alcool Todas as proteínas são insolúveis em alcool

absoluto e muito pouco solúveis em solventes absoluto e muito pouco solúveis em solventes orgânicos.orgânicos.

As propriedades das proteínas solúveis As propriedades das proteínas solúveis dependem do grupo a que pertencem.dependem do grupo a que pertencem.

PROTEÍNASPROTEÍNASAs soluções de proteínas não são soluções verdadeiras As soluções de proteínas não são soluções verdadeiras

mas sim coloidais e em presença da água têm como mas sim coloidais e em presença da água têm como característica comum apresentar levada viscosidade.característica comum apresentar levada viscosidade.

Em certas condições estas soluções coloidais formam Em certas condições estas soluções coloidais formam produtos semi-sólidos chamados Gels ou semi-líquidos produtos semi-sólidos chamados Gels ou semi-líquidos que são os Gliodes.que são os Gliodes.

A solubilidade de uma proteína não desnaturada é função A solubilidade de uma proteína não desnaturada é função de um certo número de factoresde um certo número de factores

pHpHTemperaturaTemperatura

SolventeSolventeO estudo das leis que regem a variação da solubilidade é O estudo das leis que regem a variação da solubilidade é

da máxima importância na obtenção de proteínas puras da máxima importância na obtenção de proteínas puras a partir de misturas complexas.a partir de misturas complexas.


Efeitos “Salting in” e Efeitos “Salting in” e “Salting out”“Salting out”

A concentração de cloreto A concentração de cloreto de sódio na água de sódio na água influencia a solubilidade influencia a solubilidade de uma proteína em de uma proteína em água. O cloreto de sódio água. O cloreto de sódio comporta-se como um comporta-se como um agente de dissolução agente de dissolução (salting in) ou de (salting in) ou de precipitação (salting out). precipitação (salting out).


A solubilidade de uma proteína apresenta o seu A solubilidade de uma proteína apresenta o seu mínimo no ponto isoeléctrico, como se mostra na mínimo no ponto isoeléctrico, como se mostra na figura abaixo.figura abaixo.

Solubilidade da -lactoglobulina em funçãodo pH a diferentes concentrações de cloreto de sódio

Solu

bili d

ade

em m

g /m

l

pH

0,001 M NaCl

0,005MNaCl

0,02M NaCl

2

3

4,8 5,2 5,6 5,8

PROTEÍNASPROTEÍNAS O fenómeno de “salting out” de uma proteína perante a O fenómeno de “salting out” de uma proteína perante a

concentração do cloreto de sódio resulta dos efeitos concentração do cloreto de sódio resulta dos efeitos intersticiais dos aniões fortemente hidratados à intersticiais dos aniões fortemente hidratados à superfície da proteína que originam a saída de superfície da proteína que originam a saída de moléculas de água da proteína solvatada desidratando moléculas de água da proteína solvatada desidratando a superfície desta. a superfície desta.

O efeito é devido aos aniões mais fortemente O efeito é devido aos aniões mais fortemente hidratados.hidratados.

O fenómeno de “Salting in” (aumento da solubilidade O fenómeno de “Salting in” (aumento da solubilidade por adição de baixos teores de sal) resulta da ligação e por adição de baixos teores de sal) resulta da ligação e uma proteína a um anião e um aumento bruto da carga uma proteína a um anião e um aumento bruto da carga eléctrica e solvatação. eléctrica e solvatação.

O efeito é devido aos aniões mais fracamente O efeito é devido aos aniões mais fracamente hidratados. hidratados.


A solubilidade depende da A solubilidade depende da força iónica do meio força iónica do meio e e como se mostra na figura a como se mostra na figura a Carbonilhemoglobina Carbonilhemoglobina apresenta um máximo no apresenta um máximo no ponto ponto correspondente a correspondente a uma solução de sulfato de uma solução de sulfato de amónio a 35 g/lamónio a 35 g/l

= Força iónica do meio = Força iónica do meio dada pela expressão dada pela expressão matemáticamatemática

1/2 1/2 CZCZ22

C= Concentração molarC= Concentração molar Z= Valência de cada iãoZ= Valência de cada ião

Variação da solubilidade da Carbonlhemoglobina em solução de sulfato de amónio

-1,6

-0,8

0,0

+0,8

+1,6

1 2 3 4 5 6

logS/ S0


3-Efeito do pH3-Efeito do pH O pH exerce uma O pH exerce uma

influência muito influência muito importante sobre importante sobre a solubilidade de a solubilidade de uma proteína uma proteína como se mostra como se mostra no gráfico ao no gráfico ao lado. lado.

O mínimo de O mínimo de solubilidade solubilidade corresponde ao corresponde ao ponto isoeléctricoponto isoeléctrico

Perfil de solubilidade de proteína de farinha e concentrado protéico de feijão guandu


No ponto isoeléctrico a carga total da proteína , tendo No ponto isoeléctrico a carga total da proteína , tendo em atenção outros iões da solução que se podem fixar em atenção outros iões da solução que se podem fixar à proteína é nula à proteína é nula

A noção de ponto isoleléctrico leva a aplicações na A noção de ponto isoleléctrico leva a aplicações na separação de proteínasseparação de proteínas

a) A solubilidade é mínima na vizinhança do ponto a) A solubilidade é mínima na vizinhança do ponto isoeléctricoisoeléctrico

b) As proteínas podem fraccionar-se por cromatografia b) As proteínas podem fraccionar-se por cromatografia de troca-iónicade troca-iónica

c) Quando colocadas num campo eléctrico as proteínas c) Quando colocadas num campo eléctrico as proteínas sofrem migração, excepto no ponto isoeléctrico. Esta sofrem migração, excepto no ponto isoeléctrico. Esta técnica designa-se por electoforese e pode usar papel, técnica designa-se por electoforese e pode usar papel, acetato de celulose, gel de amido ou gel de acrilamida acetato de celulose, gel de amido ou gel de acrilamida

PROTEÍNASPROTEÍNAS Chama-se Chama-se Ponto IsoiónicoPonto Isoiónico de uma proteína o pH para de uma proteína o pH para

a qual o número de catiões é igual ao número de aniões a qual o número de catiões é igual ao número de aniões quando em solução em água pura.quando em solução em água pura.

Na prática o ponto isoeléctrico é muito próximo do Na prática o ponto isoeléctrico é muito próximo do ponto isoiónico.ponto isoiónico.

Os grupos que numa proteína podem existir Os grupos que numa proteína podem existir dissociados são:dissociados são:

1—NH1—NH2 2 do aminoácido N-terminaldo aminoácido N-terminal 2—COOH do aminoácido C-termimnal2—COOH do aminoácido C-termimnal 3-Grupos básicos da histidina, lisina e arginina3-Grupos básicos da histidina, lisina e arginina 4-Grupos ácidos dos ácidos aspártico e glutâmico4-Grupos ácidos dos ácidos aspártico e glutâmico 5-Grupos fenol da tirosina5-Grupos fenol da tirosina 6—SH da cisteína6—SH da cisteína A carga total da proteína depende de:A carga total da proteína depende de: A-pH do meioA-pH do meio B-Número de cada tipo de aminoácidos da molécula B-Número de cada tipo de aminoácidos da molécula

proteicaproteica

PROTEÍNASPROTEÍNAS 4-Efeito de solventes4-Efeito de solventes A mistura de solventes orgânicos especialmente A mistura de solventes orgânicos especialmente

etanol e metanol a baixas temperaturas (-5ºC) etanol e metanol a baixas temperaturas (-5ºC) permite o fraccionamento de misturar complexa.permite o fraccionamento de misturar complexa.

Os solventes orgânicos desnaturam as Os solventes orgânicos desnaturam as proteínas alterando a sua estrutura terciária. proteínas alterando a sua estrutura terciária.

Cohn e os seus obtiveram, a partir de plasma Cohn e os seus obtiveram, a partir de plasma sanguíneo humano, fracções proteicas distintas, sanguíneo humano, fracções proteicas distintas, fazendo variar de um modo adequado o teor em fazendo variar de um modo adequado o teor em electrólitos, o pH, a concentração alcoólica, a electrólitos, o pH, a concentração alcoólica, a temperaura e a natureza dos catiões minerais temperaura e a natureza dos catiões minerais presentes em solução.presentes em solução.

PROTEÍNASPROTEÍNAS 5-Massa Molecular5-Massa Molecular As proteínas são moléculas com massa molecular As proteínas são moléculas com massa molecular

elevada. Pode determinar-se o peso molecular mínimo elevada. Pode determinar-se o peso molecular mínimo de uma proteína, por cálculo, a partir da concentração de uma proteína, por cálculo, a partir da concentração conhecida de um elemento nela existente.conhecida de um elemento nela existente.

Ex: A hemoglobina possui por cada molécula um átomo Ex: A hemoglobina possui por cada molécula um átomo de Fe na proporção de 0,34%.de Fe na proporção de 0,34%.

Aplicando a fórmula Aplicando a fórmula

P M mínimo= PA do elementoxnº de átomosx100P M mínimo= PA do elementoxnº de átomosx100 % do elemento na substância% do elemento na substância PM hemoglobina=55,85x1x100/0,34 = 16500 gPM hemoglobina=55,85x1x100/0,34 = 16500 g Este método é apenas aproximadoEste método é apenas aproximado

PROTEÍNASPROTEÍNAS As massas atómicas algumas vezes são As massas atómicas algumas vezes são

expressas em unidade de massa atómica expressas em unidade de massa atómica unificada (unificada (uu) ) . . Em bioquímica e biologia bioquímica e biologia molecular, particularmente no que se refere a molecular, particularmente no que se refere a proteínas, usa-se o termo proteínas, usa-se o termo DaltonDalton com o símbolo com o símbolo Da=uDa=u. Como as proteínas são moléculas muitos . Como as proteínas são moléculas muitos grandes as suas massas moleculares são grandes as suas massas moleculares são referidas em referidas em kDa, sendo 1 kDa= 1000 Da.kDa, sendo 1 kDa= 1000 Da.

Considerando o número de Avogadro e o Considerando o número de Avogadro e o conceito de moleconceito de mole

1u = 1 g1u = 1 g Praticamente em vez de se usar a unidade Praticamente em vez de se usar a unidade u u

utiliza-se a unidade utiliza-se a unidade g g para átomos e moléculas para átomos e moléculas não poliméricas.não poliméricas.

PROTEÍNASPROTEÍNAS Os processos físicos que permitem a Os processos físicos que permitem a

determinação da massa a molecular de determinação da massa a molecular de uma proteína são:uma proteína são:

Pressão OsmóticaPressão Osmótica Difusão da luzDifusão da luz

UltracentrifugaçãoUltracentrifugação UltrafiltraçãoUltrafiltração

PROTEÍNASPROTEÍNAS PRESSÃO OSMÓTICAPRESSÃO OSMÓTICA

Osmose é a propriedade Osmose é a propriedade pela qual um solvente pela qual um solvente passa de uma solução passa de uma solução pouco concentrada para pouco concentrada para outra mais concentrada, outra mais concentrada, através de uma através de uma membrana semi-membrana semi-permeável. Esta permeável. Esta passagem é dotada de passagem é dotada de uma força, que se reflete uma força, que se reflete na forma de pressão (p) na forma de pressão (p) sobre líquido. sobre líquido.

PROTEÍNASPROTEÍNAS Existem membranas, como as das células, que são Existem membranas, como as das células, que são

selectivas podendo apenas permitir a passagem de selectivas podendo apenas permitir a passagem de determinados solutos. determinados solutos.

Este processo de osmose é importante nos seres vivos, Este processo de osmose é importante nos seres vivos, pois é o responsável pela troca de substâncias entre o pois é o responsável pela troca de substâncias entre o organismo e o meio ambiente. organismo e o meio ambiente.

A pressáo osmótica ou potencial osmótico é dado pela A pressáo osmótica ou potencial osmótico é dado pela equação de Van´t Hoffequação de Van´t Hoff

RT C/MRT C/M= pressão osmótica= pressão osmóticaC=concentração do solutoC=concentração do solutoM= massa molecular do solutoM= massa molecular do solutoR= Constante dos gases perfeitos, R= Constante dos gases perfeitos, 0,082 atm·L/mol·K ou 0,082 atm·L/mol·K ou

62,3 mmHg·L/mol·K 62,3 mmHg·L/mol·K T= temperatura absolutaT= temperatura absoluta

PROTEÍNASPROTEÍNAS Colocando uma solução a 1% de proteína num Colocando uma solução a 1% de proteína num

osmómetro a 0ºC se gerar uma pressão osmómetro a 0ºC se gerar uma pressão osmótica P=3,79 mmHg, então a massa osmótica P=3,79 mmHg, então a massa molecular da proteína é de 45 kDa.molecular da proteína é de 45 kDa.

A pressão desenvolvida nos sistemas osmóticos A pressão desenvolvida nos sistemas osmóticos resulta directamente da pressão de difusão da resulta directamente da pressão de difusão da água, que em última análise é gerada pela água, que em última análise é gerada pela energia cinética inerente às partículas em energia cinética inerente às partículas em solução. Ou seja, a própria energia térmica de solução. Ou seja, a própria energia térmica de agitação das partículas é a responsável pelo agitação das partículas é a responsável pelo trabalho realizado em sistemas osmóticos. trabalho realizado em sistemas osmóticos.

PROTEÍNASPROTEÍNAS DIFUSÃO DA LUZDIFUSÃO DA LUZ

O Efeito TyndallO Efeito Tyndall é o efeito da difusão da luz é o efeito da difusão da luz em partículas coloidais, constituintes de em partículas coloidais, constituintes de emulsões e de suspensões. emulsões e de suspensões.

No ar este efeito resulta dos c.d.o. curtos do No ar este efeito resulta dos c.d.o. curtos do espectro solar, (zona azul) encontrarem as espectro solar, (zona azul) encontrarem as moléculas gasosas da atmosfera e serem moléculas gasosas da atmosfera e serem reflectidos por elas para a superfície da Terra.reflectidos por elas para a superfície da Terra.

Os maiores c.d.o do espectro solar, (zona Os maiores c.d.o do espectro solar, (zona vermelha) são menos afectados pelas vermelha) são menos afectados pelas partículas coloidais e atravessam a atmosfera partículas coloidais e atravessam a atmosfera até atingirem a superfície da Terra sem sofrer até atingirem a superfície da Terra sem sofrer este tipo de reflexão. este tipo de reflexão.

PROTEÍNASPROTEÍNAS FundamentoFundamento Este tipo de detector pode ser Este tipo de detector pode ser

usado para todos os solutos com usado para todos os solutos com volatibilidade inferior à da fase volatibilidade inferior à da fase móvel. Solutos semi-voláteis móvel. Solutos semi-voláteis podem ser detectados a relativas podem ser detectados a relativas baixas temperaturas nestas baixas temperaturas nestas condições. condições. Como se observa na figura ao Como se observa na figura ao lado, durante o trabalho do lado, durante o trabalho do instrumento têm de se executar instrumento têm de se executar três passos localizados três passos localizados respectivamente no nebulizador, respectivamente no nebulizador, na câmara de evaporação e no na câmara de evaporação e no sistema de detecção.sistema de detecção.

light-scattering detector (ELSD)


I-I-Nebulização do efluenteNebulização do efluente A nebulização é feita num tubo de Venturi A nebulização é feita num tubo de Venturi

semelhantemente ao que se passa numa semelhantemente ao que se passa numa absorção atómica.absorção atómica.

Quanto maiores forem as gotas formadas, Quanto maiores forem as gotas formadas, mais elevada será a temperatura necessária mais elevada será a temperatura necessária para evaporar a fase líquida Quanto maior as para evaporar a fase líquida Quanto maior as partículas do soluto, tanto mais intensa será a partículas do soluto, tanto mais intensa será a luz dispersiva.luz dispersiva.

PROTEÍNASPROTEÍNAS II- Evaporação do efluentII- Evaporação do efluentee O segundo passo inicia-se quando as O segundo passo inicia-se quando as

gotas arrastadas pelo fluxo gasoso entram gotas arrastadas pelo fluxo gasoso entram na área aquecida antes da câmara de na área aquecida antes da câmara de detecção. O solvente é completamente detecção. O solvente é completamente removido produzindo-se as partículas do removido produzindo-se as partículas do soluto sem solvatação ou mesmo gotas de soluto sem solvatação ou mesmo gotas de soluto puro.soluto puro.

PROTEÍNASPROTEÍNAS III-DetecçãoIII-Detecção

As partículas passam pela célula onde são As partículas passam pela célula onde são atravessadas por um feixe luminoso que é atravessadas por um feixe luminoso que é detectado por um sistema de detecção. Em detectado por um sistema de detecção. Em alguns instrumentos uma entrada de um fluxo alguns instrumentos uma entrada de um fluxo gasoso concentra as partículas no centro da gasoso concentra as partículas no centro da câmara de detecção.câmara de detecção.

A avaliação da dispersão por reflexão da luz, A avaliação da dispersão por reflexão da luz, baseia-se na Lei de Lambert-Beer, sendo baseia-se na Lei de Lambert-Beer, sendo necessário construir-se uma curva de calibração necessário construir-se uma curva de calibração com um conjunto de massas moleculares com um conjunto de massas moleculares certificadas. certificadas.

PROTEÍNASPROTEÍNAS ULTRACENTRIFUGAÇÃOULTRACENTRIFUGAÇÃO Para sedimentar as proteínas em solução é Para sedimentar as proteínas em solução é

necessário o emprego de elevadas forças necessário o emprego de elevadas forças centrífugas, com velocidades que ultrapassam centrífugas, com velocidades que ultrapassam 60.000 rotações/minuto, com campos 60.000 rotações/minuto, com campos gravitacionais entre 300.000-500.000 G.gravitacionais entre 300.000-500.000 G.

Cada proteína é caracterizada por uma Cada proteína é caracterizada por uma constante de sedimentação que se distribuie constante de sedimentação que se distribuie entre 10entre 10-13-13 s e 200x10 s e 200x10-13-13 s. s.

A unidade de sedimentação é o Svedberg (S).A unidade de sedimentação é o Svedberg (S). Um Svedgerg correspondente a uma constante Um Svedgerg correspondente a uma constante

de sedimentação 10de sedimentação 10-13-13 s. s. 1S=101S=10-13-13

PROTEÍNASPROTEÍNAS A massa molecular de uma proteína está relacionada com a A massa molecular de uma proteína está relacionada com a

constante de sedimentação (S) pela equaçãoconstante de sedimentação (S) pela equação M= RTS/D(1-VM= RTS/D(1-V))

M=massa molecularM=massa molecular R=constante dos gases perfeitosR=constante dos gases perfeitos T= temperatura absolutaT= temperatura absoluta D=constante de difusãoD=constante de difusão S=constante de sedimentaçãoS=constante de sedimentação V= volume específico parcial (aumento de volume sofrido V= volume específico parcial (aumento de volume sofrido

por 1 g de proteína ao juntar um grande volume de solvente)por 1 g de proteína ao juntar um grande volume de solvente) =densidade do líquido=densidade do líquido Uma outra técnica utiliza o conceito de equilíbrio de Uma outra técnica utiliza o conceito de equilíbrio de

sedimentação. Neste caso centrifuga-se a solução até que sedimentação. Neste caso centrifuga-se a solução até que se estebeleça um equilíbrio, isto é, que até naõ se dar a se estebeleça um equilíbrio, isto é, que até naõ se dar a migração das moléculas.migração das moléculas.

PROTEÍNASPROTEÍNAS ULTRAFILTRAÇÃOULTRAFILTRAÇÃO

A ultrafiltração é uma técnica A ultrafiltração é uma técnica que consiste na passagem que consiste na passagem de moléculas por uma rede de moléculas por uma rede formada por ligações formada por ligações cruzadas num poliósido cruzadas num poliósido tridimensional que pode ser tridimensional que pode ser Dextrano ou Sephadex.Dextrano ou Sephadex.

As moleculas penetram no As moleculas penetram no interior das malhas da rede interior das malhas da rede de acordo com o tamanho de acordo com o tamanho destas, como se passassem destas, como se passassem pelas malhas de um peneiro.pelas malhas de um peneiro.

Ultrafltração

PROTEÍNASPROTEÍNAS O Dextrano é um polímero O Dextrano é um polímero

de glucose com ligações de glucose com ligações (1-6) e (1-6) e (1-3) ou (1-3) ou (1-4). Os (1-4). Os Sephadex são polímeros de Sephadex são polímeros de dextrano com epicloridrina dextrano com epicloridrina com ligações (2-2).com ligações (2-2).

O Sphadex G25 para O Sphadex G25 para peptidos entre 1000 Da-5000 peptidos entre 1000 Da-5000 Da e o Sephadex G100 para Da e o Sephadex G100 para proteínas entre 5000 Da e proteínas entre 5000 Da e 300 kDa.300 kDa.

sphadex

PROTEÍNASPROTEÍNAS CONFORMAÇÃO PROTEICACONFORMAÇÃO PROTEICA

A conformação proteica diz respeito às rotações que A conformação proteica diz respeito às rotações que toda a estrutura proteica faz sobre si própria como toda a estrutura proteica faz sobre si própria como resultado da presença de ligações simples. Estas resultado da presença de ligações simples. Estas rotações podem, na totalidade ou em parte, explicar as rotações podem, na totalidade ou em parte, explicar as estruturas secundária, terceária e quaternária das estruturas secundária, terceária e quaternária das proteínas.proteínas.

A conformação das proteínas é estudada por:A conformação das proteínas é estudada por: -Difracção de Raios X-Difracção de Raios X -Espectrofotometria de V-UV-Espectrofotometria de V-UV -Fluorescência -Fluorescência -Espectropolarimetria-Espectropolarimetria -Dicroísmo circular -Dicroísmo circular -Dispersão da óptica rotatória da luz -Dispersão da óptica rotatória da luz -Substituição isomorfa-Substituição isomorfa

PROTEÍNASPROTEÍNAS DIFRACÇÃO DE RAIOS XDIFRACÇÃO DE RAIOS X O uso da técnica de Raios X para o estudo de O uso da técnica de Raios X para o estudo de

proteínas foi efectuado por Kendrew e col. Sobre a proteínas foi efectuado por Kendrew e col. Sobre a molécula da mioglobina. Por meio desta técnica molécula da mioglobina. Por meio desta técnica verificou-se que a mioglobina uma proteína de peso verificou-se que a mioglobina uma proteína de peso molecular de 17Da, obtida a partir d músculo de molecular de 17Da, obtida a partir d músculo de cachalote. É formada por 153 resíduos de aminoácidos cachalote. É formada por 153 resíduos de aminoácidos e um grupo heme coordenado a cada um dos quatro e um grupo heme coordenado a cada um dos quatro átomos de azoto dos núcleos pirrólicos. O quinto lugar átomos de azoto dos núcleos pirrólicos. O quinto lugar de coordenação é ocupadp por dos a´tomos de azoto de coordenação é ocupadp por dos a´tomos de azoto do resíduo da histidina da cadeia polipetídica e o sexto do resíduo da histidina da cadeia polipetídica e o sexto lugar da coordenação ocupado pelo oxigénio que se lugar da coordenação ocupado pelo oxigénio que se liga reversivelmente. Os estudos de Kndrew perimitam liga reversivelmente. Os estudos de Kndrew perimitam não só determinar a forma como as zonas de estrutura não só determinar a forma como as zonas de estrutura helicoidal desta proteína.helicoidal desta proteína.

PROTEÍNASPROTEÍNAS DISPERSÃO ROTATÓRIA (dor)DISPERSÃO ROTATÓRIA (dor) A dispersão rotatória da luz é a variação da actividade A dispersão rotatória da luz é a variação da actividade

óptica de um composto em função do comprimento de óptica de um composto em função do comprimento de onda da luz. Nesta técnica associa-se um onda da luz. Nesta técnica associa-se um monocromador a um polarímetro para se conseguir monocromador a um polarímetro para se conseguir estudar a variação do poder rotatório com o estudar a variação do poder rotatório com o comprimento de onda para as duas componentes comprimento de onda para as duas componentes circulares para um feixe de luz polarizada circularmente. circulares para um feixe de luz polarizada circularmente. Este estudo é feito matematicamente usando modelos Este estudo é feito matematicamente usando modelos de comparação que são polipeptidos sintéticos.de comparação que são polipeptidos sintéticos.

DICROÍSMO CIRCULAR (DC)DICROÍSMO CIRCULAR (DC) Fundamento-Fundamento-O dicroismo circular (CD) é a diferença de O dicroismo circular (CD) é a diferença de

absorção, A, da luz circularmente polarizada à esquerda absorção, A, da luz circularmente polarizada à esquerda e à direita: e à direita:

CD = AE – AD CD = AE – AD g(1)g(1)

PROTEÍNASPROTEÍNAS O dicroismo circular (CD) é particularmente útil para o O dicroismo circular (CD) é particularmente útil para o

estudo de moléculas quirais, macromoléculas, sejam elas estudo de moléculas quirais, macromoléculas, sejam elas ou não de origem biológica, tais como proteínas, ou não de origem biológica, tais como proteínas, carbohidratos, dendrímeros, etc., compostos esses, que carbohidratos, dendrímeros, etc., compostos esses, que possuem unidades opticamente activas, ou seja, podem possuem unidades opticamente activas, ou seja, podem exibir sinal na espectroscopia de dicroismo circular. exibir sinal na espectroscopia de dicroismo circular. Quando tais moléculas interagem com a luz circularmente Quando tais moléculas interagem com a luz circularmente polarizada provocam uma alteração nessa luz incidente. polarizada provocam uma alteração nessa luz incidente. A técnica de CD detecta exactamente a alteração através A técnica de CD detecta exactamente a alteração através da medida da diferença da absorção da luz circularmente da medida da diferença da absorção da luz circularmente polarizada à esquerda e à direita, após a luz passar pela polarizada à esquerda e à direita, após a luz passar pela amostra, como se mostra na equação (1). amostra, como se mostra na equação (1). A determinação faz-se em solução aquosa para que a A determinação faz-se em solução aquosa para que a estrutura de uma proteína se aproxime ao máximo da que estrutura de uma proteína se aproxime ao máximo da que existe a nível biológico.existe a nível biológico.

PROTEÍNASPROTEÍNASA luz pode ser polarizada linearmente quando a A luz pode ser polarizada linearmente quando a

orientação é fixa e única, não variando ao orientação é fixa e única, não variando ao longo da direcção do feixe luminoso. A luz é longo da direcção do feixe luminoso. A luz é polarizada circularmente quando a orientação polarizada circularmente quando a orientação varia gradualmente ao longo da direcção do varia gradualmente ao longo da direcção do feixe luminoso, rodando no sentido dos feixe luminoso, rodando no sentido dos ponteiros do relógio ou em sentido contrário.ponteiros do relógio ou em sentido contrário.No dicroísmo circular associa-se um No dicroísmo circular associa-se um espectrofotómetro a um polarímetro circular. espectrofotómetro a um polarímetro circular. Deste modo pode observar-se a diferença de Deste modo pode observar-se a diferença de absorção para um dado comprimento de onda absorção para um dado comprimento de onda das duas componentes circulares da luz das duas componentes circulares da luz polarizada.polarizada.

PROTEÍNASPROTEÍNAS SUBSTITUIÇÃO ISOMÓRFICA MÚLTÍPLA

A primeira estrutura de proteína resolvida foi a mioglobina em 1959. Essa estrutura foi resolvida por Kendrew e Perutz. Para a resolução da estrutura cristalográfica da mioglobina foi usado o método de substituição isomórfica múltipla. Este método usa uma abordagem reducionista para a solução do problema da fase. Podemos pensar no cristal de proteína como um “mar”, quase homogêneo, de densidade eletrônica.

Num mapa como este, a inclusão de densidades eletrónicas maiores destacavam-se no mar de densidade eletrónica. Tal efeito é obtido com a inclusão de metais pesados no cristal.

PROTEÍNASPROTEÍNAS Numa experiência típica de substituição isomórfica, recolhem-se dados de difração

de raios X de um cristal nativo, sem metal pesado adicionado ao retículo cristalino, e

outros conjuntos de dados com metais pesados adicionados ao retículo cristalino,

chamados derivados isomorfos. Assim, temos pelo menos dois conjuntos de

dados de difração de raios X: um nativo e outro com o metal.

PROTEÍNASPROTEÍNAS O crescimento do número de estruturas de

proteínas resolvidas gerou uma vasta base de dados estruturais, armazenadas no PDB (protein data bank) (www.rcsb.org/pdb).

Partindo do pressuposto que proteínas que compartilham alta identidade na estrutura primária, apresentam o mesmo enovelamento, Rossmann propôs em 1962 um método onde as informações sobre a fase de uma proteína, com estrutura 3D desconhecida, mas que apresentava estrutura primária similar com outra resolvida, poderia usar as informações estruturais da proteína resolvida como informação inicial.

Tal método é chamado de substituição molecular.

PROTEÍNASPROTEÍNAS APLICAÇÃO DE ISÓTOPOS RADIOACTIVOSAPLICAÇÃO DE ISÓTOPOS RADIOACTIVOS Pode obter-se uma visão da estrutura de uma proteína Pode obter-se uma visão da estrutura de uma proteína

por meio da velocidade e capacidade de troca entre os por meio da velocidade e capacidade de troca entre os átomos de Hidrogénio e Deutério numa proteína. átomos de Hidrogénio e Deutério numa proteína. Enquanto que os átomos de hidrogénio nos grupos Enquanto que os átomos de hidrogénio nos grupos livres amina, carboxilo, hidroxilo e amida são livres amina, carboxilo, hidroxilo e amida são facilmente trocados com o isótopo deutério, os facilmente trocados com o isótopo deutério, os hidrogénios que estão a estabelecer ligações por hidrogénios que estão a estabelecer ligações por pontes de hidrogénio são mais difíceis de substituir. pontes de hidrogénio são mais difíceis de substituir.

Estando as pontes de hidrogénio ligadas à estrutura Estando as pontes de hidrogénio ligadas à estrutura helicoidal das proteínas usam-se os valores da helicoidal das proteínas usam-se os valores da velocidade de substituição para determinar o grau de velocidade de substituição para determinar o grau de configuração helicoidal.configuração helicoidal.


http://ift.confex.com/ift/98annual/techprogram/acceptedhttp://ift.confex.com/ift/98annual/techprogram/accepted/925.htm/925.htm solubilidade das proteínas de soja solubilidade das proteínas de soja

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6B Proteínas des físicas

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