NUTRIÇÃO E CULTIVODE

MICRORGANISMOS

INTRODUÇÃO

Células microbianas: diferentes macromoléculas

Água 70% MU - MSMacromoléculas totais 26% 96%Proteínas 15% 55%Polissacarídeos 3% 5%Lipídeos 2% 9%DNA/RNA 1/5 3/20Aminoácidos 0,5 0,5Íons inorgânicos 1 1

Precursores das macromoléculas: ALTERNATIVAS• retirados do meio• sintetizados

Princípio geral de economia celular: preferência !

ELEMENTOS QUÍMICOS

Substâncias/elementos retirados = NUTRIENTES

Classes: MACRONUTRIENTES e MICRONUTRIENTES

! Macronutrientes: necessários em maior quantidadeprincipais constituintesC, O, H, N e S (90% composição)

! Micronutrientes: K, Ca, Fe, Mn, etc.

Água: quantidade, solvente, substrato ou produto

MACRONUTRIENTES

CARBONO

Forma inorgânica: carbonatos e CO2 – AUTOTRÓFICO

Redução do C: energia química (Quimioautotrofismo)energia luminosa (Fotoautotrofismo)

Forma orgânica: HETEROTRÓFICO

QuimioheterotrofismoFotoheterotrofismo (luz-energia)

Capacidade de utilização: potencial genético

Degradação de compostos orgânicos !

OXIGÊNIO: O2 ou parte de moléculas e íons

O2: aceptor final de elétrons (respiração aeróbia)

Inibição de atividade e/ou síntese de enzimas

Água e CO2 = fontes de O2 dos compostos celulares

HIDROGÊNIO: H2 ou parte de moléculas e íons

H2: fonte de substrato oxidável (bactérias do H)

Elevada % do material celular: compostos orgânicos e inorgânicos

NITROGÊNIO: orgânicos (aa, bases nitrogenadas, etc.)/inorgânicos (N2, NH3, NO3, etc.)

N2: 78% do ar atmosférico – poucas bactérias (FBN)

Redução por enzima: NITROGENASE

NH3: mais prontamente assimilável (grupo amino)

NO3: enzima (nitrato redutase assimilatório) – NH3

Aceptor final de elétrons – respiração anaeróbia

• NH3 e NO2 – fontes de energia (nitrificantes)

• N orgânico: economia de energia para síntese

(ausência de enzimas necessárias à síntese)

ENXOFRE: SO4 ou H2S

SO4: aceptor final de elétrons (respiração anaeróbia)

Incorporação a aa (cisteína e metionina) e vitaminas (biotina e tiamina)

Centros reativos de proteínas (ferredoxina) – cadeia de transporte de elétrons e nitrogenase

H2S: fonte de substrato oxidável (fototróficas ou quimiotróficas)

MICRONUTRIENTES – íons inorgânicos

Mg, K, P e Fe - Mn, Ca, Zn, Na, Cl, Cu, Co, Mo, Se e etc.

Adicionados Impurezas ou f (sp)

MAGNÉSIO

Associado a ácidos nucléicos e nucleotídeos

Coenzimas

Componente da molécula da clorofila

CÁLCIO

[ ] interna < que a externa (contrário a outros íons)

FERRO: férrico (Fe3+) e ferroso Fe2+ (preferência)

Sideróforos (cargas – S, O, N) : transporte de Fe3+

Processos infecciosos (efeito bacteriostático)

Composição de diversas proteínas

POTÁSSIO: Síntese protéica e co-fator de muitas enzimas

ZINCO: atividade de diversas enzimas

FATORES AMBIENTAIS

Influência na absorção --------- METABOLISMO

Pressão osmótica, pH, temperatura, O2 e luz

PRESSÃO OSMÓTICA

Saída de água de meio mais diluído (hipotônico) para o mais concentrado (hipertônico)

Normalmente: interno (mais concentrado) – PAREDE

Gram + : pressão osmótica de 5 a 22 atmGram - : pressão osmótica de 0,8 a 5 atm

Controle de pressão: íons K*, aa e açúcares !

Concentração salina

Não-halofílicas: < 0,05% (rios e lagos)

marinhas = 3,5%

Halofílicas: > 0,5% halotolerantes < 6%

halofílicas extremas < 30%

Sódio: transporte/estabilidade/atividade de enzimas

Organização/estabilização da membrana externa:

neutralização de cargas negativas de seus lipídeos

Concentração de sódio

Velo

cid

ad

e d

e c

resc

imen

to

TEMPERATURA

Influência: absorção, crescimento e sobrevivência !

Determina a velocidade das reações metabólicasvelo

cid

ad

e d

e c

resc

imen

to

temperatura

T min:gelificação damembrana –

transporte

T ótima

T máx:desnaturação

de proteínas e colapso da membrana

Adaptação a temperaturas: estruturais e fisiológicas

Segundo a T ótima: Psicrófilas 12 – 17oC

Mesófilas 18 – 37oC **

Termófilas 57 – 63oC

T. extremas 83 – 87oC

Psicrófilas: membrana citoplasmática com alta [ ] de ácidos graxos insaturados (fluidez)

Termófilas: organização tridimensional de proteínas que evita a desnaturação

pH

Exibição de maior atividade metabólica:

acidófilos 1,8 – 5

neutrófilos 5 –9 (grande maioria)

alcalófilos 9 –11

pH intracelular mantido constante: bactérias

enzimas ativas ente 6,8 – 7,2

OXIGÊNIO

Papel decisivo no crescimento:

aeróbias estritas necessidade absoluta de O2(Pseudomonas aeruginosa)

microaerófilas O2 mas em baixa tensão(Azospirillum lipoferum)

facultativas presença ou ausência de O2

anaeróbias aerotolerantes não O2 mas neutraliza-o(Streptococcus faecalis)

anaeróbias estritas O2 é letal (Clostridium tetani)

Culturas líquidas aeróbias : agitação ou borbulhamento com ar estéril

Culturas anaeróbias: técnicas mais complexas

• frasco completo e vedado

• tioglicolato (agente redutor) - reação forte com O2

• atmosfera controlada com gás inerte (N2 ou H2)

LUZ

Fator essencial para bactérias fotossintetizantes

Inibição de outras em presença de luz

MEIOS DE CULTURA

Mistura de nutrientes necessários ao crescimento, nas concentrações adequadas + substâncias tamponantes (neutralização de produtos de excreção dos microrganismos).

Fontes de C, de energia e outros elementos dependem do tipo nutritivo do microrganismo !

Microrganismos mais ou menos exigentes (capacidade de sintetizar os compostos celulares)

Definição dos componentes dos meios... ESTUDOS

Mycobacterium leprae (hanseníase): não cultivada!

FATORES DE CRESCIMENTOMicrorganismos incapazes de sintetizar determinados compostos orgânicos essenciais para seu metabolismo – obtenção do meio natural ou artificial

Muitos fatores: coenzimas (= vitaminas nos humanos)

Vitaminas, aminoácidos e nucleosídeos

MEIOS SINTÉTICOS E NÃO-SINTÉTICOS (COMPLEXOS)

Sintético: composição química conhecida (simples ou bastante complexa)

Não-sintético (complexo): composição indefinida, desconhecida (quali e quantitativamente)

Meios complexos: extratos de tecidos ou órgãos animais (carne, músculo, fígado, etc.), extratos de levedura, de malte e caseína.

Fontes de proteínas, peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, ácidos orgânicos, carboidratos, sais minerais e vitaminas.

Proteínas para meios de cultura: parcialmente hidrolisadas (peptídeos de diferentes tamanhos) = peptonas, triptonas, etc.

MEIO SINTÉTICO MEIO COMPLEXO

glicose glicoseNH4Cl extrato de carneKH2PO4 extrato de leveduraAlanina KH2PO4Vitamina K K2HPO4ZnSO4 peptonaÁgua ÁguaÁgar Ágar

• Fontes de energia: luz, compostos (in)orgânicos

• Fontes de C: CO2 (carbonatos) ou C orgânico

• Fontes de N, P, K, Ca, ..., aminoácidos, vitaminas, etc.

Doadores de e-: oxidação de compostos inorgânicos:

Classe Doador de e- Espécie

Hidrogênio H2 Hydrogenomonas sp.Enxofre H2S Thiobacillus sp.

HS- Beggiatoa sp.Amônio NH4+ Nitrosomonas sp.Nitrito NO2- Nitrobacter sp.Ferro Fe2+ Thiobacillus ferrooxidans

Aceptor final de e-: O2, NO3-, NO2-, SO42-, CO3

2-, orgânicos

MEIOS LÍQUIDOS, SÓLIDOS E SEMI-SÓLIDOS

Polissacarídeo extraído de algas vermelhas = ÁGAR

Não constitui nutriente para a maioria dos organismos

Meios sólidos = crescimento superficial no meio, em colônias isoladas (originadas de uma única célula).

Meios semi-sólidos = mobilidade (movimentação por flagelos)

Meios líquidos = curvas de crescimento/inoculações

MEIOS SELETIVOS E DIFERENCIAIS

Não existe um meio de cultura “universal”

Necessidades diferentes de cada grupo microbiano:O2, temperatura, pH, fontes de C, vitaminas, etc.

Meio seletivo: meio contendo uma substância inibidora (antibiótico por ex.) do crescimento de um grupo de microrganismos. Ciclohexamida e estreptomicina.

Meio contendo uma única fonte de C (celulose/amido)Meio sem N combinado (favorece os fixadores de N2)

Meio diferencial: permite a distinção de colônias de microrganismos diferentes por meio do acréscimo de algum composto específico (sangue, indicadores pH)...

EXOENZIMAS

Quebra de moléculas complexas por ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelos microrganismos

Amilase amido Bacillus subtilisCelulase celulose Clostridium thermocellumPeptidase peptídeos Bacillus megatheriumDesoxirribonuclease DNA Streptococcus haemolyticusRibonuclease RNA Bacillus subtilisLipase lipídeos Clostridium welchii

Concentração regulada:Os substratos degradados pelas enzimas são sempre utilizados preferencialmente.

Síntese ocorre: presença do substrato no meio, associada à ausência de glicose.

----++Meio F, glicoseG

+-----(NH4)2SO4, K2HPO4, FeSO4, KCl, MgSO4, Ca(NO2)2

F

-----+K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, glicose, FeSO4, NaMoO4

E

-+++++Extrato de carne, peptona, extrato de levedura

D

--++++Extrato de carne, peptona

C

--+---NH4H2PO4,NaCl, MgSO4, K2HPO4, amido

B

--+-++NH4H2PO4,NaCl, MgSO4, K2HPO4, glicose

A

Thiobacillus ferrooxidans

Lactobacillus sp

Bacillus sp

Staphilococcus aureus

Escherichia coli

Azotobacter vinelandii

ComposiçãoMeio de cultura