2º ano, 1º semestre 2013-2014 - ff.ul.ptjvitor/My_site/BioqI_files/Protocolos Aulas... · 1.3....

1

MESTRADO INTEGRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

BIOQUÍMICA I

AULAS PRÁTICAS

2º ano, 1º semestre

2013-2014

2

ÍNDICE

1. Introdução

1.1. Objectivos 4

1.2. Temas de trabalho 4

1.3. Calendarização das aulas práticas 5

1.4. Organização das aulas práticas 7

1.5. Avaliação 7

1.6. Bibliografia 8

2. Protocolos das Aulas Práticas

2.1. Tema A: Aminoácidos e Proteínas

A.2 Exercícios - Determinação da sequencia e do pI de péptidos 11

A.4 Apresentações – Métodos cromatográficos e electroforéticos para separação e

análise de proteínas

16

A.5 Apresentações - Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de

proteínas

17

A.6 Exercícios – Utilização de curvas de calibração para determinação do teor

proteico por métodos espectrofotométricos

18

A.7 Exercícios – Utilização de ferramentas bioinformáticas para estudo de proteínas 22

2.2. Tema B: Enzimas

B.1 Exercícios - Determinação de actividades enzimáticas e de parâmetros cinéticos

de enzimas Michaelianas

24

B.2 Exercícios - Determinação de parâmetros cinéticos de enzimas alostéricas 27

B.3 Exercícios - Determinação do tipo de inibição e constante de inibição (KI) 30

2.3. Tema C: Glúcidos

C.1 Apresentações - Métodos de análise e caracterização de glúcidos 34

2.4. Tema D: Lípidos

D.1 Apresentações - Métodos de extracção, separação e quantificação de lípidos 37

2.5. Tema E: Metabolismo Intermediário

E.1 Exercícios - Fosforilação oxidativa 39

E.2 Exercícios - Balanço energético do metabolismo glucídico e lipídico 41

E.3 Apresentações – Doenças Hereditárias do Metabolismo 43

3

1. INTRODUÇÃO

4

1.1. OBJECTIVOS

A componente prática de Bioquímica I instrui na utilização de metodologias experimentais

necessárias ao estudo qualitativo e quantitativo de macromoléculas, tais como péptidos e

proteínas (entre elas enzimas), glúcidos e lípidos. As aulas encontram-se configuradas de modo a

proporcionar ao aluno a discussão crítica dos conhecimentos adquiridos através da formulação de

questões, resolução de exercícios, discussão dos respectivos resultados e apresentação de

trabalhos sobre os Temas em estudo.

1.2. TEMAS DE TRABALHO

A. AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos: cromatografia mono e

bidimensional em camada fina; cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);

derivatização de aminoácidos;

2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:

Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;

3. Sequenciação peptídica: hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de

Edman;

4. Separação de proteínas por métodos cromatográficos: cromatografias de exclusão

molecular, troca-iónica, afinidade e hidrófoba.

5. Separação de proteínas por electroforese: separação por massa e por pI; electroforese

desnaturante/nativa; electroforese mono/bidimensional;

6. Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas: métodos de

Lowry, Bradford, Ácido bicinconínico (BCA) e absorção no UV;

7. Ferramentas bioinformáticas para estudo de proteínas: BLAST, PDB (Protein Data

Bank), Uniprot, Expasy, Molecular Viewers (Chimera)

B. ENZIMAS

1. Utilização de ferramentas informáticas para estudo e caracterização de enzimas:

determinação da actividade enzimática, parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas

e de enzimas alostéricas e de constantes de inibição.

C. GLÚCIDOS

1. Métodos de análise e caracterização de glúcidos: métodos cromatográficos; reacções

de identificação (reacções de Benedict, Barfoed, Selivanoff, Bial, Ácido múcico e

Osazonas); marcha geral de identificação de açúcares.

5

D. LÍPIDOS

1. Métodos de análise e caracterização de lípidos: fraccionamento lipídico e análise

qualitativa das fracções obtidas.

E. METABOLISMO INTERMEDIÁRIO

1. Metabolismo energético: estudo da fosforilação oxidativa; balanço energético do

metabolismo glicídico e lipídico;

2. Doenças Hereditárias do Metabolismo: apresentação e discussão de 8 Temas (Grupos

de 4 alunos).

1.3. CALENDARIZAÇÃO DAS AULAS PRÁTICAS

Número de aulas: 12

Data

30/09 – 04/10

Prática 1

Apresentação da componente prática de Bioquímica I

Apresentação do programa da componente prática e respectiva avaliação; regras de funcionamento; organização da turma em grupos

Tema A: Aminoácidos e Proteínas

A.1 - Identificação e separação de aminoácidos; Sequenciação peptídica; Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos; Determinação do pI de aminoácidos e péptidos.

07/10 – 11/10

Prática 2


A.2 - Exercícios: determinação da sequência e do pI de péptidos

A.3 - Purificação, detecção e caracterização de proteínas: Introdução.

14/10 – 18/10

Prática 3


A.4 – Apresentações: Tema “Métodos cromatográficos e electroforéticos para separação e análise de proteínas”: (1) cromatografia de exclusão molecular e troca-iónica; (2) cromatografia de afinidade e hidrófoba; (3) electroforese monodimensional desnaturante; (4) electroforese bidimensional e focagem isoeléctrica.

21/10 – 25/10

Prática 4


A.5 – Apresentações: Tema “Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas”: (1) Método de Lowry; (2) Método do Ácido bicinconínico BCA; (3) Método de Bradford e (4) Absorvência no ultravioleta;

A.6 - Exercícios: Utilização de curvas de calibração para determinação do teor proteico por métodos espectrofotométricos.

6

28/10 - 01/11

Prática 5


A.7 – Exercícios: utilização de ferramentas Bioinformáticas para estudo de proteínas.

04/11 – 08/11

Prática 6

Tema B: Enzimas

B.1 – Exercícios: determinação de actividades enzimáticas e de parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas.

11/11 – 15/11

Prática 7

Tema B: Enzimas

B.2 - Exercícios: determinação de parâmetros cinéticos de enzimas alostéricas;

B.3 - Exercícios: determinação de constantes de inibição.

18/11 – 22/11

Prática 8

Tema C: Glúcidos

C.1 - Estrutura e função dos glúcidos: propriedades químicas e estruturais;

C.2- Apresentações: Tema “Métodos de Análise e Caracterização de Glúcidos”: (1) Provas de Benedict e Barfoed; (2) Provas do ácido múcico e de Selivanoff; (3) Prova de Bial e Prova das Ozasonas; (4) Técnicas cromatográficas.

Tema D : Lípidos

D.1 - Estrutura e função dos Lípidos: propriedades químicas e estruturais;

25/11 – 29/11

Prática 9

Tema D : Lípidos

D.2 – Apresentações: Tema “Métodos de extracção, separação, identificação e quantificação de lípidos”: (1) Métodos de extracção de lípidos totais e de extracção diferencial; (2) Separação e identificação de fosfolípidos por técnicas cromatográficas; (3) Métodos de doseamento de fosfolípidos; (4) Métodos de doseamento de colesterol.

Tema E : Metabolismo Intermediário

E.1 Exercícios: fosforilação oxidativa

02/12 – 06/12

Prática 10


E.2 – Exercícios: balanço energético do metabolismo glucídico e lipídico

09/12 – 13/12

Prática 11


E.3 – Apresentações: Tema “Doenças Hereditárias do Metabolismo”: (1) Deficiência em PDH; (2) Deficiência em MCAD; (3) Doença de Gaucher; (4) Galactosémia clássica.

16/12 – 20/12

Prática 12


E.3 – Apresentações: Tema “Doenças Hereditárias do Metabolismo”: (1) Fenilcetonúria; (2) Homocistinúria clássica; (3) Deficiência em CPSI; (4) Tirosinémia tipo I

7

1.4. ORGANIZAÇÃO DAS AULAS PRÁTICAS

As turmas são compostas por um máximo de 32 alunos divididos em grupos de 4 elementos.

Nas aulas de exercícios os alunos irão resolver problemas relacionados com os Temas de

Trabalho. Os alunos deverão ser conhecedores dos Temas que vão abordar e estar aptos a

responder às questões colocadas pelo docente e pelos colegas durante o desenrolar da aula.

Nas aulas de Apresentações os alunos irão expor oralmente o resultado da pesquisa efectuada

sobre os Temas de trabalho propostos. As normas para as apresentações encontram-se

detalhadas nas páginas 16, 17, 34, 37 e 43.

Como apoio às aulas práticas os alunos deverão possuir um caderno o qual deverá estar sempre

actualizado e presente em todas as aulas.

1.5. AVALIAÇÃO

Os alunos têm que frequentar, no mínimo, 2/3 das aulas realizadas (8 aulas).

Os conhecimentos adquiridos pelos alunos serão avaliados de forma contínua ao longo do

semestre. Esta avaliação terá em conta a preparação dos exercícios a realizar, o interesse e

participação nas aulas, a preparação dos Temas a apresentar e a Avaliação final. A ponderação

dos vários elementos de avaliação prática será a seguinte:

a) 5% - Assiduidade (onde se inclui ausência de reparos em relação ao material exigido

para as aulas);

b) 10% - Desempenho na resolução dos exercícios apresentados (onde de se inclui o

interesse e participação nas aulas);

c) 45% - Apresentação dos Temas de Trabalho;

d) 40% - Teste.

A classificação final da disciplina é a média ponderada da classificação obtida no exame teórico

final (70%) e no ensino prático (30%).

8

1.6. BIBLIOGRAFIA

Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. Devlin TM ed. 6th ed. Wiley-Liss, New-

York, 2006. Chapter 3:127-129.

Bioquímica: Organização Molecular da Vida. Quintas A, Freires AP e Halpern MJ. Lidel. 2008.

Capítulo 3: 186.

Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. Wilson K e Walker J. 6th ed.

Cambridge University Press, New York, 2005.

Lehninger “Principles of Biochemistry”. Nelson DL and Cox MM, ed. 4th ed. W.H.Freeman &

Company, New York. Chapter 3: 89-96.

Harper’s Illustrated Biochemistry. Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. 27th ed. Lange

Medical Books/McGraw-Hill. Chapter 4: 21-29.

9

2. PROTOCOLOS DAS AULAS PRÁTICAS

10

TEMA A

- Aminoácidos e Proteínas -

11

A.2- EXERCÍCIOS

DETERMINAÇÃO DA SEQUENCIA E DO pI DE PÉPTIDOS

Objectivo:

Utilização dos conhecimentos adquiridos na Aula A.1 sobre as características químicas e

estruturais de aminoácidos e péptidos para determinação da sequência de aminoácidos numa

cadeia polipeptídica, dedução das formas ionizadas em função do pH do meio e determinação do

pI.

Para realização dos exercícios propostos deverá ser utilizada a informação fornecida nas Tabelas

A2-1, A2-2 e A2-3.

Exercício A2-1. Considerando a informação que lhe é fornecida construa a sequência do seguinte

péptido. No final identifique os terminais amina e carboxílico e designe o péptido

identificado. Indique para que pHs o péptido apresenta carga positiva, o seu pI e

a sua massa molecular.

a. A hidrólise completa com HCl 6 M, a 110ºC, seguida da análise dos aminoácidos revelou a

presença de Gly, Leu, Phe e Val, na razão molar de 1:1:1:1.

b. O tratamento do péptido com cloreto de dansilo, seguida de hidrólise e análise

cromatográfica, revelou a presença de um derivado dansilado com Val.

c. A digestão do péptido com pepsina, seguida de cromatografia e análise sequencial, revelou a

presença de um dipéptido constituído por Leu e Phe e de um dipéptido constituído por Val e

Gly, na razão molar de 1:1.



identificado. Indique par que valores de pH o qual o péptido apresenta carga

positiva, o seu pI e a sua massa molecular.

a. Hidrólise completa com HCl 6M, 110ºC, seguida da análise dos aminoácidos, revelou a

presença de Gly, Ala, Phe, Tyr, Met e Lys, na razão molar 1:1:1:1:1:1.

b. Tratamento do péptido com cloreto de dansilo, seguida de hidrólise e análise cromatográfica,

revelou a presença de um derivado dansilado com Ala.

c. Digestão do péptido com brometo de cianogénio seguida de análise cromatográfica, revelou

a presença de um tetrapéptido constituído por Gly, Phe, Ala e Met e de um dipéptido.

d. Digestão do dipéptido com quimotripsina revelou a presença de Lys e de Tyr livre. Digestão

do tetrapéptido com a mesma enzima revelou a presença de um tripéptido e de Met livre.

12



identificado. Indique para que valores de pH o péptido apresenta carga negativa,

o seu pI e a sua massa molecular.

a. Tratamento do péptido com cloreto de dansilo, seguida de hidrólise e análise cromatográfica

revelou a presença de um derivado dansilado com Leu.

b. Hidrólise completa com HCl 6M, 110ºC, seguida da análise dos aminoácidos revelou a

presença de Ala, Phe, Gly, Lys, Leu e Tyr.

c. A digestão do péptido com tripsina revelou a presença de dois tripéptidos. A análise de um

dos tripéptidos revelou a presença de Leu, Gly e Lys.

d. A digestão do segundo tripéptido, obtido em c), com carboxipeptidase, 5 min a 37ºC, revelou

a presença de Phe, enquanto que 10 min a 37ºC, revelou a presença de Ala e Phe.

Exercício A2-4. No decorrer do estudo da proteína A foi efectuada uma clivagem com brometo

de cianogénio. De entre outros péptidos, isolou-se o péptido A o qual se verificou

não ser o péptido C-terminal. De modo a poder determinar a sequência este

péptido, efectuaram-se vários ensaios que, juntamente com os resultados

obtidos, se encontram descritos na tabela seguinte:

Ensaio Aminoácidos identificados

Dansilação seguida de hidrólise ácida do péptido A His

Digestão com quimotripsina Péptido Q1

Péptido Q2

Hidrólise ácida seguida de dansilação do péptido Q2 His, Asp, Tyr

(tripéptido)

Hidrólise ácida seguida de dansilação do péptido Q1 2 Ala, Lys, Pro, Val, aminoácido desconhecido

(hexapéptido)

Dansilação seguida de hidrólise ácida do péptido Q2 His

Degradação de Edman do péptido Q1 Ala (1º aminoácido identificado)

Ala (2º aminoácido identificado)

Val (3º aminoácido identificado)

Lys (4º aminoácido identificado)

a. Qual a sequência e o nome do péptido A (apresente o raciocínio)?

b. Calcule a carga do péptido Q1 a pH 7 e o seu pI (apresente os cálculos).

13

Exercício A2-5. Tendo em conta os dados fornecidos, indique relativamente aos péptidos A, B e

C

Péptido A – Ala-Gly-Gln-Asp-Glu-Val

Péptido B – Arg-Glu-Asn-Gly-Lys-Glu

Péptido C – Thr-Ala-Phe-Thr-Gly-Gly-Asn-Tyr-Ala-Phe-Pro-Ala

a. O nome do péptido B

b. Os produtos resultantes após digestão com quimotripsina do péptido C. Justifique.

c. Indique o pI e massa molecular do péptido A.

d. A estrutura do péptido A a pH fisiológico.

e. Apresente (justificando) uma solução para poder identificar a sequência do péptido A.

Exercício A2-6. Para determinação da sequência do péptido A efectuaram-se vários ensaios que,

juntamente com os resultados obtidos, se encontram descritos na tabela

seguinte:

Ensaio Aminoácidos identificados

Hidrólise ácida, seguida de dansilação Arg, Glu, Val, Gly, Lys, Tyr, Thr, Phe, Ala

Dansilação seguida de hidrólise ácida Glu

Digestão com carboxipeptidase Thr

Digestão com Tripsina Péptido T1 (dipéptido)

Péptido T2 (tripéptido)

Péptido T3 (tetrapéptido)

Hidrólise ácida, seguida de dansilação do péptido T1 Lys, Ala

Hidrólise ácida, seguida de dansilação do péptido T2 Arg, Tyr, Glu

Degradação de Edman do péptido T3 Phe

Digestão do péptido T3 com carboxipeptidase Thr

Digestão do péptido A com quimotripsina Péptido Q1 (tripéptido)

Péptido Q2 (dipéptido)

Péptido Q3 (tetrapéptido)

Dansilação seguida de Hidrólise ácida do péptido Q1 Gly

Digestão do péptido Q1 com carboxipeptidase Thr

Hidrólise ácida, seguida de dansilação do péptido Q2 Tyr, Glu

Dansilação seguida de Hidrólise ácida do péptido Q3 Arg

Digestão do péptido Q3 com carboxipeptidase Phe

a. Qual a sequência e o nome do péptido A (apresente o raciocínio)?

b. Calcule a carga do péptido A a pH 5, o seu pI e massa molecular (apresente os cálculos).

14

Tabela A2-1- Agentes de clivagem da ligação peptídica e locais de hidrólise

Agente Local de clivagem Observações

Cliv

agem

quím

ica

Brometo de cianogénio

Terminal carboxílico dos resíduos de Metionina

Met-X

O-Iodobenzoato

Terminal carboxílico dos resíduos de Triptofano

Trp-X

Hidroxilamina

Ligação Asparagina-Glicina

Asn-Gly

2-Nitro-5-tiobenzoato

Terminal amina dos resíduos de Cisteína

X-Cys

Cliv

agem

enzim

ática

Tripsina

Terminal carboxílico dos resíduos de Lisina e Argina

Lys-X; Arg-X

Proetease submaxilar

Terminal carboxílico do resíduo de Arginina

Arg-X

Clostripan

Terminal carboxílico dos resíduos de Arginina

Arg-X

Protease stafilococica

Terminal carboxílico dos resíduos de Aspartato e Glutamato (glutamato apenas em certas condições)

Asp-X; Glu-X

Asp-N-protease

Terminal amina dos resíduos de Aspartato e Glutamato

X-Asp; X-Glu

Pepsina

Terminal amina dos resíduos de Fenilalanina, Triptofano e Tirosina

X-Phe; X-Trp; X-Tyr

Trombina

Terminal carboxílico da Arginina

Arg-X

Endoproteinase Lys C

Terminal carboxílico da Lisina

Lys-X

Quimotripsina

Terminal carboxílico da Tirosina, Triptofano, Fenilalanina

Tyr-X; Trp-X; Phe-X

Carboxipeptidase A Cliva a ligações peptídicas C-terminal, excepto na presença de Arginina, Lisina e Prolina

X-Aminoácido (excepto quando Arg, Lys, Pro

Carboxipeptidase B

Actua sobre a extremidade C-terminal de um péptido ou proteína mas apenas quando o aminoácido C-terminal é Arginina ou Lisina

X-Arg; X-Lys

15

Tabela A2-2- Aminoácidos constituintes das proteínas

Tabela A2-3- Valores de pKa e ionização de resíduos de aminoácidos ionizáveis

16

A.4 - APRESENTAÇÕES

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS E ELECTROFORÉTICOS PARA SEPARAÇÃO E ANÁLISE

DE PROTEÍNAS

Objectivo:

Quando se pretende estudar uma proteína é geralmente necessário isolá-la a partir de uma fonte

biológica. Neste processo emprega-se frequentemente métodos cromatográficos incluindo

cromatografia de afinidade, exclusão molecular (SEC), troca-iónica e interacção hidrófoba.

Adicionalmente, no decorrer de um processo de purificação proteica a electroforese em gel

desnaturante (SDS) de poliacrilamida é uma técnica frequentemente utilizada para monitorizar o

grau de pureza, calcular a massa molecular e efectuar uma análise semi-quantitativa da proteína

isolada. A avaliação do estado de oligomerização das proteínas pode ainda ser efectuada

recorrendo a uma electroforese em gel nativo de poliacrilamida.

Nesta aula os Grupos irão apresentar quatro Temas, relacionados com os métodos de purificação,

separação e caracterização de proteínas:

Grupo 1 – Cromatografia de exclusão molecular e troca-iónica;

Grupo 2 – Cromatografia de afinidade e hidrófoba;

Grupo 3 – Electroforese monodimensional desnaturante;

Grupo 4 – Electroforese bidimensional e focagem isoeléctrica.

Para este efeito é necessário que cada grupo pesquise sobre o tema atribuído e prepare uma

apresentação em suporte informático de cerca de 15 minutos. Seguir-se-á um período de

discussão dos trabalhos apresentados.

17

A.5 - APRESENTAÇÕES

MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS PARA ANÁLISE QUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

Objectivo:

Em Bioquímica é frequente ser necessária a determinação do teor proteico de uma amostra. De

entre os métodos existentes, os métodos espectrofotométricos (no visível e ultravioleta) são dos

mais utilizados devido à facilidade de utilização, rapidez, sensibilidade e rigor. Estes métodos

variam entre si no fundamento, sensibilidade e presença de agentes interferentes, parâmetros que

condicionam a escolha do método mais adequado.

Nesta aula os Grupos irão apresentar quatro Temas, relacionados com os métodos

espectrofométricos para análise quantitativa de proteínas:

Grupo 5 – Método de Lowry;

Grupo 6 – Método de Ácido bicinconínico (BCA);

Grupo 7 – Método de Bradford;

Grupo 8 – Absorvência no ultravioleta (UV).


apresentação em suporte informático de cerca de 10 minutos. Para além do fundamento teórico

dos métodos deverá ser dado particular relevo à sensibilidade e agentes interferentes do método

em estudo. Seguir-se-á um período de discussão dos trabalhos apresentados.

18

A.6- EXERCÍCIOS

UTILIZAÇÃO DE CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR PROTEÍCO

POR MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Objectivo:

As técnicas experimentais utilizadas em Bioquímica (ex: determinação do teor proteico) exigem,

de um modo geral, a utilização de pequenas quantidades de amostra e consequentemente

métodos com uma elevada sensibilidade. Neste contexto, a espectrofotometria de absorção no

visível e ultravioleta (UV) constitui uma das técnicas mais utilizadas para análise quantitativa de

moléculas recorrendo à utilização de curvas de calibração, efectuadas a partir de soluções padrão

com diferentes concentrações conhecidas (por exemplo, por diluição seriada a partir de uma

solução mais concentrada).

Uma Curva de calibração corresponde à relação gráfica entre: as concentrações conhecidas de

soluções efectuadas pelo operador (eixo xx) e os valores de Absorvência (A) lidos (eixo yy). Esta

relação será linear (recta; Figura A6-1) uma vez que traduz a Lei de Lambert-Beer A = cℓ, onde

a absorvência (A) é directamente proporcional ao produto da concentração da substância em

análise (c) pela largura do percurso percorrido de solução (ℓ; largura da célula). A constante de

proporcionalidade designada por Absortividade Molar (ou Coeficiente de Extinção Molar; ), é

especifica para cada substância e para um comprimento de onda particular e exprime-se em M-

1.cm-1. Assim, ao determinar o valor da absorvência (A) de uma solução é possível determinar a

sua Concentração (c), uma vez que é uma constante e ℓ é 1 cm.

Figura A6-1 – Relação linear entre a Absorvência (A) de um composto e a sua Concentração (c) e que é

traduzida pela lei de Lambert-Beer A = cℓ.

19

Uma vez traçada a curva de calibração o valor da concentração desconhecida da amostra é

determinada por interpolação gráfica (Figura A6-2).

Figura A6-2 – Utilização de uma curva de calibração para determinação da concentração de uma

amostra.

Para uma utilização adequada da curva de calibração é absolutamente necessário ter alguns

cuidados:

Conhecer a sensibilidade e o intervalo do método: concentrações da substância abaixo de um

determinado mínimo não vão ser detectadas; uma concentração acima de uma determinada

concentração vai saturar o ensaio e a Lei de Lambert-Beer deixa de se verificar;

Conhecer a linearidade do método: deve-se trabalhar dentro da zona linear do método, i.e.,

quando a absorvência é directamente proporcional à concentração;

Os padrões a efectuar devem incluir-se dentro do intervalo do método; nunca deverão ser

efectuadas menos de 3 soluções padrão de concentrações distintas;

Garantir que apenas a substância em análise é responsável pela absorção de luz no

comprimento de onda de interesse;

Preparar padrões e amostras em condições idênticas;

Utilizar iguais volumes para padrões e amostras (também simplifica o processo) uma vez que

a variação de volume em que se preparam os padrões e amostras leva a inexactidões;

Manter o tempo de leitura após a reacção, a temperatura e outros factores físicos;

Nunca utilizar um resultado de uma amostra “fora da curva” de calibração (amostra muito

concentrada); deverá ser efectuada uma diluição da amostra e um novo ensaio; neste caso a

determinação da concentração a partir da curva de calibração deverá ter em conta o factor de

diluição (F) (i.e. diluir 1/10 então F = 10);

20

Preparar e analisar várias diluições da amostra caso se desconheça a sua gama de

concentrações;

Utilizar as pipetas de modo correto pois erros de pipetagem podem afectar o volume total e

portanto o resultado obtido.

Para efectuar as leituras no espectrofotómetro é necessário calibrar o equipamento. Assim, é

necessária uma amostra de referência ou Branco. Neste ensaio é colocada uma solução que

contém TODOS os componentes dos padrões e amostra EXCEPTO a substância a analisar. Com

a amostra de referência no feixe de luz o espectrofotómetro será ajustado para ler uma

absorvência zero – “acertar o zero do aparelho”.

Este trabalho tem como objectivo introduzir o aluno na utilização de curvas de calibração para

calcular o conteúdo proteico de uma amostra.

ATENÇÃO: nesta aula é necessário que o aluno seja portador de uma folha de papel milimétrico,

de uma régua e de um lápis.

Exercício A6-1. Após purificação da proteína AB por cromatografia de afinidade obteve 5 mL de

eluído. Para dosear a proteína AB obtida no eluído utilizou o método de

Bradford. Os volumes utilizados para efectuar a curva de calibração e os

respectivos ensaios encontram-se descritos nas Tabelas A6-1 e A6-2,

respectivamente. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente a

absorvência das soluções (595 nm) foram registadas (ver Tabela A6-2).

a. Calcule as concentrações dos padrões utilizados completando a Tabela A6-1;

b. Construa a curva de calibração utilizando quer o software Excel quer o papel milimétrico;

c. Calcule a concentração da solução de proteína AB (em mg.mL-1) no eluído;e na presença dos

interferentes testados

d. Identifique os compostos que interferem nesta reacção de quantificação de proteínas.

Tabela A6-1 - Preparação dos diferentes pontos da Curva de Calibração partindo de uma solução

de Albumina sérica bovina (BSA a 1,5 mg.mL-1).

Vol. BSA stock (mL) Vol. H2O (mL) BSA (mg/mL)

P1 0,25 4,75

P2 0,50 4,50 P3 1,00 4,00 P4 2,00 3,00 P5 3,25 1,75

21

Tabela A6-2 – Volumes utilizados para determinação da concentração do teor proteico pelo

Método de Bradford e Absorvências registadas.

H2O

(L)

Padrões

(L)

Amostra

(L)

Interferente

(L)

Reag. Bradford

(L)

A595

Branco

80

-

-

-

1000

0,066 0,064

Padrões P1 50 30 - - 1000 0,125 0,125

P2 50 30 - - 1000 0,256 0,252

P3 50 30 - - 1000 0,299 0,310

P4 50 30 - - 1000 0,403 0,406

P5 50 30 - - 1000 0,448 0,457

Amostra 50 - 30 - 1000 0,276 0,281

Interferente SDS - - 30 50 1000 0.485 0.479

Triton X - - 30 50 1000 0.446 0.432

EDTA - - 30 50 1000 0.259 0.261

(NH4)2SO4 - - 30 50 1000 0.287 0.289

22

A.7- EXERCÍCIOS

UTILIZAÇÃO DE FERRAMENTAS BIOINFORMÁTICAS PARA ESTUDO DE PROTEÍNAS

Objectivo:

A estrutura de uma proteína é o responsável último pela sua função. Esta aula tem como objectivo

instruir o aluno da importância de bases de dados (ex: Protein Data Bank, Brenda) para o estudo

e caracterização de proteínas bem como da utilização de software apropriado (ex: Chimera, ) para

manipulação e análise de estruturas 3D.

Exercício A7-1 – Aceder ao sítio PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) e obter a seguinte

informação relacionada com a proteína humana “phenylalanine hydroxylase”:

a. Estrutura 3D

b. Estrutura secundária

c. Descarregar o ficheiro com a extensão pdb

Exercício A7-2 – Aceder ao sítio Brenda (http://www.brenda-enzymes.info/) e obter a seguinte

informação relacionada com a proteína humana “phenylalanine hydroxylase”:

a. Classificação EC

b. Via metabólica envolvida

c. Reacção enzimática

Exercício A7-3 – Utilizando os softwares Chimera ou Pymol e os dados pdb da proteína

”phenylalanine hydroxylase”

a. Apresente as estruturas secundárias em cartoon

b. Localize o resíduo Cys284 e identifique-o e apresente-o na forma de “ball & stick”

c. Identifique as pontes de H que o resíduo Cys284 pode estabelecer

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

23

TEMA B

- Enzimas -

24

AULA B.1- EXERCÍCIOS

DETERMINAÇÃO DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS E DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE

ENZIMAS MICHAELIANAS

Objectivo:

Utilização dos conhecimentos adquiridos nas Aulas Teóricas sobre Enzimas para determinação

da actividade enzimática e constantes cinéticas de uma enzima “Michaeliana” utilizando valores

adquiridos experimentalmente e recorrendo ao software Microsoft Excel.

Para realização dos exercícios propostos deverá ser utilizada a informação fornecida nas Figuras

B1-1 e B1-2.

Exercício B1-1. Considere uma enzima Michaeliana que catalisa a hidrólise da ligação

glicosídica, libertando a pH elevado o o-nitrofenolato (ONP-) a partir do

substrato o-nitrofenil--D-glucosido. A reacção pode ser seguida por

espectrofotometria do visível, devido à cor amarela do produto da reacção.

Na Tabela B1-1 encontram-se as absorvências lidas a =430 nm, para diferentes tempos de

reacção da enzima com o substrato a diferentes concentrações. Foi utilizada sempre a mesma

quantidade de enzima. A absortividade molar do produto a 430 nm é =4.5 mM-1 cm-1.

Tabela B1-1 - Absorvências em função do tempo de incubação e das concentrações de substrato utilizadas.

ONPG (mM)

Tempo (min)

1 2 3 4 5 6

1 0,015 0,030 0,045 0,060 0,070 0,075 2 0,026 0,051 0,077 0,103 0,120 0,128 5 0,045 0,090 0,135 0,180 0,210 0,225 10 0,060 0,120 0,180 0,240 0,280 0,300

OH

OH

HO

CH2

OH

NO2

- glucosidase

ONPG

NO2

Or toni tr of enol

OH-HO

NO2

-O

ião ort onit rofenolat o

OH

OH

CH2

OH

OH

+

Glucose

HO

25

Tendo em consideração os dados fornecidos:

a. Represente graficamente os valores de Absorvências em função do tempo de incubação para

as várias concentrações de substrato. Determine o tempo máximo em que se verificam as

condições de velocidade inicial para todas as concentrações de substrato estudadas.

Explique.

b. Calcule as velocidades iniciais (Vo) para cada concentração de S, tendo o cuidado de utilizar

as unidades convenientes.

c. Faça a representação linear e determine os valores de Vmáx e KM.

Exercício B1-2. Investigou-se o efeito do pH na constante de Michaelis-Menten (KM) e no valor

de V0 da enzima 6-fosfogluconato desidrogenase. Utilizando tampões de pH 7,6

e 9,0 e mantendo constante a concentração total de enzima, a actividade da

desidrogenase foi medida espectrofotometricamente, seguindo a redução do

NADP+ (fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo) ao comprimento de onda

de 340 nm.

As Vo, medidas para diversas concentrações de substrato, encontram-se na Tabela B1-2.

Tabela B1-2 - Velocidades Iniciais (mM min-1) em função do pH da mistura reaccional

S (mM)

V0 (mM.min

-1)

pH 7,6 pH 9,0

0,174 74 34 0,267 85 47 0,526 98 75 1,666 114 128

Tendo em consideração os dados fornecidos, responda às seguintes questões:

a. Qual o Vmáx e o KM da enzima para cada pH?

b. Indique, justificando, a que valor de pH a enzima tem maior afinidade para o substrato.

26

1

VKM

Vmáx

1

S 1

Vmáx

V Vmáx. S

KM S

Figura B1-1 – Efeito da concentração de substrato na Velocidade inicial (V0) duma reacção enzimática e

equação de Michaelis-Menten. Em qualquer ponto da curva, a velocidade está relacionada com a quantidade de complexo ES. Para baixas [S], V0 é directamente proporcional a [S] (obedece a reacção cinética de 1ª ordem). Para altas [S], V0 é independente de [S] (cinética de ordem zero). KM define-se como a [S] que resulta em 1/2 da velocidade máxima, e em que metade da enzima existe na forma de complexo ES.

Figura B1-2 – Representação gráfica da equação de Lineweaver-Burk. O gráfico de 1/V versus 1/[S] para

qualquer reacção enzimática dá uma recta com um declive igual a KM/Vmáx. Os valores de KM e Vmáx podem ser obtidos pelos pontos de intersecção da recta no eixo do X e no eixo do Y respectivamente.

27

B.2- EXERCÍCIOS

DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE ENZIMAS ALOSTÉRICAS

Objectivo:


da actividade enzimática e constantes cinéticas de uma enzima alostérica utilizando valores

adquiridos experimentalmente e recorrendo ao software Microsoft Excel.

Para realização dos exercícios propostos deverá ser utilizada a informação fornecida nas Figuras

B2-1, B2-2 e B2-3.

Exercício B2-1. Na tabela B3 encontram-se representados os valores de V0 obtidos quando se determinou a actividade de uma enzima a diferentes concentrações de substrato [S].

Tabela B2-1 - Velocidades iniciais (mM min-1) para diferentes concentrações de substrato.

S

(mM)

V0

(mM.min-1)

0,1 6,25E-06

0,2 1E-04

0,4 0,001597

0,6 0,008035

1 0,058824

1,5 0,240356

2 0,5

2,5 0,709421

3 0,835052

3,5 0,903651

4 0,941176

5 0,975039

6 0,987805

8 0,996109

10 0,998403

50 0,999997

100 1

a. Caracterize o tipo de cinética enzimática utilizando os testes de diagnóstico aprendidos.

b. Conclua sobre o tipo de cooperatividade apresentando o valor do coeficiente de Hill.

28

Figura B2-1 - Testes de diagnóstico para distinção entre cinéticas Michaelianas e Alostéricas através da

representação gráfica de V0 versus [S]. Uma curva hiperbólica é indicativa de uma cinética Michaeliana (nH=1) enquanto que uma curva sigmoidal é representativa de uma cinética alostérica com cooperatividade positiva (nH>1). No caso de cooperatividade negativa (nH<1) as curvas são difíceis de distinguir das hiperbólicas.

Figura B2-2 - Testes de diagnóstico para distinção entre cinéticas Michaelianas e Alostéricas através da

Linearização de Lineweaver Burk). Uma representação linear em toda a gama de 1/[S] é indicativo de uma cinética Michaeliana (nH=1). Se para os valores mais baixos de 1/[S] a linearidade se perder poderemos distinguir os dois tipos de cooperatividade. Na cooperatividade positiva (nH>1) correspondente a cinéticas sigmoidais, a curva dos inversos apresenta uma concavidade positiva “para cima”. Na cooperatividade negativa (nH<1), a curva dos inversos apresenta uma concavidade negativa “para baixo”. A intersecção dessa curva no eixo das ordenadas corresponde a 1/Vmáx.

29

Figura B2-3 – Gráfico de Hill e equação de Hill. Esta representação gráfica permite determinar o valor do coeficiente de Hill (H ou h) e de K (ou [S]0.5). Esta função é uma recta, em que o declive é dado por nH, o coeficiente de Hill. Para cinéticas Michaelianas nH=1. Para cinéticas de enzimas alostéricas, teremos nH>1 para cooperatividade positiva e nH<1 para cooperatividade negativa.

30

B.3- EXERCÍCIOS

DETERMINAÇÃO DO TIPO DE INIBIÇÃO E CONSTANTE DE INIBIÇÃO (KI)

Objectivo:


do tipo de inibição (competitiva, incompetitiva e não-competitiva) e da constante de inibição (KI)

utilizando valores adquiridos experimentalmente e recorrendo ao software Microsoft Excel.

Para realização do exercício proposto deverá ser utilizada a informação fornecida na Figura B3-1

e Tabela B3-1.

Exercício B3-1. Na tabela B4 apresentam-se os valores das velocidades iniciais (mM.min-1) de

uma reacção catalizada por uma enzima Michaeliana para várias concentrações

iniciais de substrato ([S]) e de inibidor ([I]).

Tabela B3-1 - Velocidades iniciais (mM.min-1) das várias reacções enzimáticas em função da

concentração de Inibidor ([I]) e substrato ([S]).

[S] (mM)

[I]

(M)

0 5 10 20

5 0,00033 0,00025 0,0002 0,00014 10 0,0005 0,0004 0,00033 0,00025 25 0,00071 0,00062 0,00055 0,00045 40 0,0008 0,00073 0,00066 0,00057

a. Utilizando a linearização de Lineweaver-Burk determine o tipo de inibição compatível com os

dados.

b. Determine os parâmetros cinéticos da enzima KM e Vmáx.

c. Explique como actua este inibidor, justificando a sua acção nos parâmetros cinéticos da

enzima com o auxílio do esquema reaccional.

d. Tendo em conta o tipo de inibição caracterizado, determine o KI.

31

Tabela B3-1 – Testes de diagnóstico dos vários tipos de inibição através da análise das várias formas de linearizações possíveis.

32

Figura B3-1 – Representação gráfica para determinação do KI para os diferentes tipos de inibição.

33

TEMA C

- Glúcidos -

34

C.1 - APRESENTAÇÕES

MÉTODOS DE ANÁLISE E CARACTERIZAÇÃO DE GLÚCIDOS

Objectivo:

Quimicamente os glúcidos (ou oses) definem-se como poli-hidroxialdeídos (aldoses) ou poli-

hidroxicetonas (cetoses). Na sua maioria as oses são constituídas por 3 (trioses), 4 (tetroses), 5

(pentoses) ou 6 (hexoses) átomos de Carbono. Estas unidades estruturais podem-se encontrar

isoladas ou na forma de polímeros, ligadas entre si por ligações glicosídicas.

Devido à sua composição química (elevado número de grupos -OH e presença de um grupo

aldeído ou cetona) as oses são moléculas altamente reactivas. É com base nesta reactividade

química que, por exemplo, é possível identificar as diferentes oses de acordo com a Marcha Geral

de identificação dos açúcares.

Nesta aula os Grupos irão apresentar quatro Temas, relacionados com os métodos de análise e

caracterização de glúcidos:

Grupo 1 – Provas de Benedict e Barfoed;

Grupo 2 – Provas do ácido múcico e de Selivanoff;

Grupo 3 – Prova de Bial e Prova das Ozasonas;

Grupo 4 – Técnicas cromatográficas.




35

MARCHA GERAL DE IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARESMARCHA GERAL DE IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARES

AMOSTRA

Prova de Benedict

Açúcares

redutoresAçúcares não

redutores

+ -

SACAROSEProva de Barfoed

Monossacáridos

redutores

rápida

FRUTOSE

rápida

lenta

Dissacáridos

redutores

Prova de Selivanoff Prova do Ácido múcico

Aldohexose/Pentose

lenta

Prova de Bial

XILOSE

+Aldohexose

-

Prova do ácido múcico

LACTOSE+

MALTOSE-

GALACTOSE+

- Aldohexose

Prova das Osazonas

GLUCOSE

rápida lenta

MANOSE

MARCHA GERAL DE IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARESMARCHA GERAL DE IDENTIFICAÇÃO DOS AÇÚCARES

AMOSTRA

Prova de Benedict

Açúcares

redutoresAçúcares não

redutores

+ -

SACAROSEProva de Barfoed

Monossacáridos

redutores

rápida

FRUTOSE

rápida

lenta

Dissacáridos

redutores

Prova de Selivanoff Prova do Ácido múcico

Aldohexose/Pentose

lenta

Prova de Bial

XILOSE

+Aldohexose

-

Prova do ácido múcico

LACTOSE+

MALTOSE-

GALACTOSE+

- Aldohexose

Prova das Osazonas

GLUCOSE

rápida lenta

MANOSE

36

TEMA D

- Lípidos -

37

D.1 - APRESENTAÇÕES

MÉTODOS DE EXTRACÇÃO, SEPARAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE

LÍPIDOS

Objectivo:

Os lípidos são moléculas que estruturalmente apresentam características muito diversas. No

entanto apresentam como propriedade comum uma elevada insolubilidade na água. Devido a esta

característica são utilizadas misturas de solventes orgânicos para proceder à sua extracção de

amostras biológicas. Após extracção selectiva das diferentes classes de lípidos estes podem ser

identificados e mesmo quantificados por métodos cromatográficos e espectrofotométricos que têm

como base as características químicas daquelas moléculas.

Nesta aula os Grupos irão apresentar quatro Temas, relacionados com os métodos de análise e

caracterização de lípidos:

Grupo 5 – Métodos de extracção de lípidos totais e de extracção diferencial;

Grupo 6 – Separação e identificação de fosfolípidos por técnicas cromatográficas;

Grupo 7 – Métodos de doseamento de fosfolípidos;

Grupo 8 – Métodos de doseamento do colesterol.




38

TEMA E

- Metabolismo Intermediário -

39

E.1- EXERCÍCIOS

FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA

Objectivo:

O processo de fosforilação oxidativa, do qual fazem parte a cadeia respiratória e a síntese de ATP

é o mecanismo celular culminar de todo o metabolismo energético, independentemente da fonte

de energia, seja ela glucídica, lipídica ou resultante da degradação de proteínas. O consumo de

oxigénio pela cadeia respiratória ocorre como resultado da transferência de electrões ao longo

dos vários elementos deste sistema celular e da consequente redução de duas moléculas de

água. A energia química e eléctrica que se reúne ao longo desse processo oxidativo permite o

funcionamento da ATP sintase, o complexo proteico que na célula constitui a forma mais rentável

de produção de ATP (pela fosforilação de ADP) e que depende de condições de aerobiose. É

sobre este sistema que muitos fármacos e xenobióticos exercem a sua acção terapêutica (ex.

antibióticos) ou tóxica, respectivamente.

Nesta aula pretende-se dar a conhecer um dos métodos utilizados para estudar o funcionamento

da cadeia respiratória, a Polarografia. Esta metodologia recorre a um eléctrodo de oxigénio que,

utilizando substratos e inibidores adequados, permite aferir, a uma dada temperatura e num

determinado tampão, variações de concentração de oxigénio numa suspensão de mitocôndrias

previamente obtida a partir de um tecido rico neste organito. Serão inicialmente introduzidos

conceitos teóricos básicos de suporte ao estudo da Fosforilação Oxidativa, nomeadamente sobre

os substratos e inibidores específicos e inespecíficos deste sistema celular, os diversos estados

de oxidação e os conceitos de índice de controlo respiratório e razão P/O. Será ainda descrito o

funcionamento do Polarógrafo, realizados ensaios utilizando um simulador virtual da metodologia

(E.1.A) e resolvidos de alguns problemas práticos.

Exercício E1-1 – O que sucede quando se adiciona na câmara de um polarógrafo mitocôndrias

isoladas e um substrato oxidável? Faça a simulação e apresente as suas

conclusões sobre o que observou. Experimente com outro substrato e analise o

resultado observado.

Exercício E1-2 – Como justifica que antes mesmo da adição de ADP (estado basal ou estado 2)

ocorra algum consumo de oxigénio?

40

Exercício E1-3 – Se na câmara de um polarógrafo se adicionar a mitocôndrias isoladas um

substrato oxidável e ADP, a adição deste último causa um decréscimo ou um

aumento na taxa de consumo de oxigénio? Experimente aumentar a

concentração de ADP adicionado. Discuta o que observou em todas as

situações testadas.

Exercício E1-4 - A uma suspensão de mitocôndrias num tampão de respiração apropriado

colocada na câmara de amostra (2,1 mL) de um eléctrodo de oxigénio

mantido a 25ºC ([O2] = 0,237 µmoles O2/ml) adicionou-se 20 µL de 0,5 M

malato e 20 µL de 0,025 M de ADP. Analise o registo de consumo de oxigénio

obtido. Determine o estado 3. Determine o estado 4. Determine o índice de

controlo respiratório. Determine a razão P:O. Obteve o valor esperado?

Porquê?


colocada na câmara de amostra (2,1 mL) de um eléctrodo de oxigénio mantido

a 25ºC ([O2] = 0,237 µmoles O2/ml) adicionou-se 20 µL de 0,5 M succinato e 20

µL de 0,025 M de ADP. Analise o registo de consumo de oxigénio obtido.

Determine o estado 3. Determine o estado 4. Determine o índice de controlo

respiratório. Determine a razão P:O. Obteve o valor esperado? Porquê?

Exercício E1-6 - Qual o efeito dos desacopladores na taxa de respiração celular? A adição de

ADP é essencial neste contexto? Faça a simulação e apresente as suas

conclusões.


colocada na câmara de amostra (2,1 mL) de um eléctrodo de oxigénio mantido

a 25ºC ([O2] = 0,237 µmoles O2/ml) adicionou-se 20 µL de 0,5 M malato e 20 µL

de 0,050 M de ADP e 10 µL de rotenona a 20 mg/ml. Analise o registo de

consumo de oxigénio obtido. O que pode dizer sobre a rotenona. Experimente

nestas condições adicionar DNP. Discuta o que observou.

Exercício E1-8 - Repita a simulação com outros inibidores da Fosforilação Oxidativa. Existe

alguma diferença no comportamento do sistema entre os inibidores testados?

41

E.2- EXERCÍCIOS

BALANÇO ENERGÉTICO DO METABOLISMO GLUCÍDICO E LIPÍDICO

Objectivo:

O metabolismo energético é fundamental à vida já que sem ele não seria possível obter ATP, a

moeda energética da célula. Como já foi atrás referido o processo mais rentável de obtenção de

energia é aquele que ocorre em aerobiose sendo ainda possível obter algum ATP intracelular

resultante da fosforilação ao nível do substrato, o que acontece principalmente em situações de

hipóxia. No entanto, o rendimento energético de um substrato não depende somente das

condições de aerobiose ou anaerobiose mas essencialmente da natureza desse substrato.

Nesta aula serão realizados exercícios para a determinação do rendimento e balanço energético

do metabolismo glucídico e lipídico permitindo compreender porque diferem em valor energético

os hidratos de carbono e dos lípidos (E.1.B). Para a realização dos exercícios deverá ser

considerado:

1 NADH = 2,5 ATP; 1 FADH2 = 1,5 ATP

Exercício E2-1 - O NADH, produzido no citosol pela glicólise, não pode atravessar directamente a

membrana da mitocôndria. Assim, os electrões passam para a cadeia

respiratória através dos sistemas de “shuttle”. Se for utilizado o “shuttle” malato-

aspartato, quantas moléculas de ATP se formam a partir do NADH citosólico

proveniente da oxidação de 1 molécula de glucose?

Exercício E2-2 - Quantas moles de ATP se formam através da oxidação mitocondrial de 2 mol de

acetil-CoA a dióxido de carbono e água na presença de rotenona?

42

Exercício E2-3 - Preencha o quadro apresentado abaixo. O que pode dizer sobre o rendimento

energético conseguido pelo metabolismo aeróbico em comparação com aquele

atingido numa situação de hipóxia?

Por molécula de glucose metabolizada

Via NADH FADH2

ATP ou GTP

(fosforilação ao

nível do substrato)

2,5 ATP

por cada

NADH

1,5 ATP por

cada FADH2 Total ATP

Glicólise

Piruvato

desidrogenase

Ciclo Krebs

Total

Exercício E2-4 - Qual é o rendimento energético da oxidação completa de uma molécula de ácido

láurico (C12:0)?

Exercício E2-5 - Se se adicionasse antimicina à reacção de oxidação mencionada no exercício

E2-4 qual seria o rendimento energético esperado?

Exercício E2-6 - Se se adicionasse DNP à reacção de oxidação mencionada no exercício E2-4

qual seria o rendimento energético esperado?

Exercício E2-7 - Qual é o rendimento energético da oxidação completa de uma molécula de ácido

palmitoleico (C14:1)?

Exercício E2-8 - Qual é o rendimento energético da oxidação completa de uma molécula do ácido

heptanóico (C7:0)?

43

E.3 - APRESENTAÇÕES

DOENÇAS HEREDITÁRIAS DO METABOLISMO

Objectivo:

As Doenças Hereditárias do Metabolismo são doenças genéticas que têm como causa mutações

nos genes que codificam para enzimas ou transportadores envolvidos em pontos específicos do

metabolismo intermediário. Estas patologias têm geralmente um elevado grau de mortalidade, os

primeiros sinais e sintomas apresentam-se frequentemente durante a infância ou no período

perinatal e são de difícil diagnóstico. Presentemente o tratamento das Doenças Hereditárias do

Metabolismo assenta basicamente em restrições dietéticas ou na suplementação com cofactores

enzimáticos.

Nesta aula os Grupos irão apresentar oito Doenças Hereditárias do Metabolismo:

Grupo 1 – Deficiência na piruvato desidrogenase;

Grupo 2 – Deficiência na desidrogenase dos ésteres acil-CoA de cadeia média;

Grupo 3 – Doença de Gaucher

Grupo 4 – Galactosémia clássica.

Grupo 5 – Fenilcetonúria;

Grupo 6 – Homocistinúria clássica;

Grupo 7 – Tirosinémia;

Grupo 8 – Deficiência na carbamoilfosfato sintetase I;

Cada grupo terá que proceder à pesquisa de informação e sua posterior organização com vista à

preparação de uma apresentação sobre o tema. Os temas serão apresentados por todos os

grupos. As apresentações deverão ser preparadas em suporte informático e não poderão

ultrapassar 15 minutos. Seguir-se-á um período de discussão dos trabalhos apresentados.

As apresentações deverão abordar os seguintes aspectos de cada patologia:

Introdução

o Nome da doença

o Via metabólica envolvida – esquema

o Enzima(s) afectada(s)

o Gene(s) afectado

o Modo de transmissão

o Frequência na população

44

Sinais e Sintomas

Diagnóstico

o Bioquímico (indicação valores normais)

o Molecular

o Outros

o Pré-natal e pós-natal (programas de rastreio)

Tratamento (farmacológico, dietético, cirúrgico)

Tema Patologia Palavras chaves

1 Deficiência na piruvato desidrogenase

Pyruvate dehydrogenase (PDH); PDH deficiency

2 Deficiência na desidrogenase dos ésteres acil-CoA de cadeia média

Medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD); Fatty acid ß-oxidation disorders; MCAD deficiency

3 Doença de Gaucher

Gaucher Disease;

4 Galactosémia clássica

Galactosyl transferase (GALT); Galactosemia; GALT deficiency

5 Fenilcetonúria Phenylketonuria (PKU); Phenylalanine hydroxylase (PAH)

6 Homocistinúria clássica

Cystathionine -synthase (CBS); CBS deficiency

7 Tirosinémia Tyrosinemia

8 Deficiência na carbamoilfosfato sintetase I

carbamyl (carbamoyl) phosphate synthetase (CPSI); CPSI deficiency; urea cycle disorders

Sugestão de sites a consultar: http://www.genetests.org/ (entrar em GeneReviews) http://www.orpha.net http://www.childrenshospital.org/newenglandconsortium (entrar em “Scientists and Physicians” e de seguida “Expanded Newborn Screening” http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ (entrar na base de dados OMIM) http://diagnosticoprecoce.org/ http://www.SSIEM.org http://www.pediatrix.com/ http://www.emedicine.com/ped

http://www.genetests.org/

http://www.orpha.net/

http://www.ssiem.org/

http://www.pediatrix.com/

2º ano, 1º semestre 2013-2014 - ff.ul.ptjvitor/My_site/BioqI_files/Protocolos Aulas... · 1.3....

Documents

Transcript of 2º ano, 1º semestre 2013-2014 - ff.ul.ptjvitor/My_site/BioqI_files/Protocolos Aulas... · 1.3....