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BIOQUÍMICA I

AULAS PRÁTICAS

2º ano, 1º semestre

2013-2014

Objectivo

Bases teórico/práticas das metodologias experimentais necessárias ao estudo

qualitativo e quantitativo de macromoléculas

- péptidos e proteínas, glúcidos e lípidos -

Objectivo

Bases teórico/práticas das metodologias experimentais necessárias ao estudo

qualitativo e quantitativo de macromoléculas

- péptidos e proteínas, glúcidos e lípidos -

Metodologia de ensino:

• Realização de exercícios;

• Pesquisa e apresentação de temas relacionados com o

programa da disciplina

Temas de trabalho A. AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:

Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de alta resolução

(HPLC); Derivatização de aminoácidos;

2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:

Determinação do pI de aminoácidos e péptidos;

3. Sequenciação peptídica:

Hidrólise da cadeia polipeptídica; degradação sequencial de Edman;

4. Separação de proteínas por métodos cromatográficos:

cromatografias de exclusão molecular, troca-iónica, afinidade e hidrófoba; electroforese

mono/bidimensional; focagem isoeléctrica;

5. Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas:

Métodos de Lowry, Bradford, Ácido bicinconínico (BCA) e absorção no UV;

6. Ferramentas bioinformáticas para estudo de proteínas:

PDB (Protein Data Bank), Brenda, Expasy, Molecular Viewers (Chimera; Pymol)

Temas de trabalho B. ENZIMAS

1. Utilização de ferramentas informáticas para estudo e caracterização de enzimas:

Determinação da actividade enzimática, parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas e

de enzimas alostéricas e de constantes de inibição.

C. GLÚCIDOS

1. Métodos de análise e caracterização de glúcidos:

Métodos cromatográficos; reacções de identificação (reacções de Benedict, Barfoed,

Selivanoff, Bial, Ácido múcico e Osazonas); marcha geral de identificação de açúcares.

D. LÍPIDOS

1. Métodos de análise e caracterização de lípidos:

Fraccionamento lipídico e análise qualitativa das fracções obtidas.

E. METABOLISMO INTERMEDIÁRIO

1. Metabolismo energético:

Estudo da fosforilação oxidativa; balanço energético do metabolismo glicídico e lipídico;

2. Doenças Hereditárias do Metabolismo

Calendário das aulas práticas Data

30/09 – 04/10

Prática 1

Apresentação da componente prática de Bioquímica I

Apresentação do programa da componente prática e respectiva avaliação; regras de funcionamento; organização da turma em grupos

Tema A: Aminoácidos e Proteínas

A.1 - Identificação e separação de aminoácidos; Sequenciação peptídica; Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos; Determinação do pI de aminoácidos e péptidos.

07/10 – 11/10

Prática 2


A.2 - Exercícios: determinação da sequência e do pI de péptidos

A.3 - Purificação, detecção e caracterização de proteínas: Introdução.

14/10 – 18/10

Prática 3


A.4 – Apresentações: Tema “Métodos cromatográficos e electroforéticos para separação e análise de proteínas”: (1) cromatografia de exclusão molecular e troca-iónica; (2) cromatografia de afinidade e hidrófoba; (3) electroforese monodimensional desnaturante; (4) electroforese bidimensional e focagem isoeléctrica.

21/10 – 25/10

Prática 4


A.5 – Apresentações: Tema “Métodos espectrofotométricos para análise quantitativa de proteínas”: (1) Método de Lowry; (2) Método do Ácido bicinconínico BCA; (3) Método de Bradford e (4) Absorvência no ultravioleta;

A.6 - Exercícios: Utilização de curvas de calibração para determinação do teor proteico por métodos espectrofotométricos.


28/10 - 01/11

Prática 5


A.7 – Exercícios: utilização de ferramentas Bioinformáticas para estudo de proteínas.

04/11 – 08/11

Prática 6

Tema B: Enzimas

B.1 – Exercícios: determinação de actividades enzimáticas e de parâmetros cinéticos de enzimas Michaelianas.

11/11 – 15/11

Prática 7

Tema B: Enzimas

B.2 - Exercícios: determinação de parâmetros cinéticos de enzimas alostéricas;

B.3 - Exercícios: determinação de constantes de inibição.

18/11 – 22/11

Prática 8

Tema C: Glúcidos

C.1 - Estrutura e função dos glúcidos: propriedades químicas e estruturais;

C.2- Apresentações: Tema “Métodos de Análise e Caracterização de Glúcidos”: (1) Provas de Benedict e Barfoed; (2) Provas do ácido múcico e de Selivanoff; (3) Prova de Bial e Prova das Ozasonas; (4) Técnicas cromatográficas.

Tema D : Lípidos

D.1 - Estrutura e função dos Lípidos: propriedades químicas e estruturais;


25/11 – 29/11

Prática 9

Tema D : Lípidos

D.2 – Apresentações: Tema “Métodos de extracção, separação, identificação e quantificação de lípidos”: (1) Métodos de extracção de lípidos totais e de extracção diferencial; (2) Separação e identificação de fosfolípidos por técnicas cromatográficas; (3) Métodos de doseamento de fosfolípidos; (4) Métodos de doseamento de colesterol.

Tema E : Metabolismo Intermediário

E.1 Exercícios: fosforilação oxidativa

02/12 – 06/12

Prática 10


E.2 – Exercícios: balanço energético do metabolismo glucídico e lipídico

09/12 – 13/12

Prática 11


E.3 – Apresentações: Tema “Doenças Hereditárias do Metabolismo”: (1) Deficiência em PDH; (2) Deficiência em MCAD; (3) Doença de Gaucher; (4) Galactosémia clássica.

16/12 – 20/12

Prática 12


E.3 – Apresentações: Tema “Doenças Hereditárias do Metabolismo”: (1) Fenilcetonúria; (2) Homocistinúria clássica; (3) Deficiência em CPSI; (4) Tirosinémia tipo I

Avaliação 1. Frequência de (no mínimo) 2/3 das aulas realizadas (8 aulas).

2. Os conhecimentos adquiridos pelos alunos serão avaliados de forma contínua ao

longo do semestre. Esta avaliação terá em conta a preparação dos exercícios a realizar,

o interesse e participação nas aulas, a preparação dos Temas a apresentar e a

Avaliação final.

3. A ponderação dos vários elementos de avaliação prática será a seguinte:

a) 5% - Assiduidade (onde se inclui ausência de reparos em relação ao material exigido

para as aulas);

b) 10% - Desempenho na resolução dos exercícios apresentados (onde de se inclui o

interesse e participação nas aulas);

c) 45% - Apresentação dos Temas de Trabalho;

d) 40% - Teste.

4. A classificação final da disciplina é a média ponderada da classificação obtida no

exame teórico final (70%) e no ensino prático (30%).

A- Aminoácidos e Proteínas

1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:

Cromatografia mono e bidimensional em camada fina; Cromatografia líquida de

alta resolução (HPLC); Derivatização de aminoácidos;





A- Aminoácidos e Proteínas 1. Técnicas de separação e identificação de aminoácidos:

Derivatização de aminoácidos; Cromatografia mono e bidimensional em camada fina;

Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC);

Elevada reactividade do Grupo –NH2 e -COOH




Classificação de acordo com a polaridade do grupo R:

1. Não polares alifáticos

2. Não polares aromáticos

3. Polares não carregados

4. Polares carregados positivamente

5. Polares carregados negativamente




Ninidrina:

Reage com aminas

Coloração violeta com grupos -NH2

Coloração amarelada com iminoácidos (ex:

Pro)

Elevada sensibilidade




U.V.

Cloreto de Dansilo:

Reage com aminas (grupo -NH2)

Emissão de luz amarelo-esverdeada no UV

Elevada sensibilidade

TLC monodimensional

Coloração Ninidrina/UV

Suporte utilizado – em geral celulose (característica hidrófilas dos aminoácidos)




TLC bidimensional

Coloração Ninidrina/UV

Suporte utilizado – em geral celulose (característica hidrófilas dos aminoácidos)




Cromatografia em coluna




Derivatização:

• Pré-coluna

• Pós-coluna

http://www.google.pt/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=Y8pm14TV0TFR-M&tbnid=Dg1P8pTg0rQGqM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.chromatographytoday.com%2Fnews%2Fhplc-uhplc-lc-ms%2F31%2Farc_sciences%2Famino_acid_analysis_-_easily_turn_any_hplc_system_into_an_amino_acid_analyser_with_pinnacle_pcx%2F17842%2F&ei=ojhEUuDlDYue7Ab3hoHICA&bvm=bv.53217764,d.ZGU&psig=AFQjCNES9E8-cHylJZhk181qel0n__ZdGQ&ust=1380289010654838


Propriedades Anfotéricas

Dador de protões

(carga +1)

Aceitador de protões

(carga -1)

(carga 0)



A- Aminoácidos e Proteínas 2. Comportamento ácido-base e curvas de titulação de aminoácidos e péptidos:


(carga +1) (carga -1) (carga 0)

pK1- -COOH (Gly2.3) pK2 - -NH2 (Gly9.6)

2

21 pKpKpI

pI - ponto isoeléctrico



Péptido

(Grupos dadores/aceitadores Protões)

* *

* Apenas R dos aa:

Asp/Glu; His/Arg/Lys; Cys/Tyr



1. 1ª forma completamente protonada

2. Calcular a carga desta forma (tem que ser positiva)

3. Retirar o 1º protão (do grupo COOH mais perto do grupo -amina)

4. Aa com carga 0: -COO- e NH3+

His Asp



3 pK:

1. pK1 1.8

2. pK2 6

3. pK3 9.3

pI = 7.6 2

32 pKpKpI

(-1)

(0)

(+1)

(+2)



NH2-Ala-Lys-COOH

Grupos ionizáveis - 3

Grupo -NH2 da Ala (9,69)

Grupo -COOH da Lys (2,18)

Grupo R da Lys (10.53)

H

+2 +1

NH2

NH2

NH2

0 -1

⇄ ⇄ ⇄ 2.2 8.9 10.5

Lys



Grupo pH 1 pH 3-5 pH 7 pH 10 pH 11

Ala -NH2 (pK 9,69) +1 +1 +1 0 0

Lys -COOH (pK 2,18) 0 -1 -1 -1 -1

Lys R (pK 10,53) +1 +1 +1 +1 0

Total +2 +1 +1 0 -1

H

NH2 ⇄ ⇄ 2,3 9,69

H

NH2

NH2

NH2

⇄ ⇄ ⇄ 2,18 8,9 10,53

Ala: Lys:

NH2-Ala-Lys-COOH Grupo -NH2 da Ala (9,69)

Grupo -COOH da Lys (2,18)

Grupo R da Lys (10.53)

2

32 pKpKpI


Péptido



Terminal -NH2

Terminal COOH

Ligação peptídica

A- Aminoácidos e Proteínas 3. Sequenciação peptídica:


HCl 6M/110ºC

Bases fortes/Temp

Agentes químicos

Endopeptidases

Carboxipeptidases

Geral

Específica



Agente Local de clivagem Observações

Cliv

agem

quím

ica

Brometo de cianogénio

Terminal carboxílico dos resíduos de Metionina

Met-X

O-Iodobenzoato

Terminal carboxílico dos resíduos de Triptofano

Trp-X

Hidroxilamina

Ligação Asparagina-Glicina

Asn-Gly

2-Nitro-5-tiobenzoato

Terminal amina dos resíduos de Cisteína

X-Cys

Cliv

agem

enzim

ática

Tripsina

Terminal carboxílico dos resíduos de Lisina e Argina

Lys-X; Arg-X

Proetease submaxilar

Terminal carboxílico do resíduo de Arginina

Arg-X

Clostripan

Terminal carboxílico dos resíduos de Arginina

Arg-X

Protease stafilococica

Terminal carboxílico dos resíduos de Aspartato e

Glutamato (glutamato apenas em certas condições)

Asp-X; Glu-X

Asp-N-protease

Terminal amina dos resíduos de Aspartato e Glutamato

X-Asp; X-Glu

Pepsina

Terminal amina dos resíduos de Fenilalanina, Triptofano

e Tirosina

X-Phe; X-Trp; X-Tyr

Trombina

Terminal carboxílico da Arginina

Arg-X

Endoproteinase Lys C

Terminal carboxílico da Lisina

Lys-X

Quimotripsina

Terminal carboxílico da Tirosina, Triptofano, Fenilalanina

Tyr-X; Trp-X; Phe-X

Carboxipeptidase A

Cliva a ligações peptídicas C-terminal, excepto na

presença de Arginina, Lisina e Prolina

X-Aminoácido (excepto

quando Arg, Lys, Pro

Carboxipeptidase B

Actua sobre a extremidade C-terminal de um péptido ou

proteína mas apenas quando o aminoácido C-terminal é

Arginina ou Lisina

X-Arg; X-Lys



Sequenciação peptídica: Processo de identificar a sequência de amino

ácidos numa cadeia polipeptídica (estrutura primária)

Insulina


Insulina



1. Separar as diferentes cadeias polipeptídicas (se existirem)

2. Para cadeia polipeptídica:

1. Identificar o aa N-terminal e C-terminal

2. Identificar os aa totais constituintes de cada ppa proteína

3. Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis

3. Identificar o aa N-terminal e C-terminal de cada péptido

4. Sequenciar os fragmentos individualmente

5. Montar o puzzle

Estratégia analítica:


Insulina



1. Separar as diferentes cadeias polipeptídicas (se existirem)


-mercapto etanol

Técnicas

Cromatográficas

http://www.google.pt/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=MazqzZVwfN8zzM&tbnid=Bu3cM2FYoP0aeM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Foregonstate.edu%2Finstruct%2Fbb450%2Fspring13%2Flecture%2Fproteinstructureoutline.html&ei=Q3REUrHALemM7QaTj4CIBg&psig=AFQjCNGqut-JaR3aiGpFlmF97KGE7G5u9A&ust=1380304214440122




• Identificar o aa N-terminal e C-terminal


Derivatização

(ex: Cl-Dns)

HCl 6M/110ºC

(hidrólise)

Apenas a Gly se encontra marcada,

os restantes aa libertados não se

encontram marcados

Identificação técnicas

cromatográficas




• Identificar o aa N-terminal e C-terminal

Liberta apenas Asn Identificação técnicas

cromatográficas

Hidrólise


Carboxipeptidase




• Identificar a composição em aa

Liberta todos os aminoácidos


cromatográficas

Hidrólise

HCl 6M/110ºC Derivatização (ex: Cl-Dns)

Todos os aa ficam marcados





• Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis (endopeptidases

ou agentes químicos)

Hidrólise

Pepsina

(Ligação amina de

aa aromáticos)

Repetir os passos anteriores para cada

um dos péptidos obtidos


+

+




• Cortar a proteína em fragmentos mais pequenos (péptidos) sobreponíveis

(carboxipeptidases)

Hidrólise

Carboxipeptidase 5 min:

10 min:

15 min:


cromatográficas




PITC: Fenil isotiocianato

Hidrolizar e separar aa

Dansilar/ Hidrolizar e separar aa

E

Proteína constituida por

38 aa. Como tem R (Arg)

e K (Lys) pode-se utilizar

Tripsina . Por ter M (Met)

pode utilizar-se CnBr

Aa N-terminal: E(Glu)

Digerir com tripsina/separar

os péptidos e sequenciar

cada um

T2 é o primeiro péptido

(começa com um E)

T3 é o último (não

termina com R ou K)

Digerir com CnBr/separar

os péptidos e sequenciar

cada um

Ordem: C1, C3, C2


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