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20/03/2014
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ANÁLISE DE IMAGENS EM
TECNOLOGIA DE SEMENTES
Produção de Sementes (LPV-5705)
Pós-graduação - Fitotecnia
Primeiro Semestre de 2014
C.C.
Francisco Guilhien Gomes Junior
Tecnologia de Sementes
Depto de Produção Vegetal
USP/ESALQ
11/05/2012 13h10 - Atualizado em 11/05/2012 14h14
Satélite russo registra maior foto já feita da Terra, com 121 megapixelsCada pixel da imagem corresponde a 1 km de distância
PIXEL, RESOLUÇÃO E TAMANHO DA IMAGEM
TamanhoO tamanho de uma imagem digital está definido no número de linhas e colunas que a forma
ResoluçãoCapacidade que um sistema de captura/reprodução de imagens tem para reproduzir detalhes
A resolução de uma imagem é o número de pixels impressos ou exibidos por unidade de medida
Pixel: (“Pictures Elements”)É o menor ponto que forma uma imagem
x
y
Pixel = f(x,y)
Imagem digital
Imagem bitmapImagem vetorialCDR, AI e EPS TIFF, JPEG, PNG, GIF, BMP e PSD
Representação de uma imagem bidimensional
usando números binários codificados de modo a
permitir seu armazenamento, transferência,
impressão ou reprodução, e seu processamento por
meios eletrônicos
Tipos de imagens digitais
Cada pixel
tem um valor
independente
de corImagem
Vetorial
Imagem
Bitmap
Imagens digitais: vetorial e bitmap
A imagem
vetorial pode ser
redimensionada
sem perda de
qualidade
A resolução de uma
imagem bitmap
deve ser definida
antes da impressão
e o seu
redimensionamento
pode causar perda
de qualidade
As imagens vetoriais
são geradas a partir de
linhas (vetores) e
pontos, e são definidas
por coordenadas e
fórmulas matemáticas
As imagens bitmap
são geradas a partir
de uma malha
quadriculada, onde
a menor unidade é
chamada pixel
Esquerda: semente
de milho captada
em imagem de
100dpi, 256 tons de
cinza e 8bits.
Direita: ampliada 7x
em tela (700%)
Resolução de imagem digital
Teixeira (2004)
Propriedades das cores
RGB - Modelo aditivo CMYK - Modelo subtrativo
Escala de cinzas
Fonte: Google
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2
28 x 28 x 28
16,7 milhões de
cores
Modelo
RGB
8 bits
Escala de
cinzas
8 bits
Pixel = f(x,y)
Pixel = f(x,y) 28
256 níveis
x
y
x
y
Bits nos modelos RGB e escala de cinzas Imagem digital
Níveis de cinza
2568 bits
1287 bits
646 bits
325 bits
164 bits
83 bits
42 bits
21 bit
Marques Filho e Vieira Neto (1999)
IMAGEM BINÁRIA
Procedimentos não destrutivos para avaliação da
qualidade de sementesRaios X
Microtomografia computadorizada de raios X
Tomografia por ressonância magnética
Câmera multiespectral
Fluorescência de clorofila
Avaliação de características físicas e morfológicas
de sementes e de plântulasDescritores de cor, forma e tamanho das sementes
Avaliação do vigor de sementes com base em imagens
digitais de plântulas
Análise de imagens de sementes e de
plântulas
Procedimentos não destrutivos para avaliação
da qualidade de sementes
TESTE DE
RAIOS X
Procedimentos não destrutivos para avaliação
da qualidade de sementes
Raios X
Descoberta dos raios X
Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen (1845-1923)
8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X
Fonte: google
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Raios X
Características dos raios X
Fonte: google
Raios X
Como são gerados os raios X?
Elétrons acelerados
emitidos pelo cátodo se
chocam com um alvo
metálico (ânodo de
tungstênio)
Ao atingir o alvo, os
elétrons desaceleram e
perdem a energia cinética,
cedendo energia aos
elétrons do ânodo, gerando
energia térmica e radiação
Raios X: geração
O comprimento de onda gerado depende do nível de
energia
Alto nível de energia: ondas curtas
Mais apropriados para objetos grandes e, ou
densos
Possuem alta absorção e resolução e causam
baixo dano aos tecidos
Baixo nível de energia: ondas longas
São apropriados para objetos pequenos
Exemplo: sementes
Possuem baixa absorção e resolução e causam
alto dano aos tecidos
Fatores que afetam o nível de absorção
dos raios X pela semente
Espessura e densidade dos tecidos
Composição da semente
Proteínas, carboidratos e lipídios: diferentes graus de
hidrofobicidade
O teor de água da semente influencia a densidade
óptica
Comprimento de onda da radiação ionizante
Raios X de menor comprimento de onda => maior poder
de penetração
35% de água 15% de água
Imagens radiográficas de sementes de
Tucumã (Astrocaryum aculeatum)
apresentando diferentes graus de umidade
Viabilidade da utilização de raios X emsementes
CAUSA EFEITO
Radiografia de semente
de milho doce
A pequena dose de radiação usada durante o teste não exerceinfluência negativa sobre a germinação (não provocamutação)
Não inviabiliza a
semente (método não
destrutivo): relações
de causas e efeitos
Gomes-Junior e Cicero (2012)
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ISTA - desde a década de 1980 (detecção de sementes cheias,
vazias, danificadas mecanicamente ou por insetos).
RAS 2009 – capítulo específico (16) sobre o teste de raios X.
Raios X para análise de sementes
Histórico
Início da década de 1950 na Suécia: avaliação da
qualidade de sementes de Pinus sylvestris L.
(Simak e Gustafsson,1953)
Pinus sylvestris L.
Primeiro trabalho foi realizado por Lundström em
1903: sementes de coníferas
Raios X para análise de sementes
Histórico
Primeiro trabalho brasileiro foi realizado por Silvio
M. Cicero em 1998: avaliação de danos mecânicos
em sementes de milho
Setembro de 2001: inauguração do Laboratório de
Análise de Imagens do Departamento de
Produção Vegetal da USP/Esalq, financiado pela
FAPESP (primeiro laboratório para avaliação de
sementes utilizando raios X no Brasil)
Raios X
Como interpretar os resultados?
Conhecer a morfologia interna
Conhecer o princípio do teste
Raios X
Como interpretar os resultados?
Trinca 3Trinca 1
Trinca 2
Radícula
Plúmula
Raízes seminais
Raios X
Como interpretar os resultados?
1 mm
Crotalaria juncea L.
radícula
hipocótilo
plúmula
cotilédones
tegumento
Raios X
Como interpretar os resultados?
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Raios X
Aplicações em Tecnologia de Sementes
Detecção de anormalidades em embriões
Determinação do estádio de desenvolvimento das
sementes
Estudos de alterações fisiológicas durante os
processos de maturação, secagem, germinação ou
condicionamento fisiológico
Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas
por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores
adversos em pré e pós-colheita
Seleção de sementes cheias
Base para utilização de programas computadorizados
na avaliação de alterações da morfologia interna
Embrião
deformadoPA
Embrião com
pequeno defeito PA
PNEmbrião sem
defeito
Socolowski e Cicero (2008)
Tecoma stans
Raios X
Detecção de anormalidades em embriões
Raios X
Identificação de injúrias mecânicas
Gomes-Junior e Cicero (2012)
Flor et al. (2004)
milho doce
soja
Plântula anormal
Plântula anormal
Raios X
Identificação de injúrias por “umidade”
Injúrias severas no eixo
embrionário
Injúrias severas na
região dos cotilédones
Plântula anormal
soja
Forti et al. (2010)
Menezes et al. (2012)
Semente de
arroz: secagem
a 50o C
Raios X
Identificação de injúrias causadas por secagem
Caruncho em
feijão-caupi
Melo et al. (2010)
Raios X
Identificação de injúrias causadas por insetos
Forti et al. (2008)
Percevejo em
feijão
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Raios X
Seleção de sementes cheias
Totalmente formada Parcialmente formada Não formada
(Carvalho et al., 2010)
Sementes
de mamona
Área do embrião = 57%
Raios X
Base para utilização de programas computadorizados na
avaliação de alterações da morfologia interna
Espaço livre interno total = 1,28 mm2
Semente
de algodão
Semente de
Xylopia aromatica
Sokolowski et al. (2011)Marcos-Filho et al. (2010)
Neethirajan et al. (2007)
Detecção de grãos de
trigo “germinados” com
base na densidade de
pixels
Raios X
1 Moega de entrada de sementes
2 Tubo de raios X
3 Ampliação da imagem
4 Interface de usuário
5 Unidade de classificação
Posicionamento
da semente
Obtenção da
imagem radiográficaAnálise e processamento
dos dadosClassificação
Raios X no controle de qualidade de
sementes
Fonte: google (adaptado)
Tomografia computadorizada de
raios X (TC)
É uma técnica que permite a visualização de
seções transversais (cortes internos) de um
objeto de forma não destrutiva
A captura é feita através de uma série de
pequenas rotações
As informações de atenuação da radiação que
atravessa o objeto são gravadas para um plano
de interesse
Um algoritmo processa os dados para formar
uma imagem 2D
A combinação dessas imagens pode gerar a
visualização em 3D
Microtomografia de raios X
Tubo de
raios X
Intensificador
de imagem
Câmera
CCD
Projeções
Imagem 3D
Algoritmo de reconstrução
Seções
Análise das imagens
Determinação de
parâmetros físicos
Modelo 3D
Sistema de
circulação
Amostra
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Microtomografia computadorizada de
raios X (microTC)
Diferença em relação à TC
consiste no grau de
resolução da imagem e no
tamanho do objeto a ser
analisado
Apresenta resoluções
mínimas de 50 microns,
favorecendo a visualização
e caracterização da
estrutura interna de objetos
pequenos, como sementes
Microtomógrafo SkyScan 1172: Embrapa Instrumentação
Microtomografia de raios X
Posicionamento da amostra:
Seção 572
Seção 690
Semente de milho
Microtomografia computadorizada de raios X
2000 seções transversais
Microtomografia computadorizada de raios X
Imagem
radiográfica
Faxitron X-ray MX 20
DC 12 digital
SkyScan 1172
Passo de rotação: 0,2°
Rotação total: 180°
Tamanho do pixel: 6,6µm
Seção coronal
Seção transversal Seção sagital
Imagem detalhada do embriãoTomografia por ressonância
magnética
A tomografia por ressonância magnética utiliza
fortíssimos campos magnéticos e ondas de
rádio para formar imagens de uma amostra
São utilizados os pulsos de radiofrequência
direcionados somente ao hidrogênio contido na
amostra
O excesso de energia liberado pelos prótons de
hidrogênio quando o pulso de radiofrequência é
desligado emite um sinal de uma bobina para o
computador
Por meio de cálculos matemáticos os sinais são
transformados em uma imagem
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Monitoramento da secagem de sementes de cevada
Seefeldt et al. (2007)
Imagem por ressonância magnética
5 min 2 h 5 min 5 h 5 min 6 h 5 min
8 h 5 min 11 h 5 min 12 h 5 min 17 h 5 minKoizumi et al. (2008)
Monitoramento da hidratação de sementes de soja
Imagem por ressonância magnética
Câmera multiespectral
Imagem multiespectral: imagens de um mesmo objeto, tomadas com diferentes comprimentos de ondas eletromagnéticas (luz visível, infravermelha, ultravioleta, raios X ou qualquer outra faixa do espectro)
Imagem colorida tradicional
Utiliza três filtros
para as bandas
Red, Green e
Blue
Imagem RGB
Limite do
Infravermelho
Comprimento de onda (nm)R
esp
osta
rela
tiva
Imagem multiespectral
ultravioleta infravermelho
Clorofila b
Clorofila a
Comprimento de onda (nm)
Ab
so
rbâ
ncia
Imagem colorida tradicional
Clorofilas a e b
apresentam
quase o mesmo
sinal RGB
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Clorofila b
Clorofila a
Comprimento de onda (nm)
Ab
so
rbâ
ncia
Imagem multiespectral
Em comprimentos
de onda específicos
as clorofilas a e b
apresentam
diferentes sinais e
podem sem
identificadas
Identificação de fungos em sementes de
espinafre
Olesen et al. (2011)
Olesen et al. (2011)
Identificação de fungos em sementes de
espinafreAlternaria
Cladosporium
Fusarium
Stemphylium
Sem infecção
Verticilium
Inte
nsid
ad
e m
éd
ia
Comprimento de onda (nm)
Identificação de fungos em sementes de
espinafreN
úm
ero
de p
ixels
Núm
ero
de p
ixels
Intensidade do pixel
Alternaria spp.
Cladosporium spp.
Fusarium spp.
Verticillium spp.
Stemphylium spp.
Sem infecção
Olesen et al. (2011)
Câmera multiespectral no controle de
qualidade de sementes
Entrada das sementes
Esteira móvel
Espectômetro e unidade de iluminação
Classificação:Sementes maduras e sadiasSementes imaturasSementes infectadas por fungos
Fonte: google (adaptado)
Fluorescência de clorofila
Jalink et al. (1998)
A clorofila fluoresce quando
excitada em um determinado
comprimento de onda
1. Um laser ou uma luz de LED
excita a clorofila
2. Um filtro de largura de banda
estreita filtra a fluorescência
3. A clorofila da semente é
determinada
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Fluorescência de clorofila em semente de
pimenta durante a germinação
Média
de F
C/p
ixel
x1000 (
valo
r escala
de c
inza)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
40
30
20
10
0
Tempo (h)
68h 20min
50
http://www.phenovation.com
Lote de baixo vigor
Ocorrência de sementes esverdeadas
Lote de alto vigor
Sinal de fluorescência, baixo para alto: pretovermelholaranjaamareloverde
Fluorescência de clorofila em sementes
de soja
http://www.phenovation.com
Avaliação de características físicas e morfológicas de sementes e de plântulas
Sementes
Plântulas
Câmera CCD
Escâner de mesa
Computador e programa
para análise de imagens
Imagens em Time-lapse
Descritores de cor, forma e
tamanho das sementes
Classificação do vigor
de lotes de sementes
Construção da imagem da semente
Curva de embebição (monitoramento)
Taxa de crescimento da raiz
Índices médios RGB
Descritores biomorfológicos Adaptado de Dell´Aquila (2006)Dell’Aquila (2009)
Índices RGB como indicadores da viabilidade
de sementes
Inicial Após envelhecimento
Escurecimento do tegumento de
sementes de lentilha após o
envelhecimento (51 dias a 40 °C
e teor de água de 14,4%)
Dell’Aquila (2006)
Índices médios RGB como indicadores da
viabilidade de sementes
Onobrychis viciifolia
Behtari et al. (2014)
Índices médios RGB como indicadores da
viabilidade de sementes
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Índices médios RGB no monitoramento da
taxa de crescimento da raiz
Dell’Aquila (2009)
Semente de rabanete Método direto para a
identificação de sementes
com alto potencial de
desempenho
Armazenamento das imagens
de plântulas
Resultados rápidos, objetivos
e precisos
Biossíntese incompleta
Membranas incompletas
MATURIDADE FISIOLÓGICA
Degeneração das membranas
Redução das atividades respiratórias e biossintéticas
Germinação lenta
Redução do potencial de conservação
Menor taxa de crescimento e de desenvolvimento
Menor uniformidade de desempenho
Maior sensibilidade a adversidades
Redução da emergência de plântulas em campo
Aberrações morfológicas (plântulas anormais)
Perda do poder germinativo
MORTE Adaptado de Delouche e Baskin (1973)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
baseada em imagens digitais de plântulas
Processamento de uma imagem digital de
plântula de milho
256 tons de cinza
(8 bits)
300 dpi
Imagem binária Esqueleto em
imagem binária
Algoritmocontador de
pixels
Teixeira et al. (2006)
Cn = média aritmética
do comprimento (cm)
n = número de
plântulas medidas em
"pixels" sob resolução
(r) dada em dpi.
Hipocótilo
Raiz
Baalbaki et al. (2009)
Marcos-Filho et al. (2009)
Programas
Seed Vigor Imaging System (SVIS)
Sistema de Análise de Sementes (SAS)
Análise Automatizada do Vigor de
Sementes (Vigor-S)
Determinação de índices (escala de 0 a
1000)
Crescimento
Uniformidade de desenvolvimento
Vigor
Determinação do comprimento médio
das plântulas
Avaliação automatizada do vigor de sementesalface
soja
Comp. plântula em azul: 7,8 cm
Índice de Crescimento: 837
Índice de Uniformidade: 947
Índice de Vigor: 870
Comp. plântula em azul: 4,5 cm
Índice de Crescimento: 435
Índice de Uniformidade: 925
Índice de Vigor: 582
Baixo vigor Alto vigor
Gomes-Junior et al. (2014)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
de feijão (programa SVIS)
SVIS: índices de vigor para soja(plântulas com três dias de idade)
Proposta da Ohio Seed Improvement Association
Alto vigor: > 500
Vigor médio: 200 - 500
Baixo vigor: < 200
Proposta da Ohio State University
Vigor excepcional: 800 - 1000
Alto vigor: 600 - 799
Bom vigor: 400 - 599
Baixo vigor: 200 - 399
Grãos: < 200
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Cultivar Nitro
Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU
6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab
7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c
8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc
9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a
10 99 a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab
C.V. (%) 5,5 5,5 6,0 5,3 3,6 2,9
Marcos Filho et al. (2006)* Comparação na coluna (teste de Tukey: p≤ 0,05)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
de melão: comparação com métodos tradicionais
Índice de VigorÍndice de
Uniformidade
Cuidados e limitações
Temperatura no germinador
Parâmetros
SVIS
Temperatura °C
Milho Soja
24 °C 25 °C 26 °C 24 °C 25 °C 26 °C
Crescimento 531 B 459 B 734 A 612 B 573 B 731 A
Uniformidade 832 B 861 A 859 A 867 A 872 A 870 A
Vigor 621 B 579 B 765 A 739 B 722 B 800 A
Uniformidade de umedecimento do substrato
Horário de instalação do teste de germinação e aquisiçãodas imagens
Comparação entre cultivares com diferentes taxas de crescimento
Sementes dormentes
Otoni e McDonald et al. (2005)