1 Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005.
Transcript of 1 Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005.
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Polymerase Chain Reaction (PCR)
Pedro TeigaRicardo LadeirasSofia Marques
21 Abril 2005
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A invenção da PCR
1983 Kary Mullis
1985 1º paper
1993 Nobel da Química
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PCR, a ferramenta do futuro
Grande quantidade de DNA em pouco tempo. Baixo custo A amostra de DNA não necessita de estar altamente
purificada. PCR pode amplificar uma única molécula de DNA /
RNA. O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de
restrição, sequenciado ou clonado.
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A reacção
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O que envolve a reacção?
DNA Template Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de
potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino)
Nucleótidos (dNTPs) Primers DNA polymerase (pex: Taq, Pfu)
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Quantos ciclos?
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Termo-Cicladores
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Funcionou?
Se não…o que fazer?
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Optimização da reacção de PCR
Temperatura Tempos Concentração de
Mg2+ na reacção. Quantidade de
template e de polymerase
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DNA polimerases..
E. coli Taq Pfu – proofreading rTth DNA
Polymerase
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Fidelidade da reacção
A Taq comete ERROS
Qual a importância dos erros?
Como superá-los?
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Concepção dos PCR Primers
Comprimento: especificidade vs eficácia Temp de annealing Composição de bases Extremidade 3’ Regiões repetitivas do DNA Enzimas de restrição Estrutura secundária
Homologias Intra e Inter-primer
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Primers a formar Hairpins e Dímeros
Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin:
Dímero de primers (intra ou inter primer).
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Aplicações do PCR
Multiplex PCR Real Time PCR PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de
DNA PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas PCR assimétrico PCR e clonagem de DNA genómico PCR e clonagem de cDNA PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da
Filiação genética
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Multiplex PCR
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Real time PCR
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PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas
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Para detectar polimorfismos de local de restrição
• O que são polimorfismos?
• Porque existem os polimorfismos?
• Como se detectam esses polimorfismos?
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PCR específico para um alelo e detecção de mutações
• Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo?
• Um só nucleotídeo faz a diferença?
• Como se interpretam os resultados?
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• Qual a vantagem?
PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA
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Linker-primed PCR
• Como decorre?
• O que é o linker?
• Que primers são usados?
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• Qual a vantagem?
PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada
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PCR inverso
• Quando se utiliza?
• Como são os primers?
• Como decorre o processo?
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Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA
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PCR assimétrico
• Com que fim se utiliza?
• Porquê assimétrico?
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Clonagem de DNA genómico
↓
Clonagem de cDNA
↓
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PCR e DNA Fingerprinting
Exemplo: “locus” D1S80
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PCR e DNA Fingerprinting
Suas principais aplicações:
Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime)
Filiação genética (ex. testes de paternidade)
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PCR e Filiação genética
Pai
Mãe
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O futuro da PCR
PCR ↔ material genéticoFotocopiadora ↔ material escrito
tornando a cópiafácil, barata, acessível
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O futuro da PCR
Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.
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Agradecimentos
• Este trabalho foi possível com a ajuda de..
Drª. Clara Monteiro Drª. Susana Pereira, IBMC Drª. Marta Pinto
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Referências
•Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA•James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition; 1992; New York,Scientific American Books•Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition•Alkami quick guide tm for PCR•Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004•A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade•Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR)•Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books