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Disciplina: Seminário I
Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira
Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
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Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos
Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira
Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA
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INTRODUÇÃO
Proteínas
Estrutural
Transporte
Enzimática
Hormonal
Imunológica
Seres vivos
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INTRODUÇÃO
Anderson & Anderson (1982)
ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS
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A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições.
Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)
7DegradaçõesProteínas
DNATranscrição
pré-RNAmSplicing
RNAm
Tradução
Modificações
Fatores epigenéticosTemperatura
EstresseDoenças
Alimentação
Dinâmica do proteoma
WITZMANN & LI (2002)
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OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA
Proteômica
Nível de expressão de proteínas
Modificações Pós-traducionais
Interações entre proteínas
Identificação de Biomarcadores
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BIOMARCADORES
São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos.
Moore et al., (2007)
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
Amostra
Separação
Identificação
ZHOU et al., (2005)
Coleta
Coleta
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• Coleta de amostras:– Unicelulares (+ sincronização):
• fase do ciclo celular e condições de cultivo
– Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares
(- sincronização):• Biópsias: ≠ tipos celulares • Cultura de tecidos
– Coleta: Manual X microdissecção a laser
– Fluídos biológicos• Complexidade
ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
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• Eletroforese Bidimensional (2D) Espectrometria de Massa (EM)
– Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos;• Quantitativos• Qualitativos
• Cromatografia líquida (CL)Espectrometria de massa (EM)
– Recuperação de ptns na forma nativa• Análises funcionais, estruturais e bioquímicas
ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES
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• Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico:
– 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica• pI
– 2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE)
• Tamanho (massa molecular)
O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(+)
(-)
pI
(menor)
M.M.
SDS-PAGEFocalização Isoelétrica
(maior)
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(menor)
M.M.
SDS-PAGE
(maior)
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(+)
(-)
M.M.
Revelação
• Azul brilhante de Coomassie coloidal
• Fluorescência
pI (+)(-)
Análise do gel
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
controle
Tratamento
Gel A
Gel B
≠
ISSAQ & VEENSTRA (2008)
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ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE)
controle
Tratamento
Cy5
Cy5
UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)
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Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional.
Vantagens Limitações
Quantificar expressão Reprodutibilidade
Analisar modificações pós-traducionais
Tempo de execução
Avaliar várias proteínas
Não é automatizada
Proteínas de membrana
Proteínas: pI e MM extremas
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ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA
Digestão: tripsina
Espectrômetro de massas
m/z
Espectros de massasProgramas: identificar
a proteína
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Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Fonte de Ionização
Analisador Detector
Recipiente com baixa pressão
Amostra
Dados
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ESPECTROMETRIA DE MASSA
• Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF)
Tempo de vôo Detector
Laser
amostra
Karas & Hillkamp (1998)
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ESPECTROMETRIA DE MASSA
m/z
Espectros de massaspeptídeos
Programas de Análise e pesquisa em banco
de dados.
Impressão Digital de peptídeos
ProteínaBiomarcador
Espectrômetro de massa
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas).
peptídeos
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
• Fase líquida:• Solvente: alto grau de pureza
• Fase estacionária:
Troca iônicaAltamente carregada (íons + ou -)
Exclusão molecular Poros com tamanhos controlados
MATT et al. 2008
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SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
Reservatório fase móvel
Bomba de alta pressão
Registro e análise dos dados
Detector
amostra
coletor
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE
• Métodos de detecção:
– Absorbância (UV)
– Fluorescência
– Espectrometria de massa• CLEM
proteínas
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CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM
(ES/ES)
• Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF)
m/z
Camara de colisão
MATT et al., 2008
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ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM)
m/z
Espectros de massas
Programas de Análise e pesquisa em banco
de dados.
Sequenciamento de novo da proteína
ProteínaBiomarcador
Espectrômetro de massa(EM/EM)
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Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance.
Vantagens Limitações
Tempo de execução Custo do equipamento
Automatização Manutenção do equipamento
Versatilidade
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ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Do geral para o particular
Analisar proteomas de condições distintas e identificar as
diferenças
Do particular para o geralAnalisar uma proteína e inferir suas
funções no contexto do todo
Separação de proteínas nas amostras
Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC)
fragmentação
Espectrometria de Massas: Determinação de massas para identificação
Impressão digital de peptídeos Sequenciamento de novo
Bioinformática
PROTEINAMANN et al. 2001
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Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um
modelo ovino de trabalho de parto
Indução de parto
Dexametasona
MS/MS
(+) Bactenecina
YOUNG et al. (2007)
0 h 28 hTrabalho de parto
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Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa
produção de ovos
corte
poedeira
18 semanas
60 semanas
CLAP-MS/MS
Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3
(HNRPH3)
KUO et al. (2007)
(HNRPH3) (+)
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Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos
Alta fertilidade
Baixa fertilidade
Purificação
Sequenciamento
identificação
Osteopontina
KILLIAN et al. (1993)
55 kDa; pI = 6,2
AIDA et al. (1999)
GONÇALVES et al. (2008)
sêmen
oócitos
FIV
(+)
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Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores
• Otimização dos bancos de dados
• Detecção de proteínas em baixas concentrações;
• Automatização das técnicas;
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Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores
• Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais;
• Seleção de animais de produção;
• Descoberta de novos princípios da fisiologia celular;
• “Metabolômica”;
