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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS DA REABILITACcedilAtildeO
RAFAEL RIBEIRO
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO NA PROLIFERACcedilAtildeO E
ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE CEacuteLULAS MUSCULARES
Satildeo Paulo SP
2009
1
RAFAEL RIBEIRO
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO NA PROLIFERACcedilAtildeO E
ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE CEacuteLULAS MUSCULARES
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave
Universidade Nove de Julho
para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Mestre em Ciecircncias da
Reabilitaccedilatildeo
Orientadora Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
Co-orientadora Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
Satildeo Paulo SP
2009
2
Ribeiro Rafael
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na proliferaccedilatildeo e atividade
gelatinoliacutetica de ceacutelulas musculares Rafael Ribeiro 2009
58 f
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Universidade Nove de Julho - UNINOVE
Satildeo Paulo 2009
Orientador (a) Prof Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
1 Ultra-som 2 Mioblastos 3 C2C12 4 Proliferaccedilatildeo 5 Zimografia
CDU 6158
3
4
DEDICATOacuteRIA
Aos meus pais Edir e Elisabete Cristina por todo amor e carinho que sempre
tiveram comigo aleacutem do apoio e compreensatildeo em todas as situaccedilotildees ao longo
desta jornada Muito obrigado por me permitirem concretizar mais esse sonho
5
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus que sempre me apoacuteia daacute forccedilas e abre os caminhos para que eu
possa caminhar e trilhar a minha vida em todos os momentos
Agrave minha esposa Bruna Torralvo aos meus irmatildeos Bruno e Raul Ribeiro pela
compreensatildeo e paciecircncia nos momentos de ausecircncia para que eu pudesse
conquistar meus objetivos
Agrave minha orientadora e amiga Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
a quem devo minha iniciaccedilatildeo acadecircmica e trajetoacuteria ateacute aqui quem me ensinou
agrave pesquisar em prol da comunidade sempre foi e seraacute um exemplo pra mim de
competecircncia e capacidade
Agrave minha co-orientadora e amiga Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
profissional e pessoa incriacutevel agradeccedilo por toda paciecircncia dedicaccedilatildeo
habilidade e amor com que me ensinou ao longo desse tempo
Por ter vivenciado todo o curso agradeccedilo a todos os demais professores que
contribuiacuteram cada uma agrave sua forma desde aos conhecimentos cientiacuteficos
propriamente ditos ateacute os ensinamentos de vida que me passaram Natildeo cito
nomes por que natildeo caberiam aqui Obrigado pela dedicaccedilatildeo respeito e toda
confianccedila que sempre dedicaram a mim
Aos teacutecnicos do laboratoacuterio de pesquisa em especial ao Bruno Duzzi por toda
sua fundamental colaboraccedilatildeo
Ao Prof Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo pela
doaccedilatildeo das ceacutelulas C2C12 que propiciaram todo esse estudo
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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23 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
26 Chen YJ Wang CJ Yang KD Chang PR Huang HC Huang YT et al
Pertussis toxin-sensitive GKi protein and ERK-dependent pathways mediate
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27 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
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37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
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38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
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39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
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stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in
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41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
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aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
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23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
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25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
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26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
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27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
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formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
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45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
1
RAFAEL RIBEIRO
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO NA PROLIFERACcedilAtildeO E
ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE CEacuteLULAS MUSCULARES
Dissertaccedilatildeo apresentada agrave
Universidade Nove de Julho
para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de
Mestre em Ciecircncias da
Reabilitaccedilatildeo
Orientadora Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
Co-orientadora Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
Satildeo Paulo SP
2009
2
Ribeiro Rafael
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na proliferaccedilatildeo e atividade
gelatinoliacutetica de ceacutelulas musculares Rafael Ribeiro 2009
58 f
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Universidade Nove de Julho - UNINOVE
Satildeo Paulo 2009
Orientador (a) Prof Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
1 Ultra-som 2 Mioblastos 3 C2C12 4 Proliferaccedilatildeo 5 Zimografia
CDU 6158
3
4
DEDICATOacuteRIA
Aos meus pais Edir e Elisabete Cristina por todo amor e carinho que sempre
tiveram comigo aleacutem do apoio e compreensatildeo em todas as situaccedilotildees ao longo
desta jornada Muito obrigado por me permitirem concretizar mais esse sonho
5
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus que sempre me apoacuteia daacute forccedilas e abre os caminhos para que eu
possa caminhar e trilhar a minha vida em todos os momentos
Agrave minha esposa Bruna Torralvo aos meus irmatildeos Bruno e Raul Ribeiro pela
compreensatildeo e paciecircncia nos momentos de ausecircncia para que eu pudesse
conquistar meus objetivos
Agrave minha orientadora e amiga Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
a quem devo minha iniciaccedilatildeo acadecircmica e trajetoacuteria ateacute aqui quem me ensinou
agrave pesquisar em prol da comunidade sempre foi e seraacute um exemplo pra mim de
competecircncia e capacidade
Agrave minha co-orientadora e amiga Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
profissional e pessoa incriacutevel agradeccedilo por toda paciecircncia dedicaccedilatildeo
habilidade e amor com que me ensinou ao longo desse tempo
Por ter vivenciado todo o curso agradeccedilo a todos os demais professores que
contribuiacuteram cada uma agrave sua forma desde aos conhecimentos cientiacuteficos
propriamente ditos ateacute os ensinamentos de vida que me passaram Natildeo cito
nomes por que natildeo caberiam aqui Obrigado pela dedicaccedilatildeo respeito e toda
confianccedila que sempre dedicaram a mim
Aos teacutecnicos do laboratoacuterio de pesquisa em especial ao Bruno Duzzi por toda
sua fundamental colaboraccedilatildeo
Ao Prof Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo pela
doaccedilatildeo das ceacutelulas C2C12 que propiciaram todo esse estudo
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
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Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
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25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
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26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
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Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
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29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
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osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
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45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
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48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
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49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
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51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
2
Ribeiro Rafael
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na proliferaccedilatildeo e atividade
gelatinoliacutetica de ceacutelulas musculares Rafael Ribeiro 2009
58 f
Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Universidade Nove de Julho - UNINOVE
Satildeo Paulo 2009
Orientador (a) Prof Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
1 Ultra-som 2 Mioblastos 3 C2C12 4 Proliferaccedilatildeo 5 Zimografia
CDU 6158
3
4
DEDICATOacuteRIA
Aos meus pais Edir e Elisabete Cristina por todo amor e carinho que sempre
tiveram comigo aleacutem do apoio e compreensatildeo em todas as situaccedilotildees ao longo
desta jornada Muito obrigado por me permitirem concretizar mais esse sonho
5
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus que sempre me apoacuteia daacute forccedilas e abre os caminhos para que eu
possa caminhar e trilhar a minha vida em todos os momentos
Agrave minha esposa Bruna Torralvo aos meus irmatildeos Bruno e Raul Ribeiro pela
compreensatildeo e paciecircncia nos momentos de ausecircncia para que eu pudesse
conquistar meus objetivos
Agrave minha orientadora e amiga Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
a quem devo minha iniciaccedilatildeo acadecircmica e trajetoacuteria ateacute aqui quem me ensinou
agrave pesquisar em prol da comunidade sempre foi e seraacute um exemplo pra mim de
competecircncia e capacidade
Agrave minha co-orientadora e amiga Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
profissional e pessoa incriacutevel agradeccedilo por toda paciecircncia dedicaccedilatildeo
habilidade e amor com que me ensinou ao longo desse tempo
Por ter vivenciado todo o curso agradeccedilo a todos os demais professores que
contribuiacuteram cada uma agrave sua forma desde aos conhecimentos cientiacuteficos
propriamente ditos ateacute os ensinamentos de vida que me passaram Natildeo cito
nomes por que natildeo caberiam aqui Obrigado pela dedicaccedilatildeo respeito e toda
confianccedila que sempre dedicaram a mim
Aos teacutecnicos do laboratoacuterio de pesquisa em especial ao Bruno Duzzi por toda
sua fundamental colaboraccedilatildeo
Ao Prof Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo pela
doaccedilatildeo das ceacutelulas C2C12 que propiciaram todo esse estudo
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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wistar rats Braz Arch Biol Technol 200851(special)225-30
15 Plentz RDM Stoffel PB Kolling GJ Costa ST Beck C Signori LU
Alteraccedilotildees hematoloacutegicas provocadas pelo ultra-som de 1 MHz na forma
contiacutenua aplicadas no tratamento da fase aguda de lesatildeo muscular
iatrogecircnica em ratos Rev Bras Fisioter 200812(6)495-501
16 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 200731482-8
17 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil
200788936-40
18 Lopes LG Bertolini SMMG Martins EER Gewehr PM Lopes MS Anaacutelise
morfomeacutetrica de tecido muscular de coelhos submetido a ultra-som pulsado
e contiacutenuo de 1 MHz Fisioterapia e Pesquisa 200512(3)15-21
19 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil
2005861304-10
20 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 20042573-7
21 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
7
27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
3
4
DEDICATOacuteRIA
Aos meus pais Edir e Elisabete Cristina por todo amor e carinho que sempre
tiveram comigo aleacutem do apoio e compreensatildeo em todas as situaccedilotildees ao longo
desta jornada Muito obrigado por me permitirem concretizar mais esse sonho
5
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus que sempre me apoacuteia daacute forccedilas e abre os caminhos para que eu
possa caminhar e trilhar a minha vida em todos os momentos
Agrave minha esposa Bruna Torralvo aos meus irmatildeos Bruno e Raul Ribeiro pela
compreensatildeo e paciecircncia nos momentos de ausecircncia para que eu pudesse
conquistar meus objetivos
Agrave minha orientadora e amiga Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
a quem devo minha iniciaccedilatildeo acadecircmica e trajetoacuteria ateacute aqui quem me ensinou
agrave pesquisar em prol da comunidade sempre foi e seraacute um exemplo pra mim de
competecircncia e capacidade
Agrave minha co-orientadora e amiga Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
profissional e pessoa incriacutevel agradeccedilo por toda paciecircncia dedicaccedilatildeo
habilidade e amor com que me ensinou ao longo desse tempo
Por ter vivenciado todo o curso agradeccedilo a todos os demais professores que
contribuiacuteram cada uma agrave sua forma desde aos conhecimentos cientiacuteficos
propriamente ditos ateacute os ensinamentos de vida que me passaram Natildeo cito
nomes por que natildeo caberiam aqui Obrigado pela dedicaccedilatildeo respeito e toda
confianccedila que sempre dedicaram a mim
Aos teacutecnicos do laboratoacuterio de pesquisa em especial ao Bruno Duzzi por toda
sua fundamental colaboraccedilatildeo
Ao Prof Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo pela
doaccedilatildeo das ceacutelulas C2C12 que propiciaram todo esse estudo
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
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26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
4
DEDICATOacuteRIA
Aos meus pais Edir e Elisabete Cristina por todo amor e carinho que sempre
tiveram comigo aleacutem do apoio e compreensatildeo em todas as situaccedilotildees ao longo
desta jornada Muito obrigado por me permitirem concretizar mais esse sonho
5
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus que sempre me apoacuteia daacute forccedilas e abre os caminhos para que eu
possa caminhar e trilhar a minha vida em todos os momentos
Agrave minha esposa Bruna Torralvo aos meus irmatildeos Bruno e Raul Ribeiro pela
compreensatildeo e paciecircncia nos momentos de ausecircncia para que eu pudesse
conquistar meus objetivos
Agrave minha orientadora e amiga Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
a quem devo minha iniciaccedilatildeo acadecircmica e trajetoacuteria ateacute aqui quem me ensinou
agrave pesquisar em prol da comunidade sempre foi e seraacute um exemplo pra mim de
competecircncia e capacidade
Agrave minha co-orientadora e amiga Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
profissional e pessoa incriacutevel agradeccedilo por toda paciecircncia dedicaccedilatildeo
habilidade e amor com que me ensinou ao longo desse tempo
Por ter vivenciado todo o curso agradeccedilo a todos os demais professores que
contribuiacuteram cada uma agrave sua forma desde aos conhecimentos cientiacuteficos
propriamente ditos ateacute os ensinamentos de vida que me passaram Natildeo cito
nomes por que natildeo caberiam aqui Obrigado pela dedicaccedilatildeo respeito e toda
confianccedila que sempre dedicaram a mim
Aos teacutecnicos do laboratoacuterio de pesquisa em especial ao Bruno Duzzi por toda
sua fundamental colaboraccedilatildeo
Ao Prof Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo pela
doaccedilatildeo das ceacutelulas C2C12 que propiciaram todo esse estudo
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
5
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus que sempre me apoacuteia daacute forccedilas e abre os caminhos para que eu
possa caminhar e trilhar a minha vida em todos os momentos
Agrave minha esposa Bruna Torralvo aos meus irmatildeos Bruno e Raul Ribeiro pela
compreensatildeo e paciecircncia nos momentos de ausecircncia para que eu pudesse
conquistar meus objetivos
Agrave minha orientadora e amiga Profa Dra Kristianne Porta Santos Fernandes
a quem devo minha iniciaccedilatildeo acadecircmica e trajetoacuteria ateacute aqui quem me ensinou
agrave pesquisar em prol da comunidade sempre foi e seraacute um exemplo pra mim de
competecircncia e capacidade
Agrave minha co-orientadora e amiga Profa Dra Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
profissional e pessoa incriacutevel agradeccedilo por toda paciecircncia dedicaccedilatildeo
habilidade e amor com que me ensinou ao longo desse tempo
Por ter vivenciado todo o curso agradeccedilo a todos os demais professores que
contribuiacuteram cada uma agrave sua forma desde aos conhecimentos cientiacuteficos
propriamente ditos ateacute os ensinamentos de vida que me passaram Natildeo cito
nomes por que natildeo caberiam aqui Obrigado pela dedicaccedilatildeo respeito e toda
confianccedila que sempre dedicaram a mim
Aos teacutecnicos do laboratoacuterio de pesquisa em especial ao Bruno Duzzi por toda
sua fundamental colaboraccedilatildeo
Ao Prof Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo pela
doaccedilatildeo das ceacutelulas C2C12 que propiciaram todo esse estudo
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
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48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
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49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
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50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
6
RESUMO
O ultra-som tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo uma
das modalidades eletro-terapecircuticas mais largamente e frequumlentemente
empregadas Mesmo assim sua efetividade no tratamento da dor das lesotildees
muacutesculo-esqueleacuteticas e das lesotildees em tecido mole permanece questionaacutevel e
seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente estabelecido Buscando
contribuir para o conhecimento neste campo esse trabalho teve como objetivos
principais fazer um levantamento bibliograacutefico por meio de uma revisatildeo
sistemaacutetica da literatura e avaliar por meio de estudo in vitro o efeito do ultra-
som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e atividade gelatinoliacutetica de
ceacutelulas musculares esqueleacuteticas (C2C12) No estudo in vitro o ultra-som foi
testado nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no
modo pulsado a 20 com periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 e 5 minutos A
proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72 horas apoacutes a irradiaccedilatildeo
por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das ceacutelulas (meacutetodo MTT) e a
atividade gelatinoliacutetica presente no sobrenadante das culturas celulares foi
avaliada por zimografia (complementada pela anaacutelise das densitometrias das
bandas que proporcionaram hidroacutelise da gelatina) O grupo controle foi
representado por culturas celulares natildeo submetidas ao ultra-som e os dados
obtidos foram tratados estatisticamente com niacutevel de significacircncia de 05 (p le
005 - ANOVA-Dunnet) Na revisatildeo sistemaacutetica observou-se grande
controveacutersia entre resultados e paracircmetros sendo impossiacutevel estabelecer
conclusotildees definitivas sobre o potencial terapecircutico do US em tecido muscular
Os experimentos mostraram que natildeo houve diferenccedila significante na
proliferaccedilatildeo celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas
controles apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria
dos geacuteis Portanto haacute necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
pelo US bem como para o estabelecimento de padrotildees de frequumlecircncia
intensidade tempo e modo de aplicaccedilatildeo deste recurso terapecircutico
Palavras-chave Ultra-som Mioblastos C2C12 Proliferaccedilatildeo Zimografia
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
7
ABSTRACT
Ultrasound has been one of the most widely and frequently used electro-
therapeutic modalities for over 60 years However its effectiveness in treating
pain musculoskeletal disorders and soft tissue lesions remains questionable
and its therapeutic potential is not fully established In order to contribute to
knowledge in this field the objectives of the present study were to carry out a
systematic review on this subject and perform an in vitro study for the
assessment of the effect of therapeutic pulsed ultrasound on the proliferation
and gelatinolytic activity of skeletal muscle cells (C2C12) Ultrasound was
tested at frequencies of 1 and 3 MHz powers of 02 and 05 Wcm2 and pulsed
mode at 20 with application periods of 2 and 5 min Cell proliferation was
measured indirectly 72 hours after irradiation by assessing mitochondrial activity
using the MTT method Gelatinolytic activity in the supernatant of the cell
cultures was assessed by zymography complimented with densitometry
analysis of bands that furnished gelatin hydrolysis The control group was made
up of cell cultures not submitted to ultrasound The data were treated
statistically with a significance level of 05 (p le 005 - ANOVA-Dunnet) The
systematic review revealed considerable controversy among the results and
parameters employed which renders definitive conclusions regarding the
potential of ultrasound on muscle tissue impossible The experiments revealed
no significant differences in cell proliferation between ultrasound-treated
myoblasts and control cultures after 72 hours of incubation The same was true
in the densitometry analysis of the gels Thus there is a need for further
investigations in order to gain a better understanding of the biochemical cellular
and organic reactions triggered by ultrasound as well as for the establishment
standards of frequency intensity exposure time and application mode of this
therapeutic resource
Key-words Ultrasound Myoblasts C2C12 Proliferation Zymography
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
8
SUMAacuteRIO
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
2 ESTUDO 1 ldquoEfeitos do ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
revisatildeo sistemaacuteticardquo 19
Resumo 20
Introduccedilatildeo 21
Material e meacutetodos 21
Resultados 23
Discussatildeo 28
Conclusatildeo 29
Referecircncias Bibliograacuteficas 30
3 ESTUDO 2 ldquoEfeito do ultra-som de baixa intensidade sobre a
proliferaccedilatildeo e remodelamento de mioblastos C2C12 estudo in vitrordquo 33
Resumo 34
Introduccedilatildeo 35
Material e meacutetodos 36
Resultados 39
Discussatildeo 42
Referecircncias Bibliograacuteficas 47
4 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 51
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 52
APEcircNDICE Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
terapecircutico na cultura celular 57
ANEXO Protocolo de submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian
Journal of Medical and Biological Research 58
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Estudo
Tabela 1 ndash Grupos experimentais 37
Apecircndice
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais 24
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos 26
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular 27
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
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regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
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22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
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23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
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47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
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200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
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49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
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51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
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53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
10
LISTA DE FIGURAS
Estudo 1
Figura 1 Divisatildeo dos artigos em 3 grandes grupos para facilitar a anaacutelise
comparativa dos resultados 23
Estudo 2
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do ultra-som
na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005) 37
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2 40
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos sobrenadantes das culturas
por meio de zimografia em 1 de gelatina-SDS-PAGE Cada linha representa
um grupo experimental - A Controle 2min B 02Wcm2 - 2min - 1MHz C
05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min - 1MHz E- 05Wcm2 - 5min -
1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 - 2min - 3MHz H 02Wcm2 -
5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz 41
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
11
Figura 5 Concentraccedilatildeo de gelatinase (proteinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) obtida pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e
forma ativa) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante entre os
grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz(p lt 005
ANOVA - Dunnet) 42
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
12
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCl ndash Cloreto de caacutelcio
cm - Centiacutemetro
DMEM ndash Meio Eagle Modificado por Dulbecco
EDTA ndash Ethylenediamine tetraacetic acid (aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico)
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
Hz - Herts
HCl ndash Aacutecido cloriacutedrico
M ndash Molar
MEC ndash Matriz extracelular
MHz ndash Megaherts
ml ndash Mililitros
mM ndash Milimolar
MMP ndash Metaloproteinase de matriz extracelular
MTT - (3-[45-Dimethylthiazol-2yl]-25-diphenyltetrazolium bromide Thiazolyl
blue
NaCl ndash Cloreto de soacutedio
NaN3 ndash Trinitrogeneto de soacutedio (azida de soacutedio)
nm ndash Nanocircmetros
NO ndash Oacutexido niacutetrico
NOS ndash Oacutexido niacutetrico sintase
PBS - Phosphate-buffered saline (soluccedilatildeo salina tamponada com fosfato)
MAPK - Mitogen-activated protein kinase
SDS-PAGE - Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SFB ndash Soro fetal bovino
microg ndash Microgramas
microm ndash Microcircmetros
US ndash Ultra-som
VCl3 ndash Cloreto de vanaacutedio
Wcm2 ndash Watts por centiacutemetro quadrado
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
13
1 CONTEXTUALIZACcedilAtildeO
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como a reparaccedilatildeo raacutepida de lesotildees em
atletas transplantes distrofias e atrofias musculares1
A estrutura do muacutesculo esqueleacutetico consiste de fibras musculares e
ceacutelulas sateacutelites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) sendo que as
ceacutelulas sateacutelites estatildeo intimamente associadas a ambas e exibem grande
capacidade de adaptaccedilatildeo frente a estiacutemulos como exerciacutecio alteraccedilatildeo
hormonal estimulaccedilatildeo eleacutetrica alteraccedilatildeo funcional entre outros12
Nas situaccedilotildees de injuacuteria muscular o processo de formaccedilatildeo do novo tecido
requer que ceacutelulas mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas
proliferem se diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos
Subsequumlentemente os miotubos iratildeo sofrer diferenciaccedilatildeo e maturaccedilatildeo para
formar fibras musculares funcionais e reparar as miofibrilas danificadas134
Jaacute a accedilatildeo coordenada de degradaccedilatildeo e siacutentese de proteiacutenas
intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC) garante o
remodelamento tecidual fisioloacutegico ou patoloacutegico do muacutesculo esqueleacutetico A
MEC representa uma complexa rede de macromoleacuteculas compostas de vaacuterias
proteiacutenas e polissacariacutedeos que satildeo secretados localmente e montados em
associaccedilatildeo com a superfiacutecie celular que os produz As interaccedilotildees ceacutelula-ceacutelula
e ceacutelulandashmatriz extracelular suprem as informaccedilotildees essenciais para
homeostase controle da morfogecircnese funccedilotildees tecido-especiacuteficas migraccedilatildeo
celular reparaccedilatildeo de tecidos tumorigecircnese e morte celular5
As metalopeptidases (ou metaloproteinases) de matriz (MMPs)
compreendem uma famiacutelia de endoproteases que degradam um ou vaacuterios
componentes da MEC como colaacutegeno elastina laminina e proteoglicanos As
MMPs portanto estatildeo envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em
uma grande variedade de fenocircmenos fisioloacutegicos e patoloacutegicos6
As MMPs possuem um importante papel na homeostasia da MEC nos
muacutesculos esqueleacuteticos 78 A MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase-A) e
a MMP-9 (tambeacutem conhecida como gelatinase B) parecem ter um papel mais
importante na adaptaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico a alteraccedilotildees de demanda
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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32
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flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
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regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
14
contraacutectil ou em resposta a injuacuteria (inflamaccedilatildeo desinervaccedilatildeo crocircnica) As MMP-
2 e MMP-9 tambeacutem estatildeo envolvidas em vaacuterias miopatias e alteraccedilotildees
inflamatoacuterias induzidas em muacutesculos esqueleacuteticos910
A expressatildeo de MMP-2 se mostrou aumentada nos muacutesculos
esqueleacuteticos apoacutes aplicaccedilatildeo de estimulaccedilatildeo eleacutetrica crocircnica11 apoacutes corrida e
apoacutes exerciacutecios de alta intensidade12 A expressatildeo de MMP-9 aumentou apoacutes
aumento crocircnico do fluxo sanguiacuteneo13 apoacutes corrida12 e em fases iniciais da
resposta inflamatoacuteria do muacutesculo frentes agrave miotoxinas14
Com isso vaacuterios trabalhos vecircm sendo desenvolvidos com o intuito de
investigar recursos terapecircuticos que acelerem o processo de reparo e um dos
recursos bioestimulantes mais utilizados com esse objetivo no tecido muscular
esqueleacutetico eacute a eletro-terapia com ultra-som Entretanto ainda satildeo escassas e
por vezes contraditoacuterias as evidecircncias cientiacuteficas para que se possa
determinar com seguranccedila os paracircmetros dosimeacutetricos e metodoloacutegicos
necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo de seus objetivos15-21
Essa eletro-terapia denominada ultra-som (US) terapecircutico consiste em
vibraccedilotildees mecacircnicas inaudiacuteveis de alta frequumlecircncia (acima de 500000Hz)
criadas quando um gerador produz energia eleacutetrica que eacute convertida em
energia acuacutestica por meio da deformaccedilatildeo mecacircnica de um cristal piezoeleacutetrico
polarizado localizado dentro de um transdutor As ondas assim geradas satildeo
transmitidas por propagaccedilatildeo de maneira longitudinal no ar nos gases e nos
liacutequidos Nos meios de alta coesatildeo molecular como os soacutelidos a propagaccedilatildeo
segue tambeacutem transversalmente e superficialmente jaacute no vaacutecuo natildeo haacute
propagaccedilatildeo182223
A quantidade total de energia de um feixe de US eacute descrita como sua
potecircncia e eacute expressa em watts A quantidade de energia que iraacute alcanccedilar um
local especiacutefico depende das caracteriacutesticas do US (frequumlecircncia intensidade
amplitude foco uniformidade do feixe) e do meio pelo qual ele iraacute se
propagar1622
A dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda e
com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) e eacute expressa em Wattscm2 Na
maioria dos estudos cliacutenicos com US terapecircutico as intensidades variam de
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
15
05 a 3 Wcm2 e pode-se observar que ainda natildeo existem paracircmetros bem
estabelecidos que norteiem a escolha desses valores182324
O US terapecircutico possui um gradiente de frequumlecircncia de 075 a 3 MHz
sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1 e 3 MHz As
ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo menos
focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente pelos
tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada para
lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade de
gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm1618
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada A emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos como a emissatildeo
contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo pois quando as
ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por formar uma onda
ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido A modalidade de
emissatildeo de energia ultra-socircnica mais relatada na praacutetica cliacutenica em fisioterapia
eacute a pulsada no regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo das ondas de ultra-
som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo25-27
Os efeitos das ondas ultra-socircnicas aleacutem de serem regidos pelos
paracircmetros de sua aplicaccedilatildeo tambeacutem estatildeo diretamente relacionados agrave
impedacircncia acuacutestica dos tecidos que as receberatildeo A impedacircncia acuacutestica de
cada tecido eacute ditada pela sua densidade e pela velocidade na qual o ultra-som
se propaga por eles Em tecidos ricos em aacutegua como o tecido adiposo haacute
baixa absorccedilatildeo e portanto alta penetraccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas jaacute em
tecidos ricos em proteiacutenas como o muacutesculo esqueleacutetico a absorccedilatildeo do ultra-
som eacute maior16
De modo geral os efeitos terapecircuticos do US tecircm sido relatados
principalmente em aplicaccedilotildees de baixa intensidade e no modo pulsado162829
A aplicaccedilatildeo do US pode induzir efeitos teacutermicos (aquecimento) e natildeo
teacutermicos O grau de aquecimento gerado pelo US depende dos paracircmetros de
frequumlecircncia e intensidade e do tipo de tecido que recebeu a irradiaccedilatildeo sendo
que os efeitos provocados pelo aquecimento incluem o aumento do fluxo
sanguiacuteneo e da flexibilidade tecidual a modulaccedilatildeo da dor a reduccedilatildeo da rigidez
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
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51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
16
articular e do espasmo muscular e a induccedilatildeo de resposta inflamatoacuteria
moderada162830
Os efeitos natildeo teacutermicos do US satildeo tidos como mais efetivos na reparaccedilatildeo
e na regeneraccedilatildeo de lesotildees de tecidos moles que os efeitos teacutermicos e
incluem a cavitaccedilatildeo e o micro fluxo acuacutestico16 A cavitaccedilatildeo pode ser definida
como a formaccedilatildeo de bolhas de gaacutes microscoacutepicas geradas por alteraccedilotildees de
pressatildeo nos fluiacutedos teciduais decorrentes da energia ultra-socircnica que acaba
por aumentar o fluxo do fluiacutedo circundante A cavitaccedilatildeo estaacutevel e regular eacute
considerada beneacutefica para o tecido lesionado jaacute a cavitaccedilatildeo irregular eacute
considerada danosa162830
O micro fluxo acuacutestico movimento unidirecional de fluiacutedos ao longo e ao
redor das membranas celulares eacute capaz de deslocar iacuteons e pequenas
moleacuteculas e ocorre como resultado das variaccedilotildees de pressatildeo mecacircnica
causada pelo US podendo alterar a estrutura a funccedilatildeo e a permeabilidade da
membrana celular1628
A lista de efeitos natildeo-teacutermicos do US inclui a aceleraccedilatildeo da fibrinoacutelise e
da angiogecircnese o estiacutemulo para produccedilatildeo de fatores mitogecircnicos para
fibroblastos condroblastos e ceacutelulas endoteliais o aumento do recrutamento de
fibroblastos o aumento da siacutentese de matriz e de fibras colaacutegenas mais densas
e o aumento da resistecircncia agrave tensatildeo dos tecidos1629
Os estudos in vitro utilizando cultura de ceacutelulas tecircm sido bastante
empregados na anaacutelise dos efeitos de recursos terapecircuticos drogas e
biomateriais devido agrave facilidade de padronizaccedilatildeo da amostra cujo controle de
pH temperatura pressatildeo osmoacutetica tensatildeo de CO2 e O2 pode ser obtido de
maneira precisa aleacutem de conseguirem-se amostras totalmente homogecircneas31
No caso do estudo dos efeitos do US o uso de cultura celular tem a
vantagem de eliminar os efeitos teacutermicos e aleacutem disso de possibilitar o estudo
molecular da hipoacutetese da ressonacircncia de frequumlecircncia Esta teoria descreve que
os efeitos mecacircnicos do US podem resultar em ativaccedilatildeo ou inativaccedilatildeo de
enzimas ou na dissociaccedilatildeo de complexos proteacuteicos levando agrave alteraccedilotildees na
transduccedilatildeo de sinais intracelulares que regulam as propriedades de
membranas a siacutentese de proteiacutenas e a modulaccedilatildeo de atividades enzimaacuteticas28
Do ponto de vista da biologia celular se um estiacutemulo alcanccedila um limiar
criacutetico a ceacutelula iraacute responder independentemente do fato dela estar em cultura
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
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tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
17
ou in vivo Logicamente as ceacutelulas em cultura geralmente respondem a
estiacutemulos de muito menor intensidade pois natildeo existem barreiras nem
dissipaccedilotildees assim os resultados obtidos in vitro natildeo devem ser diretamente
extrapolados para o uso cliacutenico sem preacutevio estudo em modelo vivo e sem o
ajuste dos paracircmetros dosimeacutetricos1528
A identificaccedilatildeo e o conhecimento cientiacutefico dos efeitos moleculares e
celulares do US in vitro certamente levaratildeo agrave compreensatildeo e ao
desenvolvimento de protocolos cliacutenicos que estabeleccedilam paracircmetros fiacutesicos e
dosimeacutetricos efetivos de modo a preencher a lacuna existente na literatura
cliacutenica sobre este recurso15182832
Johns (2002)28 ao relatar os efeitos do US in vitro utilizando aplicaccedilotildees
contiacutenuas e pulsadas e intensidades de 01 a 17 Wcm2 aponta que de uma
forma geral ocorre um retardamento no crescimento celular aumento da
siacutentese proteacuteica e alteraccedilotildees de membranas celulares sugerindo que
inicialmente a irradiaccedilatildeo lesionaria as ceacutelulas resultando num retardamento do
crescimento e que depois haveria uma recuperaccedilatildeo celular caracterizada pelo
aumento na produccedilatildeo proteacuteica
Estudos subsequumlentes nas deacutecadas de 80 e 90 evidenciaram resultados
contraditoacuterios O US utilizado em frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz e intensidades
variadas mostrou-se capaz de aumentar a proliferaccedilatildeo e a produccedilatildeo de
citocinas e de fatores de crescimento por fibroblastos osteoblastos e ceacutelulas
ligadas agrave resposta imune por outro lado tambeacutem causou lise celular em
fibroblastos e culturas de linhagens celulares de neuroblastomas2833-40 Os
estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapecircutico do ultra-som
pulsado foram realizados em osteoblastos relatando que ele pode aumentar a
regeneraccedilatildeo e promover formaccedilatildeo oacutessea por essas ceacutelulas41-43 em condroacutecitos
onde o US estimulou o metabolismo da MEC pode exercer efeito protetor em
casos de osteoartrites aleacutem de promover proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo em
cultura celular44-47 em fibroblastos onde promoveu proliferaccedilatildeo celular e
induziu resposta beneacutefica para a cicatrizaccedilatildeo48-49 em ceacutelulas epiteliais onde
natildeo se observou efeito direto sobre a regeneraccedilatildeo50 e em ceacutelulas endoteliais
onde relata-se que o US induziu caracteriacutesticas da angiogecircnese51
Em ceacutelulas precursoras miogecircnicas ou ainda na linhagem de ceacutelulas
musculares C2C12 o efeito do US pulsado foi descrito em um uacutenico artigo que
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
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26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
18
demonstrou que a aplicaccedilatildeo de frequumlecircncia 15 MHz (intensidade de
70 mWcm2 por 20 minutos) foi capaz de converter a via de diferenciaccedilatildeo de
mioblastos C2C12 cultivados em meio de cultura propiacutecio para diferenciaccedilatildeo
para osteoblastos eou condroblastos via ativaccedilatildeo da fosforilaccedilatildeo de ERK12 e
p38 MAPK52
Os mioblastos C2C12 derivam de muacutesculo esqueleacutetico de camundongos
exibem a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e diferenciam-se
em cultura propiciando um bom modelo para estudar a regeneraccedilatildeo muscular
Aleacutem disso o uso de linhagens celulares em modelos para anaacutelise de
proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da influecircncia do US sobre a
produccedilatildeo de fatores de crescimento por ceacutelulas natildeo miogecircnicas contidas em
culturas primaacuterias como fibroblastos e macroacutefagos353-56
Este trabalho buscou preencher uma lacuna no conhecimento dos efeitos
do ultra-som terapecircutico pulsado sobre as ceacutelulas musculares em cultura de
modo a contribuir para um futuro estabelecimento de padrotildees dosimeacutetricos
para o uso cliacutenico deste recurso em tecidos musculares1757
Como pode ser observado no artigo de revisatildeo incluiacutedo no apecircndice desta
tese o potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute realmente necessidade de pesquisas que utilizem
modelos celulares animais e cliacutenicos e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim poderemos um dia indicar a
terapecircutica adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
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interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
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Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
19
2 ESTUDO 1
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Revista Fisioterapia e Pesquisa
EFEITOS DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO EM MUacuteSCULO ESQUELEacuteTICO
REVISAtildeO SISTEMAacuteTICA
RAFAEL RIBEIRO Especialista em Sauacutede Coletiva e aluno do Programa de
Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo da Universidade Nove de Julho ndash
UNINOVE
RAQUEL AGNELLI MESQUITA FERRARI Profa Dra em Ciecircncias
Fisioloacutegicas - UFSCAR
JOAtildeO CARLOS FERRARI CORREA Prof Dr em Morfologia - UNICAMP
SANDRA KALIL BUSSADORI Profa Dra em Ciecircncias Odontoloacutegicas - USP
MANOELA DOMINGUES MARTINS ndash Profa Dra em Patologia Bucal - USP
KRISTIANNE PORTA SANTOS FERNANDES Profa Dra em Imunologia ndash
USP
Universidade Nove de Julho ndash UNINOVE - Satildeo Paulo - SP Brasil - Centro de
Poacutes-Graduaccedilatildeo Stricto Sensu - Mestrado em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Av Francisco Matarazzo 612 ndash 1ordm Andar Aacutegua Branca - Satildeo PauloSP - CEP
05001-100
Running title Ultra-som terapecircutico em muacutesculo esqueleacutetico
Contato Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP CEP 05001-100
fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301 e-mail kristianneportagmailcom
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril
arrangement in the endomysium of immobilizes rat soleus muscle
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12 Matheus JPC Oliveira FB Gomide LB Milani JGPO Volpon JB Shimano
AC Efeitos do ultra-som terapecircutico nas propriedades mecacircnicas do
muacutesculo esqueleacutetico apoacutes contusatildeo Rev Bras Fisioter 200812(3)241-7
31
13 Piedade MCB Galhardo MS Battlehner CN Ferreira MA Caldini EG
Toledo OMS Effect of ultrasound therapy on the repair of gastrocnemius
muscle injury in rats Ultrasonics 200848403ndash11
14 Pinto MVM Costa DA Rocha LLV Santos HR Silva ALS Barbosa LG et
al Comparative study of the effects of the Ga-As (904 nm 150mW) laser
and the pulsed ultrasound of 1 MHz in inflammation of tibialis muscle of
wistar rats Braz Arch Biol Technol 200851(special)225-30
15 Plentz RDM Stoffel PB Kolling GJ Costa ST Beck C Signori LU
Alteraccedilotildees hematoloacutegicas provocadas pelo ultra-som de 1 MHz na forma
contiacutenua aplicadas no tratamento da fase aguda de lesatildeo muscular
iatrogecircnica em ratos Rev Bras Fisioter 200812(6)495-501
16 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 200731482-8
17 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil
200788936-40
18 Lopes LG Bertolini SMMG Martins EER Gewehr PM Lopes MS Anaacutelise
morfomeacutetrica de tecido muscular de coelhos submetido a ultra-som pulsado
e contiacutenuo de 1 MHz Fisioterapia e Pesquisa 200512(3)15-21
19 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil
2005861304-10
20 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 20042573-7
21 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
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27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
20
Resumo
O ultra-som (US) tem sido usado clinicamente por mais de 60 anos sendo
uma das modalidades eletro-terapecircuticas mais empregadas Poreacutem sua
efetividade no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas permanece
questionaacutevel e seu potencial terapecircutico ainda natildeo estaacute totalmente
estabelecido havendo necessidade de novas investigaccedilotildees para a
compreensatildeo das reaccedilotildees bioquiacutemicas celulares e orgacircnicas desencadeadas
por ele bem como para o estabelecimento de protocolos efetivos que
determinem os melhores padrotildees de frequumlecircncia intensidade tempo e modo de
aplicaccedilatildeo no tratamento das lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas Por meio de uma
revisatildeo criacutetica da literatura agregou-se o conhecimento atual sobre esta terapia
para nortear novos estudos que possam aumentar o conhecimento sobre as
reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso Como meacutetodo foi feita
uma busca de artigos na Biblioteca Virtual em Sauacutede (BVS) e na Pubmed
utilizando e combinando diversas palavras referentes ao tema proposto e os
descritores definidos pelo DeCS e pelo MeSH Database respectivamente
Foram encontrados 302 artigos sendo que apenas 18 artigos estavam
diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa e relatavam efeitos que
natildeo se restringiam ao aquecimento local Conclui-se que potencial terapecircutico
do US em tecido muscular ainda estaacute longe de ser estabelecido e haacute
necessidade de pesquisas que utilizem modelos celulares animais e cliacutenicos
randomizados e que padronizem os paracircmetros dosimeacutetricos adotados
Descritores Ultra-Som Muacutesculo esqueleacutetico Revisatildeo
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
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skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
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55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
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Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
21
Introduccedilatildeo
Atualmente existe consideraacutevel interesse na regeneraccedilatildeo do muacutesculo
esqueleacutetico em funccedilatildeo de situaccedilotildees como lesotildees em atletas transplantes
distrofias e atrofias musculares1
Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de acelerar
o processo de reparo do tecido muscular esqueleacutetico eacute o ultra-som terapecircutico
Entretanto ainda satildeo escassas e por vezes contraditoacuterias as evidecircncias
cientiacuteficas para que se possa determinar com seguranccedila os paracircmetros
dosimeacutetricos e metodoloacutegicos necessaacuterios agrave aquisiccedilatildeo deste objetivo2-5
A emissatildeo das ondas ultra-socircnicas pode ser feita de maneira contiacutenua ou
pulsada diferenciando-se principalmente por promoverem respectivamente
efeitos teacutermicos ou natildeo-teacutermicos267 A emissatildeo pulsada eacute a mais relatada na
praacutetica cliacutenica em fisioterapia com um regime de 14 (20) ou seja a emissatildeo
das ondas de ultra-som eacute efetuada em 20 do periacuteodo total de aplicaccedilatildeo89
Em geral os aparelhos de US possuem um gradiente de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz sendo que a maioria dos aparelhos estabelece frequumlecircncias de 1
e 3 MHz25
Clinicamente a absorccedilatildeo das ondas ultra-socircnicas eacute influenciada pela
constituiccedilatildeo do tecido variando de acordo com a quantidade de proteiacutenas e
aacutegua na sua composiccedilatildeo aleacutem da intensidade e frequumlecircncia utilizada na
aplicaccedilatildeo510
Visto a grande discordacircncia da literatura quanto agrave efetividade ou natildeo do
ultra-som em ceacutelulas e tecidos musculares este trabalho tem com objetivo
agregar por meio de uma revisatildeo sistemaacutetica da literatura o conhecimento
atual sobre esta terapia para nortear novos estudos que possam aumentar o
conhecimento sobre as reaccedilotildees orgacircnicas desencadeadas por este recurso
Material e meacutetodos
Inicialmente definiu-se a pergunta da pesquisa ldquoQuais satildeo os efeitos do
ultra-som terapecircutico no muacutesculo estriado esqueleacuteticordquo A busca dos artigos
utilizados na presente revisatildeo sistemaacutetica foi realizada na Biblioteca Virtual em
Sauacutede (BVS) e na Pubmed (Public medline) Central que incluem entre outras
as bases Medline 1966-1996 Medline 1997-2009 (Literatura Internacional em
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
22
Ciecircncias da Sauacutede) SCIELO (Scientific eletronic library on line) e LILACS
(Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciecircncias da Sauacutede)
Para as buscas foram utilizadas e combinadas diversas palavras
referentes ao tema proposto e os descritores definidos pelo MeSH Database
(medical subject headings) e pelo DeCS (descritores em ciecircncias da sauacutede)
Foram considerados somente os artigos publicados a partir de 1995
As palavras e descritores foram buscados no tiacutetulo resumo corpo do
trabalho e palavras-chave sendo utilizadas todas as combinaccedilotildees possiacuteveis
para os seguintes termos
Ultrasound Ultrasound interventional Ultrasounds Ultrassound Ultrahigh
frequency waves
Ultrasonics myoblasts Ultrasonicsadministration and dosage
Ultrasonicsadverse effects Ultrasonicsclassification
Ultrasonicsinstrumentation Ultrasonicsmethods Ultrasonicsstandards
Ultrasonicssupply and distribution Ultrasonicstherapy
Ultrasonicsutilization
Low-intensity pulsed ultrasound Low-intensity pulsed ultrasonics
Myoblast Myoblasts Myoblasts Skeletal Myoblasts Skeletalmetabolism
Myoblasts Skeletalpathology Myoblasts Skeletalphysiology Myoblasts
Skeletalradiation effects Myoblasts Skeletalultrastructure
Muscle muscle cells Muscle Skeletalanatomy and histology Muscle
Skeletalcytology Muscle Skeletalgrowth and development Muscle
Skeletalinjuries Muscle Skeletalmetabolism Muscle Skeletalpathology
Muscle Skeletalphysiology Muscle Skeletalphysiopathology Muscle
Skeletalradiation effects
Muscle Muscles Muscle cells Muscle development Muscle contraction
Skeletal muscle Muscle skeletal
C2C12
LIPUS
Ultra-som Terapia por ultra-som Ondas de ultra frequumlecircncia Ultra-som de
intervenccedilatildeo
Muacutesculos Ceacutelulas de muacutesculos Muacutesculo esqueleacutetico Sistema
muacutesculosqueleacutetico
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
Referecircncias Bibliograacuteficas do Estudo 1
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
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tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov
200518(3)55-64
3 Warden SJ McMeeken JM Ultrasound usage and dosage in sports
physiotherapy Ultrasound Med Biol 2002 281075-80
4 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-8
5 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
6 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound produced by a conventional therapeutic ultrasound unit
accelerates fracture repair Phys Ther 200686(8)1118-27
7 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
8 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
9 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
10 Robertson VJ Baker KG A review of therapeutic ultrasound effectiveness
studies Phys Ther 200181(7)1339-50
11 Okita M Nakano J Kataoka H Sakamoto J Origuchi T Yoshimura T
Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril
arrangement in the endomysium of immobilizes rat soleus muscle
Ultrasound Med Biol 200935(2)237-44
12 Matheus JPC Oliveira FB Gomide LB Milani JGPO Volpon JB Shimano
AC Efeitos do ultra-som terapecircutico nas propriedades mecacircnicas do
muacutesculo esqueleacutetico apoacutes contusatildeo Rev Bras Fisioter 200812(3)241-7
31
13 Piedade MCB Galhardo MS Battlehner CN Ferreira MA Caldini EG
Toledo OMS Effect of ultrasound therapy on the repair of gastrocnemius
muscle injury in rats Ultrasonics 200848403ndash11
14 Pinto MVM Costa DA Rocha LLV Santos HR Silva ALS Barbosa LG et
al Comparative study of the effects of the Ga-As (904 nm 150mW) laser
and the pulsed ultrasound of 1 MHz in inflammation of tibialis muscle of
wistar rats Braz Arch Biol Technol 200851(special)225-30
15 Plentz RDM Stoffel PB Kolling GJ Costa ST Beck C Signori LU
Alteraccedilotildees hematoloacutegicas provocadas pelo ultra-som de 1 MHz na forma
contiacutenua aplicadas no tratamento da fase aguda de lesatildeo muscular
iatrogecircnica em ratos Rev Bras Fisioter 200812(6)495-501
16 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 200731482-8
17 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil
200788936-40
18 Lopes LG Bertolini SMMG Martins EER Gewehr PM Lopes MS Anaacutelise
morfomeacutetrica de tecido muscular de coelhos submetido a ultra-som pulsado
e contiacutenuo de 1 MHz Fisioterapia e Pesquisa 200512(3)15-21
19 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil
2005861304-10
20 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 20042573-7
21 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
7
27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
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49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
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53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
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55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
23
Mioblastos Mioblastos de muacutesculo esqueleacutetico Mioblastos esqueleacuteticos
Ceacutelulas musculares Distrofia muscular
Na busca realizada na base Pubmed foram adotados os seguintes filtros
de exclusatildeo Muscle Neoplasms Muscle Smooth Myocytes Cardiac
Breathing Exercises Diagnosis Education History Bone Fractures Tendon
Images
Resultados
Como a localizaccedilatildeo dos artigos foi realizada por estrateacutegias de busca bem
abrangentes foram encontrados 302 artigos permanecendo na revisatildeo apenas
18 artigos que estavam diretamente relacionados com a pergunta da pesquisa
e que relatavam efeitos que natildeo se restringiam ao aquecimento local (efeito
teacutermico) Estes artigos foram divididos em 3 grandes grupos para facilitar a
anaacutelise comparativa dos resultados (Figura 1)
Figura 1 ndash Divisatildeo dos artigos encontrados na revisatildeo sistemaacutetica
Os quadros 1 2 e 3 sumarizam os dados encontrados nos estudos
realizados em animais11-24 em humanos25-27 e em cultura celular28
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
24
Quadro 1 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em animais
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo Animal Efeito Referecircncia
1 MHz 10 Wcm2 Contiacutenuo Gel a base de
aacutegua
15 mindia
6xsemana
Por 4 semanas
Soacuteleo 22 ratos Wistar
mantidos com
imobilizaccedilatildeo em flexatildeo
plantar
Prevenccedilatildeo da contratura muscular Okita et al
(2009)11
1 e 3 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Gel 5 mindia por 6 dias Gastrocnemio 40 ratas Wistar que
receberam contusatildeo
muscular
Aceleraccedilatildeo do processo de reparo
aumento da rigidez e da carga suportada
agrave traccedilatildeo muscular natildeo havendo
diferenccedila entre as frequumlecircncias testadas
Matheus et al
(2008)12
1 MHz 057 Wcm2 Pulsado
(50)
Gel 5 mindia
2 5 e 12 aplicaccedilotildees
respectivamente para os
grupos 4 7 e 14 dias
Gastrocnemio 30 ratos Wistar que
receberam laceraccedilatildeo
muscular
Aumento na deposiccedilatildeo de fibras
colaacutegenas e melhoria na organizaccedilatildeo
estrutural das fibras musculares
Piedade et al
(2008)13
1 MHz 03 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Gel de carbocol 1xdia (natildeo consta
tempo) por 2 e 7 dias
Tibial anterior 35 ratos que receberam
injeccedilatildeo intramuscular
de hidrocloreto de
bupivacaiacutena
Accedilatildeo anti-inflamatoacuteria apoacutes 7 dias
Pinto et al
(2008)14
1 MHz 04 Wcm2
Contiacutenuo Natildeo relata 3 min
3 aplicaccedilotildees (1 8 e 24 h
apoacutes a lesatildeo
Biacuteceps
femoral
16 ratos Wistar que
receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 50 do
conteuacutedo muscular
Reduccedilatildeo de eritroacutecitos (apoacutes 1h)
aumento de neutroacutefilos (apoacutes 8h) e
eosinoacutefilos (apoacutes 24h) sugerindo
aumento da hemorragia e amplificaccedilatildeo
da resposta inflamatoacuteria
Plentz et al
(2008)15
Natildeo relata 05 10 e
20 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime)
Natildeo relata 1xdia por 1 3 e 5 dias Gastrocnemio 25 ratos Wistar machos
que receberam incisatildeo e
laceraccedilatildeo muscular
Diminuiccedilatildeo do conteuacutedo de catalase
superoxido dismutase e de substacircncias
tiobarbituacutericas aacutecido reativas
Freitas et al
(2007)16
3 MHz 03 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 36 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
muscular
Diminuiccedilatildeo da expressatildeo de RNAm do
MGF (mechano-growth factor)
McBrier et al
(2007)17
1 MHz 30 Wcm2
Pulsado
(natildeo consta
o regime) e
Contiacutenuo
Gel de
carbocol
12 mindia por 10 dias Vasto lateral 10 coelhos machos
Nova Zelacircndia sem
lesatildeo
Natildeo produz efeitos morfomeacutetricos no
tecido muscular
Lopes et al
(2005)18
3 MHz 01 Wcm2 Contiacutenuo Natildeo relata 5 mindia por 4 dias Gastrocnemio 20 ratos machos Wistar
que receberam contusatildeo
Natildeo houve alteraccedilatildeo de massa
muscular nuacutemero de nuacutecleos por fibra
Markert et al
(2005)19
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
Referecircncias Bibliograacuteficas do Estudo 1
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov
200518(3)55-64
3 Warden SJ McMeeken JM Ultrasound usage and dosage in sports
physiotherapy Ultrasound Med Biol 2002 281075-80
4 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-8
5 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
6 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound produced by a conventional therapeutic ultrasound unit
accelerates fracture repair Phys Ther 200686(8)1118-27
7 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
8 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
9 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
10 Robertson VJ Baker KG A review of therapeutic ultrasound effectiveness
studies Phys Ther 200181(7)1339-50
11 Okita M Nakano J Kataoka H Sakamoto J Origuchi T Yoshimura T
Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril
arrangement in the endomysium of immobilizes rat soleus muscle
Ultrasound Med Biol 200935(2)237-44
12 Matheus JPC Oliveira FB Gomide LB Milani JGPO Volpon JB Shimano
AC Efeitos do ultra-som terapecircutico nas propriedades mecacircnicas do
muacutesculo esqueleacutetico apoacutes contusatildeo Rev Bras Fisioter 200812(3)241-7
31
13 Piedade MCB Galhardo MS Battlehner CN Ferreira MA Caldini EG
Toledo OMS Effect of ultrasound therapy on the repair of gastrocnemius
muscle injury in rats Ultrasonics 200848403ndash11
14 Pinto MVM Costa DA Rocha LLV Santos HR Silva ALS Barbosa LG et
al Comparative study of the effects of the Ga-As (904 nm 150mW) laser
and the pulsed ultrasound of 1 MHz in inflammation of tibialis muscle of
wistar rats Braz Arch Biol Technol 200851(special)225-30
15 Plentz RDM Stoffel PB Kolling GJ Costa ST Beck C Signori LU
Alteraccedilotildees hematoloacutegicas provocadas pelo ultra-som de 1 MHz na forma
contiacutenua aplicadas no tratamento da fase aguda de lesatildeo muscular
iatrogecircnica em ratos Rev Bras Fisioter 200812(6)495-501
16 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 200731482-8
17 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil
200788936-40
18 Lopes LG Bertolini SMMG Martins EER Gewehr PM Lopes MS Anaacutelise
morfomeacutetrica de tecido muscular de coelhos submetido a ultra-som pulsado
e contiacutenuo de 1 MHz Fisioterapia e Pesquisa 200512(3)15-21
19 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil
2005861304-10
20 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 20042573-7
21 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
7
27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
25
muscular aacuterea de secccedilatildeo transversa e das
proteiacutenas contraacuteteis
33 MHz 10 Wcm2
Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 7 dias
Sacrifiacutecio apoacutes 13 5 7
14 21 28 e 40 dias
Gastrocnemio 80 ratos Wistar que
receberam contusatildeo
muscular bilateral
Natildeo houve influecircncia na massa
muscular concentraccedilatildeo de proteiacutenas
totais nuacutemero de nuacutecleos por fibra e
aacuterea de secccedilatildeo transversa
Wilkin et al
(2004)20
1 MHz 05 Wcm2
Contiacutenuo Subaquaacutetico 5 mindia por 3 5 e 7
dias
Extensor
digital longo
33 ratos Sprague-
Dawley que receberam
lesatildeo induzida por
contraccedilatildeo utilizando
eletroestimulaccedilatildeo (150
Hz 21ciclosmin)
Apoacutes 7 dias houve aumento na
produccedilatildeo de forccedila
Karnes amp Burton
(2002)21
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(20)
Natildeo relata 5 mindia por 10 dias Reto femural 26 coelhos da raccedila
Nova Zelacircndia que
receberam contusatildeo
muscular
Aumento na deformaccedilatildeo maacutexima carga
de deformaccedilatildeo no limite da
proporcionalidade e energia na fase de
deformaccedilatildeo elaacutestica
Menezes et al
(1999)22
3 MHz 15 Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 6 minaplicaccedilatildeo
Grupo 1 = 1xdia
iniciando 3 dias apoacutes
lesatildeo com sacrifiacutecio
apoacutes 4 7 e 10 dias
Grupo 2 = 2 dias
consecutivos de
tratamento e 1 dia de
repouso iniciando 6
horas apoacutes lesatildeo com
sacrifiacutecio apoacutes 1 3 6 e
9 dias
Gastrocnemio
56 ratos femeas
Sprague-Dawley que
receberam contusatildeo
muscular
Natildeo houve efeitos beneacuteficos
significantes na morfologia da
regeneraccedilatildeo muscular
Rantanen et al
(1999)23
1 MHz 05 Wcm2 Pulsado
(15)
Natildeo relata 5 mindia por 3 5 10 e
15 dias
Tibial anterior 30 ratos machos Wistar
que receberam incisatildeo e
divulsatildeo em 100 da
largura muscular
Apoacutes 3 7 e 14 dias houve
favorecimento da regeneraccedilatildeo muscular
e diminuiccedilatildeo de tecido fibroacutetico
Gouvecirca et al
(1998)24
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
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flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
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30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
26
Quadro 2 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em humanos
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio
condutor
Tempo de aplicaccedilatildeo Muacutesculo
Sujeitos da pesquisa Efeito Referecircncia
1 MHz 15 Wcm2 Natildeo consta Gel de
cloreto de
soacutedio
7 mindia 1 sessatildeo Triacuteceps sural (junccedilatildeo
miotendinosa do tendatildeo
de Aquiles)
55 mulheres e 24 homens com idade
meacutedia de 21 anos hiacutegidos
Aumento de temperatura da
flexibilidade muscular e da
amplitude de movimento
Costa et al
(2006)25
1 MHz 15 a 2
Wcm2
Pulsado
(20)
Gel 8-12 min
5xsemana
4 semanas
20 sessotildees
Reto abdominal 1 mulher de 62 anos apresentando
hematoma abdominal
Acelerou a reabsorccedilatildeo do
hematoma e aliviou a dor
Berna-Serna
et al (2005)26
1 MHz 08 Wcm2 Pulsado
(25)
Gel 7min e 21sdia - 2
sessotildees
14min e 42sdia - 2
sessotildees
Biacuteceps braquial 24 homens e 24 mulheres de 19 a 25
anos apresentando fadiga muscular
induzida por exerciacutecio
Ausecircncia de benefiacutecio
significante na dor subjetiva ou
amplitude de movimento
Craig et al
(1999)27
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
27
Quadro 3 Anaacutelise comparativa dos estudos realizados em cultura celular
Frequumlecircncia Intensidade Emissatildeo Meio condutor Tempo de aplicaccedilatildeo Tipo celular Efeito Referecircncia 15 MHz 70 mWcm2 Pulsado Meio de cultura 20 min mioblasto C2C12 Estimulou a conversatildeo e diferenciaccedilatildeo das
C2C12 em osteoblastos e condroblastos
Ikeda et al (2006)28
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
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33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
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45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
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200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
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Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
28
Discussatildeo
Em circunstacircncias normais o muacutesculo esqueleacutetico adulto de mamiacuteferos eacute
um tecido estaacutevel com baixo ldquoturn overrdquo ou seja baixo remodelamento sem
alteraccedilotildees draacutesticas em suas caracteriacutesticas fenotiacutepicas Poreacutem eacute um tecido
dinacircmico e capaz de responder a estiacutemulos fisioloacutegicos como por exemplo
treinamento fiacutesico ou lesotildees severas29 Apoacutes uma lesatildeo o muacutesculo tem a
habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado de forma a
prevenir a perda de massa muscular Este processo eacute semelhante agrave
miogecircnese poreacutem orquestrado pelas ceacutelulas sateacutelites2930
A aplicaccedilatildeo do US como recurso terapecircutico estaacute vinculada ao relato de
efeitos beneacuteficos sobre diversos tecidos destacando-se o aumento da
angiogecircnese do tecido de granulaccedilatildeo do nuacutemero de fibroblastos e da siacutentese
de colaacutegeno e a diminuiccedilatildeo de leucoacutecitos e macroacutefagos dentre outros nos
quais jaacute tem sido demonstrado o aumento da velocidade de cicatrizaccedilatildeo a
diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas inflamatoacuterias e a melhora da qualidade do
tecido neoformado31
Poreacutem tambeacutem se observa na literatura um consenso em relaccedilatildeo agrave
necessidade de estabelecer paracircmetros dosimeacutetricos para aplicaccedilatildeo deste
recurso Neste sentido a presente revisatildeo objetivou agregar o conhecimento
existente com relaccedilatildeo agrave aplicaccedilatildeo do US terapecircutico em tecido muscular
Foi possiacutevel verificar que existe uma grande variaccedilatildeo nos paracircmetros
dosimeacutetricos usados nos estudos que avaliaram o efeito do US no muacutesculo
esqueleacutetico Nos estudos realizados em animais11-24 o US terapecircutico foi
utilizado nas frequumlecircncias de 1 e de 3 MHz jaacute nos estudos em humanos25-27 o
US foi utilizado somente na frequumlecircncia de 1 MHz e no estudo realizado em
cultura celular28 foi utilizada a frequumlecircncia de 15 MHz
As ondas de baixa frequumlecircncia tecircm maior poder de penetraccedilatildeo mas satildeo
menos focadas Uma onda de frequumlecircncia de 1 MHz eacute absorvida primariamente
pelos tecidos que estatildeo a uma profundidade de 3 a 5 cm sendo recomendada
para lesotildees mais profundas e para pacientes portadores de maior quantidade
de gordura subcutacircnea Jaacute a frequumlecircncia de 3 MHz eacute recomendada para lesotildees
mais superficiais em profundidades de 1 a 2 cm25
Jaacute a dosagem do US pode variar de acordo com a amplitude de sua onda
e com sua intensidade (normalmente definida pela razatildeo entre a potecircncia de
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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32
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24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
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25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
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26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
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30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
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Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
29
saiacuteda e a aacuterea da superfiacutecie do transdutor) Verifica-se que os estudos que
avaliaram o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico em animais11-24 utilizaram
intensidades de 01 a 3 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 3 a 12 minutos Jaacute
nos estudos em humanos25-27 o US foi utilizado em intensidades variando de
08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a 12 minutos e por fim no estudo
realizado em cultura celular28 foi utilizada a intensidade de 70 mWcm2 por 20
minutos
Com relaccedilatildeo ao modo de emissatildeo das ondas ultra-socircnicas foi possiacutevel
verificar que os estudos realizados em animais11-24 avaliaram o modo pulsado e
o contiacutenuo Jaacute nos estudos em humanos25-27 e em cultura celular28 o US foi
utilizado sempre no modo pulsado A emissatildeo pulsada aleacutem de prevenir os
efeitos danosos da reflexatildeo tambeacutem natildeo gera efeitos teacutermicos como a
contiacutenua89
Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de aplicaccedilotildees houve grande variaccedilatildeo em todos
os estudos analisados nesta revisatildeo
O mesmo pode ser afirmado com relaccedilatildeo aos efeitos obtidos pela
aplicaccedilatildeo deste recurso Assim com a literatura existente natildeo eacute possiacutevel
estabelecer um consenso na relaccedilatildeo paracircmetros dosimeacutetricos versus efeitos
obtidos
Conclusatildeo
O potencial terapecircutico do ultra-som em tecido muscular ainda estaacute longe
de ser estabelecido Haacute necessidade de pesquisas que utilizem modelos
celulares animais e cliacutenicos randomizados e que padronizem os paracircmetros
dosimeacutetricos adotados Somente assim seraacute possiacutevel indicar a terapecircutica
adequada a cada tipo de lesatildeo muscular
30
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31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
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33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
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Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
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35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
30
Referecircncias Bibliograacuteficas do Estudo 1
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
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200518(3)55-64
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(Oxford) 2001401331-6
6 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound produced by a conventional therapeutic ultrasound unit
accelerates fracture repair Phys Ther 200686(8)1118-27
7 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
8 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
9 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
10 Robertson VJ Baker KG A review of therapeutic ultrasound effectiveness
studies Phys Ther 200181(7)1339-50
11 Okita M Nakano J Kataoka H Sakamoto J Origuchi T Yoshimura T
Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril
arrangement in the endomysium of immobilizes rat soleus muscle
Ultrasound Med Biol 200935(2)237-44
12 Matheus JPC Oliveira FB Gomide LB Milani JGPO Volpon JB Shimano
AC Efeitos do ultra-som terapecircutico nas propriedades mecacircnicas do
muacutesculo esqueleacutetico apoacutes contusatildeo Rev Bras Fisioter 200812(3)241-7
31
13 Piedade MCB Galhardo MS Battlehner CN Ferreira MA Caldini EG
Toledo OMS Effect of ultrasound therapy on the repair of gastrocnemius
muscle injury in rats Ultrasonics 200848403ndash11
14 Pinto MVM Costa DA Rocha LLV Santos HR Silva ALS Barbosa LG et
al Comparative study of the effects of the Ga-As (904 nm 150mW) laser
and the pulsed ultrasound of 1 MHz in inflammation of tibialis muscle of
wistar rats Braz Arch Biol Technol 200851(special)225-30
15 Plentz RDM Stoffel PB Kolling GJ Costa ST Beck C Signori LU
Alteraccedilotildees hematoloacutegicas provocadas pelo ultra-som de 1 MHz na forma
contiacutenua aplicadas no tratamento da fase aguda de lesatildeo muscular
iatrogecircnica em ratos Rev Bras Fisioter 200812(6)495-501
16 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 200731482-8
17 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil
200788936-40
18 Lopes LG Bertolini SMMG Martins EER Gewehr PM Lopes MS Anaacutelise
morfomeacutetrica de tecido muscular de coelhos submetido a ultra-som pulsado
e contiacutenuo de 1 MHz Fisioterapia e Pesquisa 200512(3)15-21
19 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil
2005861304-10
20 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 20042573-7
21 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
7
27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
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34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
31
13 Piedade MCB Galhardo MS Battlehner CN Ferreira MA Caldini EG
Toledo OMS Effect of ultrasound therapy on the repair of gastrocnemius
muscle injury in rats Ultrasonics 200848403ndash11
14 Pinto MVM Costa DA Rocha LLV Santos HR Silva ALS Barbosa LG et
al Comparative study of the effects of the Ga-As (904 nm 150mW) laser
and the pulsed ultrasound of 1 MHz in inflammation of tibialis muscle of
wistar rats Braz Arch Biol Technol 200851(special)225-30
15 Plentz RDM Stoffel PB Kolling GJ Costa ST Beck C Signori LU
Alteraccedilotildees hematoloacutegicas provocadas pelo ultra-som de 1 MHz na forma
contiacutenua aplicadas no tratamento da fase aguda de lesatildeo muscular
iatrogecircnica em ratos Rev Bras Fisioter 200812(6)495-501
16 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 200731482-8
17 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil
200788936-40
18 Lopes LG Bertolini SMMG Martins EER Gewehr PM Lopes MS Anaacutelise
morfomeacutetrica de tecido muscular de coelhos submetido a ultra-som pulsado
e contiacutenuo de 1 MHz Fisioterapia e Pesquisa 200512(3)15-21
19 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil
2005861304-10
20 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 20042573-7
21 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 200283(1)1-4
22 Menezes DF Volpon JB Shimano AC Aplicaccedilatildeo de ultra-som terapecircutico
em lesatildeo muscular experimental aguda Rev Bras Fisioter 1999427-31
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
7
27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
32
23 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 199927(1)54-9
24 Gouvecirca CMCP Vieira PMN Amaral AC Efeito do ultra-som na recuperaccedilatildeo
de muacutesculo tibial anterior de rato lesado Rev Univ Alfenas 19984165-73
25 Costa LOP Costa LCM Mendes PL Canccedilado RL Lara KL Lima MD et al
Efeitos do aquecimento por ultra-som e atividade fiacutesica aeroacutebica na
flexibilidade do triacuteceps sural humano um estudo comparativo Fisioter Mov
200619(2)19-24
26 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 200585(4)352-
7
27 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 199980(3)318-23
28 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
29 Shi X Garry DJ Muscle stem cells in development regeneration and
disease Genes Dev 2006201692ndash708
30 Chargegrave SBP Rudnicki MA Cellular and molecular regulation of muscle
regeneration Physiol Rev 200484209ndash38
31 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
33
3 ESTUDO 2
Artigo submetido para publicaccedilatildeo na Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
EFEITO DO ULTRA-SOM TERAPEcircUTICO PULSADO SOBRE A
PROLIFERACcedilAtildeO E ATIVIDADE GELATINOLIacuteTICA DE MIOBLASTOS
C2C12 ESTUDO IN VITRO
Tiacutetulo resumido Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre
mioblastos
R Ribeiro1 RAM Ferrari3 MD Martins3 SK Bussadori3 CV Sampaio2
PP Artilheiro2 KPSFernandes3
1 Estudante do Curso de Mestrado Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
2 Estudante do Curso de Fisioterapia Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo
SP Brasil
3 Doutor Professor Integral Departamento de Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo
Universidade Nove de Julho Satildeo Paulo SP Brasil
Autor correspondente
Kristianne Porta Santos Fernandes
Av Francisco Matarazzo 612 Aacutegua Branca Satildeo Paulo SP Brasil
CEP 05001-100 Fone (11) 3665-9325 fax (11) 3365-9301
e-mail- kristianneportagmailcom
Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer ao Dr Joseacute Ernesto
Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil pela doaccedilatildeo das ceacutelulas
C2C12
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
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55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
34
Resumo
O remodelamento muscular envolve a reaccedilatildeo inflamatoacuteria necrose das
ceacutelulas danificadas fagocitose de restos necroacuteticos proliferaccedilatildeo de ceacutelulas
sateacutelites de reserva e de fibroblastos e a recuperaccedilatildeo gradual das
propriedades funcionais do muacutesculo O remodelamento da matriz extracelular
(MEC) do muacutesculo eacute principalmente influenciado pelas metaloproteinases de
matriz (MMPs) enzimas que tecircm a habilidade de regular a composiccedilatildeo da
MEC No muacutesculo esqueleacutetico a MMP-2 e a MMP-9 parecem estar envolvidas
na resposta agrave injuacuteria assim como agrave miopatias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias Uma
das terapias mais utilizadas para reparaccedilatildeo muscular envolve um agente
eletrofiacutesico o ultra-som (US) No entanto natildeo existem evidecircncias suficientes
da sua efetividade sobre a regeneraccedilatildeo muscular e natildeo haacute ainda consenso
sobre os paracircmetros apropriados para alcanccedilar esse objetivo O presente
estudo avaliou o efeito do US sobre a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites bem
como sobre a atividade gelatinoliacutetica destas mesmas ceacutelulas Para tanto
culturas celulares da linhagem C2C12 foram irradiadas com US no modo
pulsado a 20 nas frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05Wcm2
durante 2 ou 5 minutos A proliferaccedilatildeo celular foi mensurada indiretamente 72
horas apoacutes a irradiaccedilatildeo por meio da avaliaccedilatildeo da atividade mitocondrial das
ceacutelulas pelo meacutetodo MTT e a atividade gelatinoliacutetica foi avaliada por zimografia
e anaacutelise de densitometria Natildeo houve diferenccedila significante na proliferaccedilatildeo
celular entre os mioblastos tratados com ultra-som e as culturas controles apoacutes
72 horas de incubaccedilatildeo e tambeacutem na anaacutelise de densitometria dos geacuteis Assim
o ultra-som natildeo alterou a proliferaccedilatildeo viabilidade e atividade gelatinoliacutetica dos
mioblastos C2C12 usando os paracircmetros acima
Palavras-chave Ultra-som Cultura cellular Mioblastos Proliferaccedilatildeo MMP
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
35
Introduccedilatildeo
O remodelamento muscular pode ser dividido em trecircs fases distintas Na
primeira fase a inflamaccedilatildeo a necrose das miofibrilas danificadas e a
fagocitose dos restos necroacuteticos satildeo as principais caracteriacutesticas O objetivo de
qualquer tratamento nesta fase seraacute limitar a extensatildeo do hematoma e modular
a reaccedilatildeo inflamatoacuteria12 Na fase de reparo ou regeneraccedilatildeo a principal
caracteriacutestica eacute a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas sateacutelites reserva e de fibroblastos
originados do endomiacutesio seguida de uma ativa siacutentese proteacuteica As ceacutelulas
musculares quiescentes precursoras mononucleadas (mioblastos ceacutelulas
sateacutelites) se tornam ativas proliferam diferenciam e se fundem para formar
ceacutelulas musculares jovens multinucleadas conhecidas como miotubos Os
miotubos entatildeo se diferenciam e amadurecem para dar origem a uma fibra
muscular totalmente funcional3 Esses processos satildeo controlados por vaacuterios
componentes da matriz extracelular (MEC) desintegrada pelas membranas
plasmaacuteticas e por vaacuterios fatores de crescimento A fase da cicatrizaccedilatildeo
maturaccedilatildeo ou remodelamento muscular eacute caracterizada por uma recuperaccedilatildeo
gradual das propriedades funcionais do muacutesculo incluindo a recuperaccedilatildeo da
resistecircncia agrave traccedilatildeo do seu componente conjuntivo O remodelamento da MEC
fornece suporte estrutural e proteccedilatildeo e eacute importante na manutenccedilatildeo da
integridade funcional das fibras45
O remodelamento da MEC em condiccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas eacute
realizado principalmente pelas metaloproteinases de matriz (MMPs) que satildeo
uma famiacutelia de enzimas zinco-dependentes que tecircm a capacidade de regular a
composiccedilatildeo da matriz45 As MMPs satildeo classificadas em seis grandes
subfamiacutelias com base em suas estruturas primaacuterias organizaccedilatildeo de domiacutenio
especificidade de substrato e localizaccedilatildeo celular No muacutesculo esqueleacutetico
MMP-2 (tambeacutem conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambeacutem conhecida
como gelatinase B) estatildeo envolvidas nas respostas agraves lesotildees bem como em
miopatias inflamatoacuterias e alteraccedilotildees inflamatoacuterias induzidas6
Como o processo de reparo muscular eacute muito lento e dependendo da
gravidade da lesatildeo muitas vezes ocorre uma recuperaccedilatildeo parcial encontrar a
melhor forma de tratamento para todas as fases da reparaccedilatildeo muscular eacute uma
questatildeo desafiadora em reabilitaccedilatildeo17 O ultra-som (US) eacute o agente eletrofiacutesico
mais amplamente disponiacutevel e o mais frequumlentemente utilizado no tratamento
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
36
fisioteraacutepico de lesotildees muacutesculo-esqueleacuteticas8 No entanto com as evidecircncias
biofiacutesicas atuais ainda haacute muitas duacutevidas em relaccedilatildeo ao mecanismo de accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico pulsado bem como os paracircmetros adequados para atingir
a regeneraccedilatildeo muscular desejada29-12 Sendo assim o objetivo do presente
estudo foi avaliar o efeito da irradiaccedilatildeo do ultra-som sobre a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e remodelamento por meio da avaliaccedilatildeo da atividade de
proteinases
Material e Meacutetodos
Cultura celular
A linhagem das ceacutelulas C2C12 eacute um subclone da linhagem celular de
mioblastos C2 ceacutelulas derivadas de ceacutelulas-sateacutelite de ratos adultos13 e foram
doadas pelo Dr Joseacute Ernesto Belizario da Universidade de Satildeo Paulo Brasil
As ceacutelulas C2C12 foram cultivadas em meio Dulbecco modificado por Eagle
(DMEM CULTILAB Campinas SP Brasil) suplementado com 10 de soro
fetal bovino (FBS CULTILAB) e 1 antibioacutetico soluccedilatildeo antimicoacutetica
(CULTILAB) a 37 C em uma atmosfera uacutemida com 5 de CO2 As ceacutelulas
foram mantidas em densidades de subconfluecircncia e subcultivadas a cada 2-3
dias Antes dos experimentos todas as culturas de ceacutelulas foram examinadas
com um microscoacutepio de luz (Eclipse TE 2000U Nikon Melville NY EUA) e a
viabilidade das culturas foi confirmada pelo teste de exclusatildeo Azul de Trypan
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA)
Modelo de aplicaccedilatildeo do ultra-som
Para a aplicaccedilatildeo do ultra-som utilizamos um aparelho Sonomaster
Microcontrolled Comunicator (KW Eletrocircnica Amparo SPBrasil) nas
frequumlecircncias de 1 e 3 MHz intensidades de 02 e 05 Wcm2 no modo pulsado a
20 e tempos de 2 e 5 minutos
As aplicaccedilotildees foram realizadas no interior de um banho-maria com
controle termostaacutetico (Nova Teacutecnica NT271 Piracicaba SP Brasil) para
manter a temperatura constante de 37degC O reservatoacuterio apresentava dimensatildeo
interna de 16 cm x 30 cm x 49 cm e suas paredes laterais e inferior foram
cobertas por borracha para eliminar reflexos muacuteltiplos O tanque foi preenchido
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
37
com aacutegua destilada deionizada desmineralizada que era substituiacuteda antes de
cada experimento
As ceacutelulas de cada grupo experimental foram preparadas em tubos de
ensaio (tubo Falcon esteacuteril) Um aparato de madeira foi desenvolvido para fixar
a cabeccedila do transdutor (32 cm de diacircmetro) e os tubos de cultura de modo
que o US pudesse ser transversalmente irradiado na direccedilatildeo das extremidades
inferiores dos tubos a uma distacircncia de 3 cm (Figura 1) de acordo com o
esquema proposto por Mukai et al (2005)14 Culturas controle foram
submetidas ao mesmo procedimento poreacutem com o aparelho de US desligado
Os grupos experimentais estatildeo descritos na tabela 1
Figura 1 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do aparato para aplicaccedilatildeo do
ultra-som na cultura celular Adaptado de Mukai et al (2005)
Tabela 1 ndash Grupos experimentais
Grupo Frequecircncia
(MHz)
Tempo
(Minutos)
Intensidade
(Wcm2)
1 1 2 02
2 1 2 05
3 1 5 02
4 1 5 05
5 3 2 02
6 3 2 05
7 3 5 02
8 3 5 05
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
38
Apoacutes a irradiaccedilatildeo as ceacutelulas controle (natildeo irradiadas) e as tratadas
(irradiadas) foram ressuspendidas em meio DMEM contendo 10 Soro Fetal
Bovino (SFB) e plaqueadas (103 ceacutelulaspoccedilo) em placas de 96 poccedilos Para a
anaacutelise de viabilidade as culturas foram incubadas em uma atmosfera uacutemida
de 5 CO2 por 72 h Em seguida a anaacutelise da atividade mitocondrial foi
realizada para avaliar a viabilidade celular
A funccedilatildeo mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada por meio do
ensaio MTT (3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)
(Sigma-Aldrich St Louis MO USA) Depois da irradiaccedilatildeo e incubaccedilatildeo por 72
horas o MMT foi adicionado agraves culturas celulares numa concentraccedilatildeo de 05
mgmL e as ceacutelulas foram incubadas num ambiente uacutemidocontendo 5 CO2 a
37deg por 3 h Depois deste periacuteodo 100 L de isopropanol foi adicionado em
cada poccedilo para dissolver os cristais formazan A absorbacircncia foi medida a 620
nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020 Anthos Labtec Instruments
Wals Austria) Os dados de absorbacircncia correspondente agrave viabilidade celular
foram obtidos em quadruplicata e estatildeo apresentados como meacutedias desvio
padratildeo
Atividade gelatinoliacutetica
A atividade gelatinoliacutetica do sobrenadante de todas as amostras das
culturas de ceacutelulas foi detectada por SDS-gel de gelatina por zimografia
Resumidamente o conteuacutedo de proteiacutena total foi estimado utilizando o teste de
Bradford (BioRad Laboratories Hercules CA EUA) seguindo o meacutetodo de
Bradford Para o ensaio enzimaacutetico geacuteis de SDS (10) foram preparadas com
1 mgmL de gelatina e proteiacutenas de 30 mg foram carregados por faixa sem
reduccedilatildeo Apoacutes a eletroforese os geacuteis foram lavados duas vezes durante 15
minutos cada um com 25 Triton X-100 para eliminar SDS Os geacuteis foram
entatildeo incubados overnight a 37ordmC em tampatildeo de substrato Tris-HCl 50 mM pH
85 CaCl2 5 mM e NaN3 002) Os geacuteis foram corados por 30 min com
005 de Coomassie blue R-250 em aacutecido aceacutetico metanol aacutegua (145) e
descorado na mesma soluccedilatildeo Todos os geacuteis foram preparados e executados
ao mesmo tempo As bandas de todos os geacuteis e de todos os grupos
experimentais foram quantificadas por densitometria utilizando o software
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
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25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
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40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
39
Image J (Software Image Processing and Analysis in Java - Image J 141
NIH) sendo que cada banda foi mensurada trecircs vezes para se obter a meacutedia e
o desvio padratildeo Ensaios enzimaacuteticos tambeacutem foram realizados na presenccedila
de EDTA 15 mM As metaloproteinases satildeo enzimas zinco-dependentes e o
EDTA se quela ao zinco vinculado agrave metaloproteinase inibindo assim a sua
atividade
Anaacutelise estatiacutestica
As comparaccedilotildees entre os grupos foram realizadas por anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) O teste de Dunnet foi utilizado para determinar diferenccedilas
significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle Valores de
p 005 foram considerados estatisticamente significativos Os dados foram
analisados por meio do programa GraphPad Prism 40 (GraphPad Software
San Diego CA EUA) Todos os experimentos foram realizados em
quadruplicata e repetidos por trecircs vezes embora apenas um experimento uacutenico
representativo de trecircs estaacute exposto em cada figura
Resultados
Efeito do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a proliferaccedilatildeo
celular
Natildeo houve diferenccedila significativa na proliferaccedilatildeo celular avaliada pelo
meacutetodo MTT entre as culturas celulares tratadas com ultra-som e as culturas
controle apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo A Figura 2 (1 MHz) e a Figura 3 (3 MHz)
mostram a comparaccedilatildeo da viabilidade de ceacutelulas C2C12 irradiadas nos
paracircmetros citados acima com as ceacutelulas natildeo-irradiadas
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
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during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
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42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
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43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
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57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
40
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacircn
cia
(n
m)
Dosagem do ultra-som
Figura 2 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 1 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 e 05
Wcm2
00
01
02
03
Controle 02W - 2 min 05W - 2 min 02W - 5 min 05W - 5 min
Ab
so
rbacirc
nc
ia (
nm
)
Dosagem do ultra-som
Figura 3 Viabilidade celular mensurada em absorbacircncia pelo meacutetodo MTT das
culturas de ceacutelulas C2C12 irradiadas com ultra-som pulsado de baixa
intensidade de 3 MHz durante 2 ou 5 minutos nas intensidades de 02 ou 05
Wcm2
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
41
Efeito do ultra-som terapecircutico pulsado na atividade de gelatinase nos
sobrenadantes das culturas celulares
A figura 4 mostra a atividade gelatinoliacutetica presente nos sobrenadantes
das culturas de todos os grupos experimentais Cada faixa representa um
conjunto de quatro amostras dos diferentes grupos Todas as amostras
apresentaram atividade gelatinoliacutetica semelhante As massas moleculares que
proporcionaram hidroacutelise da gelatina foram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa da MMP-2 As amostras foram testadas com o aacutecido
etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA natildeo mostrado) e natildeo houve atividade
Figura 4 Detecccedilatildeo da atividade gelatinoliacutetica nos meios de cultura por meio de
zimografia Cada linha representa um grupo experimental - A Controle B
02Wcm2 - 2min - 1MHz C 05Wcm2 - 2min - 1MHz D 02Wcm2 - 5min -
1MHz E- 05Wcm2 - 5min - 1MHz F 02Wcm2 - 2min - 3MHz G 05Wcm2 -
2min - 3MHz H 02Wcm2 - 5min - 3MHz I 05Wcm2 - 5min - 3MHz
Na anaacutelise de densitometria dos geacuteis a concentraccedilatildeo de proteinase dos
grupos eacute apresentada como meacutedia e desvio padratildeo e foi determinada
somando-se a densidade oacuteptica integrada obtida (expressos em unidades
arbitraacuterias) pelas trecircs bandas (proacute-enzima intermediaacuteria e forma ativa)
A B C D E F G H I
-- 62 kDa
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
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3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
42
Nenhuma diferenccedila estatiacutestica foi encontrada entre o controle e os grupos
experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz (Figura 5)
000
020
040
060
080
100
120
140
controle 02W 2min 1MHz
05W 2min 1MHz
02W 5min 1MHz
05W 5min 1MHz
02W 2min 3MHz
05W 2min 3MHz
02W 5min 3MHz
05W 5min 3MHz
Un
idad
es
arb
itraacute
rias
Dosagem do ultra-som
Figura 5 Concentraccedilatildeo de proteinase (gelatinase) expressa em meacutedia e desvio
padratildeo determinada pela soma da densidade oacuteptica integrada (expressa em
unidades arbitraacuterias) Natildeo foi encontrada diferenccedila estatisticamente significante
entre os grupos controle e experimentais tanto em 1 MHz como em 3 MHz
(plt 005 ANOVA - Dunnet)
Discussatildeo
Ateacute o presente momento natildeo se encontra na literatura um trabalho que
avalie o efeito do ultra-som terapecircutico pulsado sobre a proliferaccedilatildeo e a
viabilidade de ceacutelulas musculares bem como sobre sua atividade gelatinoliacutetica
Com base nisso o presente estudo teve este objetivo ao adotar este
modelo experimental onde pode-se observar que nos paracircmetros avaliados a
irradiaccedilatildeo por US natildeo influenciou a viabilidade dos mioblastos C2C12 e natildeo
proporcionou taxas de crescimento celular superiores aos observados nas
culturas controle Estes resultados foram obtidos pelo ensaio MTT que avalia a
atividade mitocondrial
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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20 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
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21 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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357
22 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
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23 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
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24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
26 Chen YJ Wang CJ Yang KD Chang PR Huang HC Huang YT et al
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42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
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43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
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formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
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45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
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49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
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50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
43
A cultura celular eacute por definiccedilatildeo um artefato no entanto permite que o
investigador tenha um controlo rigoroso sobre diversas variaacuteveis do processo e
possa fazer questionamentos de maneira mais sistemaacutetica15 Portanto estudos
in vitro como o presente trabalho satildeo importantes complementos dos estudos
in vivo
Foi utilizada a linhagem celular C2C12 porque essas ceacutelulas satildeo um
subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de ceacutelulas-sateacutelites de ratos
adultos apresentam a maioria das caracteriacutesticas dos mioblastos normais e
satildeo comumente usadas como modelo para estudar a proliferaccedilatildeo e a
diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas musculares Aleacutem disso o uso de linhagens celulares
como modelos para a anaacutelise da proliferaccedilatildeo celular elimina a possibilidade da
influecircncia do US sobre a produccedilatildeo de fatores de crescimento de ceacutelulas natildeo
miogenicas contidas em culturas primaacuterias como fibroblastos e
macroacutefagos1316
Aleacutem disso o protocolo de cultura celular adotado possibilita a
ldquoeliminaccedilatildeordquo dos efeitos teacutermicos do US e o estudo dos efeitos mecacircnicos do
mesmo na tentativa de identificar seu mecanismo de accedilatildeo15 Embora a
exposiccedilatildeo ao ultra-som natildeo tenha aumentado a temperatura global do sistema
experimental (natildeo houve alteraccedilatildeo na temperatura da aacutegua durante a aplicaccedilatildeo
do US) eacute difiacutecil determinar se ocorreram aumentos de temperatura na
superfiacutecie ou nos microambientes celulares No entanto afericcedilotildees diretas de
alteraccedilotildees de temperatura nestes microambientes natildeo satildeo atualmente
possiacuteveis15
Um segundo aspecto importante quando se projeta experimentos para
avaliar terapias eacute o quanto eacute possiacutevel adaptar o procedimento para aplicaacute-lo no
modelo adotado Como o ultra-som terapecircutico tem uma faixa de frequumlecircncia de
075 a 3 MHz e a maioria dos aparelhos e dos estudos usam uma frequumlecircncia
de 1 ou 3 MHz10 estas duas frequumlecircncias foram avaliadas no presente estudo
As intensidades de saiacuteda foram 05 e 02 Wcm2 e tempos de aplicaccedilatildeo de 2
ou de 5 minutos A intensidade meacutedia portanto foi de 01 e 004 Wcm2 Como
o cabeccedilote do ultra-som tinha uma aacuterea de irradiaccedilatildeo efetiva de 32 cm2 as
potecircncias de saiacuteda do aparelho foram de 032 W e de 0128 W
A maioria dos estudos que avaliou o efeito do US no muacutesculo esqueleacutetico
em animais utilizou intensidades de 01 a 3 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
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200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
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26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
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27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
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adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
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29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
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41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
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osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
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formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
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44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
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45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
44
5 a 15 minutos No entanto nos estudos em humanos o US foi utilizado em
intensidades que variaram de 08 a 2 Wcm2 com tempos de aplicaccedilatildeo de 7 a
14 minutos1281117-22 De acordo com Warden e McMeeken (2002)8 os
terapeutas predominantemente usam o US de ondas pulsadas em intensidades
de 051 a 2 Wcm2 e periacuteodos de aplicaccedilatildeo de 2 a 20 min
A respeito do modo de emissatildeo das ondas ultrasonicas verifica-se que os
estudos que avaliaram o efeito do US em muacutesculos esqueleacuteticos de animais
usaram o modo pulsado e o contiacutenuo No entanto em estudos que avaliaram o
US em muacutesculo esqueleacutetico de humanos o US foi sempre usado no modo
pulsado1271117-22 Assim o ultra-som no modo pulsado a 20 foi adotado no
presente estudo Aleacutem disso a emissatildeo pulsada natildeo gera efeitos teacutermicos
como a emissatildeo contiacutenua e tambeacutem previne os efeitos danosos da reflexatildeo
pois quando as ondas refletidas encontram outras ondas geradas acaba por
formar uma onda ultrasocircnica permanente com efeito adverso sobre o tecido23-
25 Foi utilizada ainda aacutegua destilada deionizada desmineralizada como meio
de transmissatildeo para prevenir os efeitos de reflexatildeo14
A comparaccedilatildeo dos resultados obtidos nos ensaios sobre os efeitos
terapecircuticos do US eacute muito difiacutecil pois os efeitos dependem do tipo de ceacutelula
do tipo de tecido da patologia e tambeacutem da dosagem utilizada Aleacutem disso o
US eacute agraciado com um grande nuacutemero de paracircmetros que se combinam para
construir a dose final12
Ao analisar os ensaios in vitro se observa que alguns autores relatam
que o US promove a proliferaccedilatildeo de osteoblastos fibroblastos26-29 ceacutelulas
endoteliais30 e condroacutecitos14 No entanto outros trabalhos natildeo demonstraram
de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferaccedilatildeo de
fibroblastos31 de ceacutelulas provenientes de discos intervertebrais de bovinos32
de ceacutelulas uro-epiteliais33 e de condroacutecitos3435 Alguns estudos relatam ateacute
mesmo uma diminuiccedilatildeo no nuacutemero de fibroblastos apoacutes o tratamento com
US36-38
Apenas um artigo que analisa o efeito do US sobre culturas de mioblastos
C2C12 foi encontrado na literatura mas os paracircmetros e objetivos eram muito
diferentes dos adotados neste estudo pois avaliaram a diferenciaccedilatildeo de
ceacutelulas C2C12 apoacutes a aplicaccedilatildeo do US na frequumlecircncia de 15 MHz intensidade
de 70 mWcm2 durante 20 min observando que o US estimulou a diferenciaccedilatildeo
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
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25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
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37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
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38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
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expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
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37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
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39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
45
das ceacutelulas C2C12 em osteoblastos e condroblastos tornando difiacutecil a
comparaccedilatildeo dos resultados 39
De qualquer modo mesmo se fosse considerado que o US natildeo tem
efeito sobre ceacutelulas sateacutelites in vitro deve-se considerar que in vivo muitos
outros tipos celulares podem responder aos estiacutemulos mecacircnicos do US e
tambeacutem haacute muitos fatores soluacuteveis como fatores de crescimento lipiacutedios
mitogecircnicos citocinas inflamatoacuterias e hormocircnios que satildeo conhecidos
reguladores da proliferaccedilatildeo celular Aleacutem disso o US embora natildeo tenha gerado
estiacutemulo proliferativo tambeacutem natildeo impediu o crescimento celular
De fato foi demonstrado que o US pulsado aumenta a proliferaccedilatildeo de
ceacutelulas sateacutelites e de fibroblastos em modelo experimental de lesatildeo contusa em
muacutesculo gastrocnecircmio de rato1 Aleacutem disso foi demonstrado que o tratamento
com US melhora a extensibilidade muscular40 a produccedilatildeo de forccedila apoacutes lesatildeo
por contraccedilatildeo20 e pode aumentar a diferenciaccedilatildeo das ceacutelulas musculares em
modelo animal7 No entanto outros autores que tambeacutem utilizaram modelo
experimental animal foram incapazes de demonstrar um aumento
estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneraccedilatildeo tecidual
em lesotildees musculares tratadas com o US111819 Esta controveacutersia apoacuteia a ideacuteia
de que ainda haacute uma escassez de evidecircncia cientiacutefica sobre a eficaacutecia do US
na reparaccedilatildeo muscular ou que os protocolos de tratamento comumente
empregados para o ultra-som natildeo satildeo capazes de prover a eficaacutecia
terapecircutica715 muito disso devido tambeacutem agrave grande variaccedilatildeo dos paracircmetros
adotados em cada trabalho aleacutem da metodologia utilizada que dificulta a
comparaccedilatildeo ou complementaccedilatildeo de resultados
Por outro lado o reparo do muacutesculo estriado requer natildeo apenas
proliferaccedilatildeo mas tambeacutem interaccedilatildeo equilibrada entre ceacutelulas musculares MEC
e metaloproteinases neovascularizaccedilatildeo e a adesatildeo de fibras musculares agrave
matriz extracelular41
As MMP-2 e MMP-9 degradam colaacutegenos do tipo IV e V bem como
colaacutegenos desnaturados intersticiais Enquanto a MMP-2 tambeacutem eacute secretada
no muacutesculo esqueleacutetico por fibroblastos e ceacutelulas sateacutelites a MMP-9 eacute
produzida principalmente por leucoacutecitos5 Na maioria dos estudos a MMP-2
estaacute relacionada com a regeneraccedilatildeo de novas fibras musculares
possivelmente devido agrave degradaccedilatildeo do colaacutegeno tipo IV na membrana basal42
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
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20 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
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25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
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35 Zhang ZJ Huckle J Francomano CA Spencer RG The effects of pulsed
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36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
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37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
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38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
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39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
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40 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static
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healthy women Phys Ther 1987 67 674-679
41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
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32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
46
Tambeacutem tem sido demonstrado que os mioblastos C2C12 secretam MMP-2 de
uma forma constitutiva43
As anaacutelises dos resultados da zimografia revelaram atividade gelatinoliacutetica
similar em todas as amostras experimentais A massa molecular das bandas
que proporcionaram hidroacutelise da gelatina eram de aproximadamente 62 kDa
sugerindo a forma ativa de MMP-2 Assim sugere-se que nesses paracircmetros o
US natildeo exerce efeito sobre a produccedilatildeo de proteinases ou mais que o US natildeo
exerce efeito sobre a produccedilatildeo de MMP-2 pelos mioblastos Nenhum trabalho
que descrevesse o efeito do US sobre a produccedilatildeo de MMP por mioblastos foi
encontrado assim natildeo foi possiacutevel comparar os resultados do presente
trabalho
Muitas questotildees surgem deste trabalho assim novos estudos devem ser
conduzidos com o objetivo de entender o mecanismo da bioestimulaccedilatildeo do US
sobre as ceacutelulas do muacutesculo esqueleacutetico Aleacutem disso esses estudos podem
tambeacutem determinar os paracircmetros corretos para otimizar a bioestimulaccedilatildeo dos
mioblastos
47
Referecircncias Bibliograacuteficas do Estudo 2
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irradiation on the viability of C2C12 myoblasts in a muscle injury model
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48
14 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Bio 2005 31(12) 1713-1721
15 Johns LD Nonthermal Effects of Therapeutic Ultrasound The Frequency
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16 Chandran R Knobloch TJ Anghelina M Agarwal S Biomechanical signals
upregulate myogenic gene induction in the presence or absence of
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17 Okita M Nakano J Kataoka H Sakamoto J Origuchi T Yoshimura T
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18 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
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19 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
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20 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
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21 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
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357
22 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
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23 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
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24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
26 Chen YJ Wang CJ Yang KD Chang PR Huang HC Huang YT et al
Pertussis toxin-sensitive GKi protein and ERK-dependent pathways mediate
ultrasound promotion of osteogenic transcription in human osteoblasts
FEBS Lett 2003 554(1-2) 154-158
27 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
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28 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist in fibroblast Int
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29 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
1999 57 409-419
30 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11) 1818-1829
31 De Oliveira RF Oliveira DA Monteiro W Zangaro RA Magini M Soares
CP Comparison between the effect of low-level laser therapy and low-
intensity pulsed ultrasonic irradiation in vitro Photomed Laser Surg 2008
26(1) 6-9
32 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine 2005
30(21) 2398-2405
33 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 2005 31(12) 1701-1706
34 Parvizi J Wu CC Lewallen DG Greenleaf JF Bolander ME Low-intensity
ultrasound stimulates proteoglycan synthesis in rat chondrocytes by
increasing aggrecan gene expression J Orthop Res 1999 17(4) 488-494
50
35 Zhang ZJ Huckle J Francomano CA Spencer RG The effects of pulsed
low intensity ultrasound on chondrocyte viability proliferation gene
expression and matrix production Ultrasound Med Biol 2003 29 1645-
1651
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblasts Phys Ther 1995 75 629ndash634
37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 1989 15 133-144
38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sport
Exerc 1997 29 326-332
39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
2006 79(20) 1936-1943
40 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static
stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in
healthy women Phys Ther 1987 67 674-679
41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
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25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
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26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
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27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
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46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
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55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
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56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
47
Referecircncias Bibliograacuteficas do Estudo 2
1 Rantanen J Thorsson O Wollmer P Hurme T Kalimo H Effects of
therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after
experimental muscle injury Am J Sports Med 1999 27(1) 54-59
2 Freitas LS Freitas TP Silveira PC Rocha LG Pinho RA Streck EL Effect
of therapeutic pulsed ultrasound on parameters of oxidative stress in
skeletal muscle after injury Cell Biol Int 2007 31 482-488
3 Huard J Li Y Fu FH Muscle injuries and repair current trends in research
J Bone Joint Surg Am 2002 84 822-832
4 Kjaer M Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal
muscle to mechanical loading Physiol Rev 2004 84 649-698
5 Carmeli E Moas M Reznick AZ Coleman R Matrix metalloproteinases and
skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2) 191-197
6 Choi YC Dalakas MC Expression of matrix metalloproteinases in the
muscle of patients with inflammatory myopathies Neurology 2000 54 65ndash
71
7 Piedade MCB Galhardo MS Battlehner CN Ferreira MA Caldini EG
Toledo OMS Effect of ultrasound therapy on the repair of gastrocnemius
muscle injury in rats Ultrasonics 2008 48 403ndash411
8 Warden SJ McMeeken JM Ultrasound usage and dosage in sports
physiotherapy Ultrasound Med Biol 2002 28 1075-1080
9 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 2001 81(7) 1351-1358
10 Robertson VJ Baker KG A review of therapeutic ultrasound effectiveness
studies Phys Ther 2001 81(7) 1339-1350
11 Markert CD Merrick MA Kirby TE Devor ST Nonthermal ultrasound and
exercise in skeletal muscle regeneration Arch Phys Med Rehabil 2005 86
1304-1310
12 Warden SJ A new direction for ultrasound therapy in sports medicine
Sports Med 2003 33 (2) 95-107
13 Ferreira MPP Ferrari RAM Gravalos ED Martins MD Bussadori SK
Gonzales DAB et al Effect of low-energy GaAlAs and InGaAlP laser
irradiation on the viability of C2C12 myoblasts in a muscle injury model
Photomed Laser Surg 2009 (in press)
48
14 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Bio 2005 31(12) 1713-1721
15 Johns LD Nonthermal Effects of Therapeutic Ultrasound The Frequency
Resonance Hypothesis J Athl Train 200237(3)293ndash299
16 Chandran R Knobloch TJ Anghelina M Agarwal S Biomechanical signals
upregulate myogenic gene induction in the presence or absence of
inflammation Am J Physiol Cell Physiol 2007 293 C267ndashC276
17 Okita M Nakano J Kataoka H Sakamoto J Origuchi T Yoshimura T
Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril
arrangement in the endomysium of immobilizes rat soleus muscle
Ultrasound Med Biol 2009 35(2) 237-244
18 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechamo-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil 2007 88
936-40
19 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 2004 25 73ndash77
20 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 2002 83 1-4
21 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 2005 85(4) 352-
357
22 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 1999 80(3) 318-323
23 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
26 Chen YJ Wang CJ Yang KD Chang PR Huang HC Huang YT et al
Pertussis toxin-sensitive GKi protein and ERK-dependent pathways mediate
ultrasound promotion of osteogenic transcription in human osteoblasts
FEBS Lett 2003 554(1-2) 154-158
27 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004 279(52) 54463-54469
28 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist in fibroblast Int
J Dermatol 2007 46 587-593
29 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
1999 57 409-419
30 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11) 1818-1829
31 De Oliveira RF Oliveira DA Monteiro W Zangaro RA Magini M Soares
CP Comparison between the effect of low-level laser therapy and low-
intensity pulsed ultrasonic irradiation in vitro Photomed Laser Surg 2008
26(1) 6-9
32 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine 2005
30(21) 2398-2405
33 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 2005 31(12) 1701-1706
34 Parvizi J Wu CC Lewallen DG Greenleaf JF Bolander ME Low-intensity
ultrasound stimulates proteoglycan synthesis in rat chondrocytes by
increasing aggrecan gene expression J Orthop Res 1999 17(4) 488-494
50
35 Zhang ZJ Huckle J Francomano CA Spencer RG The effects of pulsed
low intensity ultrasound on chondrocyte viability proliferation gene
expression and matrix production Ultrasound Med Biol 2003 29 1645-
1651
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblasts Phys Ther 1995 75 629ndash634
37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 1989 15 133-144
38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sport
Exerc 1997 29 326-332
39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
2006 79(20) 1936-1943
40 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static
stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in
healthy women Phys Ther 1987 67 674-679
41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Seale P Rudnicki MA A new look at the originf unction and ldquostem-cell
rdquostatus of muscle satellite cellsDev Biol 2000218(2)115-24
3 Kumar A Mohan S Newton J Rehage M Tran K Baylink DJ Pregnancy-
associated Plasma Protein-A Regulates Myoblast Proliferation and
Differentiation through an Insulin-like Growth Factor-dependent Mechanism
J Biol Chem 2005280(45)37782ndash9
4 Dogra C Hall SL Wedhas N Linkhart TA Kumar A Fibroblast growth factor
inducible-14 (Fn14) is required for the expression of myogenic regulatory
factors and differentiation of myoblasts into myotubes Evidence for TWEAK-
independent functions of Fn14 during myogenesis J Biol Chem
2007282(20)15000-10
5 Goetsch SC Hawke TJ Gallardo TD Richardson JA Garry DJ
Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during
muscle regeneration Physiol Genomics 200314(3)261-71
6 Stetler-Stevenson WG Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix Am J Pathol 1996148(5)1345-50
7 Massova I Kotra LP Fridman R Mobashery S Matrix metalloproteinases
structures evolution and diversification FASEB J 1998121075-95
8 Carmeli E Moas M Reznick AZ amp Coleman R Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2)191-7
9 Koskinen SAO Kjaer M Mohr T Sorensen FB Suuronen T Takala TES
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle effect of
functional electrical stimulation Muscle Nerve 200023(4)580-9
10 Verzola RMM Mesquita RA Peviani S Ramos OHP Moriscot AS Perez S
et al Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training
Braz J Med Biol Res 200639(5)621-7
11 Haas TL Milkiewicz M Davis SJ Zhou AL Egginton S Brown MD et al
Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
48
14 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Bio 2005 31(12) 1713-1721
15 Johns LD Nonthermal Effects of Therapeutic Ultrasound The Frequency
Resonance Hypothesis J Athl Train 200237(3)293ndash299
16 Chandran R Knobloch TJ Anghelina M Agarwal S Biomechanical signals
upregulate myogenic gene induction in the presence or absence of
inflammation Am J Physiol Cell Physiol 2007 293 C267ndashC276
17 Okita M Nakano J Kataoka H Sakamoto J Origuchi T Yoshimura T
Effects of therapeutic ultrasound on joint mobility and collagen fibril
arrangement in the endomysium of immobilizes rat soleus muscle
Ultrasound Med Biol 2009 35(2) 237-244
18 McBrier NM Lekan JM Druhan LJ Devor ST Merrick MA Therapeutic
ultrasound decreases mechamo-growth factor messenger ribonucleic acid
expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil 2007 88
936-40
19 Wilkin LD Merrick MA Kirby TE Devor ST Influence of therapeutic
ultrasound on skeletal muscle regeneration following blunt contusion Int J
Sports Med 2004 25 73ndash77
20 Karnes JL Burton HW Continuous therapeutic ultrasound accelerates
repair of contraction-induced skeletal muscle damage in rats Arch Phys
Med Rehabil 2002 83 1-4
21 Bernaacute-Serna JD Saacutenchez-Garre J Madrigal M Zuazu I Berna-Mestre JD
Ultrasound therapy in rectus sheath hematoma Phys Ther 2005 85(4) 352-
357
22 Craig JAacute Bradley J Walsh DM Baxter GD Allen JM Delayed onset muscle
soreness lack of effect of therapeutic ultrasound in humans Arch Phys Med
Rehabil 1999 80(3) 318-323
23 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
24 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
26 Chen YJ Wang CJ Yang KD Chang PR Huang HC Huang YT et al
Pertussis toxin-sensitive GKi protein and ERK-dependent pathways mediate
ultrasound promotion of osteogenic transcription in human osteoblasts
FEBS Lett 2003 554(1-2) 154-158
27 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004 279(52) 54463-54469
28 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist in fibroblast Int
J Dermatol 2007 46 587-593
29 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
1999 57 409-419
30 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11) 1818-1829
31 De Oliveira RF Oliveira DA Monteiro W Zangaro RA Magini M Soares
CP Comparison between the effect of low-level laser therapy and low-
intensity pulsed ultrasonic irradiation in vitro Photomed Laser Surg 2008
26(1) 6-9
32 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine 2005
30(21) 2398-2405
33 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 2005 31(12) 1701-1706
34 Parvizi J Wu CC Lewallen DG Greenleaf JF Bolander ME Low-intensity
ultrasound stimulates proteoglycan synthesis in rat chondrocytes by
increasing aggrecan gene expression J Orthop Res 1999 17(4) 488-494
50
35 Zhang ZJ Huckle J Francomano CA Spencer RG The effects of pulsed
low intensity ultrasound on chondrocyte viability proliferation gene
expression and matrix production Ultrasound Med Biol 2003 29 1645-
1651
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblasts Phys Ther 1995 75 629ndash634
37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 1989 15 133-144
38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sport
Exerc 1997 29 326-332
39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
2006 79(20) 1936-1943
40 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static
stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in
healthy women Phys Ther 1987 67 674-679
41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Seale P Rudnicki MA A new look at the originf unction and ldquostem-cell
rdquostatus of muscle satellite cellsDev Biol 2000218(2)115-24
3 Kumar A Mohan S Newton J Rehage M Tran K Baylink DJ Pregnancy-
associated Plasma Protein-A Regulates Myoblast Proliferation and
Differentiation through an Insulin-like Growth Factor-dependent Mechanism
J Biol Chem 2005280(45)37782ndash9
4 Dogra C Hall SL Wedhas N Linkhart TA Kumar A Fibroblast growth factor
inducible-14 (Fn14) is required for the expression of myogenic regulatory
factors and differentiation of myoblasts into myotubes Evidence for TWEAK-
independent functions of Fn14 during myogenesis J Biol Chem
2007282(20)15000-10
5 Goetsch SC Hawke TJ Gallardo TD Richardson JA Garry DJ
Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during
muscle regeneration Physiol Genomics 200314(3)261-71
6 Stetler-Stevenson WG Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix Am J Pathol 1996148(5)1345-50
7 Massova I Kotra LP Fridman R Mobashery S Matrix metalloproteinases
structures evolution and diversification FASEB J 1998121075-95
8 Carmeli E Moas M Reznick AZ amp Coleman R Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2)191-7
9 Koskinen SAO Kjaer M Mohr T Sorensen FB Suuronen T Takala TES
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle effect of
functional electrical stimulation Muscle Nerve 200023(4)580-9
10 Verzola RMM Mesquita RA Peviani S Ramos OHP Moriscot AS Perez S
et al Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training
Braz J Med Biol Res 200639(5)621-7
11 Haas TL Milkiewicz M Davis SJ Zhou AL Egginton S Brown MD et al
Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
49
25 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
26 Chen YJ Wang CJ Yang KD Chang PR Huang HC Huang YT et al
Pertussis toxin-sensitive GKi protein and ERK-dependent pathways mediate
ultrasound promotion of osteogenic transcription in human osteoblasts
FEBS Lett 2003 554(1-2) 154-158
27 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004 279(52) 54463-54469
28 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist in fibroblast Int
J Dermatol 2007 46 587-593
29 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
1999 57 409-419
30 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11) 1818-1829
31 De Oliveira RF Oliveira DA Monteiro W Zangaro RA Magini M Soares
CP Comparison between the effect of low-level laser therapy and low-
intensity pulsed ultrasonic irradiation in vitro Photomed Laser Surg 2008
26(1) 6-9
32 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine 2005
30(21) 2398-2405
33 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 2005 31(12) 1701-1706
34 Parvizi J Wu CC Lewallen DG Greenleaf JF Bolander ME Low-intensity
ultrasound stimulates proteoglycan synthesis in rat chondrocytes by
increasing aggrecan gene expression J Orthop Res 1999 17(4) 488-494
50
35 Zhang ZJ Huckle J Francomano CA Spencer RG The effects of pulsed
low intensity ultrasound on chondrocyte viability proliferation gene
expression and matrix production Ultrasound Med Biol 2003 29 1645-
1651
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblasts Phys Ther 1995 75 629ndash634
37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 1989 15 133-144
38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sport
Exerc 1997 29 326-332
39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
2006 79(20) 1936-1943
40 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static
stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in
healthy women Phys Ther 1987 67 674-679
41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Seale P Rudnicki MA A new look at the originf unction and ldquostem-cell
rdquostatus of muscle satellite cellsDev Biol 2000218(2)115-24
3 Kumar A Mohan S Newton J Rehage M Tran K Baylink DJ Pregnancy-
associated Plasma Protein-A Regulates Myoblast Proliferation and
Differentiation through an Insulin-like Growth Factor-dependent Mechanism
J Biol Chem 2005280(45)37782ndash9
4 Dogra C Hall SL Wedhas N Linkhart TA Kumar A Fibroblast growth factor
inducible-14 (Fn14) is required for the expression of myogenic regulatory
factors and differentiation of myoblasts into myotubes Evidence for TWEAK-
independent functions of Fn14 during myogenesis J Biol Chem
2007282(20)15000-10
5 Goetsch SC Hawke TJ Gallardo TD Richardson JA Garry DJ
Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during
muscle regeneration Physiol Genomics 200314(3)261-71
6 Stetler-Stevenson WG Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix Am J Pathol 1996148(5)1345-50
7 Massova I Kotra LP Fridman R Mobashery S Matrix metalloproteinases
structures evolution and diversification FASEB J 1998121075-95
8 Carmeli E Moas M Reznick AZ amp Coleman R Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2)191-7
9 Koskinen SAO Kjaer M Mohr T Sorensen FB Suuronen T Takala TES
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle effect of
functional electrical stimulation Muscle Nerve 200023(4)580-9
10 Verzola RMM Mesquita RA Peviani S Ramos OHP Moriscot AS Perez S
et al Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training
Braz J Med Biol Res 200639(5)621-7
11 Haas TL Milkiewicz M Davis SJ Zhou AL Egginton S Brown MD et al
Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
50
35 Zhang ZJ Huckle J Francomano CA Spencer RG The effects of pulsed
low intensity ultrasound on chondrocyte viability proliferation gene
expression and matrix production Ultrasound Med Biol 2003 29 1645-
1651
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblasts Phys Ther 1995 75 629ndash634
37 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 1989 15 133-144
38 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sport
Exerc 1997 29 326-332
39 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
2006 79(20) 1936-1943
40 Wessling KC DeVane DA Hylton CR Effects of static stretch versus static
stretch and ultrasound combined on triceps surae muscle extensibility in
healthy women Phys Ther 1987 67 674-679
41 Kaumlaumlriaumlinen M Kaumlaumlriaumlinen J Jaumlrvinen TLN Nissinen L Heino J Jaumlrvinen M
Kalimo H Integrin and dystrophin associated adhesion protein complexes
during regeneration of shearing-type muscle injury Neuromuscul Disord
2000 10121ndash132
42 Fukushima K Nakamura A Ueda H Yuasa K Yoshida K Takeda S et al
Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the
skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ) BMC
Musculoskelet Disord 2007 854
43 Lluri BSG Jaworski DM Regulation of TIMP-2 MT1-MMP and MMP-2
expression during C2C12 differentiation Muscle Nerve 2005 32 492-499
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Seale P Rudnicki MA A new look at the originf unction and ldquostem-cell
rdquostatus of muscle satellite cellsDev Biol 2000218(2)115-24
3 Kumar A Mohan S Newton J Rehage M Tran K Baylink DJ Pregnancy-
associated Plasma Protein-A Regulates Myoblast Proliferation and
Differentiation through an Insulin-like Growth Factor-dependent Mechanism
J Biol Chem 2005280(45)37782ndash9
4 Dogra C Hall SL Wedhas N Linkhart TA Kumar A Fibroblast growth factor
inducible-14 (Fn14) is required for the expression of myogenic regulatory
factors and differentiation of myoblasts into myotubes Evidence for TWEAK-
independent functions of Fn14 during myogenesis J Biol Chem
2007282(20)15000-10
5 Goetsch SC Hawke TJ Gallardo TD Richardson JA Garry DJ
Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during
muscle regeneration Physiol Genomics 200314(3)261-71
6 Stetler-Stevenson WG Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix Am J Pathol 1996148(5)1345-50
7 Massova I Kotra LP Fridman R Mobashery S Matrix metalloproteinases
structures evolution and diversification FASEB J 1998121075-95
8 Carmeli E Moas M Reznick AZ amp Coleman R Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2)191-7
9 Koskinen SAO Kjaer M Mohr T Sorensen FB Suuronen T Takala TES
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle effect of
functional electrical stimulation Muscle Nerve 200023(4)580-9
10 Verzola RMM Mesquita RA Peviani S Ramos OHP Moriscot AS Perez S
et al Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training
Braz J Med Biol Res 200639(5)621-7
11 Haas TL Milkiewicz M Davis SJ Zhou AL Egginton S Brown MD et al
Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
51
3 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Neste estudo buscou-se aliar os dados obtidos por meio da pesquisa
bibliograacutefica sobre a utilizaccedilatildeo do US em tecido muscular com um modelo
experimental in vitro onde fosse possiacutevel avaliar o efeito deste recurso
terapecircutico sobre a ceacutelula mais representativa deste tecido o mioblasto
Com os dados do levantamento bibliograacutefico verifica-se que ateacute o
presente momento natildeo haacute suporte cientiacutefico para a utilizaccedilatildeo do ultra-som
terapecircutico pulsado no tratamento de lesotildees musculares devido agrave carecircncia de
estudos em modelos celulares e animais e de estudos cliacutenicos randomizados e
controlados
Jaacute no estudo in vitro constatou-se que o US natildeo alterou a proliferaccedilatildeo a
viabilidade e a atividade gelatinoliacutetica dos mioblastos C2C12 quando expostos
a irradiaccedilatildeo nos paracircmetros descritos Por outro lado se evidenciou tambeacutem
que o US natildeo eacute lesivo agraves ceacutelulas musculares mantendo nos grupos
experimentais viabilidade similar a do grupo controle
Como este agente terapecircutico continua sendo largamente utilizado com o
objetivo de acelerar o processo de reabilitaccedilatildeo do muacutesculo esqueleacutetico pode-
se concluir que haacute necessidade premente da realizaccedilatildeo de novos estudos nos
diversos modelos a fim de que se possa num futuro proacuteximo estabelecer seu
real papel como recurso terapecircutico
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Seale P Rudnicki MA A new look at the originf unction and ldquostem-cell
rdquostatus of muscle satellite cellsDev Biol 2000218(2)115-24
3 Kumar A Mohan S Newton J Rehage M Tran K Baylink DJ Pregnancy-
associated Plasma Protein-A Regulates Myoblast Proliferation and
Differentiation through an Insulin-like Growth Factor-dependent Mechanism
J Biol Chem 2005280(45)37782ndash9
4 Dogra C Hall SL Wedhas N Linkhart TA Kumar A Fibroblast growth factor
inducible-14 (Fn14) is required for the expression of myogenic regulatory
factors and differentiation of myoblasts into myotubes Evidence for TWEAK-
independent functions of Fn14 during myogenesis J Biol Chem
2007282(20)15000-10
5 Goetsch SC Hawke TJ Gallardo TD Richardson JA Garry DJ
Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during
muscle regeneration Physiol Genomics 200314(3)261-71
6 Stetler-Stevenson WG Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix Am J Pathol 1996148(5)1345-50
7 Massova I Kotra LP Fridman R Mobashery S Matrix metalloproteinases
structures evolution and diversification FASEB J 1998121075-95
8 Carmeli E Moas M Reznick AZ amp Coleman R Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2)191-7
9 Koskinen SAO Kjaer M Mohr T Sorensen FB Suuronen T Takala TES
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle effect of
functional electrical stimulation Muscle Nerve 200023(4)580-9
10 Verzola RMM Mesquita RA Peviani S Ramos OHP Moriscot AS Perez S
et al Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training
Braz J Med Biol Res 200639(5)621-7
11 Haas TL Milkiewicz M Davis SJ Zhou AL Egginton S Brown MD et al
Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
52
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
1 Grounds MD White JD Rosenthal N Bogoyevitch MA The Role of Stem
Cells in Skeletal and Cardiac Muscle Repair J Histochem Cytochem
200250589-610
2 Seale P Rudnicki MA A new look at the originf unction and ldquostem-cell
rdquostatus of muscle satellite cellsDev Biol 2000218(2)115-24
3 Kumar A Mohan S Newton J Rehage M Tran K Baylink DJ Pregnancy-
associated Plasma Protein-A Regulates Myoblast Proliferation and
Differentiation through an Insulin-like Growth Factor-dependent Mechanism
J Biol Chem 2005280(45)37782ndash9
4 Dogra C Hall SL Wedhas N Linkhart TA Kumar A Fibroblast growth factor
inducible-14 (Fn14) is required for the expression of myogenic regulatory
factors and differentiation of myoblasts into myotubes Evidence for TWEAK-
independent functions of Fn14 during myogenesis J Biol Chem
2007282(20)15000-10
5 Goetsch SC Hawke TJ Gallardo TD Richardson JA Garry DJ
Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during
muscle regeneration Physiol Genomics 200314(3)261-71
6 Stetler-Stevenson WG Dynamics of matrix turnover during pathologic
remodeling of the extracellular matrix Am J Pathol 1996148(5)1345-50
7 Massova I Kotra LP Fridman R Mobashery S Matrix metalloproteinases
structures evolution and diversification FASEB J 1998121075-95
8 Carmeli E Moas M Reznick AZ amp Coleman R Matrix metalloproteinases
and skeletal muscle a brief review Muscle Nerve 2004 29(2)191-7
9 Koskinen SAO Kjaer M Mohr T Sorensen FB Suuronen T Takala TES
Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle effect of
functional electrical stimulation Muscle Nerve 200023(4)580-9
10 Verzola RMM Mesquita RA Peviani S Ramos OHP Moriscot AS Perez S
et al Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training
Braz J Med Biol Res 200639(5)621-7
11 Haas TL Milkiewicz M Davis SJ Zhou AL Egginton S Brown MD et al
Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
53
angiogenesis in rat skeletal muscle Am J Physiol Heart Circ Physiol
2000279(4)H1540-7
12 Carmeli E Moas M Lennon S Powers SK High intensity exercise
increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle
fibres Exp Physiol 2005 Jul90(4)613-9
13 Van Gieson EJ Skalak TC Chronic vasodilation induces matrix
metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in
rat skeletal muscle Microcirculation 2001 8(1)25-31
14 Rucavado A Escalante T Teixeira CF Fernandes CM Diaz C Gutierrez
JM Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal
muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the
snake Bothrops asper Mediators Inflamm 200211(2)121-8
15 Baker KG Robertson VL Duck FA A review of therapeutic ultrasound
biophysical effects Phys Ther 200181(7)1351-1358
16 Speed CA Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions Rheumatology
(Oxford) 2001401331-6
17 Sundaram J Mellein BR Mitragotri S An experimental and theoretical
analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes Biophys
J 200384(5)3087-101
18 Blume K Matsuo E Lopes MS Lopes LG Dosimetria proposta para o
tratamento por ultra-som - uma revisatildeo de literatura Fisioter Mov 2005
18(3)55-64
19 Ferrari RJ Picchi LD Botelho AP Minamoto V Processo de regeneraccedilatildeo
na lesatildeo muscular uma revisatildeo Fisioter Mov 200518(2)63-71
20 Franco AD Pereira LE Groschitz M Aimbire F Martins RABL Carvalho
RA Anaacutelise do efeito do ultra-som no edema inflamatoacuterio agudo ndash estudo
experimental Fisioter Mov 200518(2)19-24
21 Mitragotri S Healing sound the use of ultrasound in drug delivery and other
therapeutic applications Nat Rev Drug Discov 20054255-60
22 Bassoli DA Avaliaccedilatildeo dos efeitos do ultra-som pulsado de baixa
intensidade na regeneraccedilatildeo de muacutesculos esqueleacuteticos com vistas agrave
aplicabilidade em cliacutenica fisioterapecircutica [dissertaccedilatildeo] Satildeo Carlos (SP)
Univ Satildeo Paulo 2001
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
54
23 Warden SJ Fuchs RK Kessler CK Avin KG Cardinal RE Stewart RL
Ultrasound Produced by a Conventional Therapeutic Ultrasound Unit
Accelerates Fracture Repair Phys Ther 200686(8)1118-27
24 Pong M Umchid S Guarino AJ Lewin PA Litniewski J Nowicki A et al In
vitro ultrasound-mediated leakage from phospholipid vesicles Ultrasonics
200645133-45
25 Carvalho PTC Silva IS Reis FA Belchior ACG Aydos RD Facco GG et al
Histological study of tendon healing in malnourished wistar rats treated with
ultrasound therapy Acta Cir Bras 200621(4)13-7
26 Monte-Raso VV Barbieri CH Mazzer N Fazan VPS Os efeitos do ultra-
som terapecircutico nas lesotildees por esmagamento no nervo ciaacutetico de ratos
anaacutelise funcional da marcha Rev Bras Fisioter 200610(1)113-9
27 Frasson NFV Parizotto NA Taciro C Anaacutelise nanoestrutural da accedilatildeo do
ultra-som terapecircutico sobre o processo de regenaraccedilatildeo do tendatildeo de ratos
adultos Congresso de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica 15 2007 Satildeo Carlos Anais de
Eventos da UFSCar 2007 3 533
28 Johns LD Nonthermal effects of therapeutic ultrasound the frequency
resonance hypothesis J Athl Train 200237(3)293-9
29 Mendonccedila AC Ferreira AS Barbieri CH Thomazine JA Mazzer N Efeitos
do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a cicatrizaccedilatildeo por segunda
intenccedilatildeo de lesotildees cutacircneas totais em ratos Acta Ortop Bras
200614(3)152-7
30 Dalecki D Mechanical bioeffects of ultrasound Annu Rev Biomed Eng
2004 6229-48
31 Freshney RI Culture of animal cells A manual of basic technique 5a ed
New York (NY) Wiley-Liss 2005
32 Campbell P Prausnitz MR Future directions for therapeutic ultrasound
Ultrasound Med Biol 2007 33(4)657-658
33 Vivino AA Boraker DK Miller D Nyborg W Stable cavitation at low
ultrasonic intensities induces cell death and inhibits 3H-TdR incorporation by
Con-A-stimulated murine lymphocytes in vitro Ultrasound Med Biol
198511751-9
34 Mortimer AJ Dyson M The effect of therapeutic ultrasound on calcium
uptake in fibroblasts Ultrasound Med Biol 198814499ndash506
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
55
35 Fahnestock M Rimer VG Yamawaki PR Edmonds PD Effects of
ultrasound exposure in vitro on neuroblastoma cell membranes Ultrasound
Med Biol 198915133-144
36 De Deyne PG Kirsch-Volders M In vitro effects of therapeutic ultrasound on
the nucleus of human fibroblast Phys Ther 199575629-634
37 Ramirez A Schwane JA McFarland C Starcher B The effect of ultrasound
on collagen synthesis and fibroblast proliferation in vitro Med Sci Sports
Exerc 199729326-32
38 Doan N Reher P Meghji S Harris M In vitro effects of therapeutic
ultrasound on cell proliferation protein synthesis and cytokine production by
human fibroblasts osteoblasts and monocytes J Oral Maxillofac Surg
199957409-19
39 Johns LD Colloton PA Neuenfeldt J Effects of therapeutic ultrasound on T
cell proliferation and IL-2 production J Athl Train 199934(suppl)S24
40 Reher P Doan N Bradnock B Meghji S Harris M Effect of ultrasound on
the productin of IL-8 basic FGF and VEGF Cytokine 199911416-23
41 Harle J Mayia F Olsen I Salih V Effects of ultrasound on transforming
growth factor-B genes in bone cells Eur Cell Mater 20051070-7
42 Maddi A Hai H Ong ST Sharp L Harris M Meghji S Long wave ultrasound
may enhance bone regeneration by altering OPGRANKL ratio in human
osteoblast-like cells Bone 200639283-8
43 Tang CH Yang RS Huang TH Lu DY Chuang WJ Huang TF et al
Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone
formation through integrin focal adhesion kinase phosphatidylinositol 3-
kinase and akt pathway in osteoblasts Mol Pharmacol 200669(6)2047-57
44 Iwabuchi S Ito M Hata J Chikanishi T Azuma Y Haro H In vitro evaluation
of low-intensity pulsed ultrasound in herniated disc resorption Biomaterials
200526(34)7104-14
45 Miyamoto K An HS Sah RL Akeda K Okuma M Otten L et al Exposure
to pulsed low intensity ultrasound stimulates extracellular matrix metabolism
of bovine intervertebral disc cells cultured in alginate beads Spine
200530(21)2398-405
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
56
46 Mukai S Ito H Nakagawa Y Akiyama H Miyamoto M Nakamura T
Transforming growth factor B1 mediates the effects of low-intensity pulsed
ultrasound in chondrocytes Ultrasound Med Biol 200531(12)1713-21
47 Park K Hoffmeister B Han DK Hasty K Therapeutic ultrasound effects on
interleukin-1B stimulated cartilage construct in vitro Ultrasound Med Biol
200733(2)286-95
48 Zhou S Schmelz A Seufferlein T Li Y Zhao J Bachem MG Molecular
mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts J
Biol Chem 2004279(52)54463-9
49 Lai J Pittelkow MR Physiological effects of ultrasound mist n fibroblast Int J
Dermatol 200746587-93
50 Hill GE Fenwick S Matthews BJ Chivers RA Southgate J The effect of
low-intensity pulsed ultrasound on repair of epithelial cell monolayers in
vitro Ultrasound Med Biol 200531(12)1701-6
51 Mizrahi N Seliktar D Kimmel E Ultrasound-induced angiogenic response in
endothelial cells Ultrasound Med Biol 2007 33(11)1818-29
52 Ikeda K Takayama T Suzuki N Shimada K Otsuka K Ito K Effects of low-
intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells Life Sci
200679(20)1936-43
53 Amack JD Mahadevan MS The myotonic dystrophy expanded CUG repeat
tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast
differentiation Hum Mol Genet 200110(8)1879-87
54 Yoshiko Y Hirao K Maeda N Differentiation in C2C12 myoblasts depends
on the expression of endogenous IGFs and not serum depletion Am J
Physiol Cell Physiol 2002283(4)C1278-86
55 Lee MH Jang MH Kim EK Han SW Cho SY Nitric Oxide induces
apoptosis in mouse C2C12 myoblast cells J Pharmacol Sci 200597369-76
56 Ferrari RAM Influecircncia da desintegrina Alternagina-C isolada do veneno de
Bobothrops Alternatus em cultura primaacuteria de mioblastos [dissertaccedilatildeo] Satildeo
Carlos (SP) Univ Federal de Satildeo Carlos 2007
57 Jaumlrvinen TAH Jaumlrvinen TLN Kaumlaumlriaumlinen M Kalimo H Jaumlrvinen M Muscle
Injuries Biology and Treatment Am J Sports Med 200533(5)745-64
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
57
APEcircNDICE
Representaccedilatildeo fotograacutefica do aparato para a aplicaccedilatildeo do US
(Sonomaster Microcontrolled Comunicator KW Eletrocircnica Amparo
SPBrasil) terapecircutico na cultura celular
58
ANEXO
Submissatildeo de artigo para publicaccedilatildeo agrave Brazilian Journal of Medical and
Biological Research