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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
TIAGO DE MORAES LENZ
DESENVOLVIMENTO DE POLVOS OCTOPUS SPP. DURANTE A FASE
PLANCTÔNICA: SUBSÍDIOS PARA O CULTIVO
PONTAL DO PARANÁ
2015
TIAGO DE MORAES LENZ
DESENVOLVIMENTO DE POLVOS OCTOPUS SPP. DURANTE A FASE
PLANCTÔNICA: SUBSÍDIOS PARA O CULTIVO
Tese apresentada como requisito parcial para a
obtenção do grau de Doutor em Sistemas Costeiros
e Oceânicos. Curso de Pós-Graduação em Sistemas
Costeiros e Oceânicos, Centro de Estudos do Mar,
Setor de Ciências da Terra, Universidade Federal
do Paraná.
Orientador: Dra. Érica Alves González Vidal
Linha de pesquisa: Biologia e Ecologia dos Sistemas Costeiros e Oceânicos
PONTAL DO PARANÁ
2015
C u r s o d e P ó s -g r a d u a ç ã o em S i s t e m a s
C o s t e i r o s e O c e â n i c o sCentro de Estudos do Mar - Setor Ciências da Terra - UFPRAvn. Beira-mar, s/n° - Pontal do Sul - Pontal do Paraná - Paraná - Brasil Tel. (41) 3511*8644 - Fax (41) 3511*8648 - www.cem.ufpr.br - E-mail: pgsisco@ufpr.br
TERMO DE APROVAÇÃO
Tiago de Moraes Lenz
DESENVOLVIMENTO DE POLVOS OCTOPUS SP. DURANTE A FASE PLANCTÔNICA: SUBSÍDIOS PARA O CULTIVO
Tese aprovada como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor(a) em Sistemas Costeiros e Oceânicos, da Universidade Federal do Paraná, pela
Comissão formada pelos professores:
Dr. Ac^Cio Ribeira Gomes Tomás (Insituto de Pesca-SP)
Membro Examinador
Dr. TeoHòrÓVaske Júnior (UNESP)
Membro
DireafísTÍduardo Belz (UFPR/CEM)
Membro Examinador
J2 /
Dra. Terèzmha Absher (UFPR/CEM)
Membro Examinador
Dra. Érica Alves Gonzáles Vidai (UFPR/CEM)
Orientadora (afastada oficialmente)
Pontal do Paraná, 27/03/2015.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Dra. Érica Vidal que me deu a oportunidade de estudar o fantástico
mundo dos cefalópodes.
Aos corajosos companheiros do Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia
Marinha Experimental (LaCCef), Gustavo, Daphne, Nathália, Rita, Juliana, Paulo,
Fabrício e Marcelo.
Às Dra Cármen Évora, Aracelli Delgado e Maria Évora Rodriguez, além do Dr. Carlos
todos do Departamento de Farmácia da Universidade de La Laguna em Tenerife na
Espanha, pela paciência em transmitir os procedimentos técnicos e pela alegria no
convívio diário.
Ao Instituto Espanhol Oceanográfico de Canárias, em especial ao Dr. Eduardo
Almansa, Diego Lorenzo, Ullises, Diana Reis, Salvador Herrera, Beatriz Paramio,
Virgínia Martin, Catalina Raya, Luís Alberto e toda a equipe de apoio.
Ao professor Dr. Luís Fernando Fávaro e todos os amigos que fiz no Laboratório de
Reprodução de Peixes da Universidade Federal do Paraná. A Dra Gisela Westphal e Dr.
Antonio Ostrensky por ceder o laboratório de histologia.
Ao CAMAR através do Dr. Ubiratã e do companheiro Jorge que estiveram sempre
solícitos em ajudar na captação da água e outras pequenas necessidades emergenciais.
A todos os que se envolveram nas capturas de reprodutores de polvo, sem os quais este
trabalho não seria possível. Gustavo, Betão, Zé Hugo, Iroshi, Abraão, Tatiana, além dos
motoristas Agnaldo e Fumaça e dos seguranças Marcos, Cláudio, Adílson e Eduardo
que davam sempre uma força quando necessário.
Ao PGSisCO por compor a minha formação, trazendo conhecimentos da Oceanografia
que ampliaram a minha visão à outras perspectivas.
À CAPES pelo apoio na concessão da bolsa de Doutorado Sanduíche no Exterior e de
doutoramento viabilizando a realização deste trabalho.
À minha esposa que me acompanhou bravamente nesta longa jornada.
À minha mãe que é o alicerce do cidadão que sou hoje.
Ao privilégio de viver tudo que hei vivido.
RESUMO
Os polvos tem despertado crescente interesse para a aquicultura mundial devido à sua
boa adaptabilidade ao cativeiro, à aceitação de alimento congelado, altas taxas de
crescimento e de conversão alimentar, além de elevados preços de mercado. No entanto,
a baixa sobrevivência na fase paralarval é atualmente o principal gargalo para o
desenvolvimento do cultivo integral em nível comercial. Este estudo foi realizado nesta
fase crítica e buscou descrever aspectos gerais do desenvolvimento embrionário e das
paralarvas de uma espécie recém-descrita de polvo (Octopus insularis), avaliar o efeito
de variáveis ambientais (disponibilidade de alimento) sobre o conteúdo de vitelo e o
potencial de sobrevivência de paralarvas do polvo comum (Octopus vulgaris) após a
eclosão. Objetivou também, observar pela histologia as mudanças teciduais e
morfológicas no trato digestivo decorrentes da primeira alimentação e do
desenvolvimento planctônico, além de avaliar o crescimento e a sobrevivência de
paralarvas de O. vulgaris durante o inicio da fase planctônica, com a oferta de dieta
inerte encapsulada com quitosano e enriquecida com fluoesferas como marcadores de
ingestão. Este trabalho visa contribuir com informações que auxiliem no aprimoramento
do cultivo de polvos na fase planctônica.
Palavras-chave: Octopus, ovos, paralarvas, vitelo, quitosano, marcador de ingestão.
ABSTRACT
The octopus has aroused the interest for world aquaculture, due to its good adaptability
to captivity, the acceptance of frozen food, high growth rates and feed conversion, and
high market prices. However, the low survival is currently in phase paralarval main
bottleneck for the development of full-cultivation on a commercial level. This study was
conducted in this critical phase and sought to describe general aspects of embryonic
development and paralarvae of a newly described species of octopus (Octopus
insularis), and also evaluate the effect of environmental variables (food availability) on
the yolk contents and the potential paralarvae of survival of the common octopus
hatchling (Octopus vulgaris). Aimed also observe through the tissue histology and
morphologic changes in the digestive tract resulting from the first feeding and
planktonic development, and to evaluate the growth and O. vulgaris paralarvae survival
during early planktonic phase with the diet offer inert encapsulated with chitosan and
enriched with fluospheres as intake markers. The results of these findings will
contribute information for the efforts to improve the octopus cultivation in planktonic
phase.
Key words: Octopus, eggs, paralarvae, yolk, chitosan, intake marker.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 7
OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 12
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 12
HIPÓTESES.............................................................................................................. 13
LOCAL DE ESTUDO............................................................................................... 13
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 15
CAPÍTULO I - First description of the eggs and paralarvae of the tropical octopus
(Octopus insularis) under culture conditions ............................................................23
CAPÍTULO II - Mudanças teciduais no trato digestivo de Octopus vulgaris durante
a fase planctônica: influência do vitelo e da disponibilidade de alimento ...............51
CAPÍTULO III - Efeito da micro-encapsulação de dietas alimentares com
quitosano no crescimento e sobrevivência de paralarvas do polvo comum (Octopus
vulgaris) utilizando marcadores de ingestão ............................................................78
CONCLUSÕES .........................................................................................................98
7
INTRODUÇÃO GERAL
A pesca extrativista mundial se mantém estagnada em relação à sua produção e
mesmo o aumento no esforço de pesca aliado às inovações tecnológicas no setor, não
tem sido suficientes para aumentar a produção. A produção pesqueira mundial manteve-
se em torno de 150 milhões de ton/ano na última década, tendo a aquicultura importante
contribuição na produção. De acordo com dados da FAO (2014), a aquicultura tem
alcançado aproximadamente 43% do total de pescados produzidos no planeta, com 66
milhões de toneladas produzidos em 2012.
O Brasil, apesar de possuir grande potencial para a produção de pescados em
cativeiro, apresenta lento desenvolvimento, tendo sua produção estimada em 272 mil
toneladas (IBAMA, 2006). A aquicultura brasileira ainda se baseia em um pequeno
número de espécies, em sua maioria espécies exóticas. As ostras do Pacífico
Crassostrea gigas (Thundberg, 1795), os camarões-brancos Litopenaeus vannamei
(Boone, 1931) e as tilápias Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) são as principais
espécies cultivadas (CAMARGO & POUEY, 2005; BALDISSEROTTO, 2009).
O país possui uma enorme diversidade de organismos nativos com grande
potencial para a aquicultura, fato que, além de diversificar os produtos da aquicultura
nacional, podem contribuir para sua maior aceitabilidade em diversas regiões. Nesse
contexto, uma das principais tendências globais da aquicultura é a necessidade de
diversificação das espécies cultivadas, merecendo especial ênfase as espécies marinhas
de alto valor comercial e com mercado consolidado. Dentre os organismos com maior
potencial destacam-se os polvos, com elevado valor comercial e ampla aceitabilidade
nos mercados internacionais (GLOBEFISH, 2009).
Os polvos habitam diversos tipos de substrato, desde recifes de corais a
substratos rochosos e arenosos (GUERRA, 1981; LEITE & MATHER, 2008) em
profundidades de até 200m. São predadores visuais que se alimentam principalmente de
poliquetas, crustáceos, moluscos e peixes, podendo ainda ser observado o canibalismo
(GUERRA, 1978; GÍMENEZ & GARCÍA-GARCÍA, 2002; IBAÑEZ & KEYL, 2010).
Possuem a capacidade de mudar de cor e a textura da pele em perfeita sintonia com o
entorno, se camuflando dos predadores e auxiliando na estratégia de captura de presas.
Animal solitário e territorialista apresentam migrações estacionais principalmente
quando se aproxima a época de reprodução (SEIXAS, 2009). Seu ciclo de vida é
8
relativamente curto, sendo de um a dois anos no meio natural (MANGOLD &
BOLETZKY, 1973; HATANAKA, 1979; SMALE & BUCHAN, 1981; DOMAIN et al.
2000). Os machos apresentam maior longevidade do que as fêmeas, tendo em vista que
elas morrem logo após o período de incubação dos ovos (SEIXAS, 2009).
Dentre os moluscos cefalópodes mais bem estudados está o polvo comum
(Octopus vulgaris CUVIER, 1797), objeto de estudos no campo da neurobiologia,
fisiologia, bioquímica, e comportamento animal (YOUNG, 1971; WELLS, 1978;
BOYLE, 1983), que tem distribuição cosmopolita desde as zonas tropicais até águas
temperadas e no Brasil é encontrada em praticamente toda a costa (JEREB et al. 2014).
Apresentando características similares ao polvo comum, o Octopus insularis
(LEITE & HAIMOVICI, 2008), é uma espécie predominante em águas rasas e quentes
das ilhas tropicais oceânicas e ao longo da costa nordeste do Brasil (LEITE et al. 2010).
Espécie de porte médio é o principal alvo da pesca de cefalópodes em águas rasa
tropicais no nordeste do Brasil (LEITE et al. 2008), no entanto há poucos estudos sobre
a biologia e ecologia desta espécie (LEITE, 2007), já que anteriormente a espécie era
confundida com Octopus vulgaris. Apenas recentemente, através de diferenças
genéticas e morfológicas, houve a diferenciação da nova espécie (LEITE et al. 2008;
LEITE & MATHER, 2008).
Nas últimas décadas, os polvos tem despertado crescente interesse para a
aquicultura mundial, devido à sua boa adaptabilidade ao cativeiro, à aceitação de
alimento congelado, altas taxas de crescimento e de conversão alimentar e elevados
preços de mercado (GARCÍA-GARCÍA & AGUADO, 2002; IGLESIAS et al. 1999;
IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004). Vários estudos têm demonstrado que o
Octopus vulgaris pode chegar ao peso de comercialização (± 3 kg) a partir de um peso
médio inicial de 700 g em apenas 3 ou 4 meses (GARCÍA-GARCÍA & VALVERDE,
2004, GARCÍA-GARCÍA & CEREZO, 2006). As taxas de crescimento obtidas variam
de 0,5 a 1,0 kg por polvo ao mês e são realmente expressivas, uma vez que
pouquíssimas espécies cultiváveis atingem um crescimento semelhante.
Vários estudos têm avaliado a biologia e o ciclo de vida da espécie em cativeiro,
com o objetivo de aplicar estes conhecimentos no cultivo integral e comercial
(IMAMURA, 1990; HAMAZAKI et al. 1991; IGLESIAS et al. 1999; GARCÍA-
GARCÍA & VALVERDE, 2004; IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004;
IGLESIAS et al. 2007; DELGADO et al. 2011; VIDAL et al. 2014).
9
Segundo Vaz-Pires et al. (2004) para que o cultivo da espécie alcance o nível
industrial é necessário padronizar os métodos de larvicultura. A baixa sobrevivência
somada ao baixo crescimento na fase paralarval é atualmente o gargalo tecnológico para
se fechar o ciclo de vida do polvo comum (IGLESIAS et al. 1999; IGLESIAS et al.
2004).
Até o momento, pesquisas sobre a larvicultura de polvos tiveram como foco
principal a sobrevivência e o crescimento das paralarvas, além dos seus requerimentos
nutricionais (VILLANUEVA, 1994; 1995; NAVARRO & VILLANUEVA, 2000; 2003;
VILLANUEVA et al. 2002; IGLESIAS et al. 2002; 2004; VILLANUEVA &
BUSTAMANTE, 2006). Porém, pouca atenção foi destinada aos fatores que afetam o
desenvolvimento do embrião e as taxas de absorção do vitelo, ou seja, que determinam a
qualidade das paralarvas para a larvicultura.
Após a eclosão as paralarvas são planctônicas vivendo à deriva até o momento
do assentamento (NIXON, 1985; IGLESIAS et al. 2004; IGLESIAS et al. 2007). Nos
primeiros dias após a eclosão, as paralarvas combinam alimentação endógena (absorção
do vitelo) com exógena (captura de presas), para manutenção das suas altas taxas
metabólicas nesta fase da vida (VIDAL et al. 2002; 2005). A reserva vitelínica suporta
o metabolismo das paralarvas quando estas, todavia estão desenvolvendo suas
habilidades para capturar presas. No entanto, a energia contida no vitelo não dura por
longo período e as paralarvas devem rapidamente capturar alimento para manter seus
requerimentos metabólicos. Este fato pode explicar por que as paralarvas iniciam
alimentação exógena antes da completa depleção da reserva vitelínica (VIDAL et al.
2002; 2005).
Ao eclodirem as paralarvas podem ou não encontrar alimento em abundância,
fato que possivelmente irá afetar as taxas de crescimento. Diversos autores sugerem que
a transição entre a utilização do vitelo e a captura de presas ativas representa um
período crítico no ciclo de vida dos cefalópodes (BOLETZKY, 1987; VECCHIONE,
1987; IMAMURA, 1990; VIDAL & HAIMOVICI, 1998; IGLESIAS et al. 2000;
VIDAL et al. 2002; IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004). No entanto, não
há até o momento, estudos que descrevam as alterações progressivas que ocorrem em
nível de tecidos ou órgãos durante a absorção do vitelo na presença e na ausência de
alimento durante os primeiros dias de vida.
Outro momento delicado durante a larvicultura de polvo e a composição
nutricional do alimento ofertando durante a fase planctônica (VIDAL et al. 2014). A
10
artêmia por ser um crustáceo fácil de produzir e sua composição bioquímica poder ser
manipulada através de enriquecimento é o principal alimento ofertado na fase inicial de
vida de muitos organismos aquáticos cultivados (SEIXAS, 2009). Villanueva et al.
(2002) conclui que durante os primeiros dias de vida das paralarva a artêmia
enriquecida é um bom alimento, no entanto após os 14 dias, esta parece não suprir as
necessidades das paralarvas, resultados enfatizados por Seixas et al. (2010). A utilização
de zoeas de crustáceos como dieta complementar seria uma boa alternativa para oferecer
os nutrientes requeridos pelas paralarvas, já que foi utilizada com sucesso por Iglesias et
al. (1997), quando estes conseguiram fechar integralmente o cultivo de polvos em todos
os seus estágios de desenvolvimento. No entanto, há uma grande dificuldade em
conseguir produzir zoeas em quantidades suficientes e no momento preciso para suprir
as necessidades até o final da fase planctônica (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000;
IGLESIAS et al. 2007).
O uso de dietas artificiais com a composição nutricional específica para cada
estágio de vida é uma forma de substituir o uso de alimento vivo, abaixando
relativamente os custos de produção (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000). Algumas
tentativas de uso de dietas formuladas para paralarvas de polvo não obtiveram bons
resultados (NAVARRO & VILLANUEVA, 2000; VILLANUEVA et al. 2002), pois
não apresentaram crescimento e sobrevivência diferenciados quando comparado a
paralarvas alimentadas com artêmia enriquecida. Segundo Villanueva et al. (2002),
esses resultados podem indicar desnutrição induzida pela formulação inadequada da
microdieta.
As paralarvas necessitam alimentos ricos em ácidos graxos polinsaturados
(PUFA), fosfolipídios e colesterol, assim como a presença lipídios neutros (NAVARRO
& VILLANUEVA, 2000). A relação proteína/lipídios na dieta parece ser mais
importante que a quantidade de ácidos graxos altamente insaturados (HUFA) para a
sobrevivência e crescimento da paralarvas (SEIXAS et al. 2010). No entanto, outros
aspectos devem ser considerados para o desenvolvimento de dietas artificiais, dentre
eles podemos destacar: a cor, forma tamanho, movimento na água, além do estímulo
olfativo (KOLKOVSKI, 2008). Os polvos são reconhecidamente predadores visuais
(VILLANUEVA & NORMAN, 2008), no entanto outros fatores químicos ainda pouco
conhecidos podem influenciar na seleção e ingestão de presas (VILLANUEVA, 1995).
Alguns trabalhos buscaram testar o uso de dietas artificiais com paralarvas de
cefalópodes (CASTRO et al. 1993; IGLESIAS et al. 2000; NAVARRO &
11
VILLANUEVA, 2000; VILLANUEVA et al. 2002; SEIXAS et al. 2010). Os autores
observaram a captura e ingestão das partículas, no entanto, quando avaliado o
crescimento e sobrevivência não se observou melhores índices quando comparadas às
alimentadas com presas vivas. A busca por formas de elaboração de partículas que
aumentem a ingestão da dieta e concomitantemente supram as necessidades nutricionais
das formas jovens são essenciais para tornar cultivo de polvos viável economicamente
(IGLESIAS et al. 2007).
Devido a sua composição natural, biocompatibilidade, não toxidade, habilidade
de adsorção e propriedade antimicrobiana o quitosano vem sendo utilizado para
encapsular ingredientes ativos na indústria farmacêutica (RAVI-KUMAR, 2000;
MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2005; KONG et al. 2010), alimentícia (DUTTA et
al. 2009), além de estudado o seu uso como coagulante no tratamento de efluentes
orgânicos (BOUGH, 1976; CHENG et al. 2005) e na formação de fibra sintética
(RINAUDO, 2006; PILLAI et al. 2009). Por ser um produto extraído da carapaça de
caranguejos e camarões (JOHNSON & PENISTON, 1982; RINAUDO, 2006; AL
SAGHEER et al. 2009), sendo o primeiro uma das principais fontes de alimentação dos
polvos em fase adulta, o quitosano pode ser um interessante aglutinante alimentar tanto
para polvos como também para peixes, tendo em vista que se pode manipular os
ingredientes encapsulados de acordo com a necessidade alimentar do organismo e seu
estágio de desenvolvimento.
Quando se testa uma dieta inerte com uma co-alimentação com presas vivas, há
a dificuldade de saber qual alimento foi realmente ingerido, já que muitas vezes pela
coloração do trato digestivo não é possível fazer uma distinção segura. O uso de
marcadores de ingestão é uma interessante ferramenta que pode ser utilizada para
avaliar a seleção e ingestão de partículas alimentares. O uso de microesferas
fluorescentes avançou principalmente no campo de administração de medicamentos,
terapia e investigação genética, marcação molecular e métodos de detecção óptica,
desencadeando um grande avanço nestas áreas do conhecimento (BORM et al. 2006). O
uso de microesferas permite avaliar a seleção e ingestão de presas através de
ferramentas relativamente simples, como o uso de microscópio de fluorescência ou um
espectrofotômetro de fluxo, método este que já foi testado em larvas de peixes marinhos
(HANSEN et al. 2009) e pode ser adaptado ao estudo de diferentes organismos
cultivados.
12
Neste contexto, o presente estudo abordou aspectos reprodutivos de uma nova
espécie nativa de polvo, como também aspectos relacionados à digestão na fase pós-
eclosão em uma espécie nativa de polvo já conhecida. Esta tese está formatada
conforme modelo exigido pelo Programa de Pós-Graduação em Sistemas Costeiros e
Oceânicos (PGSisCO) da Universidade Federal do Paraná, sendo apresentada na forma
de três artigos, antecedidos de uma Introdução Geral e procedidos das Conclusões
Finais. O primeiro artigo está em inglês e formatado nas normas da revista American
Mallacologial Bulletin, de acordo com as exigências do PGSisCO, que visa acelerar o
processo de publicação.
OBJETIVO GERAL
Este estudo tem como objetivo descrever aspectos gerais do desenvolvimento
embrionário e as paralarvas de uma espécie recém-descrita de polvo (Octopus
insularis). Também, avaliar o efeito de variáveis ambientais (disponibilidade de
alimento) sobre o vitelo e o potencial de sobrevivência de paralarvas do polvo comum
(Octopus vulgaris) e, ainda descrever mudanças teciduais e morfológicas no trato
digestivo decorrentes da primeira alimentação e durante a fase planctônica, além de
avaliar o crescimento e a sobrevivência de paralarvas de O. vulgaris durante o inicio da
fase planctônica, as quais foram alimentadas com dieta inerte elaborada com quitosano
e marcadas com microesferas fluorescentes.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
· Descrever o desenvolvimento embrionário, ovos e as paralarvas de Octopus
insularis através da manutenção de reprodutores em laboratório;
· Avaliar a influência da disponibilidade de alimento na fase pós-embrionária do
polvo comum em laboratório no que se refere às taxas de crescimento, potencial
de sobrevivência e às taxas de absorção do vitelo;
13
· Descrever ao longo da ontogenia as alterações celulares e teciduais na glândula
digestiva durante a transição alimentar endógena e exógena, para a alimentação
puramente exógena nas paralarvas de Octopus vulgaris;
· Comprovar a viabilidade do uso de fluoesferas como marcadores de ingestão em
paralarvas de polvo;
· Avaliar a influência da dieta inerte no crescimento e sobrevivência das
paralarvas de Octopus vulgaris durante o inicio da larvicultura.
HIPÓTESES
· Devido às espécies O. insularis e O. vulgaris possuírem similaridades
morfológicas, espera-se que ambas espécies tenham também modo de
desenvolvimento similar, produzam uma grande quantidade de ovos e
apresentem paralarvas planctônicas;
· Se a ausência de alimento influencia no consumo de vitelo, espera-se que a
quantidade de vitelo seja menor nas paralarvas em inanição;
· Se ao eclodir as paralarvas possuem a glândula digestiva funcional, então
espera-se encontrar os mesmos tipos celulares durante toda a sua cronologia
ontogenética;
· Se as paralarvas assimilam a dieta inerte, espera-se encontrar marcadores de
ingestão em seu trato digestivo;
· Se a dieta elaborada com quitosano é adequada para o a primeira alimentação
das paralarvas, espera-se que paralarvas alimentadas com esta dieta e artêmias
enriquecidas tenham maior crescimento e sobrevivência que aquelas alimentadas
somente com artêmia enriquecida.
LOCAL DE ESTUDO
Este estudo foi realizado no Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia
Marinha Experimental (LaCCef) do Centro de Estudos do Mar (CEM) na Universidade
14
Federal do Paraná, localizados no município de Pontal do Paraná no Estado do Paraná.
Os reprodutores de Octopus insularis foram capturados no município de Rio do Fogo no
Estado do Rio Grande do Norte e trazidos para o LaCCef por via aérea. Os reprodutores
de Octopus vulgaris foram capturados na desembocadura do Complexo Estuarino de
Paranaguá no litoral paranaense e no município de Bombinhas no Estado de Santa
Catarina através de mergulho livre e autônomo. O processamento histológico foi
realizado no Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes da Universidade
Federal do Paraná no município de Curitiba sob orientação do professor Dr. Luís
Fernando Fávaro. O experimento com dieta inerte micro-encapsulada com quitosano
para alimentação de paralarvas de Octopus vulgaris e suas análises, foram realizados no
Instituto Espanhol Oceanográfico (IEO) e no Departamento de Farmácia da
Universidade de La Laguna localizados em Tenerife, Ilhas Canárias, Espanha, orientado
pelo Dr. Eduardo Almansa.
15
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23
Capítulo I - FIRST DESCRIPTION OF THE EGGS AND PARALARVAE OF THE TROPICAL OCTOPUS (OCTOPUS INSULARIS) UNDER CULTURE
CONDITIONS*
DESCRIPTION OF EGGS AND PARALARVAE OF OCTOPUS INSULARIS
Tiago M. Lenz1, Nathalia H. Elias1, Tatiana S. Leite2, Erica A. G Vidal1*
1Centro de Estudos do Mar, Universidade Federal do Paraná, Pontal do Paraná, PR, Brazil.
tiagopesca@hotmail.com, naths.he@gmail.com, ericavidal2000@yahoo.com.br
2Dept. Oceanografia e Limnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN, Natal, Brazil. leite_ts@yahoo.com.br
Corresponding author EAG Vidal: ericavidal2000@yahoo.com.br
Keywords: cephalopod, chromatophore, embryonic development, fecundity, Octopus
*No prelo. American Malacological Bulletin, 2015.
24
ABSTRACT
Octopus insularis (Leite and Haimovici 2008) occurs in a wide region of the tropical
Atlantic, inhabiting shallow waters along the coast and oceanic islands of northeastern
Brazil, where it is considered the primary target of octopus fisheries. This species is
only recently described, and detailed information about its spawning, eggs, and
paralarvae is unknown. The objective of this study was to estimate the fecundity,
describe the eggs and paralarvae and the duration of embryonic development under
culture conditions. Broodstock (3 females and 1 male) were captured and transported to
the laboratory, where they were acclimated in a closed recirculation water system at
26°C and 32 salinity. Eggs were obtained from 2 spawning females; 30 eggs were
sampled 1 day after spawning and 1 day prior to the first hatching day, and their length
and diameter were measured. Embryonic development was monitored every three days
through the sample of 30 eggs. Fecundity was estimated. The duration of embryonic
development lasted from 30-38 days and fecundity was 85,000 eggs per female. The
length and width of the eggs on the first day after spawning were 2.13±0.06 mm and
0.82±0.04 mm, respectively, and were 2.29±0.06 mm and 0.92±0.03 mm, respectively,
one day before hatching. The newly hatched paralarvae exhibit 3 suckers per arm and a
mean mantle length of 1.682 ± 0.133 mm. The chromatophore pattern of paralarvae is
conspicuous, with a total of ~90-111 chromatophores. A total of 32-40 and 56-69
chromatophores were found on the dorsal and ventral view, respectively. These results
are of essential importance for identifying the eggs and paralarvae of Octopus insularis
and in broadening our knowledge of this species.
25
INTRODUCTION
Octopus insularis Leite and Haimovici 2008 is a medium-sized octopus and is
the principal commercial cephalopod species around the tropical oceanic islands of
Brazil and along the country’s northeastern coast. O. insularis shows distinct
morphological characteristics from its congener Octopus vulgaris Cuvier, 1797,
including short and stout arms, mantle, and head with large reddish-brown rough skin
(Leite et al. 2008). A recent study also described distinct reproductive features, such as
relatively smaller gonads, lower absolute and relative fecundity in the ovary, year round
production and release of spermatophores and group-synchronous ovulation (Lima et al.
2014). This species occurs throughout the year in shallow waters, where it is the focus
of artisanal fisheries (Lima et al. 2013.), and is usually found in rocky and reef habitats,
where it feeds primarily on crustaceans, bivalves, and gastropods and, less frequently,
on cephalopods and fish (Leite, Haimovic and Mather et al. 2009, Bouth et al. 2011).
Several studies have sought to understand aspects of the biology and ecology of
Octopus insularis by focusing primarily on adults and juveniles (Leite, Haimovic and
Mather 2009, Leite, Haimovic and Mather et al. 2009, Bouth et al. 2011, Lima et al.
2013). However, as it was not previously distinguished from O. vulgaris complex, only
recently described as a new species, there is virtually no information on the early life
stages of O. insularis.
Knowledge on early life stages is required for a better understanding of life
cycles, ecology and the sustainable management of stocks (Rodhouse et al. 1992,
Sweeney et al. 1992). Besides, information on the morphology and distribution of early
26
stages of cephalopods is of crucial importance for discriminating populations and
identifying species (Young 1989, Hochberg et al. 1992, Vidal et al. 2010).
Benthic, littoral octopuses species produce a small number of eggs, i.e., Octopus
joubini Robson, 1929 (<100 eggs) (Hanlon 1983), whereas others may produce several
hundred thousand eggs, e.g, O. vulgaris (100,000-500,000 eggs) (Mangold 1983,
Iglesias et al. 1997) and O. maorum Hutton, 1880 (>50,000 eggs) (Grubert and Wadley
2000). High fecundity species produce small eggs that hatch into planktonic paralarvae.
Lower fecundity species produce relatively few large eggs, resulting in more highly
developed benthic hatchlings that resemble the adult (Villanueva and Norman 2008). Ré
(1998) has suggested that fecundity depends on the weight of females, and Osborn
(1995) has stated that, on an absolute basis, larger females laid more festoons containing
a greater density of eggs. This author also suggested that the maintenance of females
under optimal laboratory conditions may increase the amount of energy available for
egg production and may ultimately increase fecundity.
The temperature is the principal factor controlled in laboratory conditions and
had direct influence in metabolism of the embryo and newly hatched. Embryonic
development in cephalopods is inversely related to water temperature (Mangold and
Boletzky 1973, Boletzky 1974). In fact, temperature is known to affect all metabolic
processes, such as respiration, excretion, yolk utilization, and consequently,
developmental time (Bouchaud 1991, Caverivièrie et al. 1999, Vidal et al. 2002).
Octopus paralarvae are delicate, have short arms with few suckers and limited
swimming ability (Villanueva and Norman 2008). Paralarvae have primarily been
described based on their chromatophore pattern, as the number and distribution of
chromatophores on the skin are species specific. Indeed, the chromatophore pattern is
27
conservative and can be used as a reliable taxonomic characteristic to identify paralarval
cephalopods (Young et al. 1989, Hochberg et al. 1992).
There is no available information on the embryonic and post-embryonic
development of Octopus insularis. Furthermore, maintenance under laboratory
conditions has not previously been accomplished but can potentially provide rich
information on embryonic development and morphological features of eggs and
hatchlings. This knowledge may help to examine such important features as
reproductive behavior in captivity, number of eggs laid, egg length, and embryonic
developmental times.
Due to the morphological similarity between O. insularis and O. vulgaris, we
aim to investigate the hypothesis that these species have a similar mode of development;
producing a large number of eggs and planktonic paralarvae. Therefore, the objectives
of this study describe, for the first time, the eggs, egg masses, fecundity, and newly
hatched paralarvae of O. insularis.
MATERIALS AND METHODS
Broodstock collection and maintenance
Broodstock (3 females and 1 male) were captured by scuba diving at a depth of
7-9 m along the coast of Rio Grande do Norte State (5°16 'S, 35°18' W) on 25 October
2011 and maintained for four days at the Technological Center of Aquaculture, at the
University of Rio Grande do Norte. After this previous acclimation, the animals were
air-freighted in their original seawater to the Laboratory of Cephalopod Culture and
Experimental Marine Ecology at the University of Paraná in southern Brazil. The
transportation time was approximately 10 h. Upon arrival, the octopuses were weighed
28
individually (male – 1,340 g; females – 1,630 g, 1,680 g and 1,810 g) and acclimatized
to a closed recirculation water system at 26±1°C and 32±1 salinity. The recirculation
system consisted of 3 culture tanks, 2 rectangular tanks (1.60 m length x 0.40 m height
x 0.30 m width – 192 L; 0.69 m length x 0.51 m height x 0.30 m width – 106 L) and 1
circular tank (superior edge diameter of 1.22 m, inferior opening diameter of 0.96 m,
height of 0.58 m – 300 L utilized), all connected to a biofilter (1.80 m length x 0.60 m
height x 0.30 m width – 325 L). The system was connected to a 13 W ultra-violet filter,
and two PVC shelters (30 cm length x 10 cm diameter) were offered per animal.
The broodstock diet consisted of live prey: blue crab (Callinectes sapidus,
Rathbun 1869), oyster (Crassostrea sp. Sacco, 1897), and mussels (Perna perna,
Linnaeus 1758). The shells and tissues not ingested were rapidly removed from the
tanks to ensure the maintenance of water quality. Broodstock were initially fed live
crabs only at night. After capturing the food, the octopuses brought it into the shelters
and then discarded only the remains. After 4 days, the octopuses became accustomed to
feeding by handlers during the day and were able to capture defrosted fish. The sardine,
Sardinella brasiliensis (Steindachner, 1879) was provided as food to the octopuses at a
ratio of one sardine per octopus per day; live crabs were offered at a ratio of one crab
octopus-1 day-1. Every day, the tanks were cleaned and siphoned to remove particulate
matter, food waste, and the excreta of the animals. Partial exchanges of water (20%
daily) were performed to reduce the nitrate levels and replenish the water removed by
cleaning. Measurements of physical and chemical parameters (salinity, temperature, pH,
and nitrogen compounds- nitrite, nitrate and ammonia) were performed daily.
Copulation, breeding, egg laying, fecundity, and embryonic development
29
Breeding was conducted in three tanks. With one male and three females as
breeding stock, it was necessary to rotate the male among the three tanks to ensure that
mating occurred with all the females. The male was observed to copulate with all the
female soon after it was place in the same tank.
During copulation male inserted the hectocotized arm (3rd right arm) inside the
mantle cavity of the female and copulation was observed to lasted around 20-30 min.
There were no fights between the octopuses, as there was plenty of food and shelter, but
the octopus were always positioned in front of their dens as if they were protecting their
shelters.
Twenty-six days after arrival at the laboratory, spawning was confirmed, when the
first clusters of eggs were observed on 21/11/2011. On November 28, another female
spawned and more eggs were seen in another tank. Spawning lasted for several days.
Fecundity was estimated by counting the total number of eggs in three clusters of
strings (the mean number of strings per cluster and mean number of eggs per cm of
string was obtained; the length of all strings was measured to estimate the total number
of eggs spawned per female).
Embryonic development was monitored using the eggs obtained from one of the
females. One day after spawning and one day prior to the first hatching day, 30 eggs
were sampled for image acquisition using a compound microscope attached to a high-
resolution, computer-based video system. The eggs were collected and immediately
photographed in a large Petri dish to ensure that they retained their natural
characteristics. Measurements were obtained using public domain NIH-Image software.
The eggs length and diameter were obtained by image analysis. The developmental
stages were based on the scale proposed by Naef (1928).
30
Description of morphology and chromatophore pattern of paralarvae
A total of 19 newly hatched live paralarvae were randomly sampled from the
rearing tanks, and placed on petri dishes for capture of dorsal, ventral, and side views
digital images with the same procedure used for the eggs. The morphological
description was based on the measurements of the following body dimensions: total
length (TL), mantle length (ML), mantle width (MW), length of the second pair of arms
(A2L), head width (HW), funnel length (FL) eye diameter (ED), and number of suckers
on the arms (Fig. 1) according to Roper and Voss (1983).
Figure 1
After image capture, the paralarvae were fixed in 70% alcohol. Schematic drawings
of the paralarvae were produced to describe the chromatophore pattern. A description of
the chromatophore pattern was performed based on the images taken in the dorsal view
(mantle, head, and arms), ventral view (mantle, funnel, head, and arms), and lateral
view (head, eyes, arms, and funnel) and followed anterior to posterior orientation of the
paralarvae body (Hochberg et al. 1992). For example, for funnel, the pattern 4+2+2
represents 4 chromatophores near the funnel aperture, 2 chromatophores in the median
region, and 2 more chromatophores in the posterior region (funnel base).
RESULTS
Broodstock behavior and spawning
Four days before laying eggs, the females stopped eating. The male fed normally
during this period and was removed from tanks holding brooding females. The egg
strings were attached to the posterior upper wall of the PVC shelter, and the females
31
remained in their dens cleaning, ventilating, and caring for the egg, dying a few days
after all the paralarvae have hatched.
Egg laying, fecundity, and embryonic development
The spawning process lasted approximately 7 days. Fecundity was estimated at
85,000 eggs per female and was most likely 30 % underestimated, as a few egg strings
were lost in the first days after spawning. The length and width of the eggs on the first
day after spawning were 2.13±0.06 mm and 0.82±0.04 mm, respectively, and 2.29±0.06
mm and 0.92±0.03 mm, respectively, one day before hatching.
TABLE 1
The eggs had a prolate ellipsoid-shaped chorion, which was devoid of other
capsules, and a short chorion stalk that was enlarged at the free end (Fig. 2a). Egg
strings of variable size were attached by the oviducal gland to the den wall by female.
The female attached the egg strings to a central axis (Fig. 2b), and was surrounded by
secretions from oviducal glands at the moment of laying, forming strings of a variable
number of eggs. In complete clutch, 108 strings were counted, and the presence of 790
eggs was estimated per string (Table 1). Embryonic development lasted from 30-38
days.
FIGURE 2
Based on the embryonic development stages defined by Naef (1928), cell
division occurred shortly after fecundation; however, the blastodisc was only clearly
visible beginning on the 7th day (stages I-III), resulting in an increase in cell number
(morula). The blastoderm spread by marginal cell division over the uncleaved yolk mass
at this stage, covering 10- 20% of the embryo length between days 7 and 10 (stages IV
and V). The organogenesis followed, which is characterized by the production of organs
32
formed during gastrulation. Prior to early organogenesis, the first inversion of the
embryo was observed on day 19 of embryonic development; however, not all embryos
went through the first inversion (Fig. 3a). Advanced organogenesis was observed on
day 22 corresponded to a (Stages XIII and XIV) and a mean ML of 568 µm (SD±132,
n= 30). Also, eight buds, corresponding to the eight arms, with suckers rudiments of
were observed on the embryo. The eyes pigmented (orange) and the mantle initially
developed to partially cover the gills of the embryo.
On the 25th day of development, the arms were more developed, showing the
three suckers fully formed. Functional chromatophores were distributed on the mantle,
ventral arms, head, and funnel. The mantle was larger in size (mean= 871 µm±260,
n=25) than on the 22nd day. The eyes were larger and more heavily pigmented, but still
reddish in color (stage XV).
An increase in the size of the mantle (mean=1224 µm±131, n=30), funnel, and
arms in relation to the total size of the embryo was observed on the 29th day of
development. Chromatophores were found on the arms, mantle, funnel, and head, and
the eyes were larger and more pigmented showing a brownish retina (XVI and XVII).
The advanced developmental stages (stage XIX) before (Fig. 3b) and after (Fig.
3c) the second inversion of the embryo occurred on day 30-31, indicating the end of
organogenesis. The eyes exhibited a darkish- brown retina and a conspicuous lens, the
ink sac was fully formed, and the mantle and funnel were well developed. No
significant morphological modifications were observed from day 31 to day 38, with
exception of the outer yolk sac that was substantially reduced, accompanied by an
increase in the volume of the inner yolk sac.
FIGURE 3
33
Description of paralarvae and their chromatophore pattern
The mean total length and mantle length of newly-hatched paralarvae was 2.34 ±
0.16 mm and 1.68 ± 0.13 mm, respectively. The funnel (0.49 ± 0.05 mm) was well
developed, occupying almost the entire length of the head in the ventral region. The
arms were short with three well defined suckers of approximately the same diameter.
The eyes had a diameter of 0.31 ± 0.04 mm, with the right and left always identical
(Table 2).
TABLE II
A skin membrane densely surrounded by Kölliker organs covered the head, and
mantle, although it was more prominent on the surface of the mantle. The
chromatophore pattern of paralarvae was described considering the dorsal, ventral and
lateral views as follows. When variability was observed among individuals, the most
frequent number and pattern of chromatophores was listed.
Dorsal view: Mantle: Three to four tegumental chromatophores are distributed at the
mantle edge and another four in the posterior region (Fig. 4a). The number of
extrategumental chromatophores on the central mantle covering the visceral mass was
between six and 11. These chromatophores exhibited an oval shape but were arranged in
the form similar to a "flower" (that is one in the middle and the other eight distributed
around this central chromatophore). Head: A dense arrangement of eight tegumental
chromatophores was present: two between the eyes, four in corresponding middle
position and two other at the central posterior region near the edge of the mantle. The
lateral sides bore one pair of extrategumental chromatophore. Eyes: one chromatophore
over the anterior portion of each eye (Fig. 4a).
FIGURE 4
34
Ventral view: Mantle: Densely covered with tegumental chromatophores; an average of
40 chromatophores (Fig. 4b; Table 3) were distributed into nine rows. The first three
rows were arranged horizontally, while the next six rows were distributed in a spiral
form. Head: two extra large extrategumental chromatophores were always observed and
when expanded, occupied almost the entire surface of the head below the eyes; another
tegumental chromatophore was present between the eyes. Funnel: always contained
eight chromatophores distributed in a standardized manner, four of which were near the
orifice of the funnel (above), two in the middle, and two more at toward the base of the
funnel. Arms: a single row with four to five chromatophores.
Side view: Next to the eyes 2-4 chromatophores were always observed; four on the
funnel and in the mantle, four extrategumental on the viscera and several tegumental
distributed on the mantle.
The chromatophore pattern of O. insularis is very distinctive, with a total of
~90-111 chromatophores. In the dorsal view, from 17 to 25 chromatophores were found
on the mantle (8-11 under the viscera), 9-12 on the head, and 3-4 in a single row on the
arms. In the ventral view, 42-50 chromatophores were found on the mantle, 2-3 large
chromatophores on the head, 4-5 on the arms, 8 on the funnel, and 2-4 around the eyes.
TABLE III
DISCUSSION
Newly laid eggs are immature, and formative cytoplasm is concentrated in a
small spot but increases in size at a later developmental stage, providing ample space
for the mantle sac after the second inversion (Boletzky and Fioroni 1990).
35
Octopus insularis produces small eggs and planktonic paralarvae in accordance
to our hypothesis. The estimated number of 85,000 eggs for female, with a mean total
weight of 1680 g, is comparable to the data found by Lima et al. (2014) who reported
that the number of oocytes in O. insularis ovaries ranged between 68,502 – 120,166,
with average of 93,820. This number is much lower than the fecundity estimated for O.
vulgaris, at 100,000–500,000 eggs per female (Mangold 1983). However, fecundity
seems to be dependent on the weight and size of females at the advanced maturity stage
(Mangold 1983, Ré 1998, Boyle and Rodhouse 2005). Indeed, O. insularis is a smaller
species than O. vulgaris with a shorter life cycle at the tropical environment; thus, it is
expected that the fecundity of O. insularis would be lower. Besides, although the latter
has a gonadal development similar to O. vulgaris, it has relatively smaller gonads, lower
absolute and relative fecundity and year around production and release of
spermatophores (Lima et al. 2014). Furthemore, it was also suggested by these authors
that these reproductive characteristics of O. insularis are related to more predictable
conditions at the tropical environment. Interestingly, this species has recently been also
found at a subtropical estuary in southern Brazil (EAG Vidal, unpublish data), where
environmental conditions are quite variable. Thus, further studies are necessary to
assess the fecundity of O. insularis of different weights from different locations of its
distributional range.
On the first day after spawning the length and width of the eggs of O. insularis
were 2.13±0.06 mm and 0.82±0.04 mm, respectively; thus, being slightly larger than the
eggs of O. vulgaris, which measure 1.8-2.0 mm in length and 1.0 mm in width (Nixon
1985, Mangold 1986, Boletzky and Fioroni 1990). The slightly larger size of the eggs of
O. insularis might indicate longer embryonic developmental time. The duration of the
embryonic development in O. insularis was 30-38 days at 26±1°C. However, the course
36
of development was not identical, with different embryonic stages being observed even
in the same egg string. Caveriviere et al. (1999) found that embryonic developmental
time in O. vulgaris was 15-42 days at an average temperature of 27°C and 29-49 days at
approximately 22-23 °C. On previous experiments, with O. vulgaris females of similar
weight as the O. insularis female of the present study, we have verified an embryonic
developmental time of 20-32 days at an average temperature of 26 °C (unpublished
data).
Embryonic developmental times in cephalopods show an inverse relationship
with temperature (Boletzky 1987), thus higher temperatures will reduce the time to
hatchling. Temperature directly affects almost every aspect of the early life history of
marine larvae, including the hatching time, yolk utilization rate and efficiency, and size
and weight at first feeding (Pechenik 1987, Pechenik 1990, Boidron-Metarion 1995;
Vidal et al. 2002). These physiological responses are due to the domineering effects of
temperature on metabolism. However, the combined effects of temperature and salinity
seem to be also important and deserve further investigation (Vidal and Boletzky 2014).
The embryonic stages observed in O. insularis closely resembled those of O.
vulgaris described by Naef 1928. The first reversal of the embryo inside the chorion
was observed at approximately stage VIII of Naef´s scale and the second inversion at
stage XIX. The first inversion is combined with a regular rotation around the axis of the
egg case (Orelli and Mangold 1961, Boletzky 1971), whereas the second inversion
brings the advanced embryo into a position corresponding to that prior to the first
inversion by a unique dorsal folding movement, to provide ample space for the mantle
after the second inversion prior to hatching (Boletzky and Fioroni 1990).
Octopus insularis hatchlings are planktonic, a characteristics of octopus species
with small oocytes and relatively high fecundity (Hochberg et al. 1992). However, O.
37
insularis hatchlings are slightly smaller than those of O. vulgaris, whose hatchlings
have a TL = ~3.0 mm and an ML=~2.0 mm (Boletzky 1987, Villanueva 1995, Nixon
and Mangold 1996, Villanueva et al. 1996, Vidal et al. 2010). Both species display 3
suckers distributed a single row along the arms, although the arms are shorter in O.
insularis (~0.58 mm) than in O. vulgaris (~0.7 to 1.0 mm) (Villanueva et al. 1996,
Vidal et al. 2010). Adult O. insularis shows negative allometric growth of the arm
length and positive allometric growth of the arm width with mantle length for a size
range of 32-120 mm mantle length (Leite 2007). These characteristics result in
individuals with short and thick arms in comparison to O. vulgaris (Voight 1991), a
difference that facilitates the discrimination of larger specimens of the two species
(Leite et al. 2008). The hatchlings of O. insularis showed a similar pattern to adults,
with the arms length comprising ~ 30% of the TL, in comparison with O. vulgaris
which occupied ~ 45% of the TL (Vidal et al. 2010).
This study showed that the chromatophore pattern of O. insularis paralarvae is quite
conspicuous. A comparison with the chromatophore pattern of O. vulgaris paralarvae
described by Vidal et al. (2010), shows that the principal differences between the two
paralarvae occur in the dorsal mantle and in the ventral view. The dorsal mantle of O.
vulgaris has 8-11 chromatophores, 6 of which are visceral, whereas O. insularis shows
an average of 17 chromatophores, with 7-11 visceral. In ventral view, O. vulgaris shows
an average of 23 chromatophores distributed in horizontal rows, whereas O. insularis
shows an average of 40 chromatophores divided into 9 rows of which the first 3 are
arranged horizontally and the others are distributed in a spiral form. On the funnel, O.
vulgaris exhibits 4 chromatophores with a 2 +2 distribution; in contrast, O. insularis
always shows 8 chromatophores in standard 4 +2 +2 distribution. In total, O. vulgaris
shows 56-77 chromatophores, whereas O. insularis shows 84-112. Interestingly, the
38
color pattern of O. insularis adults is also much darker than that of O. vulgaris (Leite
and Mather 2008), suggesting that the former species bears more chromatophores than
the latter.
On the other hand, when compared to the other warm-water species, O. insularis
still exhibits fewer chromatophores than O. burryi (Voss, 1950) endemic to the Gulf of
Mexico, for example, which displays approximately 205 chromatophores in total
(Forsythe and Hanlon 1985). Similarly, O. maorum, native to New Zealand, shows
approximately 220 (Batham 1957). Typically, older or brown chromatophores are found
in such regions as the mantle (ventral and dorsal), mainly covering the viscera, head
(dorsal), arms, and funnel. Conversely, younger or reddish chromatophores are found on
the soft tissue of the head that coats the entire ventral and small dorsal region, whereas
yellows chromatophores are generally small, appear in smaller quantities, and are
observed only along the dorsal edge of the mantle. During the planktonic phase, the
color changes are less pronounced, culminating with a small variety of chromatophores
and a color pattern that is less complex when compared to newly settle benthic juveniles
(Villanueva 1995, Vidal et al. 2010).
Octopus insularis was recently described as a new species in northeastern Brazil
(Leite et al. 2008) and discriminated from the O. vulgaris complex. The present study
provided fundamental information on the early life stages of O. insularis that will be
essential to identifying paralarvae from plankton samples and achieve a better
understanding of the ecology and distribution of the species. Accordingly, much of the
information on the population dynamics of both species is confusing due to the
occurrence of both species. Thus, more observations of the paralarvae, juveniles, and
adults of O. insularis should be conducted in both natural and controlled environments.
Octopus insularis should receive more focused attention, particularly because it is the
39
main target of fisheries in the northeastern Brazil and may have aquaculture potential
due to its relatively high fecundity, easy adaptation to captivity conditions at high
temperatures, good acceptability of frozen food, and high market price.
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45
Figures Legend
Figure 1. Schematic illustration showing the body dimensions measured in Octopus insularis
paralarvae. Abbreviations: a2l, length of the second pair of arms; ed, eye diameter; fl, funnel
length; hw, head width; ml, mantle length; mw, mantle width; tl, total length
46
Figure 2. Octopus insularis. (a) Eggs and (b) eggs strings in initial embryonic
development.
47
Figure 3. Octopus insularis embryos at different developmental stages. (a) Initial
developmental stages before (down) and after (upper) the first inversion of the embryo;
(b) advanced developmental stages before the second inversion; (c) after the second
inversion of the embryo and (d) newly-hatched paralarvae.
48
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4 (1
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) 2+
3+4
2 3-
4 Y
21
(8
VS)
24
-25
38-4
0 4-
5 (1
row
) 2+
1 2
35-3
8 4+
2+2
55-5
9 93
-99
5 3-
4 (1
row
) 2+
4+4
a 5
2 3-
4 Y
22
(11
VS)
25
-26
40-4
3 4-
5 (1
row
) 2+
1 2
33-3
5 4+
2+2
55-5
8 95
-101
6 3
(1 r
ow)
2+2+
3+4
2 3-
4 Y
19
(9
VS)
22
-23
39-4
0 4
(1 r
ow)
2+1
2 39
-41
4+2+
2 59
-61
98-1
01
7 3
(1 r
ow)
2+4+
4 a
5 2
3-4
Y
19 (
11 V
S)
22-2
3 37
-39
5 (1
row
) 2+
1 -
32-3
5 4+
2+2
51-5
5 88
-94
8 3
(1 r
ow)
2+4+
4 4
3-4
Y
13 (
8 V
S)
16-1
7 33
-34
4 (1
row
) 2+
1 2
45-4
7 4+
2+2
67-6
9 10
0-10
3
9 4
(1 r
ow)
2+4+
4 a
5 2
3-4
Y
13 (
7 V
S)
16-1
7 32
-34
4 (1
row
) 2+
1 -
34-3
7 4+
2+2
52-5
5 84
-89
10
3-4
(1 r
ow)
2+1+
4+4
2 3-
4 Y
19
(12
VS)
22
-23
36-3
9 5
(1 r
ow)
2+1
- 34
-38
4+2+
2 53
-57
89-9
6
11
3 (1
row
) 1+
2+3+
5 2
3-4
Y
15 (
9 V
S)
18-1
9 34
-36
6 (1
row
) 2+
1 -
44-4
7 4+
2+2
64-6
7 98
-103
12
3 (1
row
) 2+
4+4
a 5
- 3-
4 Y
14
(7
VS)
17
-18
30-3
2 5
(1 r
ow)
2+1
- 44
-47
4+2+
2 63
-66
93-9
8
13
3 (1
row
) 2+
4+4
a 5
2 3-
4 Y
15
(9
VS)
18
-19
33-3
5 4-
5 (1
row
) 2+
1 -
44-4
7 4+
2+2
62-6
6 95
-101
14
4 (1
row
) 2+
4+4
a 5
4 3-
4 Y
9
(6 V
S)
12-1
3 30
-32
4-5
(1 r
ow)
2+1
- 50
-52
4+2+
2 68
-72
98-1
04
15
3 (1
row
) 3+
4+4
a 5
2 3-
4 Y
18
(9
VS)
21
-22
37-3
9 4
(1 r
ow)
2+1
2 40
-42
4+2+
2 56
-58
93-9
7
16
3 (1
row
) 2+
4+4
2 3-
4 Y
18
(9
VS)
21
-22
35-3
6 3
(1 r
ow)
2+1
- 53
-56
4+2+
2 70
-73
105-
109
17
3 (1
row
) 2+
4+4
a 5
2 3-
4 Y
16
(6
VS)
19
-20
34-3
6 4-
5 (1
row
) 2+
1 -
34-3
7 4+
2+2
50-5
4 84
-90
18
2-3
(1 r
ow)
2+4+
4 2
3-4
Y
20 (
12 V
S)
23-2
4 38
-40
3-4
(1 r
ow)
2+1
2 41
-44
4+2+
2 61
-65
99-1
05
19
4 (1
row
) 2+
4+6
2 3-
4 Y
19
(12
VS)
22
-23
40-4
1 4
(1 r
ow)
2+1
- 34
-37
4+2+
2 50
-53
90-9
4
51
Capítulo II - Mudanças teciduais no trato digestivo de Octopus vulgaris durante a
fase planctônica: influência do vitelo e da disponibilidade de alimento
Tiago M. Lenz1, José Iglesias3, Luís F. Fávaro2, Érica A. G. Vidal1
1Centro de Estudos do Mar, Universidade Federal do Paraná, Pontal do Paraná, PR, Brasil.
2Laboratório de Reprodução e Comunidade de Peixes, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil.
3Instituto Espanhol Oceanográfico, Vigo, Espanha.
Resumo: Durante os primeiros dias de vida, os cefalópodes combinam a alimentação
endógena (absorção do vitelo) com a exógena (captura de presas) a fim de sustentar suas
altas taxas metabólicas. A transição alimentar é considerada um período crítico nas
fases iniciais de vida dos polvos, onde ocorrem altas taxas de mortalidade. Este trabalho
objetivou estimar as taxas de absorção de vitelo e sobrevivência em paralarvas de
Octopus vulgaris alimentadas e em inanição logo após a eclosão, além de examinar
através de análise histológica a cronologia ontogenética da glândula digestiva desde a
eclosão, na presença e ausência de alimento, bem como durante fase planctônica.
Reprodutores (2♀ : 1♂) foram capturados e transportados para o laboratório, mantendo-
os em um sistema de recirculação de água fechado a 26 ± 2 ° C e salinidade 33 ± 2. A
partir da desova as paralarvas foram distribuídas em dois tratamentos, um denominado
alimentado, mantido com náuplius de artêmia e outro denominado inanição, mantidos
sem alimento, cada um com três réplicas. Diariamente 15 paralarvas de cada tratamento
foram amostradas para estimar as medidas do volume do vitelo, comprimento total,
comprimento do manto, comprimento do braço e peso seco. Para a análise histológica,
foram selecionadas amostras diárias de 15 paralarvas de cada tratamento, e a fim de
contemplar as diferentes etapas do desenvolvimento planctônico, paralarvas com idade
de 15, 22, 31, 41 e 45 dias foram analisadas. Observou-se que a transição alimentar
ocorre principalmente durante os 3 primeiros dias, sendo que o consumo do vitelo
ocorre nos 2 primeiros dias após a eclosão à temperatura 26 °C. O ciclo citológico na
glândula digestiva esteve relacionado ao ato de se alimentar sendo independente da
idade.
Palavras-chave: paralarva, vitelo, glândula digestiva, Octopus.
52
INTRODUÇÃO
Os polvos da família Octopodidae apresentam duas estratégias reprodutivas bem
definidas. A primeira se caracteriza pela produção de relativamente poucos ovos
grandes que ao eclodirem, darão origem a indivíduos morfologicamente similares aos
adultos e de hábito de vida bentônico (VILLANUEVA, 1995; AVILA-POEDA et al.
2009; VILLANUEVA & NORMAN, 2008). A outra estratégia se caracteriza pela
produção de grande quantidade de ovos pequenos, que ao eclodirem dão origem a
indivíduos igualmente pequenos e de hábito planctônico, denominados paralarvas, as
quais passam por alterações morfológicas antes de se tornarem bentônicas (NIXON &
MANGOLD, 1996; VILLANUEVA & NORMAN, 2008).
Durante os primeiros dias de vida, os cefalópodes combinam a alimentação
endógena (absorção do vitelo) com a exógena (captura de presas) a fim de sustentar suas
altas taxas metabólicas (IMAMURA, 1990; BOLETZKY, 1989; 2003; VIDAL et al.
2002; 2005). A taxa de absorção de vitelo é exponencial e dependente da temperatura,
portanto, as paralarvas devem rapidamente aprender a capturar alimento para não
morrerem de inanição. Por esta razão, a transição alimentar endógena para exógena é
considerado um período crítico nas fases iniciais de vida dos cefalópodes, onde ocorrem
altas taxas de mortalidade (BOLETZKY, 1975; VIDAL et al. 2002; 2005).
Alterações celulares e teciduais ocorrem durante a absorção do saco vitelínico
interno e provavelmente esteja relacionado a modificações na glândula digestiva,
principal órgão responsável pelo processo de digestão. Dentro do processo de digestão
podemos destacar a importância da glândula digestiva na síntese e secreção das enzimas
digestivas, na reabsorção e metabolismo de nutrientes, no armazenamento de reservas e
na secreção de metabólitos (BOUCAUD-CAMOU & BOUCHER-RONDONI, 1983;
BUNDELMANN et al. 1997). No entanto, pouco se sabe sobre a relação entre a
glândula digestiva e a reserva vitelínica na fase final de absorção de seus nutrientes e
secreção de metabólitos. Boletzky (1975) enfatiza que o mecanismo básico de absorção
do vitelo em decápodes e octópodes não diferem, o saco vitelínico interno está em
contato com uma grande veia (sinus) sanguínea na qual libera ao sistema circulatório os
nutrientes provenientes do vitelo.
Boletzky (1975; 1989) também sugere que as paralarvas de polvo podem
capturar presas ativamente imediatamente após a eclosão, pois o seu trato digestivo já é
53
capaz de digeri-las. No entanto, Iglesias et al. (2006) observaram que paralarvas recém
eclodidas de Octopus vulgaris efetuavam poucos ataques à presas e sugeriu que as
mesmas não estariam fisiologicamente aptas para iniciar a alimentação exógena. Um
resultado similar foi encontrado por Vidal et al. (2002) que mostraram que o percentual
de paralarvas de lulas com o trato digestivo cheio, aumenta nos primeiros dias após a
eclosão, concomitantemente com a redução das reservas vitelínicas. Em seu estudo
sobre alimentação e digestão de juvenis recém eclodidos de Sepia officinalis, Boucaud-
Camou et al. (1985) analisou a glândula digestiva, por ser este o único órgão a não estar
totalmente desenvolvido no momento da eclosão e estar diretamente relacionada aos
processos de digestão e absorção de nutrientes. Estes estudos ilustram que ainda pouco
se conhece sobre as modificações que ocorrem na glândula digestiva durante a fase de
absorção do vitelo e também quais são as alterações esperadas caso o animal não
encontre alimento disponível neste momento crucial de sua vida. Vidal et al. (2002;
2005) observaram que em lulas Doryteuthis opalescens, as taxas de utilização do vitelo
diferiram em paralarvas alimentadas e em inanição, sugerindo que as taxas de absorção
de vitelo poderiam estar relacionadas ao processo de digestão de alimento.
Nixon & Mangold (1996) sugerem que as adaptações na morfologia das
paralarvas de polvo durante a fase planctônica são fruto do desenvolvimento do sistema
nervoso e poderiam afetar a formação de órgãos. Estas adaptações preparariam as
paralarvas para em um curto intervalo de tempo realizar uma drástica mudança
comportamental para sobreviver no bentos. Moguel et al (2010) comentam que após a
eclosão, o Octopus maya possui capacidade digestiva limitada, no entanto aos 45 dias a
glândula digestiva mostra amadurecimento através do espessamento da lâmina basal e
evidenciação das células digestivas e vacúolos. No entanto, os autores sugerem que o
processo de alimentação parece ter maior influencia na composição da glândula
digestiva, pois a estimula a secretar grandes quantidades de enzimas.
Estudos experimentais comparativos sobre as alterações teciduais da glândula
digestiva durante a fase planctônica podem aportar importantes conhecimentos sobre a
cronologia ontogenética deste importante órgão, responsável pelos processos de
absorção e excreção. Neste contexto os objetivos deste trabalho são: 1) estimar as taxas
de absorção de vitelo e sobrevivência em paralarvas de Octopus vulgaris alimentadas e
em inanição 2) examinar através de análise histológica a cronologia ontogenética da
glândula digestiva desde a eclosão, na presença e ausência de alimento, bem como
durante fase planctônica.
54
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta e manutenção dos reprodutores
Reprodutores foram coletados na natureza através de mergulho livre com uso de
solução hipersalina na desembocadura da Baía de Paranaguá no município de Pontal do
Paraná (25°32ɂ822ʺS; 48°23ɂ283ʺO) durante os meses de setembro e outubro de 2012.
Os polvos capturados foram acondicionados em recipiente de 50 L com suprimento de
ar e transportados ao Laboratório de Cultivo de Cefalópodes e Ecologia Marinha
Experimental e (LaCCef) distante 20 Km do ponto de coleta. Os polvos foram
previamente aclimatados e mantidos em um sistema fechado de recirculação de água
para abrigar os reprodutores. O sistema foi constituído por um filtro biológico com
dimensões de 1,80 x 0,60 x 0,30 m e um volume aproximado de 325 L, interligado a 3
tanques circulares de fibra, dois com dimensões de 1,00 m de diâmetro na borda
superior, 0,73 m de diâmetro na borda inferior e altura de 0,60 m, com volume útil de
250 L; outro com 1,20 m de diâmetro na borda superior, 0,88m na borda inferior e
altura de 0,69 m com um volume útil de 400 L, sendo o volume total do sistema de
1225 L.
Os reprodutores foram dispostos (2♀ : 1♂) em tanques contendo abrigos
confeccionados com tubos de PVC de 100 mm de diâmetro e 34 cm de comprimento os
quais serviram de refúgio e local para a deposição dos ovos. Medições diárias dos
parâmetros físico-químicos foram realizadas. A temperatura foi de 26 ± 2 °C e
salinidade 33 ± 2, medidas com o uso termômetro de mercúrio e de refratômetro Atago,
respectivamente. O pH foi de 8,4 ± 1 medido com peagametro digital de bolso e o
fotoperíodo foi o natural. Os compostos nitrogenados (nitrito, nitrato e amônio), foram
monitorados com auxílio de kit colorimétrico SERA, sendo feitas, quando necessária,
trocas parciais de água para manter os níveis de compostos nitrogenados dentro dos
limites aceitáveis. Diariamente os tanques eram limpos e sifonados para retirada de
partículas em suspensão, restos de alimentos e excretas do animal. Os reprodutores
foram alimentados diariamente com uma dieta composta por crustáceos (50%), peixes
(30%) e moluscos (20%) vivos e/ou congelados, até o momento da desova.
Uma fêmea de 1,5 kg desovou entre 30/10/2012 e 04/11/2012 no abrigo de PVC.
O desenvolvimento embrionário durou entre 20 e 31 dias (19/11 a 01/12/2012) à
55
temperatura 26 ± 2 ° C e salinidade 33 ± 2. Durante todo o período de incubação dos
ovos a qualidade de água foi mantida em níveis adequados de acordo com IGLESIAS et
al. (2004).
Protocolo experimental
O protocolo experimental consistiu em dois tratamentos denominados
‘alimentado’ e ‘inanição’, cada um com três réplicas. Cada réplica consistiu em
recipientes de vidro de 2 L, com volume útil de 1,5 L. Cada réplica possuía uma aeração
central disposta dentro de uma estrutura cilíndrica de PVC vazada, esta recoberta por
uma tela de 500µm, estrutura responsável pelo suprimento de oxigênio, além de criar
um leve fluxo de água dentro dos recipientes.
No tratamento alimentado, o alimento vivo foi oferecido para as paralarvas. No
tratamento inanição as paralarvas foram mantidas na ausência de alimento. O alimento
vivo oferecido as paralarvas do tratamento alimentado, consistiu de náuplios artêmia
recém eclodidos oferecidos na densidade de 15 artêmias paralarva-1. Esta densidade foi
mantida durante todo o experimento.
Para se obter paralarvas da mesma idade, todas do tanque de eclosão eram
transferidas para outros tanques no final da tarde, assim todas as paralarvas utilizadas no
experimento eclodiram durante a noite seguinte. O número inicial de paralarvas foi de
50 indivíduos por réplica. O dia de eclosão foi considerado como Dia 0, pois menos de
24 horas havia se passado após a eclosão. O dia seguinte de amostragem foi considerado
o Dia 1 e assim sucessivamente.
Diariamente 30% do volume de água de cada réplica eram renovados utilizando-
se água na mesma salinidade e temperatura. A mortalidade foi determinada diariamente
pela contagem dos indivíduos mortos em cada réplica e a sobrevivência estimada de
acordo com o número de indivíduos presentes no início do experimento. Para o
tratamento inanição foi registrado quantos dias as paralarvas sobreviveram apenas com
a energia contida em sua reserva vitelínica e este, foi considerado o potencial de
sobrevivência das paralarvas às condições submetidas.
Paralarvas de diferentes idades obtidas através de cultivo
56
Para complementar a análise histológica na fase planctônica, paralarvas com
idades de 15, 22, 31, 41 e 45 dias foram obtidas através de cultivo realizado no Instituto
Espanhol de Oceanografia (IEO) em Vigo, Espanha, entre 15 de março e 19 de abril de
2010. Estas foram cultivadas em tanques circulares pretos, de 85 cm de diâmetro e
volume de 500 L. A densidade de paralarvas foi de 10 indivíduos L-1 (5000 paralarvas
por tanque), a temperatura média foi mantida entre 21 – 22 ºC, a salinidade entre 33 –
34 e uma iluminação contínua de 800 – 1000 lux foram fornecidas a cada tanque através
de duas lâmpadas fluorescentes de 36 W. A dieta consistiu em artêmias (1,5-2 mm)
alimentadas com Isochrysis galbana e posteriormente enriquecidas por 24h com
Nannochloropsis sp.. As paralarvas foram coletadas ao acaso nos tanques de cultivo e
fixadas em formol 4-6 % neutralizado e enviadas por correio ao Centro de Estudos do
Mar, da Universidade Federal do Paraná, Brasil.
Obtenção e análise dos dados
Diariamente 30 paralarvas foram amostradas, totalizando 15
paralarvas/dia/tratamento. As paralarvas foram anestesiadas em cloreto de magnésio
segundo Moltschaniwskyj et al. (2007) e feita a captura de imagens ventrais, utilizado-
se um microscópio Olympus com uma das oculares de 8x de aumento substituída por
câmera fotográfica Nikon (SMZ-10A). O comprimento total, o comprimento do manto e
o comprimento do 4º par de braços foram medidos utilizando-se o software de imagem
de domínio público NIH- Image.
Para estimar o volume da glândula digestiva e de vitelo das paralarvas, as
imagens capturadas foram analisadas através de um software de imagem Photoshop
7.0.1®. Para tal, a forma de uma elipse foi sobrepostas à forma da glândula digestiva e
outra à forma do saco vitelínico das paralarvas recém eclodidas. A seguinte fórmula foi
usada:
Elipsóide rotacional: V(1,2) = 4πAB2
. 3
Onde V1 é o volume da glândula digestiva (mm3), V2 o volume do vitelo (mm3), A e B
são, respectivamente, a metade do comprimento e a metade da largura da glândula
digestiva e do saco vitelínico, respectivamente. O volume real de vitelo foi obtido pela
57
subtração do volume da glândula digestiva do volume do saco vitelínico. Sendo a
estimativa do valor real do volume de vitelo (VR) dado pela seguinte fórmula:
VR= V2-V1
Os volumes estimados de vitelo foram convertidos em peso quando multiplicado
pela densidade de 1,036 mg.mm-3 (O`DOR et al. 1986; VIDAL et al. 2002).
Figura 1: O. vulgaris. Paralarva recém eclodida em vista ventral mostrando as medidas
de dimensão do corpo, área da glândula digestiva e do vitelo. O saco vitelínico e a
glândula digestiva são indicados pela forma geométrica (elipsóide) utilizada para
calcular o volume do vitelo.
Após o registro fotográfico, as mesmas foram pesadas para obtenção do peso
seco de acordo com a metodologia proposta por Vidal et al. (2002), registrando-se o
peso seco inicial no Dia 0 (n=30) e o peso seco final no Dia 4 (n=9/tratamento).
Para verificar diferenças estatísticas entre as médias de comprimento do manto,
comprimento total, uma Análise de Variância de dois fatores com nível de significância
de 5% foi utilizada. Para comparar as médias de peso inicial e final entre tratamentos foi
usado o Teste t-student (p<0,05). As análises estatísticas foram realizadas com o uso do
pacote estatístico R.
Com
primento total
Com
prim
ento
do
man
to
Com
prim
ento
do
4° p
ar d
e br
aços
Saco vitelínico
Glândula digestiva
58
Caracterização histológica
Para a análise histológica, foram selecionadas amostras diárias de 15 paralarvas
de cada tratamento (alimentado e inanição), sendo 3 paralarvas de cada réplica, nos 4
primeiros dias após a eclosão. Para complementar a amostragem, paralarvas alimentadas
com idade de 15, 22, 31, 41 e 45 dias foram cedidas pelo Instituto Oceanográfico
Espanhol de Vigo, a fim de analisar diferentes etapas do desenvolvimento planctônico.
Para garantir que as paralarvas amostradas no tratamento alimentado tivessem
capturado presas, e assim iniciado a alimentação exógena, as amostras obtidas no
primeiro dia após eclosão foram selecionadas da seguinte forma: a) paralarvas
amostradas antes de ser oferecido (n=5); b) paralarvas amostradas no momento da
primeira alimentação (n=5), realizada 5 minutos após a ingestão; c) paralarvas
amostradas após a 1º, 2º e 3º hora após terem capturado a primeira presa (n=2 para cada
hora). Para estas amostragens as paralarvas foram selecionadas imediatamente após a
oferta de presas. Para tal, seguiu-se o seguinte procedimento, quando uma paralarva era
observada capturando uma presa, a mesma era cuidadosamente retirada do tanque de
cultivo em um recipiente de vidro, onde a mesma podia ser observada separadamente
até a completa ingestão da presa. No tratamento alimentado as amostragens seguiram
até o dia 8, momento em que se observou grande taxa de mortalidade. Para o tratamento
em inanição as amostragens seguiram até o quarto dia.
As amostras foram fixadas em solução Alfac (85 partes de álcool etílico 80%, 10
partes de formaldeído 40% e cinco partes de ácido acético glacial) e decorridas
aproximadamente 30 h de fixação, os exemplares foram transferidos para etanol a 70%.
O processamento histológico seguiu a rotina clássica de desidratação em série alcoólica
crescente, diafanização em xilol, impregnação/emblocamento em parafina, obtenção de
cortes com cerca de 5 μm através de microtomia, hidratação progressiva, coloração por
Hematoxilina de Harris e Eosina (HE), desidratação e montagem sob lamínula. A
glândula digestiva foi eleita alvo das análises devido a sua importância nos processos de
digestão e absorção de nutrientes.
59
RESULTADOS
Variáveis morfométricas
O experimento foi conduzido até o 5º dia após a eclosão (Dia 4), momento em
que a mortalidade do tratamento de paralarvas em inanição ultrapassou 80%. Os dados
morfométricos se encontram sintetizados na Tabela 1.
Tabela 1: Octopus vulgaris. Características morfométricas das paralarvas durante os
primeiros dias após a eclosão.
Dia 0 Dia 2 Dia 4
Inanição Alimentadas Inanição Alimentadas
Sobrevivência (%) 100 81 (77-89) 95(91-100) 16 (7-22) 67 (57-77)
Comprimento total
(mm)
2,79±0.08 2,83±0.12 2,99±0.15 2,90±0,36* 3,36±0,22
Comprimento do
manto (mm)
1,90 ± 0,06 1,86±0,11 2,05±0,11 2,05±0,28* 2,29±0,15
Comprimento do 4°
par de braços (mm)
0,88±0,04 0,97±0,05 0,93±0,06 0,85±0,10* 1,07±0,10
Peso seco (mg) 0,15±0.04 - - 0,14±0,08 0,17±0,05
Peso do vitelo (mg) 0,054±0,009 0,005±0,002* 0,01±0,003 0 0
*Diferença significativa para p<0,05
A média de sobrevivência para as réplicas do tratamento alimentado no Dia 4 foi
de 67%. Para os indivíduos mantidos em inanição a sobrevivência foi de 16% ao final
do Dia 4, o que decretou o final do experimento.
O comprimento médio total no Dia 4 foi de 3,36 mm ± 0,22 e 2,90 mm ± 0,36
para paralarvas alimentadas e em inanição, respectivamente (t= 3,87 gl=23; p<0,05)
apresentando diferença significativa entre os tratamentos.
O comprimento médio do manto no Dia 4 foi de 2,29 mm ± 0,15 e 2,05 mm ±
0,28 para paralarvas alimentadas e em inanição. Observou-se uma leve diminuição no
comprimento do manto após o primeiro de vida após a eclosão, seguida de uma
tendência de valores maiores para paralarvas alimentadas, observando-se diferença
significativa entre os tratamentos (t= 2,69; gl=23; p<0,05) (tabela 1).
60
O comprimento médio do 4° par de braços foi de 0,70 mm ± 0,03 para ambos os
tratamentos no Dia 0 e no Dia 4 foi de 1,07 mm ± 0,10 e 0,85 mm ± 0,13 para
paralarvas alimentadas e em inanição (t= 5,20; gl=23; p<0,05), apresentando diferença
significativa entre os tratamentos.
O peso seco médio em paralarvas de ambos os tratamentos não mostraram
diferenças significativas (p>0,05), com média inicial de 0,15 mg ± 0,04 para o Dia 0 e
de 0,14± 0,08 mg e 0,17± 0,05 mg no dia 4 para os tratamentos inanição e alimentados,
respectivamente.
Figura 2: O. vulgaris. A) Comprimento total, B) comprimento do manto de paralarvas
alimentadas e em inanição. A idade expressa os dias após a eclosão e os valores são a
média de 63-68 paralarvas ± DP. Maioria das paralarvas em inanição morreu no Dia 4.
y = 2.72e0.05x
R² = 0.93
y = 2.77e0.02x
R² = 0.43
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 1 2 3 4
Co
mp
rim
en
to t
ota
l (m
m)
Idade (dias)
Alimentadas
Inanição
A
y = 1.85e0.05x
R² = 0.91
y = 1.82e0.03x
R² = 0.53
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 1 2 3 4
Co
mp
rim
en
to d
o m
an
to (
mm
)
Idade (dias)
Alimentadas
Inanição
B
61
Absorção de vitelo
O maior percentual de vitelo foi absorvido entre os dias 0 e 2 em ambos os
tratamentos (Figura 3). Diferenças significativas nos valores estimados de vitelo entre
os tratamentos foram observados nos dias 1, 2 e 3 entre os tratamentos (p<0,05) e não
houve diferenças no dia 4 (p>0,05). As taxas de utilização de vitelo diárias expressas
pelo declive da função exponencial entre o peso do vitelo e a idade foram de 88% para o
grupo alimentado e 100% para o grupo em inanição. Isso significa que a cada 24 h, 88%
da reserva vitelínica foram utilizadas pelas paralarvas alimentadas e praticamente 100%
pelas paralarvas em inanição, assim, no segundo dia após a eclosão, a taxa de utilização
do vitelo restante foi de novamente 88% para paralarvas alimentadas e praticamente
100% para as paralarvas em inanição e assim sucessivamente até o Dia 4, onde toda a
reserva vitelínica havia sido consumida.
As paralarvas do tratamento em inanição utilizaram o vitelo a maiores taxas que
as paralarvas do tratamento alimentado. Apesar da maioria das paralarvas não
apresentarem mais vitelo no 4º dia após a eclosão, em alguns indivíduos ainda era
possível observar resquícios do saco vitelínico, no entanto não apresentou diferença
significativa entre os tratamentos.
Em termos de peso do vitelo tem-se que 0,019 mg de vitelo foram consumidos
pelas paralarvas alimentadas e 0,033 mg pelas paralarvas em inanição ao fim das
primeiras 24 h. No dia 3 somente havia 0,004 mg e 0,0015 mg de vitelo remanescente
nas paralarvas alimentadas e em inanição, respectivamente. No dia 4, a maioria das
paralarvas já não apresentava mais vitelo, no entanto ainda era possível observar
resquícios do saco vitelínico em alguns indivíduos.
62
Figura 3: O. vulgaris. Taxa de utilização de vitelo (mg), em paralarvas alimentadas e em
inanição nos primeiros dias pós eclosão. A idade expressa os dias após a eclosão e os
valores são a média de 16-38 paralarvas. Para as paralarvas em inanição uma taxa de
mortalidade de 86% foi registrada no Dia 4.
Caracterização histológica:
Paralarvas recém eclodidas alimentadas e em inanição
Em paralarvas recém eclodidas verificou-se que a glândula digestiva é envolta
por tecido conjuntivo que por seu caráter acidófilo possui coloração rosada. Este a
separa do saco vitelínico interno, da glândula salivar posterior, do saco de tinta e dos
outros órgãos presentes na cavidade do manto. A glândula digestiva possui formato
globular e é composta por ácinos tubulares onde se pode observar a presença de dois
tipos celulares principais, a) células de digestão e b) vacúolos digestivos. É possível
também visualizar uma secreção enzimática preenchendo a luz do lúmen da glândula
digestiva (Figura 4 e 5).
y = 0.06e-0.88x
R² = 0.98
y = 0.05e-1.07x
R² = 0.98
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0 1 2 3 4 5
Pe
so d
o v
ite
lo (
mg
)
Idade (dias)
Alimentadas
Inanição
63
Figura 4: O. vulgaris. A) Paralarva recém-eclodida (Dia 0); B) Glândula digestiva e
saco vitelínico interno; C) Detalhe da glândula digestiva. m: manto, br: braços, v:
ventosa, cm: cavidade do manto, e: estatólitos, gd: glândula digestiva, svi: saco
vitelínico interno, f: funil, b: bico, mc: massa cerebral; tc: tecido conjuntivo; svi: saco
vitelínico interno; gsp: glândula salivar posterior; se: secreção enzimática e st: saco de
tinta.
64
Figura 5: O. vulgaris. Tipos celulares identificados na glândula digestiva das paralarvas.
lb: lâmina basal; cd: células digestivas, vd: vacúolos de digestão; se: secreção
enzimática.
Após a eclosão, quando ainda há a presença do saco vitelínico interno, as
paralarvas apresentam a glândula digestiva repleta de vacúolos digestivos e uma
quantidade menor de células de digestão, as quais estão localizadas principalmente
sobre a lâmina basal (Figura 4 e 5). As células de digestão são granulares e amorfas e
possuem um tamanho médio de 4,4 µm. Os vacúolos de digestão têm forma esférica
variando a trapezoidal e seu tamanho pode variar de 9 a 19 µm dentro de um mesmo
indivíduo.
As paralarvas fixadas logo após a primeira alimentação, isto é, logo após
haverem ingerido a primeira presa, não mostraram diferença na composição da glândula
digestiva e proporção celular quando comparadas com paralarvas recém-eclodidas
mantidas somente com suas reservas vitelínicas e sem alimento (Figura 6).
65
Figura 6: O. vulgaris. Paralarva de recém eclodida fixada logo após capturar e ingerir a
1°presa, preenchida pelos vacúolos de digestão (vd), com a presença das células de
digestão (cd), glândula salivar posterior (gsp) e do saco de tinta (st).
No segundo dia após a eclosão a absorção das reservas vitelínicas é quase
completa, havendo forte diminuição na quantidade de vacúolos digestivos,
principalmente nas paralarvas mantidas em inanição. No terceiro dia em diante as
paralarvas em inanição mostraram células de digestão, no entanto pouquíssimos
vacúolos, sugerindo que ao não haver alimento há a extinção quase que total dos
vacúolos abundando as células digestivas sobre a lâmina basal (Figura 7).
Nas paralarvas alimentadas foi registrada a maior presença de vacúolos até o 8°
dia (Figura 8), no entanto não em todos os exemplares, sugerindo que mesmo com a
presença de alimento, alguns indivíduos estavam sofrendo de inanição.
A maior presença de um ou outro tipo célula parece estar relacionada ao
processo de alimentação, já que há variação na abundância de tipos celulares em
indivíduos da mesma idade. As células de digestão parecem ser produzidas através da
lâmina basal que na presença de alimento abunda de vacúolos de digestão que secretam
enzimas na luz do lúmen dos túbulos digestivos.
66
Figura 7: O. vulgaris. Detalhe da glândula digestiva: A) paralarva em inanição (Dia 3) e
B) paralarva alimentada (Dia 3). cd: células digestivas; vd: vacúolos digestivos; lb:
lâmina basal; l: lúmen; se: secreção enzimática.
A glândula digestiva não mostrou diferença na estrutura citológica entre
paralarvas alimentadas e não alimentadas, porém apresentou diferenças na proporção de
células digestivas e ou vacúolos digestivos (Figura 7 e 8). Cabe resaltar que após a total
67
absorção do saco vitelínico interno as paralarvas em inanição apresentaram maior
quantidade de células de digestão e poucos vacúolos digestivos, os quais foram mais
abundantes em paralarvas alimentadas. No entanto, em paralarvas alimentadas também
foi observado grande quantidade de células digestivas e menor quantidade de vacúolos
de excreção, sugerindo que a abundância de vacúolos digestivos esteja associada à
ingestão de alimento. Portanto, é possível que a maior ou menor quantidade de vacúolos
digestivos tenha uma produção cíclica dentro do processo de digestão e excreção. Outro
aspecto observado foi que as paralarvas em inanição apresentaram o lúmen quase
sempre vazio, diferente das paralarvas alimentadas que podiam apresentar o túbulo do
lúmen preenchido de secreções enzimáticas ou vazio em alguns momentos.
Figura 8: O. vulgaris. A) paralarva em inanição (Dia 5) e B) paralarva alimentada (Dia
8). cd: células digestivas; vc: vacúolos digestivos; st: saco de tinta; m: manto; cm:
cavidade do manto; c: ceco e tc: tecido conjuntivo.
Características da glândula digestiva de paralarvas durante o desenvolvimento
planctônico
Durante o desenvolvimento planctônico a glândula digestiva é o órgão que
ocupa a maior proporção da cavidade do manto em todas as idades. Através da análise
histológica não se observou a formação ou diferenciação de novos tecidos e tampouco
diferentes tipos de células na glândula digestivas durante a fase planctônica. Os mesmos
tipos de células observados em paralarvas recém eclodidas foram encontrados em
paralarvas de diferentes idades ao longo do desenvolvimento planctônico (Figura 9).
68
Não houve mudanças na composição estrutural interna da glândula digestiva,
sendo que a lâmina basal, as células digestivas e vacúolos de digestão possuíam
tamanho similar em paralarvas mais velhas quando comparados com as paralarvas
recém eclodidas, notando-se somente o alargamento da luz do lúmen em paralarvas
maiores.
Figura 9: O. vulgaris. Vista em detalhe da glândula digestiva das paralarvas de O.
vulgaris com A) 22; B) 35dias; C) 41 dias e D) 45 dias após a eclosão. vd: vacúolos
digestivos; cd: células digestivas; lb: lâmina basal; se: secreção enzimática; gsp:
glândula salivar posterior; st: saco de tinta e tc: tecido conjuntivo.
No decorrer do desenvolvimento pode ser observada uma alternância nos tipos
de célula, podendo haver a presença massiva de vacúolos de digestão ou abundancia de
células digestivas, sugerindo que a composição celular da glândula digestiva está
associada ao ato de se alimentar e não com a idade do animal. Em amostras da mesma
idade observou-se tanto paralarvas com presença massiva de vacúolos de digestão,
como também paralarvas com abundancia de células digestivas (Figura 10), reforçando
69
a hipótese de haver um ciclo citológico na glândula digestiva, este independente da
idade.
Figura 10: O. vulgaris. Paralarvas com 31 dias após a eclosão); A) detalhe da glândula
com maior presença de vacúolos de digestão e B) detalhe da glândula digestiva com
maior presença de células de digestão. vd: vacúolos digestivos; cd: células digestivas;
lb: lâmina basal; l: lúmen e st: saco de tinta.
DISCUSSÃO
Os resultados demonstraram que há uma leve diminuição do comprimento do
manto e comprimento total logo após o primeiro dia de vida, fato que ocorreu em ambos
os tratamentos. Deste modo, a reserva vitelínica que nesse momento ocupa grande parte
da cavidade do manto é utilizada para manter o metabolismo basal e a atividade das
paralarvas. A reserva vitelínica foi praticamente toda consumida, em ambos os
tratamentos, nos dois primeiros dias após a eclosão. Após a eclosão, o saco vitelínico
interno ocupa um grande volume na cavidade do manto e pode haver uma compactação
dos órgãos e tecidos, esse fato poderia explicar o porquê da diminuição dos
comprimentos de manto para ambos os tratamentos no primeiro dia. Boletzky (1974)
comenta que durante o desenvolvimento pós-embrionário dos cefalópodes ocorrem
mudanças significantes na proporção corporal. A energia disponibilizada pelo saco
vitelínico consumido parece refletir no leve crescimento do manto, observado em ambos
os tratamentos no Dia 3. Resultados semelhantes foram registrados por outros autores
(BOUCHER-RODONI et al. 1987; VIDAL et al. 2002; MOGUEL et al. 2010) para
cefalópodes. Após as primeiras 48 horas há a recuperação do animal em tamanho em
70
ambos os tratamentos. No entanto, no Dia 4 a energia disponibilizada pelo alimento
oferecido, parece haver contribuído para que as paralarvas alimentadas apresentassem
maior crescimento do que as paralarvas em inanição.
A transição alimentar endógena para exógena acarreta altas taxas de mortalidade
(VECHIONE, 1987; BOLETZKY, 1989; VIDAL et al. 2002; VIDAL & BOLETZKY,
2014), atribuída principalmente à inabilidade das paralarvas em capturar presas na
quantidade e qualidade suficiente para manterem os seus altos requerimentos
metabólicos (VIDAL et al. 2002).
Apesar da maioria das paralarvas não apresentarem mais vitelo no 3º dia pós-
eclosão, em alguns indivíduos alimentados ainda era possível observar visualmente
resquícios do saco vitelínico. Observou-se que em paralarvas em inanição houve uma
tendência de consumo do vitelo mais rápido, fato este que pode ter sido influenciado
pela possível ingestão de presa pelas paralarvas alimentadas, fazendo com que estas
aproveitem parte dos nutrientes da presa mantendo por algum tempo mais a sua reserva
vitelínica. Observamos diferença significativa entre o volume e peso de vitelo durante
primeiras 72 h após a eclosão, com as paralarvas em inanição mostrando uma tendência
ao consumo mais rápido do vitelo. VIDAL et al. (2002) também observou que o
consumo de vitelo foi maior em paralarvas de lulas mantidas em inanição, sugerindo
que a ingestão de alimento poderia influenciar a taxa de absorção de vitelo.
Um aspecto que é evidente no desenvolvimento inicial das paralarvas é a
variabilidade morfométrica individual que ocorre entre paralarvas de mesma idade de
eclosão e provenientes da mesma fêmea. Há uma tendência ao aumento da variabilidade
dos dados morfométricos mensuradas no decorrer dos dias, sendo que as paralarvas em
geral apresentaram maior desvio padrão das variáveis morfométricas nos últimos dias
de experimento. O desenvolvimento desigual é observado em diversos organismos
aquáticos cultivados, assim como também em cefalópodes (FORSYTHE & HANLON,
1988; VILLANUEVA, 1995; MOGUEL et al. 2010) durante todo o ciclo de vida. Esta
variabilidade pode estar relacionada a fatores não completamente conhecidos como a
disposição do ovo nos cachos em relação à disponibilidade de oxigênio e nutrientes,
influencia genética, nutrição inicial da paralarva, dominância, dentre outros (IGLESIAS
et al. 2007).
A glândula digestiva foi escolhida como alvo do presente estudo, pois segundo
Boucau-Camoud et al. (1985) é o único órgão digestivo a não estar totalmente
desenvolvido após a eclosão. No entanto, Boletzky (1989) comenta que a paralarva
71
recém eclodida é um cefalópode completo em miniatura, com o tubo digestivo
completamente formado e a boca já aberta e com uma reserva em seu saco vitelínico
interno que vai sendo absorvida em paralelo com a digestão de presas capturadas
ativamente. Estas sugestões foram confirmadas no presente estudo, onde foi possível
observar a presença dos órgãos relacionados à digestão já nas paralarvas recém
eclodidas e também durante o desenvolvimento planctônico.
Foi possível observar também as transformações que ocorrem na glândula
digestiva após a captura e ingestão de presas quando o processo de absorção de vitelo
ainda estava em andamento. Ao eclodir observou- se em ambos os tratamentos a
presença do saco vitelínico interno, este separado da glândula digestiva por uma lâmina
de tecido conjuntivo, estrutura também observada em outros cefalópodes por outros
autores (BOLETZKY, 1975; VILLANUEVA & NORMAN, 2008; MOGUEL et al.
2010). A glândula digestiva apresentou no seu interior, células comuns a todas as idades
e tratamentos. As células digestivas podem apresentar-se de duas formas: como células
de digestão e os vacúolos de excreção (BOUCHER-RODONI, 1982), aqui chamadas de
vacúolos de digestão. O que se diferencia entre as paralarvas em inanição e alimentadas
é a maior presença de vacúolos digestivos nas últimas. Por outro lado, paralarvas em
inanição apresentam uma grande quantidade de células de digestão. A morfologia do
órgão não se diferenciou entre os tratamentos sendo formado por lâmina basal que
parece ser a base de produção das células de digestão. Estudos realizados com o polvo
O. maya até os 45 dias após a eclosão mostram o espessamento da lâmina basal, como
também o aumento da quantidade de vacúolos digestivos no decorrer do
desenvolvimento (MOGUEL et al. 2010).
No presente estudo, as paralarvas com até 3 dias de idade mostram a presença de
vacúolos digestivos, sugerindo que os mesmos podem estar relacionados a assimilação e
digestão da reserva vitelínica. Alguns autores relacionaram a baixa quantidade de
vacúolos digestivos na fase pós-eclosão ao fato da glândula digestiva ainda não estar
suficiente madura ou totalmente formada e provavelmente com sua capacidade digestiva
limitada (BOUCAUD-CAMOU & YIM, 1980; VECCHIONE & HAND, 1989;
MOGUEL et al. 2010). No entanto, no presente estudo observou-se a presença de
vacúolos digestivos logo após a eclosão, como também durante todo o desenvolvimento
planctônico, demonstrando que as paralarvas de O. vulgaris já possui uma capacidade
digestiva funcional e ativa, no que diz respeito aos processos de absorção e excreção de
nutrientes e metabólitos, respectivamente.
72
Nossos resultados mostraram também que paralarvas mantidas em inanição
apresentaram ampla luz do lúmen com ausência de secreção enzimática e baixa
presença de vacúolos de digestão. Vecchione & Hand (1989) comentam que animais
submetidos à inanição ou má alimentação, a glândula digestiva possui ampla luz e finas
paredes nos seus túbulos. Este fato foi observado tanto nas paralarvas mantidas em
inanição, como em parte das paralarvas alimentadas que possivelmente, mesmo com a
presença de alimento, estavam sofrendo de inanição.
Nesta fase ocorre uma alta mortalidade e mesmo quando se oferece alimento
para as paralarvas (tratamento alimentado), boa parte delas não inicia a alimentação por
não conseguir capturar presas. A inabilidade das paralarvas na captura do alimento
aliada à necessidade constante de energia para manter o seu alto metabolismo, faz com
que boa parte das paralarvas morra de inanição quando suas reservas de vitelo se
esgotam.
Em paralarvas da mesma idade se observou indivíduos com a maior presença de
células digestivas e outros com a maior presença de vacúolos de digestão, reforçando a
hipótese de haver um ciclo citológico na glândula digestiva, o qual parece ser
independente da idade. Uma alternância natural no tipo de células digestivas pode estar
associada ao processo digestivo e não propriamente com o desenvolvimento da
paralarva.
A fase planctônica dos polvos pode durar entre 30 e 70 dias, dependendo da
temperatura (VILLANUEVA, 1995; NIXON & MANGOLD, 1996; MOXICA et al.
2002; IGLESIAS et al. 2004). Após este período ocorre o assentamento e os pequenos
polvos assumem o hábito bentônico (NIXON & MANGOLD, 1996; VILLANUEVA &
NORMAN, 2008). Este é considerado o segundo momento mais crítico dentro do ciclo
de vida dos polvos devido à drástica mudança de comportamento que acarreta em altas
taxas de mortalidade (VILLANUEVA, 1995; IGLESIAS et al. 2007; VIDAL et al.
2014). Nixon & Mangold (1996) sugerem que as alterações que ocorrem nos órgãos e
na morfologia dos animais durante a fase planctônica são consequência das mudanças
comportamentais dos animais, os quais precisam se adaptar às diferentes presas que irão
encontrar ao assumir o habito bentônico. A presença das células e vacúolos digestivos
está relacionada à síntese enzimática e à excreção de metabólitos (BOUCAUD-
CAMOU et al. 1976; BOUCAUD-CAMOU & BOUCHER-RODONI, 1983). O
processo de alimentação e inanição influencia diretamente no processo de excreção de
amônia (BOUCHER-RODONI & MANGOLD, 1985) sendo assim, o momento de
73
alimentação terá influência direta sobre os tipos de células encontradas na glândula
digestiva, sendo que antes da ingestão se observa uma grande quantidade de células
digestivas e após a ingestão um aumento na quantidade de vacúolos de digestão. As
diferentes formas celulares parecem ser estágios funcionais de um único tipo de célula,
as células digestivas (YIM & BOUCAUD-CAMOU, 1980; BOUCHER-RODONI,
1981). As células digestivas maduras são caracterizadas pelas células digestivas e pela
frequente ocorrência das células dos “Brown bodies”, estes grande massa contendo
cristais, frequentemente incluído no vacúolo (BOUCAUD-CAMOU & BOUCHER-
RODONI, 1983).
No decorrer do desenvolvimento planctônico não se observou diferença no
tamanho das células e tampouco no tamanho dos vacúolos digestivos quando
comparado às paralarvas recém eclodidas. Segundo Boucaud-Camou & Boucher-
Rodoni (1983) o bolo alimentar é liberado para o intestino, entrando em contato com a
glândula digestiva, ocorrendo a fase de absorção. Neste momento os vacúolos
digestivos que portam a secreção enzimática, aumentam em número, com flutuações
devidas principalmente, ao estímulo para liberação da enzima digestiva (BOUCHER-
RODONI & MANGOLD, 1977) causado pela alimentação. Estas enzimas podem ser
produzidas pela fragmentação dos vacúolos e em seguida sofrer exocitose (YIM &
BOUCAUD-CAMOU, 1980).
A nutrição das paralarvas é apontada como uma das maiores responsáveis pela
alta mortalidade neste período (VAZ-PIRES et al. 2004; IGLESIAS et al. 2007). A
nutrição inadequada ou carência de nutrientes pode afetar a composição celular da
glândula digestiva e a composição da dieta pode influenciar na quantidade de células
específicas na glândula digestiva, fato observado nas paralarvas mantidas em inanição.
Neste estudo pudemos observar que a transição alimentar ocorre principalmente
durante os 3 primeiros dias, sendo que o consumo do vitelo ocorre principalmente nos 2
primeiros dias após a eclosão, de acordo com a temperatura em que as paralarvas foram
expostas (24 °C). O ciclo citológico na glândula digestiva esteve relacionado ao ato de
se alimentar parecendo ser independente da idade.
74
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78
Capítulo III - Efeito de dieta alimentar micro-encapsulada com quitosano no
crescimento e sobrevivência de paralarvas do polvo comum (Octopus vulgaris)
utilizando marcadores de ingestão
Resumo: O cultivo do polvo comum Octopus vulgaris (Cuvier, 1797) é promissor, no
entanto, esbarra na inexistência de formas jovens devido à alta mortalidade que ocorre
na fase inicial de vida. A formulação de dietas inertes para paralarvas e a busca por
formas mais eficientes de elaboração de micro partículas tem sido um desafio para
diminuir a mortalidade após a eclosão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da
microdieta encapsulada com polímero natural (quitosano) no crescimento e
sobrevivência das paralarvas de polvo, assim como avaliar a viabilidade do uso das
fluoesferas como marcadores de ingestão. A partir da desova, dois experimentos
similares foram realizados distribuindo as paralarvas em dois tratamentos: o ‘controle’,
mantidos somente com náuplius de artêmia enriquecido e o ‘dieta’, mantidos com
náuplius de artêmia enriquecido co-alimentados com dieta inerte microencapsulada com
quitosano e enriquecida com fluoesferas, havendo três réplicas por tratamento. Nos dias
0, 10 e 15 foram amostrados 15 paralarvas de cada tratamento para estimar o
comprimento ventral do manto e o peso seco e ao final do experimento estimar a razão
de crescimento, a prevalência de ingestão e a sobrevivência. A dieta foi ingerida por
15% das paralarvas, com as fluoesferas mostrando-se uma ferramenta viável como
marcadores de ingestão em cefalópodes. A dieta inerte encapsulada com quitosano não
mostrou eficiência para promover maior crescimento e sobrêvivencia das paralarvas nas
condições aqui apresentadas, não mostrando diferença significativa entre os
tratamentos. As propriedades físicas das partículas se mostraram inadequadas para esta
espécie, sendo necessário aprimorar sua composição e aceitabilidade, adequando sua
flutuabilidade ao comportamento alimentar das paralarvas.
Palavras-chave: paralarva, dieta artificial, quitosano, Octopus.
79
INTRODUÇÃO
O grande interesse no cultivo do polvo comum Octopus vulgaris (Cuvier, 1797)
é justificado devido às características biológicas da espécie; ampla distribuição
geográfica, boa adaptação ao cativeiro, alta fecundidade, aceitação de alimento
congelado, altas taxas de crescimento e elevado valor de mercado (GARCÍA-GRACÍA
& AGUADO, 2002; IGLESIAS et al. 2004; VAZ-PIRES et al. 2004). No entanto, o
cultivo integral do polvo em nível comercial é uma realidade ainda não alcançada,
devido principalmente à inexistência na suplementação de formas jovens (VIDAL et al.
2014).
Segundo a revisão de Iglesias et al. (2007) o principal problema para o
desenvolvimento integral do cultivo de polvos é a elevada mortalidade observada
durante o cultivo das paralarvas. Grande esforço tem sido realizado para solucionar este
entrave (IMAMURA, 1990; HAMAZAKI et al. 1991; VILLANUEVA, 1995;
IGLESIAS et al. 2000; MOXICA et al. 2002; OKAMURA, 2005; CARRASCO et al.
2006; IZQUIERDO et al. 2008, SEIXAS et al. 2010) havendo um consenso entre os
pesquisadores que a solução está fundamentada nos aspectos nutricionais das presas
nesta fase do desenvolvimento (IGLESIAS et al. 2007).
Até o presente momento foi possível fechar o ciclo de cultivo de polvos em
laboratório uma única vez (IGLESIAS et al. 2004). Este estudo demonstrou a
viabilidade do uso de zoeas e Artemia adultas enriquecidas durante a fase planctônica.
Alguns grupos de pesquisadores conseguiram juvenis bentônicos em laboratório
(IMAMURA, 1990; HAMAZAKI et al. 1991), porém não tem sido possível repetir o
fato fundamentando-se na metodologia descrita por eles. Outros autores também
conseguiram juvenis bentônicos com a utilização de diferentes presas como zoeas de
diferentes crustáceos decápodos e Artemia enriquecida com microalgas complementada
com zoeas do caranguejo Maja brachydactyla (VILLANUEVA, 1994; 1995;
CARRASCO et al. 2003; IGLESIAS et al. 2004).
O uso de Artemia é importante para o cultivo larvário de polvo, pois é um
crustáceo fácil de produzir, os náuplius e metanáuplios se desenvolvem bastante rápido
(24-72 h) e é possível variar a sua composição bioquímica por meio de enriquecimento
(SEIXAS, 2009). Durante os primeiros dias de vida da paralarva, a artêmia enriquecida
costuma ser um bom alimento para sustentar suas altas taxas metabólicas, no entanto
80
depois dos primeiros 14 dias, seu conteúdo nutricional parece não mais suprir as
necessidades das paralarvas (VILLANUEVA et al. 2002). Neste momento, a utilização
de zoeas de crustáceos como dieta complementar seria a melhor alternativa para
oferecer os nutrientes requeridos pelas paralarvas (IGLESIAS et al. 2007). Porém, a
dificuldade de controlar as quantidades assim como os momentos exatos para a
obtenção das zoeas, faz que esta prática seja muito custosa e incerta (NAVARRO &
VILLANUEVA, 2000).
Uma forma de substituir o alimento vivo seria a formulação de dietas artificiais.
As dietas balanceadas direcionadas aos requerimentos nutricionais das paralarvas são
imprescindíveis para alcançar o sucesso em escala comercial, baixando os custos de
produção e fornecendo os nutrientes basais e de crescimento. Em larvas de peixes, as
dietas são uma realidade para várias espécies (HOLT, 1993; CAHU et al. 1998;
SOUTHGATE & PARTRIDE, 1998; TAKEUCHI, 2001). Para paralarvas de polvo
algumas tentativas de subministração de dietas formuladas não tiveram muito sucesso
(VILLANUEVA et al. 2002; NAVARRO & VILLANUEVA, 2000), pois mesmo as
micro dietas sendo ativamente atacadas e ingeridas pelas paralarvas não resultaram em
crescimento e sobrevivência satisfatória. Segundo Villanueva et al. (2002), isso pode
ser resultado da adaptação enzimática para um substrato nutricional específico ou
indicar desnutrição induzida pela formulação inadequada da micro dieta.
Navarro e Villanueva (2000) destacam que paralarvas nas fases iniciais de vida
necessitam alimentos ricos em ácidos graxos polinsaturados (PUFA), fosfolipídeos e
colesterol, além de lipídeos neutros. Seixas et al. (2010) demonstrou no seu trabalho
que a relação proteína/lipídeos na dieta é mais importante que a quantidade de ácidos
graxos altamente insaturados (HUFA) para a sobrevivência e crescimento. Estas
informações são imprescindíveis para a formulação de dietas inerte que possam suprir
as necessidades nutricionais das paralarvas. No entanto, alguns outros aspectos internos
e externos devem ser considerados, pois podem afetar a eficiência da utilização da
partícula alimentar inerte em larvas marinhas. A busca, identificação e ingestão são
influenciadas por fatores físicos e químicos como a cor, forma, tamanho, movimento e
estimulo olfativo a nível celular (KOLKOVSKI, 2008). As paralarvas de polvo são
predadores visuais, mas certamente os estímulos táteis e químicos influenciam na caça,
seleção e ingestão da presa (VILLANUEVA & NORMAN, 2008). Desta forma, estes
aspectos devem ser considerados na elaboração da dieta, buscando alguma forma de
qualificar e quantificar a seleção e ingestão do alimento oferecido.
81
O uso de microesferas fluorescente pode ser uma ferramenta interessante que
poderia ajudar a avaliar a seleção e ingestão de presas de paralarvas de polvo por meio
da sua visualização através de microscópio de fluorescência ou em espectrofotômetro de
fluxo. Até o momento, esta técnica nunca havia sido utilizada com cefalópodes, porém
já foi testado com sucesso em larvas de peixes marinhos e segundo Hansen et al. (2008)
pode ser adaptadas a diferentes áreas da nutrição larval, seleção e ingestão de presas.
Outro desafio na formulação de dietas inertes para paralarvas de polvo é a busca
por formas mais eficientes de elaboração de micro cápsulas. Partículas alimentares
foram testadas usando o processo de gelificação-coacervação por Villanueva et al.
(2002), com a produção de partículas ovaladas com tamanho em torno de 1.3-2.0mm.
Os autores observaram a captura e ingestão da dieta, mas quando comparado às
paralarvas alimentadas somente com Artemia enriquecida, não houve diferencia
significativa no crescimento.
O quitosano é um polissacarídeo natural derivado da quitina, que possui como
fonte principal carapaças de camarões, lagostas e caranguejos (JOHNSON &
PENISTON, 1982). Recentemente é usado para encapsular componentes ativos devido
a não ser tóxico, ser biodegradável, biocompatível e atuar como indutor do sistema
imune. Sua composição natural pode ser testada como encapsulador da dieta a ser
testada por meio da formação de grãos de quitosano.
Neste contexto, este estudo tem como objetivos: 1) Avaliar o efeito da
microdieta encapsulada com polímero natural (quitosano) no crescimento e
sobrevivência de paralarvas de polvo comum (Octopus vulgaris), assim como 2) avaliar
a viabilidade do uso das fluoesferas como marcadores de ingestão para paralarvas de
polvo.
MATERIAIS E MÉTODOS
Formação e distribuição do tamanho das partículas alimentares
O alimento inerte oferecido às paralarvas consistiu de uma dieta produzida
através do método de gelificação iônica (DELGADO, 2009), o qual entrecruza o gel de
quitosano aos ingredientes, formando as partículas alimentares. A composição da dieta
foi de 0,47 g de carne de lula liofilizada (Doryteuthis opalescens), 0,47 g de carne de
caranguejo liofilizado (Portunus validus), 11,2 mg de microalga liofilizada
82
(Nannochloropsisis sp.), 16,1 mg de ácido ascórbico em pó e 12000 fluoesferas
(FluoSpheres®Molecular Probes®Polystyrene Micrrospheres, 10 µm, blue fluorescent
(365/415)), estes entrecruzados em 2% de gel de quitosano (ALDRICH®), produzindo
um grama de dieta inerte.
A distribuição do tamanho da dieta foi amostrada a partir de um total de 90
partículas. Estas foram confeccionadas e congeladas, posteriormente foram liofilizadas,
e mantidas em refrigeração para posterior análise em microscópio de luz (LEICA
DM4000B) com câmera digital acoplada (LEICA DFC300 FX). Através das fotografias
e com uso de software de imagens (Leica Q-win V3 Pro-image Analysis System), o
diâmetro das partículas foi medido antes e depois do processo de liofilização.
Taxa de incorporação das fluoesferas na dieta
Para avaliar a quantidade de fluoesferas incorporadas na dieta inerte, o
recipiente comercial foi agitado em vórtex por 10 segundos e então coletadas 3 amostras
de 2 µL. Após a produção das partículas alimentares foram coletadas da solução de
entre cruzamento 3 amostras de 1 mL sob agitação magnética (IKA-WERK®) a 500
rpm. A taxa de incorporação foi a diferencia entre a quantidade total de fluoesferas
adicionada à dieta menos a quantidade residual de fluoesferas na solução de entre
cruzamento. As amostras foram divididas em alíquotas e quantificadas em câmara de
contagem de Neubauer.
Teste de flutuabilidade das partículas
Um total de 90 partículas foi distribuído em dez recipientes de 50 ml contendo
água salgada na salinidade de 35. Após 48 h registraram-se a quantidade de partículas
que se mantiveram flutuando e quantas afundaram.
Octopus vulgaris reprodutores e ovos
Os reprodutores de Octopus vulgaris foram capturados individualmente por
pescadores artesanais profissionais na costa de Tenerife (Ilhas Canárias, Espanha).
Indivíduos com peso médio de 1309±503 g, foram mantidos em tanques circulares de
fibra de 1000 L com fluxo contínuo de água do mar, sob fotoperíodo natural (12 luz: 12
83
escuridão), temperatura da água de 23±2°C e salinidade de 36,8±0,14. A temperatura foi
medida com um Tinytag Plus 2 (TGP-4020; Gemini Data Loggers Ltd.) e a salinidade
com um refratômetro S/Mill-E (ATAGO). Três polvos com peso médio similar foram
colocados em cada tanque (2♀ : 1♂), os quais continham dois potes por polvo como
abrigo para evitar competição. Os indivíduos foram alimentados ad libitum com lulas
congeladas (Doryteuthis opalescens). Semanalmente foi verificada se havia a presença
de ovos e ao constata-los, a fêmea era mantida sozinha através da retirada dos outros
polvos.
Protocolo experimental
Foram realizados dois experimentos utilizando duas desovas de diferentes
fêmeas. No primeiro experimento as paralarvas recém eclodidas tiveram média de
1,56±0,05 mm de comprimento ventral do manto (CVM) e 0,21±0,02 mg de peso seco.
No segundo experimento as paralarvas recém eclodidas tiveram média de 2,03±0,07 de
CVM e peso seco médio de 0,22±0,02 mg. Para ambos os experimentos utilizou-se uma
densidade de 1 paralarvas/L em 6 tanques de fibra cilíndricos cônicos de 100 L (52 cm
de diâmetro e 56 cm de altura) com fluxo de água do mar entrando através de um anel
circular posicionado na borda superior. A vazão de renovação de água foi 504%/dia,
acionada das 18 h às 8 h da manhã. Os tanques foram mantidos em intensidade
luminosa de 500-700 lux (provido por uma lâmpada incandescente de 21 W) e um
fotoperíodo de 12L:12E (luz das 8:00 a.m. a 8:00 p.m.). Antes de povoar os tanques
com as paralarvas foram inseridos 16000 copépodes (Tisbe sp.) em todas as réplicas.
Diariamente, no período da manhã, microalgas Nannochloropsis sp. eram
adicionadas aos tanques na densidade de 1milhão de células/mL e 500 mil células/mL,
respectivamente para o primeiro e o segundo experimento. A média da temperatura da
água foi de 24,28±0,30°C e 21,4±0,39°C para ambos os experimento, respectivamente;
e a salinidade foi de 36,8±0,14. Semanalmente os compostos nitrogenados foram
medidos, amônia ionizada (NH4+) e nitritos (NO2
-) com uso do kit teste para aquário
TETRA. O pH foi medido diariamente com um pHmetro Hanna-HI-98107 que
mostraram valores de 7,9-8,0.
Dois diferentes grupos de paralarvas baseados nas diferentes dietas foram
estabelecidos: a) o controle, o qual consistiu na adição de 10 náuplius de artêmias/ml
enriquecidos com 106 células de T-Iso/ml/dia; e b) dieta artificial, o qual consistiu na
84
co-alimentação de 0,25 gramas de dieta de quitosano com fluoesfera/dia e 10 náuplius
de artêmias/ml enriquecidos com 106 células de T-Iso/ml/dia. Ambos os tratamentos
foram realizados em triplicata e os experimentos tiveram duração de 15 dias. A
sifonagem dos tanques ocorreu diariamente e somente no primeiro experimento, sempre
antes da primeira alimentação.
Quinze paralarvas foram amostradas no início e ao final do experimento, cinco
indivíduos de cada tanque. As amostras foram utilizadas para calcular: (i) peso seco
(DW; mg); (ii) comprimento ventral do manto (VML; mm); (iii) razão de crescimento
instantâneo (IGR;%DW t-1) = (LnW2 - LnW1) t-1.100, onde W1 e W2 são o peso seco
inicial e final, respectivamente, Ln o logaritmo natural e t o número de dias do
experimento. A razão de sobrevivência (SR; %) foi determinada como (100Nf)Ni-1, onde
Nf e Ni são, respectivamente, o número final e inicial de paralarvas nos tanques de cada
tratamento.
As paralarvas amostradas foram anestesiadas com Cl2Mg6H2O 0.4 M (Panreac-
Química SA), de acordo com a metodologia descrita por Messenger et al. (1985). Após
mediu-se o comprimento médio do manto, através das imagens registradas por uma lupa
estereoscópica acoplada a uma câmera fotográfica (59 x de magnificação, SMZ-10A;
Nikon), e o peso seco foi determinado pela secagem das amostras ao fim de 24 h a 110
°C.
A coleta das paralarvas ocorreu nos dias 0, 7 e 15, totalizando 90 paralarvas (45
paralarvas/tratamento ou 5 paralarvas/tratamento/amostras). Estas foram fotografadas
para a avaliação do crescimento e a taxa de ingestão da dieta. Para avaliar a ingestão
utilizou-se um microscópico (AZ100; Nikon) acoplado a uma epifluorescência em
diferentes aumentos (50-400x). As marcas de fluorescência foram observadas através de
luz de epi-fluorescência usando filtros de excitação UV-2A (330-380 nm) e V-2A (380-
420 nm). Ao final dos 15 dias de experimento avaliou-se o incremento em peso seco e a
sobrevivência.
Para verificar diferenças estatísticas entre as médias de comprimento do manto,
peso seco e sobrevivência nos diferentes tratamentos e experimentos, uma Análise de
Variância de dois fatores com nível de significância de 5%. As análises estatísticas
foram realizadas com o uso do pacote estatístico R.
85
RESULTADOS
O tamanho das partículas e incorporação de fluoesferas
A concentração de gel de quitosano de 2 % apresentou viscosidade adequada
para passar no goteador, sendo utilizado na proporção de ingredientes e quitosano de
80:20. Após diferentes testes, esta foi a proporção que possibilitou a maior incorporação
de nutrientes em relação à menor quantidade de gel de quitosano adicionado.
O tamanho das partículas alimentares variou de 1,45 mm a 2,33 mm, com média
de 1,83± 0,17 mm e a taxa de incorporação de fluoesferas à dieta foi de 88 %. A
incorporação foi resultado da subtração da concentração inicial de fluoesfera
adicionadas à dieta (1940 ± 260 células para cada 0,3 g de dieta liofilizada), da
concentração final media resultante não incorporada que foi de 232 fluoesfera (Figura
1).
Figura 1: A) Partículas de dieta encapsulada com quitosano; B) fluoesferas de 10 µm
incorporadas às partículas alimentares.
Peso seco, crescimento, IGS e sobrevivência das paralarvas nos diferentes
tratamentos
Experimentos 1
O peso seco médio das paralarvas ao eclodir foi de 0,21± 0,02 mg e ao final do
experimento no dia 15, foi de 0,41± 0,02 mg e 0,42± 0,03 mg para os tratamentos dieta
86
e controle, respectivamente. Não houve diferença significativa entre os tratamentos
(p=0,86).
O comprimento ventral do manto foi de 1,56± 0,05 no momento da eclosão e de
2,48± 0,07 mm e 2,51± 0,10 mm ao final do experimento para os tratamentos dieta e
controle, respectivamente (Figura 2). Não houve diferença significativa entre os
tratamentos (p=0,56).
Figura 2: O. vulgaris. Comprimento do manto de paralarvas dos tratamentos dieta e
controle. A idade expressa os dias após a eclosão e os valores são a média de 80
paralarvas ± DP.
A razão de crescimento instantâneo foi de 4,45±0,28 % e 4,55±0,68 % para os
tratamentos dieta e controle, respectivamente. A razão de sobrevivência foi de
2,91±1,29 % e 4,27±2,14 % para os tratamentos dieta e controle, respectivamente.
Tabela 1: Octopus vulgaris. Características morfométricas das paralarvas para o
experimento 1.
Experimento 1 Dia 0 Dia 7 Dia 15
Dieta Controle Dieta Controle
Sobrevivência (%) 100 - - 2,91±1,29 4,22±2,14
Comprimento do
manto (mm)
1,56 ± 0,05 2,17±0,01 2,22±0,04 2,48±0,07 2,51±0,10
Peso seco (mg) 0,21±0,02 - - 0,41±0,02 0,42±0,03
IGS (%) - - - 4,45±0,28 4,55±0,68
y = 1.62e0.030x
R² = 0.92
y = 1.63e0.031x
R² = 0.90
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
2.60
2.80
0 5 10 15
Co
mp
rim
en
to d
o m
an
to (
mm
)
Idade (dias)
dieta
controle
Exponencial (dieta)
Exponencial
(controle)
87
Experimento 2
O peso seco médio das paralarvas ao eclodir foi de 0,22± 0,02 mg e ao final do
experimento no dia 15, foi de 0,32± 0,04 mg e 0,34± 0,05 mg para os tratamentos dieta
e controle, respectivamente (Figura 3). Não houve diferença significativa entre os
tratamentos (p=0,79).
O comprimento ventral do manto foi de 2,03± 0,07 no momento da eclosão e de
2,30± 0,02 mm e 2,21± 0,33 mm ao final do experimento para os tratamentos dieta e
controle, respectivamente (Figura 4). Não houve diferença significativa entre os
tratamentos (p=0,08).
Figura 3: O. vulgaris. Peso seco das paralarvas dos tratamentos dieta e controle. A idade
expressa os dias após a eclosão e os valores são a média de 180 paralarvas ± DP.
y = 0.23e0.0239x
R² = 0.76
y = 0.23e0.0293x
R² = 0.83
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0 5 10 15
Pe
so s
eco
(m
g)
Idade (dias)
dieta
controle
88
Figura 4: O. vulgaris. Crescimento do manto das paralarvas dos tratamentos dieta e
controle. A idade expressa os dias após a eclosão e os valores são a média de 180
paralarvas ± DP.
A razão de crescimento instantâneo foi de 4,16±0,76 % e 4,16±1,24 % para os
tratamentos dieta e controle, respectivamente. A razão de sobrevivência foi de 4,79% e
6,15 % para os tratamentos dieta e controle, respectivamente.
Tabela 2: Octopus vulgaris. Características morfométricas das paralarvas durante o
segundo experimento.
Experimento 2 Dia 0 Dia 5 Dia 10 Dia 15
Dieta Controle Dieta Controle Dieta Controle
Sobrevivência (%) 100 - - - - 4,79±5,83 6,15±3,12
Comprimento do manto
(mm)
2,03±0,07 2,05±0,05 2,13±0,09 2,11±0,02 2,15±0,02 2,l3±0,05 2,21±0,03
Peso seco (mg) 0,22±0,02 0,29±0,04 0,29±0,14 0,32±0,04 0,34±0,04 0,32±0,01 0,34±0,03
IGS (%) - 5,26±0,94 5,26±2,44 3,50±1,30 4,13±1,30 4,16±0,76 4,16±1,24
Prevalência de ingestão
Um total de 41 paralarvas foi amostrado para analise de ingestão da dieta através
da presença de fluoesfera no trato digestivo. Observou-se o ataque às partículas e o seu
manuseio pelas paralarvas, bem como a presença de fluoesferas no trato digestivo em
y = 1.99e0.0082x
R² = 0.85
y = 2.05e0.0054x
R² = 0.93
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0 5 10 15
Co
mp
rim
en
to d
o m
an
to (
mm
)
Idade (dias)
dieta
controle
Exponencial (dieta)
Exponencial
(controle)
89
15% das paralarvas amostradas (Figura 5), encontradas principalmente no esôfago,
estômago e intestino.
Figura 5: O. vulgaris. Fluoesfera ingerida por paralarva submetida ao tratamento com a
dieta alimentar inerte encapsulada com quitosano.
DISCUSSÃO
O presente estudo testou pela primeira vez em cefalópodes o uso de microdieta
de quitosano e a incorporação de fluoesferas como marcadores de ingestão. A dieta foi
ingerida por 15% das paralarvas, mostrando que apesar da proporção ser baixa, houve a
ingestão. As fluoesferas se mostraram uma ferramenta útil como marcadores de ingestão
nas paralarvas de polvo, constatando sua aplicabilidade em experimentações que
busquem avaliar a seleção e ingestão de presas. Estudos com larvas e juvenis de
bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) mostraram a viabilidade do uso de fluoesferas
como marcador indireto para estimar a digestibilidade de proteínas (HANSEN et al.
2008) como também para avaliar a seleção e quantificação de ingestão (MUSCATO et
al. 2009; KOLKOVSKY et al. 2009)
Neste estudo, pode-se observar que a técnica de micro encapsulação produz
partículas com alta estabilidade em água salgada e baixa desintegração, mantendo a
flutuabilidade por períodos maiores que 24 h. As partículas ao flutuarem se mantém
abaixo da película formada pela tensão superficial da água durante longo período,
estando assim maior tempo à disposição para serem consumidas. No entanto, estudos
em laboratório com dietas inertes para paralarvas de polvos mostraram que o ataque
90
acontecia principalmente, quando a partícula afundava na coluna d’água (NAVARRO
& VILLANUEVA, 2000). No presente estudo foi possível visualizar ataques às
partículas da dieta, porém como as mesmas se mantinham em suspensão na camada
mais superficial da coluna de água, isso possivelmente dificultou o acesso às partículas
para a maioria das paralarvas, explicando em parte a baixa taxa de ingestão observada.
Cabe enfatizar que a dieta de quitosano, devido a sua baixa desintegração,
mostrou-se favorável para a manutenção de uma boa qualidade da água nos tanques de
cultivo. No entanto, Yúfera et al. (2003) comentam que por diminuir a lixiviação dos
componentes solúveis em água, a micro encapsulação pode diminuir a atração das
larvas pelas partículas alimentares. Métodos de micro encapsulação até o momento não
obtiveram bons resultados no crescimento de larvas marinhas (YÚFERA et al. 2003),
devido principalmente à inabilidade das larvas em digerir e assimilar as partículas,
como também à alta proporção de elementos não essenciais utilizados para formar a
cápsula (YÚFERA et al. 2003). Neste estudo a proporção de quitosano foi 20 % do total
do conteúdo da dieta, sendo que menores proporções de quitosano dificultavam a
formação das partículas aumentando o seu tamanho, devido à diminuição da fluidez.
O quitosano é um polímero de composição natural, biocompatibilidade, não
toxidade, habilidade de adsorção e propriedade antimicrobiana que já é utilizado na
indústria farmacêutica (RAVI, 2000; MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2005; KONG
et al. 2010) e alimentícia (DUTTA et al. 2009), podendo ter um grande potencial para o
uso na aquicultura. Estudos que comprovem a assimilação e digestibilidade da dieta de
quitosano em diferentes espécies marinhas são necessários para comprovar sua eficácia
no crescimento, como também investigar a sua possível aplicabilidade na administração
de medicamentos via oral para o tratamento contra enfermidades. Assim como em
paralarvas de polvo, em testes realizados usando alevinos de truta arco íris de
aproximadamente 15 cm, observou-se a ingestão completa da dieta de quitosano
oferecida (observação pessoal), podendo esta técnica ser viável em peixes, fato este que
abriria um campo interessante de pesquisa no desenvolvimento de dietas alimentares e
suplementação de fármacos com o quitosano.
As partículas produzidas tiveram tamanho médio de 1,83 mm, com a menor
medindo 1,4 mm e a maior medindo 2,3 mm. Após a eclosão as paralarvas tem
preferência por partículas alimentares em torno de 1,4 mm (IGLESIAS et al. 2006),
limite estes inferiores ao tamanho médio das partículas da dieta de quitosano. Este fato
91
pode ter dificultado a captura das partículas da dieta de quitosano, e consequentemente,
resultado nas baixas taxas de ingestão da dieta observadas.
A sobrevivência observada ao final de ambos os experimentos esteve abaixo do
encontrados por outros autores que também utilizaram dieta inerte em co-alimentação
com artêmia, ou somente artêmia (IGLESIAS et al. 2000; VILLANUEVA et al. 2002;
SEIXAS et al. 2010). A baixa sobrevivência observada em ambos os tratamentos
seguramente influenciou na ingestão das partículas da dieta, mas não pode ser atribuída
à presença da mesma, tendo em vista que o tratamento controle também apresentou
baixos valores de sobrevivência ao encontrado por outros autores, não havendo
diferença significativa entre os tratamentos. A contaminação bacteriana através do
alimento vivo, fezes e resíduos orgânicos podem ter sido a maior causa da alta
mortalidade, tendo em vista que os valores de qualidade de água e oxigênio dissolvido
estiveram de acordo ao sugerido por Iglesias et al. (2007).
O peso seco inicial das paralarvas no Dia 0, ou seja, logo após a eclosão, foi de
0,2 mg, valores inferior aos registrados por Iglesias et al. (2000) de 0,46mg, Villanueva
et al. (2002) de 0,27mg e 0,34 mg, Seixas et al. (2010) de 0,32 mg e por Moxica et al
(2002) 0,36 mg. O peso seco das paralarvas neste estudo aos 15 dias de cultivo foi
também inferior aos registrados em outros estudos (IGLESIAS et al. 2000;
VILLANUEVA et al. 2002; SEIXAS et al. 2010), sugerindo que as condições do
cultivo foram influenciadas por algum fator que afetou o desenvolvimento e a
sobrevivência das paralarvas, no entanto a qualidade da desova parece ter afetado a
qualidade das paralarvas, e consequentemente, ter influenciado os valores obtidos neste
trabalho. Os maiores valores de peso seco após 15 dias de cultivo foram obtidos no
experimento 1, os quais variaram de 0,41±0,02 mg a 0,42±0,03 mg. Estes valores
ficaram abaixo aos valores encontrados após 15 dias de cultivo por Seixas et al. (2010)
que variou de 0,43-0,50 mg, por Villanueva et al. (2002) que ao utilizar somente
náuplius de artêmia obteve 0,40-0,88 mg e ao utilizar artêmia co-alimentada com dieta
inerte obteve 0,78-0,84 mg e por Iglesias et al. (2000) que utilizando náuplius e
metanáuplius obteve peso seco de 0.75 mg.
No presente estudo o CVM das paralarvas ao eclodir foi de 1,56± 0,05 e 2,03±
0,07 para o primeiro e segundo experimento, respectivamente. Estes valores foram
inferiores no primeiro experimento e similares no segundo experimento aos valores
encontrados por Seixas et al. (2010), porém superiores ao registrado por Iglesias et al.
(2000). Ao final de 15 dias de cultivo, os valores do comprimento do manto foram
92
similares quando comparados aos resultados de Seixas et al. (2010) que observaram
valores médios variando de 2,24 a 2,34 mm.
Neste estudo, esperava-se que devido ao CVM após 15 dias de cultivo ser
similar ao encontrado por Seixas et al. (2010), o peso seco das paralarvas também fosse
similar, o que não aconteceu. Este fato sugere que a relação CVM e peso seco foram
influenciados por fatores nutricionais ou até a possível inanição das paralarvas que
afetou ambos os tratamentos. Mesmo as paralarvas apresentando crescimento no CVM,
este não se refletiu no ganho de peso afetando negativamente a razão de crescimento
como também a sobrevivência em comparação aos resultados de outros autores
(VILLANUEVA et al. 2002; SEIXAS et al. 2010).
A dieta inerte encapsulada com quitosano não se mostrou eficiente para
promover crescimento e sobrêvivencia das paralarvas de polvo nas condições aqui
apresentadas. Este fato foi devido principalmente às suas propriedades físicas
inadequadas para esta espécie, sendo necessário aprimorar a composição das partículas,
assim como sua aceitabilidade, adequando sua densidade, e consequentemente sua
flutuabilidade ao comportamento alimentar das paralarvas. O quitosano parece ser um
interessante aglutinante alimentar para dietas inertes para peixes, tendo em vista que se
podem manipular os ingredientes encapsulados de acordo com a necessidade alimentar
do organismo, de acordo com seu estágio de desenvolvimento. Assim, pesquisas que
objetivem investigar a aceitabilidade e digestibilidade de dietas micro encapsuladas com
quitosano em diferentes espécies cultivadas, como também a sua interação com
fármacos, se fazem necessárias para avaliar o seu potencial uso na aquicultura, tanto
para a alimentação de espécies aquáticas como para a administração de tratamentos
profiláticos através da encapsulação de ingredientes ativos.
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98
CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no primeiro capítulo deste trabalho levaram à
aceitação da hipótese de trabalho na qual devido à similaridade morfológica entre a
espécie recém-descrita de polvo O. insularis e a espécie amplamente conhecida e
estudada O. vulgaris, esperava-se que a primeira assim como a segunda espécie
produzissem uma grande quantidade de ovos e paralarvas planctônicas.
O padrão de distribuição de cromatóforos diferenciado entre as paralarvas de
ambas as espécies de polvo permitirá que estudos realizados no plâncton já possam
identificar corretamente a espécie de paralarva de polvo capturada, possibilitando a
identificação correta das áreas de desova de cada espécie.
Trabalhos futuros visando estabelecer técnicas apropriadas de larvicultura,
identificar presas adequadas para a fase planctônica, assim como avaliar o desempenho
de juvenis de O. insularis na engorda precisam ser realizados para avaliar o real
potencial da espécie para a aquicultura.
Os resultados encontrados no segundo capítulo levaram à aceitação da hipótese
de trabalho, na qual se esperava um consumo mais rápido do vitelo em paralarvas
mantidas em inanição. A outra hipótese também foi aceita, pois se verificou que a
glândula digestiva é funcional desde o momento da eclosão, apresentando todos os tipos
celulares. O ciclo citológico na glândula digestiva esteve relacionado ao ato de se
alimentar independente da idade.
A nutrição das paralarvas é apontada como ponto chave para aumentar os
índices de sobrevivência durante a fase planctônica. O ato de ingerir a presa determina
a quantidade de células específicas na glândula digestiva, no entanto a presença de um
determinado tipo de célula não garante que a paralarva está bem nutrida. Pesquisas que
busquem determinar quais presas (nutrientes) aumentam realmente a sobrevivência em
cada fase do desenvolvimento planctônico segue sendo determinante para tornar a
larvicultura de polvos economicamente viável.
No capítulo três, pudemos observar a ingestão da dieta através da presença de
fluoesferas no trato digestivo das paralarvas, aceitando as hipóteses de trabalho. No
entanto, a dieta inerte encapsulada com quitosano não melhorou o crescimento e
tampouco a sobrevivência das paralarvas, sendo rejeitada a outra hipótese, aceitando a
hipótese nula.
99
Os resultados mostraram a viabilidade da técnica para a aquicultura, no entanto
há a necessidade de ampliar as pesquisas visando melhorar a aceitabilidade e entender a
digestibilidade das partículas micro encapsuladas com quitosano. Pesquisas em
diferentes espécies cultivadas, como também a sua interação com fármacos, se fazem
necessárias para avaliar o seu potencial uso na aquicultura, tanto para a alimentação de
espécies aquáticas como para a administração de tratamentos profiláticos através da
encapsulação de ingredientes ativos.
Esperamos que os resultados, sugestões e ideias apresentadas nesta tese, possam
contribuir para pesquisas futuras no que diz respeito à larvicultura de polvos. Assim
outras pesquisas, em cada capítulo aqui apresentado, se fazem necessárias para ampliar
o conhecimento no que diz respeito ao cultivo do O. insularis, assim como também para
entender as transformações que ocorrem na fase plactônica dos polvos, buscando
desenvolver dietas que possam melhorar os baixos índices de sobrevivência atualmente
observados.