Mariana Härter Remião

Mestranda PPGB- UFPEL

Universidade Federal de Pelotas

Centro de Desenvolvimento Tecnológico

Graduação em Biotecnologia

Disciplina de Transgênese Animal

Professor Vinicius Farias Camp0s

Novembro de 2013

Clonagem:

• O termo vem da palavra grega Klón, que significa broto vegetal.

• O termo ‘clone’ foi criado pelo botânico Webber em 1903: uma população de moléculas, células ou organismos originadas de uma matriz comum, sendo estas, idênticas à célula que lhes deu origem.

• Mecanismo de propagação que ocorre naturalmente em plantas e bactérias.

Clonagem em Biotecnologia:

• Clonagem Molecular;

• Clonagem Celular;

• Clonagem de Organismos;

Breve histórico sobre a clonagem:

• Final de 1880 – Hans Driesh (ouriço do mar)

• 1914 - Hans Spemman (Triturus taeniatus)

• 1938 transferiu núcleos de células de gástrulas de salamandra para citoplasma de oócitos enucleados.

• 1952- Robert William Briggs e Thomas Joseph King transferiram núcleos de blástulas de embriões de Rana pipiens em ovos enucleados.

Embriões com anormalidades

• 1962 - John Gurdon : usou células intestinais adultos totalmente diferenciados para clonar rãs Sul-Africanas adultas ( Xenopus laevis);

• 1963 - Tong Dizhou: clonou uma carpa, publicando suas descobertas em uma revista científica chinesa de forma obscura.

• 1981 - Illmenesee & Hoppe: primeiro rato clonado de células de massa celular interna (ICM). Seu trabalho não foi repetido por outros pesquisadores e sofreu ceticismo grave.

• 1983 - McGrath & Solter: demonstraram a viabilidade da troca pronuclear entre zigotos de rato, mostrando também que citoplastos derivados de zigotos em estagio inicial não tinham capacidade para manter o desenvolvimento, os dados confirmaram mais tarde por Prather et al 1987.

• 1984 - "The cloning of mammals, by simple nuclear transfer, is biologically impossible” (Revista Science).

• 1986 – Willadsen: nascimento de descendentes viáveis derivadas de transferência nuclear de blastômeros ovinos em estágio inicial de pré-implantação produzidos in vivo, utilizando oócitos maturados em estágio de metáfase como citoplastos destinatários.

• 1987 - Robl et al : Confirmou a técnica de transferência nuclear em bovinos, demonstrando a reprodutibilidade do processo, quando se utiliza células doadoras totipotentes ou multipotentes.

• 1996 – Campbell et. al.: utilização de células embrionárias cultivadas como doadores nucleares, resultando em prole viva.

• 1997 – Ian Wilmut et. al.: nascimento de ovelha clonada utilizando células somáticas a partir da glândula mamária de uma ovelha de 6 anos de idade como doadora nuclear utilizando o procedimento de transferência nuclear de células somáticas (TNCS).

• 1997 - Ryuzo Yanagimachi et. al.: camundongo;

• 1998 - Cibelli et. al.: bovinos oriundos de fibroblastos fetais;

• 1998 - Kato et. al.: bovinos oriundos de células somáticas adultas.

1998 – 1ª vaca de célula de indivíduo adulto no Instituto de Pesquisa do Gado de Ishikawa.

2002 – A gatinha CC, 10 clone de um animal de estimação. Ela nascera após 188 tentativas na A & M University do Texas.

2000 – 1os suínos clonados de célula somática na Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia (EUA).

2003 – 1º eqüino clonado, a mula Idaho Gem na Universidade de Idaho em Moscou.

2005 – Snuppy, 1º cão clonado na Universidade Nacional de Seul, Coréia do Sul.

2002 – 10 coelho clonado na Agronomy Research Institute na França.

Brasil

2001 – Vitória, clone de embrião, feita pela Embrapa de Brasília. Morreu em 2011.

2002 – Penta, de célula somática de Nelore adulta, na UNESP.

2003 – Lenda, criada na Embrapa Brasília, 1º clone brasileiro de um animal que já havia morrido.

Brasil

2008 – Catarina, primeiro clone de bovino do sul do país, na UDESC, parceria entre UDESC, UFRGS eUSP.

2012 – Brisa, de uma raça bovina em extinção, pelo grupo de pesquisa da UDESC, liderado pelo professor Alceu Mezzalira. Ambas por Handmade.

Brasil

2013 – Labareda, 1º clone de uma fêmea Girolando no Brasil.

2012 - clonagem do cavalo da raça mangalarga Turbante JO, morto em 1998. 1º eqüino clonado no Brasil.

2013 - primeira fêmea registrada da raça Holandesa.

Canadá

2000- Starbuck II clonado de touro já morto, 1º bovino clonado do Canadá, 1º clone canadense de célula somática, feito por brasileiros.

Vilceu Bordignon Lawrence C. Smith

Canadá

2007 – Primeiros clones de suínos do Canadá, pelo professor Vilceu Bordignon.

Clonagem a partir de células somáticas

• Multiplicação de animais de mérito genético superior;

• Multiplicação de animais transgênicos;

• Recuperação de espécies em perigo de extinção;

Humanos...

• Terapia celular e regenerativa;

• Ferramenta para o estudo de função de genes, imprinting genômico,

reprogramação genômica, doenças genéticas, terapia gênica, podendo estas

serem estendidas à compreensão de doenças, disfunções e terapias voltadas

a humanos.

Clonagem em humanos... • 1998 - A empresa americana Advanced Cell Technology dá seu primeiro susto na

comunidade científica ao anunciar que, em 1996, introduzira DNA humano em um óvulo de vaca sem núcleo. O embrião resultante foi destruído.

• 2001 - A Academia Nacional de Ciências dos EUA promove uma audiência com os três mais notórios defensores da clonagem humana para fins reprodutivos: os médicos Severino Antinori e Panos Zavos e a química Brigitte Boisselier, diretora da Clonaid, dizem que o primeiro clone humano não vai demorar muito a nascer.

• A empresa Advanced Cell Technology desencadeia uma gigantesca polêmica ao anunciar que produzira embriões humanos a partir de clonagem. A empresa diz que não tem intenção de usar a técnica para fins reprodutivos e, sim, para cura de doenças.

• 2002 – Uma pesquisadora chinesa respeitada - Lu Guangxiu, Escola de Medicina de Xiangya - diz ter produzido dezenas de embriões humanos por clonagem desde 1999.

• Severino Antinori diz em uma conferência médica que uma mulher estava na oitava semana de gestação de um clone.

• Em uma reação a este anúncio, a empresa Clonaid diz já ter implantado no útero várias mulheres embriões produzidos a partir de clonagem e meses depois anuncia o nascimento - até hoje não comprovado - de uma menina chamada Eva, o primeiro clone humano.

• 2003 - Cientistas da Advanced Cell Technology anunciam que conseguiram repetir a produção de embriões humanos por clonagem e que eles alcançaram o estágio de 16 células.

• 2004 - O especialista em fertilização Panos Zavos anuncia que implantou um embrião humano produzido por clonagem no útero de uma mulher. A experiência não resultou em gravidez.

• Cientistas sul-coreanos anunciam que produziram uma linhagem de células-tronco pluripotentes a partir de dezenas de embriões produzidos a partir de clonagem.

• 2005 - Cientistas da Universidade Nacional de Seul anunciam a obtenção de várias linhagens de células-tronco, a partir de clonagem. As linhagens pertencem a nove pacientes - homens, mulheres e crianças.

Clonagem em humanos...

Procedimentos de clonagem:

• Transferência nuclear de célula somática (TNCS)

• Handmade cloning (HMC)

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

Etapas:

1. Coleta, seleção e maturação dos oócitos;

Oócito imaturo Oócito maturo

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

2. Enucleação ou remoção da cromatina dos oócitos receptores;

a) Remoção das células do cumulus (Hialuronidase);

b) Seleção dos oócitos;

c) Exposição à soluções desestabilizadoras de citoesqueleto (Citocalasina B).

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

3. Preparação das células doadoras de núcleo;

▫ Cultivo de células:

Tipo de célula

Pronase

Tripsina

• Cultivo celular para obtenção de transgênico a partir de TNCS

Animal transgênico doador de células

Células transfectadas no cultivo celular

Transgênico

Não Transgênico

TNCS

TNCS

Em transgênese:

Transfecção de DNA em células • Eletroporação

• Lipofecção

• Vetores virais

• Nanotransfecção

Seleção das células transformadas • Genes de seleção

• PCR

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

4. Transferência das células doadoras de núcleo e fusão destas com

os oócitos receptores;

Transferência da célula para o oócito

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

Fusão:

• Impulsos elétricos;

• Liposomas;

• Etilenoglicol;

• Vírus Sendai inativado.

Eletroporador

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS)

5. Ativação dos oócitos receptores;

• Permitir que os oócitos completem o processo meiótico;

In vivo... In vitro...

Sptz libera sinal para degradação de MPF; Liberação de ondas de cálcio.

Soluções contendo cálcio; Etanol; Ionóforos; Cloreto de estrôncio; Impulsos elétricos; Inibidores de síntese protéica e enzimas quinases.

• 15µM de ionomicina • 10mM de cloreto de estrôncio (SrCl2) • 7,5µg/mL de citocalasina B (CtB), • 10µg/mL de cicloheximida

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Exemplo de protocolo de ativação

Transferência nuclear de célula

somática (TNCS) 6. Cultivo e transferência dos embriões reconstituídos para fêmeas

receptoras.

Handmade cloning (HMC)

1. Coleta, seleção e maturação dos oócitos;

2. Enucleação ou remoção da cromatina dos

oócitos receptores;

3. Preparação das células doadoras de núcleo;

4. Transferência das células doadoras de núcleo

e fusão destas com os oócitos receptores;

5. Ativação dos oócitos receptores;

6. Cultivo e transferência dos embriões

reconstituídos para fêmeas receptoras.

Difere da TNCS

Handmade cloning (HMC)

• Oócitos desnudados;

• Zona pelúcida parcialmente removida (pronase);

Handmade cloning

• Bipartição do oócito maturado;

• Seleção das metades sem a cromatina (corante fluorescente genômico).

• Duas metades de oócitos próximas à célula doadora de núcleo – Fusão;

• Ativação partenogenética, cultivo, e transferência de embrião.

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Handmade cloning

Problemas relacionados à clonagem

• Alta taxa de falhas;

• Saúde frágil e morte prematura;

• Problemas de desenvolvimento;

• Diferenças nos comprimentos dos telômeros;

• Anormalidades genéticas.

Problemas de reprogramação epigenética e ciclo celular

Ciclo celular e clonagem

Coordenação do ciclo celular entre as células

• Evitar incompatibilidade entre núcleo e citoplasma;

• Favorecer a reprogramação dos núcleos.

Fase S

Fase G0 ou G1

Oócito ativado

Oócito em MII

Ciclo celular e clonagem

Benefícios de usar oócitos em MII:

• Aumento do diâmetro nuclear nos embriões reconstruídos;

• Remodelagem de proteínas do envelope nuclear;

• Tempo necessário para modificar a atividade de transcrição e

replicação da cromatina;

• Reprogramação da forma somática da H1.

Reprogramação epigenética

Epigenética: Modificações no genoma que não alteram sequência de DNA, mas sim, atuam mudando a acessibilidade da cromatina para regulação transcricional.

• Metilação do DNA

• Modificação nas histonas

Reprogramação epigenética

• Reconduzir o núcleo da célula somática ao estágio de zigoto – remoção de fatores epigenéticos;

• Histonas H1 – regulação da atividade nuclear;

▫ Ciclo celular e enzimas quinases

Reprogramação epigenética

Estratégias:

Oct4, Sox2, KLF4, e c-myc (OSKM)

Moléculas usadas para Reprogramação

Epigenética

• Proteases;

• Inibidores de metilação de DNA;

• Inibidores de desacetilação de histona;

• Inibidores de histona metiltransferase;

• Inibidores de enzimas quinases.

Efeito da diferenciação e bagagem

genética das células doadoras

Efeito da diferenciação e bagagem

genética das células doadoras

Telômeros

Clones:

• Ovinos – Telômeros mais curtos;

• Bovinos e camundongos – Telômeros restabelecidos ou maiores.

Conclusões e Perspectivas

• Progressos em diversas áreas;

• Redução dos custos de reprodução de animais OGM;

• Baixa eficiência;

• Resultados devem ser mais previsíveis e repetitivos;

• Necessários mais avanços na remodelagem do núcleo.

marri.hr@hotmail.com