Natália M. F. Borges

Orientadora: Prof. Dra. Cíntia Silva Minafra e RezendeComitê de Orientação: Prof. Dra. Iolanda Aparecida Nunes

Prof. Dr. Albenones José de Mesquita

Escola de VeterináriaPrograma de Pós-Graduação em Ciência Animal

Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Aplicação da Biologia Molecular na Microbiologia:

Princípios Básicos

Métodos de Análise

Imagens: wikipedia.com

E. Coli O157:H7 – 23 pessoas infectadas Fingerprint – a mesma cepa identificada em nove estados 41.280 quilos de produtos cárneos da JBS Swift Beef Co. – recall Expandido para 380.000 quilos de carne (28 de junho)

E. Coli O157:H7 – 23 pessoas infectadas Fingerprint – a mesma cepa identificada em nove estados 41.280 quilos de produtos cárneos da JBS Swift Beef Co. – recall Expandido para 380.000 quilos de carne (28 de junho)

O DNA é composto por sub-unidades chamadas nucleotídeos Nucleotídeos: uma base nitrogenada, uma pentose e

um grupo fosfato DNA: dupla-hélice

Duas cadeias de DNA face a face em sentido anti-paralelo

Subtipagem: exame de moléculas que permitem a discriminação abaixo do nível de espécie Ácidos Graxos, Lipídeos, Proteínas e Ácidos Nucléicos

Ácidos Nucléicos: Western Blot

Fingerprinting

RFLP

PFGE

PCR – RAPD, RT, Nested, Multiplex, Real Time

1953Watson e Crick propuseram a

estrutura dedupla-hélice do DNA

1957Arthur Kornberg isolou a

DNA polimerase1958

Matthew Meselson &Franklin Stahl:

Replicaçãosemi-conservativa do

DNAImagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL

1971David Baltimore &

HowardTemin demonstram apresença da RT em

víruscapaz de sintetizar

DNAfda partir de RNAfs

1975Fred Sanger: Seqüenciamento de

DNAbaseado em terminação de

cadeia porincorporação de ddNTPs

1985Kary Mullis: Permite obter (in

vitro)grandes quantidades de uma

sequênciaespecífica de DNAImagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL

1989Descoberta da Taq

polimerasetermoestável no

lagodo “YellowstoneNational Park”

1995Haemophilus influenzae:

primeirogenoma seqüenciado

1998C. elegans: Primeiro genoma

completode um animal

2000Rascunho do Genoma Humano

Imagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL

Vários anos de intenso trabalho experimental para determinar a existência de um “princípio transformante” que era o DNA (SALZANO, 2002).

Desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante propiciou grande avanço nas mais diversas áreas do conhecimento (SCHRANK

et al, 1996). Atualmente, genes podem ser caracterizados

em nível de seqüência e regulação com relativa facilidade (SCHRANK et al, 1996).

Em microbiologia de alimentos, os métodos moleculares têm substituído os métodos fenotípicos como forma de confirmar a proximidade entre cepas envolvidas em um surto (UENO & JORGE, 2002).

Imagens: www.cotuca.unicamp.br e http://origins.swau.edu

O Western Blot é um método semi-quantitativo altamente específico, que é particularmente indicado para análise de proteínas insolúveis (BRETT et al., 1999).

4 etapas principais: Extração das proteínas Separação eletroforética em condições

desnaturantes Eletrotransferência das proteínas Reações imunoquímicas de dectecção de enzimas

(MEYER et al, 1988).

SCHALER et al (1999) documentaram os resultados de vários estudos independentes para detectar a Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE) em bovinos e ovinos.

Proteína protease-resistente do príon PrPSc Análise amostral de bovinos afetados com a

BSE Observaram alta sensibilidade,

especificidade e confiabilidade da técnica.

O “fingerprinting” é um método para caracterização e discriminação de microrganismos de origem alimentar (JAY, 2005).

Cada vez mais utilizado para fazer inferências sobre níveis de variação genética dentro e entre populações naturais (LYNCH, 1990);

Análise de Fragmentos de Restrição de Tamanhos Polimórficos de DNA

Consiste em diferenças herdadas nos tamanhos dos fragmentos de DNA quando ele é digerido com uma endonuclease de restrição O DNA celular é digerido com uma enzima de

restrição, separado por eletroforese e hibridizado por Southern Blot com uma sonda de DNA de um determinado gene do microrganismo em questão (JAY, 2005).

BRODA et al. (1999) avaliaram cepas de referência de clostrídios psicrófilos e psicrotróficos em carnes através da diferenciação por RFLP. Agrupamentos obtidos foram confirmados com o

seqüenciamento do gene 16S rDNA.

Os resultados se tornaram úteis no diagnóstico da causa de deteriorações prematuras de produtos refrigerados, carnes embaladas à vácuo e também no rastreamento de clostrídios deteriorantes nos abatedouros.

Eletroforese em Gel de Campo Pulsado Uma das técnicas mais utilizadas para

análise epidemiológica da maioria das bactérias patogênicas (RODRÍGUEZ-LÁZARO et al,

2007). É um método derivado da eletroforese

convencional do DNA, em gel de agarose, sendo a principal diferença a mudança repetida da orientação do campo elétrico (DESTRO, 1995).

Imagem: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/

Esta mudança provoca o re-arranjo da estrutura conformacional da molécula, permitindo a sua migração no gel (LAI et al,

1989). BARROS (2007) realizou uma

genotipagem de cepas brasileiras de Y. pestis através da PFGE.

A técnica de PFGE revelou-se capaz de diferenciar cepas da bactéria obtidas a partir de diferentes municípios BARROS (2007).

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica altamente sensível, por meio da qual, são obtidas milhões de cópias de seqüências de ácidos nucléicos, através de uma reação enzimática, partir de diminutas quantidades de seqüências de DNA ou de RNA específicas (KONEMAM et al, 2001).

Desenvolvida primeiramente por Kary B. Mullis em 1985, esta técnica permite obter milhões de cópias de um segmento específico de DNA por meio da ação da enzima Taq DNA polimerase e de oligonucleotídeos iniciadores (primers) sobre um DNA molde (KONEMAM et al, 2001).

É realizada em um equipamento automatizado e computadorizado, denominado termociclador, que promove a alternância de temperaturas por determinados períodos de tempo, possibilitando a ocorrência de ciclos repetitivos de desnaturação e síntese do DNA (KONEMAM et al, 2001).

A introdução da PCR, em diagnóstico microbiano, estabeleceu uma alternativa viável aos métodos tradicionais de cultura (MARLONY et al, 2003).

Esta técnica apresenta diversas vantagens em relação aos métodos convencionais, como: Maior poder de tipificação e discriminação Maior rapidez Bom limite de detecção Maior seletividade Especificidade Potencial para automação A possibilidade de trabalhar com bactérias que não são

cultiváveis (BUSH & NITSCHKO, 1999).

A técnica foi se aperfeiçoando ao longo do tempo e hoje existem variações como: RAPD-PCR RT-PCR Nested-PCR Multiplex-PCR Real Time PCR (GANDRA et. al, 2008).

“Random Amplified Polymorphic DNA” Descrita, originalmente, por Welsh e

McClelland em 1990. Primer único e pequeno (usualmente

de 10 a 15 bases), aleatório Amplificação do DNA genômico em

condições de baixa estringência Não sendo necessário o conhecimento

prévio da região de ligação do primer (WELSH & MCCLELLAND, 1990).

Quando submetidos à PCR, estes iniciadores arbitrários resultarão na amplificação de uma ou mais seqüências de DNA

Gerando conjuntos de fragmentos que funcionam como marcadores genéticos

O número e o tamanho destes fragmentos são à base de tipagem de um isolado bacteriano (DESTRO, 1995).

A principal vantagem do RAPD sobre o PCR tradicional é a possibilidade de detectar polimorfismos do DNA sem a necessidade de conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos de um gene relevante ou do DNA alvo (MASLOW et al, 1993).

“Reverse Transcriptase” PCRDesenvolvida para amplificar DNA

obtido por meio da transcrição reversa de RNA

Para isto, primeiramente, o RNA é convertido em DNA complementar (DNAc) pela ação da enzima transcriptase reversa e o DNAc é amplificado por PCR (TANG E PERSING, 1999).

Esta técnica pode ser utilizada na análise de expressão de genes em alimentos

Possui ampla aplicação para o estudo de RNA viral (TANG E PERSING, 1999)

Sendo utilizado para detecção de nanovírus em alimentos (MARIN et al., 2006).

É uma técnica na qual são realizados diversos ciclos de amplificação com um grupo de primers

O produto dessa amplificação é re-amplificado, utilizando-se outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo de primers.

Atualmente, raros são os estudos realizados utilizando esta técnica (KONEMAM et al, 2001).

Outra técnica molecular de interesse para o diagnóstico de microrganismos de importância em alimentos é o multiplex PCR (mPCR)

Utiliza mais de um par de primers na mesma reação, possibilitando a amplificação simultânea de diferentes seqüências de DNA (TANG E

PERSING, 1999).

Vantagens do mPCR, na detecção de patógenos alimentares, em relação a uma reação PCR para apenas uma seqüência alvo (uPCR) de um microrganismo: Diminuição da intensidade e do período

de trabalho laboratorial Redução do número de reagentes Redução dos custos

Desvantagens desta técnica em relação ao uPCR: Redução da sensibilidade de detecção

Imagem: http://eshop.intronbio.com/index.php?var=Good&Good_no=385

Ensaios com mPCR têm sido desenvolvidos para detecção simultânea de Salmonella spp., L. monocytogenes e E. coli O157:H7 em carne de porco, verificando um limite de detecção de uma unidade formadora de colônia por grama de carne (PERRY et al., 2007).

Recentemente, uma inovação tecnológica da PCR, conhecida como Real Time - PCR tornou-se cada vez mais importante na clínica de diagnósticos e laboratórios de pesquisa devido à sua capacidade de gerar resultados quantitativos (MORILLO et al, 2003).

Esta técnica permite que se acompanhe a reação e apresentação de resultados de forma mais rápida e precisa do que o PCR convencional, que exibe apenas os resultados qualitativos (MORILLO et al, 2003).

De acordo com BUSTIN (2002) o PCR em tempo real possui sistema tubular para detectar o acúmulo de produtos de PCR

Composto de um termociclador com câmeras detectoras refrigeradas para detecção de luz fluorescente, em que a ressonância emitida é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência e por sua vez ao número de amplicons produzidos

Gerando uma curva-padrão, associando a ressonância emitida com os produtos amplificados.

Possui ainda sistema informatizado com software que realiza a separação, quantificação e interpretação do espectro gerado, realizando assim a distinção e quantificação de mais de um fluoróforo, que por sua vez permite a detecção de mais de um DNA alvo (BUSTIN, 2002).

Duas tecnologias de PCR, em tempo real, destacam-se atualmente:

SYBR Green Real-Time PCR▪ são utilizados nucleotídios ligados a sondas SYBR

Green para quantificar produtos de PCR

5’-Nuclease Real-time PCR▪ Atividade 5’- 3’ exonucleolítica da enzima

TaqDNAPolimerase▪ A mistura de reação é composta por sondas

fluorogênicas formadas e um elemento que emite ressonância denominado de “quencher” (PERRY et al., 2007).

Vantagens do PCR em tempo real incluem: Facilidade de quantificação Maior sensibilidade, reprodutibilidade e

precisão Rapidez Melhor controle da qualidade no

processo Menor risco de contaminação

Filme: http://www.unl.edu/

A biologia molecular é um campo que ainda está se desenvolvendo em nível de pesquisa e as técnicas têm sido aperfeiçoadas cada vez mais rapidamente, especialmente em microbiologia de alimentos.

O desenvolvimento da técnica de PCR abriu enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas e detecção de agentes infecciosos.

Entretanto, há uma limitação da reação PCR tradicional na característica qualitativa desta técnica, limitando-a para estudos quantitativos.

Foi em função disso desenvolveu-se uma nova metodologia, a de PCR em tempo real, que utiliza sondas químicas fluorescentes, é automatizada e permite o monitoramento em tempo real dos produtos da PCR.

O desafio hoje é tornar as variadas técnicas de biologia molecular, uma alternativa viável à rotina laboratorial, principalmente em relação ao custo e recursos humanos.

Imagem: http://www.asdk12.org