Post on 13-Oct-2018
Técnicas de Imuno-Citoquímica
e Imuno-Histoquímica
Identificação de linfócitos T e B:
Marcadores CD4+, CD8+, IgM e
IgG
Doutoranda: Priscila Diniz Lopes
Prof. Hélio José Montassier
Disciplina: Imunologia Veterinária
Linfócitos T
Seleção e maturação de células T
TCR αβ se transformam em CD4+ ou
CD8+ na medula tímica
T CD4+ virgem : MHC de classe II-
antígenos exógenos
T CD8+ virgem : MHC de classe I –
antígenos endógenos
Linfócitos B
Linfócitos B são ativados pelo antígeno e secretam anticorpos para eliminá-los
Em resposta ao CD40 e às citocinas sofre mudança de isótipo da cadeia pesada, levando a produção de anticorpos com cadeias pesadas de diferentes classes
Citocinas produzidas pelas céls T auxiliares que são ativadas por patógenos regulam a mudança do isótipo
Marcadores
Técnica - definição
Utilização de Acs para detecção do
antígeno distribuído no tecido ou no
compartimento de uma célula
Histoquímica
◦ Corte de tecido congelado ou parafinado
Citoquímica
◦ Esfregaço sanguíneo, aspirados ou suabes
Principais fatores
Qualidade da marcação:
A. Fase pré-analítica (destacando-se
fixação do tecido e processamento);
B. Recuperação antigênica de
epítopos;
C. Sensibilidade do sistema de
detecção.
História
Coons, Creech e Jones em 1941
◦ Conjugaram um anticorpo com um corante
fluorescente.
Novos compostos marcadores como as
enzimas horseradish peroxidase (HRP)
em 1966 e fosfatase alcalina em 1978
Aplicações
Pré-requisitos
Antígeno - Anticorpo
Antígeno: molécula que se une de
maneira específica a um anticorpo
Epítopo: sítios de reconhecimento ou
de ligação
Imunógeno: molécula que pode
desencadear uma reposta
◦ Peptídeos sintéticos
◦ Antígeno purificado
Antígeno - Anticorpo
Anticorpo: molécula proteica que se
liga de maneira específica a uma
substância, o antígeno
Especificidade e afinidade
Soros
Reagente da técnica
Imunização de animais-alvo
Soros policlonais e monoclonais
Soros policlonais
Vários plasmócitos
◦ Reage com diversos epítopos de um
antígeno
Coelho, cabra, porco, equino ou
ovelha
◦ Facilidade na manutenção
◦ Anticorpos de coelhos precipitam com
proteínas de humanos
◦ Pool de anticorpos de diferentes coelhos
10 a 200 µg
Intradérmico ou subcutâneo
Músculo da pata ou cavidade peritoneal
Adjuvante completo ou incompleto de Freund’s
Soros monoclonais
Produto de um único clone de
plasmócitos
Uniforme em estrutura, especificidade e
afinidade
Anticorpos de um clone -
imunoquimicamente idênticos e reagem
com um epítopo específico
Ratos
Produção de soros
monoclonais A. Imunização de um animal
B. Colheita de plasmócitos no baço desse animal.
C. Fusão desses plasmócitos (curto tempo de vida)
com células de mieloma (longo tempo de vida).
D. Colocação individual das células resultantes da
fusão em cultura de modo a poder recolher-se os
anticorpos por elas produzidos.
E. Testes para saber suas características.
F. Manutenção das culturas (clones) que demonstrem
características úteis e destruição das restantes.
G. Recolha sistemática dos anticorpos produzidos
pelo clone que passam a constituir o soro monoclonal
Monoclonais x Policlonais
Imunienzimologia
É o método de imunohistoquímica que
utiliza enzimas como substâncias
propiciadoras da visualização do
antigênio
Métodos Imunohistoquímicos
Métodos diretos
AC primário possui o marcador
Simples, rápido
Pouca ampliação de sinal
Métodos indiretos
Método indireto simples
Anticorpo primário
Anticorpo secundário possui o
marcador
Mais sensível que o método direto,
maior versatilidade, mais econômico
Mais demorado e complexo do que o
direto
Método Peroxidase Anti-Peroxidase
(PAP)
Anticorpo primário e secundário
Complexo Peroxidase Anti-Peroxidase
(PAP)
Mais sensível, menos
marcações inespecíficas
Mais demorado e mais
complexo
Métodos indiretos
Métodos indiretos
Método APAAP (Alkaline phosphatase
anti Alkaline phosphatase)
Método semelhante ao PAP, mas que
utiliza como marcador a fosfatase
alcalina em vez da peroxidase
Imunocitoquimica (eritrócitos)
Métodos de avidina-biotina
Detecta pequenas quantidade de
antígenos
Alta sensibilidade (1 molécula de
anticorpo se liga a 150 moléculas de
biotina )– diminui o “fundo”
Técnica mais rápida
Alta versatilidade
Métodos de avidina-biotina
Avidina-biotina se baseiam em 4 princípios gerais:
A. A extraordinária afinidade existente entre a avidina e a biotina que se ligam formando um complexo praticamente indissociável
B. A possibilidade existente de ligação entre a biotina e outras moléculas, como enzimas e anticorpos (anticorpos biotinilados)
C. Possibilidade de se marcar a avidina com uma variedade de substâncias como enzimas, metais pesados ou fluorocromos
D. Possibilidade de utilização da avidina como ponte entre duas moléculas biotini-ladas (e.g. um anticorpo e uma enzima)
Métodos de avidina-biotina
Técnica streptABC
Anticorpo primário
Anticorpo secundário biotinilado
Aplicação do complexo streptavidina-
biotina (marcado com substância
propiciadora da visualização -
normalmente HRP).
Métodos de avidina-biotina
Técnica LSAB
Anticorpo primário
Anticorpo secundário biotinilado
Aplicação da streptavidina marcada
com substância propiciadora da
visualização (normalmente HRP).
Métodos de polímero
Técnica mais sensível e permite
detectar a quantidade mínima do
antígeno
Não utiliza estreptoavidina e biotina
Simples e rápida execução
Reprodutibilidade
Facilidade da padronização
Métodos de polímero
Polímero de esqueleto interno
Esqueleto central que estão acoplados
anticorpos secundários (20) e moléculas
propiciadoras da visualização (100
moléculas) (Ex: HRP)
Molécula utilizada para a formação do
esqueleto é dextrano (polissacarídeo
hidrofílico)
Métodos de polímero Polímero de esqueleto interno direto
Esqueleto de dextrano
Anticorpo primário e HRP acoplados
Extremamente rápido e fácil, diminuindo
fatores de erros
Pouco poder de amplificação e
relativamente dispendioso e existem
poucos anticorpos primários
comercializados desta forma
Métodos de polímero
Polímero de esqueleto interno indireto
Anticorpo primário
Anticorpos secundários e HPR
acoplados ao polímero
Fácil e rápido, diminui erros,
amplificador de sinais
Relativamente dispendioso
Aspecto prático dos
reagentes Cuidado com material e reagentes
Diluição do anticorpo
Testar diluições diferentes
Pipetagem
Tempo e temperatura de incubação
Higiene e segurança do laboratório
Preparação de amostras
Fixação
Preservação
Estabilização
Proteção
Preparação de amostras
Formaldeído
Econômico, mais utilizado, penetra nos tecidos ◦ Pontes de metileno entre os aminoácidos de
várias proteínas
◦ “Máscarar” antígenos
◦ Algumas alterações estruturais nas biomoléculas, principalmente nas proteínas
◦ Recuperação antigênica
◦ O tempo de espera entre colheita de material e fixação, pH, temperatura, tamanho dos fragmentos a fixar (10*10*3 mm), duração da fixação
Preparação de amostras
Fixação para cortes de criostato
> preservação dos tecidos
Fixadores: álcool, acetona
Microtomia
Cortes finos, sem pregas ou estrias
Não desbastar os cortes entre HE e
IHQ
Recuperação antigênica
Cortes parafinados
Digestão enzimática proteolítica
Recuperação antigênica de origem
térmica por alta temperatura
◦ Forno de micro-ondas, autoclave, panela
de pressão, banho de água quente e vapor
quente
Inibição de partículas
endógenas Peroxidase endógena
Baço, Rins, Fígado, Medula óssea e
em áreas de necrose
◦ Bloqueada por um excesso de substrato (
H2O2) que leva à saturação da atividade
enzimática
Fosfatase alcalina
Rim, fígado e osso
Figura 92 - Receptores de
Estrogênio
Figura 112 - CD3 (negro) e CD20
(castanho) em gânglio linfático