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T&E Analítica 2013
AMOSTRAGEMAMOSTRAGEMIMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
ENCONTRO ABRASP
30 out 2013
T&E Analítica Flávio Leite
Laboratório de Análises Químicas
Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP 13087-548 – BrasilFone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128
teanalitica@teanalitica.com.br www.teanalitica.com.br
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BOCA/ESÔFAGO
ESTÔMAGO
DUODENO
JEJUNOCOLON
TRANSVERSO
COLONASCENDENTE
ÍLEO COLONDESCENDENTE
INTESTINODELGADO
INTESTINOGROSSO
pH= entre 5 - 6pH= jejum alim 4,9 5,2 6,1 5,4 6,3 5,1 6,4Médio e Distal pH= jejum alim
4,,4 - 6,5 5,2 - 6,0 6,6 6,2
pH= jejum alim 6,5 6,8 - 7,8
6,8 - 8,0 6,8 - 8,0 7,4 7,5
pH= entre 1 - 3,5
Apr
oxim
adam
ente
6 m
etro
s de
com
prim
ento
MEIOS SISTÊMICOS BIOLÓGICO – pHs – via oral
Ref.: Michael E.AultoN 2ª EDIÇÃO DELINEAENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS
Temperatura 37ªC
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É quando um composto sofre alteração estrutural para compostos menores ou maiores, mais estáveis em determinada condição de temperatura e pressão.:
REAÇÕES DE DECOMPOSIÇÃO (Análise)
Quando um composto exposto de forma natural a condições como: calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade
REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO
Quando um composto é exposto de forma forçada a condições como: calor, radiação, umidade, acidez/alcalinidade
DECOMPOSIÇÃO E DEGRADAÇÃO
PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO
A espécie final formada, pode ser produto de várias reações. A espécie estável final está em função do conjunto de energias aplicadas.
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IMPUREZAS DA ROTA QUÍMICA OU IMPUREZAS RELATADASResíduos de solventes utilizados na fabricação e presença de metais/semi/ametais. Produtos de reações secundárias. Impurezas intrínsecas à matéria-prima.
IMPUREZAS
IMPUREZAS DE DECOMPOSIÇÃOGeradas pela instabilidade natural do compostos. Geradas, após a composição earmazenamento do produto final (contato embalagem, contato insumos, temperaturade armazenamento). Geradas nos meios sistêmicos do organismo biológico.
IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃOGeradas após exposição em situação de estresse.
ENSAIO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA
Elaborado para o estudo de NOVOS FÁRMACOS E ESTABILIDADE
Pesquisa: Interferência de Potência e ou natureza genotóxicas.
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ANVISA OBJETO LOCALIZADORESPÉCIE DE ESTRESSSE
Lim: Not-Id-QtICH (10-30%)
INTENSIDADE ESTRESSANTE "IN VIVO"
RE 899, de 29/05/2003
Validação de Métodos
Item2- Especificidade e
Seletividade - 2.1.2
Não define Não traz no corpo da norma
Não define Não define
IT 1 de 15/07/2008
Esclarecimento da RE 1 de 29/07/2005
Toda a IT 1 temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise e Ions Metálicos
Traz no corpo da IT
60°C;75%UR; HCl e NaOH 0,1N;
H2O2 3% ; UV-B; Fe2 ou Cu2
0,05M
Não define
C P 11, de 23/01/2012
Impurezas Degradação
Toda a CP 11 temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise e Ions Metálicos
Traz no corpo da CP
Não define Art.8 §5 Toxici e Genotoxi
RDC 45 de 09/08/2012
Estabilidade de Insumos Farmacêuticos
Seção VIII art.36-39
temperatura/umidade/ oxidação/luz/hidrólise
Não traz no corpo da norma
Não define Não define
IMPUREZAS – PUBLICAÇÕES ANVISA
ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Requisitos para IMPUREZAS EM NOVOS MEDICAMENTOS - várias públicações: QA/QB/QC/QD e Guide Lines
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ICH - IMPURITIES IN NEW DRUGSUBSTANCES – Q3A(R2) oct/2006
Notificação – Identificação - Qualificação
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ICH- ÁRVORE PARA IDENTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO - Q3A(R2) oct/2006 New Drugs Products - NOVOS MEDICAMENTOS
É impureza com limite superior de Identificação
Sem ação
Sem ação
EstruturaIdentificada?
Reduzir para não mais que
o limite deIdentificação?
Sem novasmedidas
Algum conhecimentode risco relevante ao ser humano?
Reduzir Limitede segurança
Reduzir para não maisque o limite deQualificação?
Maior que o limite de
Qualificação?
Considere a população de pacientes e duração de uso e considerar a realização de: a) Os estudos de genotoxicidade (mutação de ponto, aberração cromossômica)b) Estudos toxicidades gerais (uma espécie, geralmente
14 a 90 dias)c) Outros parâmetros de toxicidades específicas. (conforme o caso).
Algum efeitoadverso clínicorelevante?
Reduzir Limitede segurança
Qualificado
sim
não
sim
sim
sim
sim
sim
sim
não
não
nãonão
não
não
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USO DE ESTRESSANTES PELA CP 11
ESTRESSAR:- Matéria prima do ATIVO que compõe o formulado- Placebo do formulado- Produto formulado ou acabado
ESTRESSANTES:
1- Aquecimento2- Umidade3- Solução Ácida4- Solução Básica5- Solução Oxidante6- Exposição Fotolítica7- Ions metálicos
DEFINIÇÃO PARA O STRESS:
Degradar de 10 a 30% do ATIVO
Dificuldades:- Parar a reação e manter o equilíbrio- Isolar a impureza- Quantificar/Identificar a impureza - Genotoxi (principalmente pela qdade)
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∆H
ENERGIA DE ATIVAÇÃOLuminosidade/Ausência de LuzResfriamento-AquecimentoMetais ou sais – Ácidos-BasesOxigênio / EnzimasHidratação/DesidrataçãoReações secundáriasRadiação Ionizante e N.IonizanteOutras possíveis Caminho da reação
Caminho da reação
ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Toda reação química para acontecernecessita de energia. Esta energia edenominada ENERGIA DE ATIVAÇÃO
Caminho da reação
Reag Prod
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REAÇÕES QUÍMICAS
ESCALA MACRO São reações que ocorrem em previsão para concentrações acima de 1% em massa ou volume.
H+
Ácido Oleico (c/impurezas) + Metanol (c/impurezas) Oleato de Metila + Água + impurezas (a.palmítico, (etanol, (palmitado e esteárico, formol, estearato/ C4,C6, etc) a.fórmico,etc metila e etila)
ESCALA MICRO São reações que ocorrem de forma secundária e nem sempre previstas dentro dos parâmetros teóricos da química reacional. Material orgânico em decomposição + cloro CH4 + Cl2 várias possibilidades
IMPUREZA DE DECOMPOSIÇÃO/DEGRADAÇÃO Podem ocorrer na escala MACRO como na escala MICRO, sendo a escala MICRO a mais complexa para identificação e quantificação.
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REAÇÕES E MECANISMOS DAS REAÇÕES
Mecanismos: - homolítico, heterolítico, pericíclico[ - nucleófilo, eletròfilo
Reações: - adição, substituição, eliminação - salificação, esterificação, - oxidação branda, exaustiva e combustão - redução , polimerizaçãoFormação de Cadeias Carbônicas:
- normal e ramificada - aromática - cíclica normal e ramificada- alicíclica normal e ramificada- alquil /aromática/ciclica/alicíclica
Considerando as moléculas da Farmacêutica, para alterar o equilíbrio do meio a a seguinte matriz deve ser olhada para o interferente e produto:
Fator 1- Concentração (quanto menor , maior deve ser Fator 2 e ou Fator 3)
Fator 2-Tempo de contato
Fator 3 - Energia aplicada (agitação, temperatura, radiação, etc)
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0,01
1
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3,
0
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5 100 30 20 15 10 5 2
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1 2 3 4 5 6 7 8 10
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AÇÃO DE ESTRESSANTE ÚNICO E COMBINADO - Previsão
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Considerando o Produto acrescido de Estressante
1 - Pode resultar em precipitações ou solubilizações na solução do produto,
2 - Pode ocorrer polimerizações,
3 - Pode alterar as estruturas e não “aparecerem” na condição analítica (principalmente nas reações com NaOH e HCl),
4 - Pode ocorrer alteração de cor, que dificultará a análise na condição analítica,
5 - Extração com solvente, pode-se supor que a impureza não seja extratível e ou ainda gerar IOV,
6 - Interações do tipo excipiente-excipiente ; ativo-excipiente ; embalagem
7- Reações conhecidas da química, como oxidação de aldeídos a alcoóis, hidrólise de ésteres, adições, quebras, etc
PREVISÕES DE REAÇÕES DE DEGRADAÇÃO
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IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO PARA METAIS, SEMI-METAIS E AMETAIS
Em casos que a alteração do número de oxidação é de fundamental importância na aplicação.
Exemplo 1: o antimônio utilizado no tratamento da “úlcera de Bauru”, no qual a mudança do número de oxidação do antimônio resultada em dor elevada quando ministrado na formainjetável muscular. Exemplo 2: aplicação sobre complexos metálicos, na relação: quelato / não quelato
ANÁLISE DE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO POR OUTRAS TÉCNICAS
Nem todas as técnicas permitem análise de impurezas de degradação
Exemplo 1: Volumetria, colorimetria, potenciometria, absorção a luz ultravioleta e visível, infravermelho, etc..Exemplo 2: Compostos que possuem sua quantificação por métodos microbiológicos,
SOBRE IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Técnicas separativas: HPLC e CFG em seus detectores
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Agentes estressantes
Área=1000
LB
Área=700
Área= 300
Área= 650
Área= 1000
Área=1200LC-UV/VisGC-FIDMat.prima ou
Placebo ouFormulado
Sistema Físico de Separação – ALTERAÇÃO DO SINAL
Submeter um produto a estressantes pode alterar o sinal analítico da espécie emanálise para aquele sistema de detecção.
As alterações podem resultar em diferentes interpretações. As justificativas podemser dirigidas para fenômenos Químicos e ou Físicos.
Área= 700
Não visívelaquele detectpr
ANÁLISECondição Analítica : análise sem validaçãoMétodo: análise com validação
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Placebo
Prod.Acabado
Prod.Acabado+Es
Estressante
M.Prima
M.prima+Es
Placebo+Es
LB
LB
LB
LB
LB
LB
LB
Para as análises no estudo de ID o cuidado com o equipamento é importante,não apenas aos danos materiais, mas às falsas interpretações de resultados.
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IMPUREZAS DE DEGRADAÇÃO
Duas situações são colocadas para as ImpurezasPRESENTES ou INDUZIDAS em um fármaco
ANALISANDO COM O MÉTODO/CONDIÇÃO ANALÍTICA (CA) :
Situação 1- a Cond.Analítica utilizada VISUALIZA a impureza gerada pelo estresse. Situação 2- a Cond.Analítica utilizada NÃO VISUALIZA a impureza gerada pelo estresse.
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O MÉTODO NÃO VISUALIZA:
Utilizando-se deste método sobre as amostras colocadas sob os efeitos de energia (stress) poderão resultar em espécies que não sejam absorvidas pela LUZ ULTRAVIOLETA, destaforma, o sinal analítico não será percebido e não se pode deduzir que houve impureza.
SITUAÇÃO – 2 – NÃO VISUALIZA
Considerando técnicas separativas: CFG; HPLC, etc
Absorve no UV Absorve no UV NÃO Absorve no UV
Qual direção analítica utilizar? Quantos métodos serâo necessários?
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SISTEMAS DE EXTRAÇÃO/CONCENTRAÇÃO
SPME = Solid Phase Micro Extraction
“Sobre” agulha
Resina Polar; Apolar/Interm. CFG
Líquido
SPE = Solid Phase Extraction
Mistura Líquida
Adsorvente
Demais Componentes
-Analito fica retido -É extraído com solvente em função da polaridade
Extração Líquido/LíquidoExtração Líquido/Vapor)Extração Contra Corrente Extração por Ppdades Coligativas
Cromatografia PreparativaCromatografia de Camada DelgadaCromatografia de Coluna SPE - SPME - SBE
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CC e CCD (TLC)
Cromatografia de Camada Delgada
Cromatografia de Coluna
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HPLC PREPARATIVA
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DE FORMA BEM SIMPLIFICADAESPECTROMETRIA DE MASSAS - Determina fragmentos e Peso MolecularINFRA VERMELHO - Determina grupos funcionais RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR - Determina posições na Cadeia CarbônicaABSORÇÃO AO ULTRA-VIOLETA - Determina a presença de insaturaçõesCC e CCD - Determinações da Química ClássicaICP (Inductively Coupled Plasma) - Determina metais/ametais/semi-metaisACOPLAMENTOS - LC/MS; LC/MSMS; GC/MS ; MIC/IV; LC/TOF; LC/PDA
F-X (Fluorescência X) - Determina metais/semi-metaisRAIO-X - DIFRAÇÃO - Determina Polimorfismo/Estrutura cristlinaMICROSCOPIA - Determina: Polimosfismo/Tamanho de PartículaMEV/EDS - Determina análise elementar ANÁLISE ELEMENTAR (CHNSO) - Determina a composição CentesimalABSORÇÃO AO VISÍVEL - Determina a presença de cromóforosCOLORIMETRIA - Determinações da Química ClássicaAED (Detector de Emissão Atômica) - Determina composição centesimalANÁLISE TÉRMICA ATD/ATG - DSC - Determina decomposição da molécula; polimorfismo
ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA
Caso um proposta é obtida: o nome atribuído a impureza pode não ser comparado aos nomes existentes no mercado. (se houver)
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ENSAIOS FARMACÊUTICOS PARA TOXICIDADE GENÉTICA
ANVISA : - RE 90- de 16 de março de 2004: “Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos” - Ofício Circular no 002/2009/GGTOX) Gerência Geral de Toxicologia Brasília 08/09/2009
- GUIA PARA A CONDUÇÃO DE ESTUDOS NÃO CLÍNICOS DE SEGURANÇA NECESSÁRIOS AO DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTOS - Gerência de Avaliação de Segurança e Eficácia - GESEF
Neles incluem-se: - toxicidade aguda - toxicidade de doses repetidas (longa duração) - estudo especial - Genotoxicidade
Aqui Apresentados:
1- TOXICIDADE : Daphnia 2- TOXICIDADE : DL 50 e CL 503- MUTAGENICIDADE : Ensaio de AMES4- MUTAGENICIDADE : Ensaio Micronúcleo
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1- O ensaio de toxicidade só é possível com o isolamento da(s) espécie(s), o que é complexo, para ter massa suficiente para a identificação/quantificação e suficiente para toxicidade.
Obs.: Uma substância testada em toxicidade isolada, pode não ser tóxica quando no formulado
TOXICIDADE/GENOTOXICIDADE
Genotoxicidade não e uma medida de Carcinogenicidade (Indicador para o câncer)
Mutagenicidade mede evento inicial ou intermediário do processo de tumorigenese
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O ensaio consiste básicamente na exposição do microcrustáceo de água doce Daphnia magna em diferentes condições, visando assim a detectar seus efeitos letais e/ou subletais em estudos de avaliação de toxicidade
TOXICIDADE AGUDA POR DAPHNIA
O Ensaio:- para cada concentração observa-se a imobilidade e/ou a mortalidade dos indivíduos após o
período de exposição de 24 e 48 horas, encerrando o teste após 48 horas.
Resultados:Porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade / quantidade de indivíduos no início do ensaio
Quanto maior a porcentagem de imobilidade e/ou a mortalidade dos indíviduos no tempo do ensaio, maior a toxicidade
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A morte é universal: Todas as drogas são capazes de causar a morte. A dose que causa a morte em 50% dos animais testados em determinado período de tempo é denominada de dose letal mediana (DL50). A relação entre esta dose e a dose efetiva mediana (DL50/DE50) define o índice terapêutico (IT).
TOXICIDADE - DL 50 ( Dose Letal Média)
Algumas substâncias já possuem literatura quanto a degradação e toxicidade destas impurezas. O ácido ascórbico tem sua degradação em 10% em massa inicial da seguinte forma:
Vamos parar de consumir laranja, acerola, entre outras fontes da Vit C? ?
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O ensaio de AMES , determina mutagenicidade utilizando de Cepas (estirpes) Salmonella typhimurium. O ensaio mede a indução de mutações reversas em cepas
auxotróficas (His-) para o aminoácido Histidina que revertem as mesmas à prototrofia (His+) (selvagem).
MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE AMES
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O teste do micronúcleo, sendo um teste citogenético, consiste na investigação de células previamente expostas a agentes químicos,
com a finalidade de detectar possíveis aberrações cromossômicas.
O teste baseia-se num aumento da freqüência de eritrócitos policromáticos com micronúcleos, utilizando-se para isso, preferencialmente, células de mamíferos (medula óssea ou sangue periférico de animais devidamente tratados. (camundongos machos e jovens).
Grupos de controle e experimental são distribuídos aleatoriamente, e dividem-se em: grupo controle negativo, grupo-controle positivo (administra-se substância reconhecidamente indutora de mutagênese p.ex
ciclofosfamida 50mg/Kg) e grupo-teste (administra-se a substância teste ).
Quantidade de coletas em tempos máximos determinados, devem ser rigorosamente observados. Os micronúcleos normalmente são visualizados usando-se de diferentes técnicas, entre elas a coloração de Giemsa ou a Fluorescência . A quantificação é por microscopia.
MUTAGENICIDADE - ENSAIO DE MICRONUCLEO
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ETAPA 1A- BUSCA DA IMPUREZA DE DEGRADAÇÃO CONSIDERANDOENSAIOS TÉCNICA PERTINENTE
(LC-DAD, HPLC-UV/Vis , CFG ou GC/MS)MP Ativo
Tfinal
PLACEBO Tfinal
FORMULADO Tfinal
BRANCO Stressante
Teor Ativo (dupl) ANTES colocar as quantidades (tzero ) *Teor impurezas conhecidas antes Teor do ativo+Imp LUZ - FINAL de cada dia Teor do ativo+Imp UMIDADE - FINAL de cada dia Teor do ativo+Imp-TEMPERATURA - FINAL de cada dia (60oC) Teor do ativo+Imp-OXIDAÇÃO - FINAL 2 conc de cada dia Teor do ativo+Imp-HIDRO ÁCIDA- FINAL 2 conc de cada dia Teor do ativo+Imp- HIDRO BÁSICA- FINAL 2 conc de cada dia Teor ativo+Imp OXIREDUÇÃO-FINAL,2 conc,2 reagde cada dia Quantificação NOVAS Imp Fator Resposta Ativo ou Área%
Incremento de análises diárias (1 a 20 dias)
TOTAL ANÁLISES=
MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO CP - 11
Prazo: 10 a 20 dias
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ETAPA 2- ISOLAMENTO IMPUREZAENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas Impureza por TLC, CC ou LC/Prep
ETAPA 3- PROPOSTA DE IDENTIFICAÇÃO DA IMPUREZAENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas Impureza por DAD/MS/IV
ETAPA 4- QUANTIFICAÇÃO FATOR RESPOSTA IMPUREZAENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de impurezas Impureza por LC ou GC
ETAPA 5- GENOTOXICIDADEENSAIOS PROVÁVEIS
Quantidade de Impurezas DL 50 Daphineas AMES Micronuclideo Outros métodos
Prazo: 20 a 50 dias
Prazo: 10 a 30 dias
Prazo: 5 a 15 dias
Prazo: 3 a 12 meses
MODELO DE PROTOCOLO PARA IMPUREZAS DEGRADAÇÃO CP 11
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PRINCIPAIS REFERÊNCIAS
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OBRIGADO
Rua Lauro Vannucci 1260 – Jardim Santa Cândida – Campinas – SP - CEP 13087-548 – BrasilFone: (19) 3756 – 6600 Fax: 3296 0128 www.teanalitica.com.br