Post on 01-Nov-2020
Escolha de iniciadores
Cairé Barreto
2017
• A replicação do DNA precisa de iniciadores para acontecer (PRIMASE)• A DNA polimerase replica o DNA a partir de uma fita pré-existente (5’ -> 3”).• Pequenos segmentos de RNA “orientam” a DNA polimerase III.
Escolha de iniciadores
• PCR: replicação in vitro de segmentos de DNA desejados.• Como dar início à síntese do segmento de DNA de interesse em um tubo?
• A enzima primase é adicionada à reação dentro do tubo?
Escolha de iniciadores
• PCR: replicação in vitro de segmentos de DNA desejados.• Como dar início à síntese do segmento de DNA de interesse em um tubo?
• A enzima primase é adicionada à reação dentro do tubo?
Escolha de iniciadores
DNA polimerase IRibonucleotídeos Tampões DNA primase Ribonuclease
• PCR: replicação in vitro de segmentos de DNA desejados.• Como dar início à síntese do segmento de DNA de interesse em um tubo?
• A enzima primase é adicionada à reação dentro do tubo?
Escolha de iniciadores
Escolha de iniciadores
Fonte: https://www.ted.com/speakers/kary_mullis
Kary B. Mullis
• Primers de DNA flanqueiam a região de interesse e demarcam o “amplicon”.• Amplificação específica!
Fonte: Biologia Molecular da Célula, 5ª Edição.
• Pequenos segmentos sintéticos feitos de ssDNA!
Escolha de iniciadores
A T C G
P P P P P P P P
P OH
5’ 3’
A C G T T
• Pequenos segmentos sintéticos feitos de ssDNA!• Oligonucleotídeos (oligos: poucos): usualmente entre 18 e 23 nucleotídeos.
• Maior estabilidade térmica.
• Simplificação do processo de replicação in vitro.
Escolha de iniciadores
Escolha de iniciadores
Escolha de iniciadores
Tá, mas de onde é que vêm esses “oligonucleotídeos” de DNA?
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
Escolha de iniciadores
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
Escolha de iniciadores
A T C G 25°C
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
Escolha de iniciadores
A T C G 95°C
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
Escolha de iniciadores
A T C G
3’ 5’
5’ 3’
3’
3’
5’
5’
60°C
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
Escolha de iniciadores
3’ 5’
3’5’
5’ 3’3’ 5’
A T C G 60°C
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
Escolha de iniciadores
3’ 5’
3’5’
3’ 5’
5’ 3’
A T C G 60°C
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
• Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada.
Escolha de iniciadores
DNA complementar (cDNA)
Álcool Desidrogenase (ADH)
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
• Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada.
Escolha de iniciadores
Álcool Desidrogenase (ADH)
DNA complementar (cDNA)
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
• Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada.
Escolha de iniciadores
Álcool Desidrogenase (ADH)
DNA complementar (cDNA)
• Os iniciadores são “desenhados” por nós, pesquisadores!• A sequência dos iniciadores é escolhida de acordo com o segmento de DNA de
interesse.
• Os iniciadores definem qual a região do DNA que será amplificada.
Escolha de iniciadores
Álcool Desidrogenase (ADH)
DNA complementar (cDNA)
• Como escolhê-los?
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
• Como escolhê-los?
• Como escolhê-los?
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
TAGATCTCGATCGTTCGA
• Como escolhê-los?
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
TAGATCTCGATCGTTCGA5’ 3’
TATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
Forward ou Primer “Senso”
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
• Como escolhê-los?
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
• Os iniciadores são sempre específicos?
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
CGGATATGCTAGCTAGAT5’ 3’
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
Escolha de iniciadores
• Como escolhê-los?
Escolha de iniciadores
ACTGATCTAGAGCTAGCAAGCTATATAGGCGGATATGCTAGCTAGATTGCAGTGCATGCATGCTA
TGACTAGATCTCGATCGTTCGATATATCCGCCTATACGATCGATCTAACGTCACGTACGTACGAT
3’ 5’
3’5’
CGGATATGCTAGCTAGAT3’ 5’
ORIENTAÇÃO DOS INICIADORES: 5’ -> 3’
TAGATCGATCGTATAGGC5’ 3’
COMPLEMENTAR REBATIDO (“Reverse Complement”)
Reverse ou Primer “Antissenso”
Escolha de iniciadores
MAS POR QUE TODA ESSA TRABALHEIRA, MEU
DEUS?
Escolha de iniciadores
As sequências depositadas nos bancos de dados são referentes a
uma única fita da dupla hélice!
• Os iniciadores devem estar posicionados em sentidos opostos.• Flanqueamento do segmento de interesse!
Escolha de iniciadores
COMO DESENHAR INICIADORES?
Escolha de iniciadores
• Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt)
• Temperatura de melting (Tm):∼ 60°C• Temperatura de anelamento (Ta)
• Conteúdo CG
Escolha de iniciadores
Escolha de iniciadores
Forward
Reverse
ATCGCTATCGGATCGATAGC5’ 3’
CTATCGGCTTAGCATGCTAATC5’3’
• Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt)
• Temperatura de melting (Tm):∼ 60°C• Temperatura de anelamento (Ta)
• Conteúdo CG
• Formação de dímeros
Escolha de iniciadores
ATCGCTATCGGATCGATAGC5’ 3’
CTATCGGCTTAGCATGCTAATC5’3’
......
• Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt)
• Temperatura de melting (Tm):∼ 60°C• Temperatura de anelamento (Ta)
• Conteúdo CG
• Formação de dímeros
Escolha de iniciadores
5’ 3’
5’3’
5’ 3’
5’3’
• Tamanho dos iniciadores (18 a 23 nt)
• Temperatura de melting (Tm):∼ 60°C• Temperatura de anelamento (Ta)
• Conteúdo CG
• Formação de dímeros
Escolha de iniciadores
Será que toda PCR funciona?
Escolha de iniciadores
ÀS VEZES DÁ PROBLEMA!
Como identificar erros de reação
M A1 A2 A3 A4
Quais os erros?
C -
Como identificar erros de reação
Quais os erros?
Como identificar erros de reação
M A1 A2 A3 A4 C -