Bio Reactores

Biorreatores e Processos Fermentativos

Aula 4 – Profa. Dra Ilana L. B. C. CamargoCiências Físicas e Biomoleculares

IFSC - USP

Processo “Upstream”

Biorreatores e biorreação

Processo “Downstream”

Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios:

Parte I

Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas

mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas ou

microrganismos, ou enzimas sobre condições controladas para a

biotransformação de matérias primas em produtos.

Produto – alimento, medicamento ou composto industrial

Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto

direto – biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes

com ou sem subproduto ou derivados

Escala laboratorial Escala industrial

Estágios do processo produtivo

Biorreatores, reatores bioquímicos, reatores biológicos são os

reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações

químicas catalisadas por biocatalisadores

Enzimas Células vivas

Reatores enzimáticos Biorreatores

Reatores bioquímicos Reatores Biológicos

Biorreatores

Sistema não asséptico – onde não é absolutamente necessário

se operar com culturas inteiramente puras (sistemas de

descarte de efluentes);

Sistema asséptico – onde as condições de assepsia são pré-

requisitos para a formação do produto com sucesso;

Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de contaminações!!

Antigamente, a maceração das uvas era feita com os pés!!

Produção caseira dos vinhos

http://www.viagemesabor.com.br/noticias/roteiros/br /norte/para/marajo

Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de c ontaminações!!

Queijo de leite de búfala

Tanque de maceração das uvasProdução de vinhos

(Hoje: prensa hidráulica)

Quanto mais controle se tem sobre o processo de fer mentação, maior é a facilidade em se manter a qualidade e garantir a re produção do processo.

Produção artesanal de queijo, vinho, vinagre, iogur te e cerveja, muitas vezes eram processadas satisfatoriamente, mesmo sob condições

precárias de assepsia

Dióxido de enxofre (conservante)

Hoje: prensa hidráulica

Maceração das uvas

Biorreator ou fermentador

Biorreator ou fermentadorVariação em forma e tamanho dependendo da aplicação

O design do biorreator depende de um número de fato res que incluem:

-Tipo de células-Tipo de reação metabólica-Informação sobre a transferência de massa e calor-Viscosidade e homogeneização

Tamanhos:

-Frascos agitados (erlenmeyers): 100 – 1.000 mL-Fermentadores de bancada: 1 L – 30L-Fermentadores piloto: 100 – 1.000 L-Fermentadores industriais: 1.000 – 1.000.000 L

Também podem ser bandejas, garrafas (fermentação só lida), colunas (imobilização células ou enzimas)

Biorreator de bancada

http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

Escala laboratorial~1L



1943 – EUA, Primeira planta industrial de fermentaçã o para produção de

penicilina em fermentadores de aço-carbono de 54 m 3

•Reatores em aço-carbono

•Sistemas de agitação e aeração

•Fundo e tampa torriesféricosesterilizáveis

•Entrada para a adição de inóculo

•Antiespumante

•Coleta de amostras

•Descarga e saída dos gases formados durante a fermentação, etc.


Padrões de materiais usados nos fermentadores sofisticados:

� Todos os materiais que estão em contato com as soluções ou com a

cultura do organismo devem ser resistentes à corrosão para prevenir a

contaminação do processo com traços de metais;

� Não podem ser tóxicos pois se houver alguma dissolução do material

ou componente não haverá inibição do crescimento da cultura;

� Materiais precisam suportar repetidas esterilizações por vapor em alta

pressão;

� O sistema de agitação, portas de entrada e de saída devem ser rígidas

o suficiente para não deformar ou quebrar sob estresse mecânico;

� Inspeção visual do meio e cultura é uma vantagem, por isso deve haver

materiais transparentes quando possível

Biorreator ou fermentadorSistema de agitação

Agitadores: turbinas

Sonda pH

Sonda oxigênio dissolvido

Camisa deresfriamento

Reator agitado mecanicamente(STR: stirred tank reactor)

Estudo atual

Aumento de escala

12 Kg �� 800 Kg

http://www.cetem.gov.br/publicacao/CTs/CT2005-084-00.pdf

Serpentinas

Capacidade dos biorreatores de escala industrial

1- Pequena escala: 1 a 2 m 3 de capacidade – cultivo de microrganismos

patogênicos, ou para crescimento de células animais ou vegetais. Em geral, seu

uso tem como objetivo produtos ligados à área de saúde

2 – Escala intermediária: dezenas de metros cúbicos até 100 a 200 m 3 –

especificamente empregado na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas.

3- Grande escala: reatores com milhares de metros cú bicos de capacidade -

para processos que exigem poucos ou até mesmo nenhum cuidado de assepsia:

fermentação alcoólica ou do tratamento biológico de resíduos

1- O reator deve ser capaz de manter-se estéril por muitos dias, trabalhar sem

problemas por longos períodos e satisfazer todas as exigências legislativas de

contenção ambiental;

2- As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto a aeração e agitação,

devem ser plenamente satisfeitas, mantendo porém a integridade física dos

mesmos;

Para satisfazer a função primária de fermentação, q ue é a de fornecer condições ambientais adequadas ao crescime nto dos

microrganismos, 12 pontos devem ser observados:

6- Um sistema de tomada de amostras à prova de contaminação do conteúdo

do fermentador deve ser parte integrante do equipamento

3- A potência absorvida deve ser a menor possível;

4- Um eficiente sistema de controle de temperatura deve estar disponível;

5- Um sistema de controle de pH deve estar disponível;

7- Perdas por evaporação devem ser mantidas ao mínimo;

8- Eficiente sistema de controle dos gases e saída do fermentador devem estar

disponíveis;



10 – O reator deve preencher, sempre que possível, a característica de multi-

propósito, contudo, a regulamentação de contenção ambiental e a possibilidade de

contaminações cruzadas podem ser fatores limitantes

9 - O reator deve exigir o mínimo em mão-de-obra para sua operação, limpeza e manutenção;

11- O reator deve ter as superfícies internas polidas e todas as suas conexões, na

medida do possível, devem ser soldadas e não rosqueadas;



12- Na medida do possível, o reator deve manter uma geometria similar à dos

reatores menores ou maiores, a fim de facilitar a ampliação de escala do processo.

Fermentação microbiana: um sistema de três fases

1. Fase líquida: contém sais, substratos e metabólitos dissolvidos. Pode também possuir substrato imiscível em água;

2. Fase sólida: consiste nas células, substratos ou produtos insolú veis;

3. Fase gasosa: oxigênio, CO 2

1 - Oxigênio

2 - Temperatura

3 - pH

Fatores importantes:

Entrada de Inóculo

meios/nutrientesanti-espumante

Sistema de aeração

Sistema de colheita

de amostras

Sistema de agitação

Sondas para determinação de

pHpO2

Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial

1- Oxigênio

Processos aeróbios têm destaque na Biotecnologia Industrial, pois

estão envolvidos no cultivo de microrganismo para produção de

antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas

recombinantes (hormônios, insulina), etc.

Processos fermentativos envolvendo cultivo de células aeróbias ou

aeróbias facultativas visando formação de produtos ou tratamento

biológico de águas residuárias têm em comum o aspecto de exigirem

um adequado dimensionamento do sistema de transferê ncia de

oxigênio (fase gasosa �� fase líquida)


1- Oxigênio

(Tortora, Funke & Case, 2000)

Último elemento a aceitar elétrons

Permite:

- Armazenamento de energia – ATP;

- Reoxidação das coenzimas que participam

das reações de desidrogenação.

NADH

NADH

NADH


Diagrams:

Prokaryotic Mariana Ruiz

Binary Fission, JW Schmidt6

Participam das reações de síntese de

moléculas levando à sobrevivência

das células e ao surgimento de novas

células no processo de proliferação da

biomassa microbiana, para a qual a

energia é fundamental.

1- Oxigênio C6H12O6 + 6O2 � 6CO2 + 6H2O

Para a oxidação de 1 mol de glicose, é necessário o consumo de 6 mols de O2

Glicose é bastante solúvel, já O2 é pouco solúvel em água.

A concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da

ordem de 7 mg O2/L (7ppm), ao se borbulhar ar atmosférico à

pressão de 1 atm e a 35oC.

Nada adianta alimentar o biorreator se não houver um ótimo

sistema de transferência de oxigênio

http://www.pptechnologygroup.com/cfd_engineering.htm

- Transferência entre fases gasosa e aquosa;

- Oxigênio dissolvido deve chegar às células;

- Oxigênio deve penetrar nas células;

- Oxigênio deve ser consumido na reação


1- Oxigênio Em reatores não aerados, o oxigênio étransferido do espaço livre acima do líquido.

A agitação quebra continuamente a superfície do líquido e aumenta a área de transferência.

O efeito da velocidade de agitação na entrada do gás em um biorreator de 2 L :

300 rpm 450 rpm 750 rpm


1- Oxigênio Chicanas/BafflesAumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio


Análise computacional de dinâmica de fluxos

1- Oxigênio Chicanas, quebra vórtice ou “baffles”

Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio

Normalmente:

4 chicanas equidistantes

Largura: 10% do diâmetro do reator

Devem ser fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do

fermentador para evitar zonas de estagnação


1- Oxigênio Chicanas afastadas da parede do biorreatorEvita zonas de estagnação


Co

Co 1

t0 t1

Co

Concentração de Oxigênio dissolvida aumenta com a agitação

Concentração de O

2

Tempo

1- Oxigênio

Quando a velocidade de agitação é pequena, as bolhas não serão quebradas tendendo a subir direto para a superfície. Além disso, irão se acumular no eixo do agitador, coalescendo e diminuindo a transferência de oxigênio.

Quando a velocidade de agitação é grande, as bolhas pequenas irão circular por todo o reator e terão o seu tempo de residência aumentado.

Devagar rápida

Injetar ar esterilizado


kLa diminui com o aumento do volume do

líquido

kLa aumenta com a área superficial do

líquido

kLa é maior quando as pequenas chicanas estão

presentes


1- Oxigênio

Métodos para aumentar a taxa de transferência de

oxigênio (kLa) no sistema:

Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (kLa)

no sistema:

-Aumento da pressão;

-Aumento da concentração de O2 no ar inserido no reator;

-Aumento da agitação;

-Aumento do fluxo de ar;

-Redução de espumas e remoção de bolhas de ar da superfície.


Biorreator ou fermentadorSistema de Controle de espuma

Formação excessiva de espuma pode:

1. Bloquear os filtros de saída de ar;2. Aumentar a pressão do biorreator

O controle é feito com a adição de agentes antiespum antes baseados em silicone ou óleos vegetais que desestabilizam a es puma pela redução da tensão superficial.

ON-OFF. Uma parte fica no meio e a outra acima do nível do líquido. Quando a espuma atinge a superfície do sensor que está em cima, existe a produção de uma corrente elétrica que é detectada pelo controlador, resultando na ativação da bomba.

•Meio de fermentação: meios ricos em proteínas tendem a formar mais espuma. Muitas células produzem moléculas tipo detergente (ácidos nucléicos e proteínas excretadas após lise das células ou compostos lipídicos produzidos durante o crescimento);

•Taxa de aeração e velocidade do agitador (↑,↑ formação de espuma);

Fatores que favorecem a formação de espuma:


Sistema de Controle de espuma

Fatores que auxiliam na diminuição da formação da espuma:

• O volume livre no reator: em sistemas nos quais a espuma é formada facilmente, o volume de trabalho deve ser reduzido para facilitar o controle de espuma. Quanto maior o volume livre, maior a probabilidade da espuma colapsar por causa do seu próprio peso;


Sistema de Controle de espuma

• Temperatura do condensador: em reatores de laboratório, uma temperatura mais baixa pode ajudar no controle da espuma. A densidade da espuma aumenta quando ela se move de uma região mais quente para a região fria do condensador, causando o colapso da espuma;

• Quebradores mecânicos de espuma: agitador de alta velocidade. A bolha épuxada para o agitador e colapsa por ação de forças mecânicas. Em pequenos reatores de laboratório são utilizados quebradores ultrasônicos, que geram vibrações de alta frequência responsáveis por quebrar as bolhas da espuma

Fatores que alteram a aeração de uma cultura microbiana

Geometria do biorreator

Wi

Li

DiC

HL

DT

WB

Geralmente cilíndricos. São construídos em dimensões padrão publicadas pela International Standards Organisation e

British Standards Institution.

Reatores do tipo STR, em geral:

-Tanque cilíndrico

-Relação de altura:diâmetro (H:D)

2:1 ou 3:1

Wi

Li

DiC

HL

DT

WB

Di = Diâmetro do impelidor (m)DT = Diâmetro do tanque (m)HL = altura da coluna do líquido (m)C = distância do impelidor ao fundo do reator (m)Wi = altura da pá da turbina (m)WB = altura da chicana (m)

Esquema de tanque agitado por turbinas de pás planas, com indicação de dimensões importantes

na transmissão de potência ao líquido

Máxima potência com mais de um impelidor:

Di < Hi < 2Di

Hi = distância entre impelidores

Número de impelidores para uma máxima transferência de potência

> N˚Impelidores >HL – Di

Di

HL – 2Di

Di


1E/WDistância média entre o impelidor e a saída de gás e

altura da pá

0,25L/DaLargura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor

0,2W/DaAltura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor

~0,08 – 0,1Db/DtDiâmetro das chicanas e diâmetro do tanque

Reatores com turb. Rushton são geralmente 1/3 do diâmetro do tanque. Os de fluxo axial são

maiores

1/3 – 1/2Da/DtDiâmetro do impelidor e diâmetro do tanque

Reatores europeus tendem a ser mais altos que os projetados nos

EUA~ 1 - 2Ht/DtAltura do reator e diâmetro do tanque

Depende do nível de espuma produzido durante a fermentação

~ 0,7 - 0,8Ht/HlAltura do líquido do reator e altura do reator

OBSValoresTípicos

Razão



Fluxos: Axial e Radial


Fluxo axial: o líquido é dirigido para a base do reator, isto é, paralelo ao eixo do agitador. São deficientes em gerar turbulência e quebra das bolhas de ar, o que os tornam indesejáveis para cultivos aerados.

Algumas marcas comerciais:Impelidor Lightnin 320, ImpelidorKPC – KROMA, Impelidor Pitched

Impelidor Lightnin �


No fluxo radial, o líquido é inicialmente dirigido a parede do reator, isto é, ao longo do raio do tanque. Não é tão eficiente quanto o fluxo axial . Maior quantidade de energia é necessária para gerar o mesmo fluxo que o axial;

Algumas marcas comerciais: tipo Arrowhead, de pás curvas, de pás retas verticais, Impelidor Rushton, ImpelidorSmith.

2- Temperatura

A reação que ocorre no biorreator pode ser exotérmica ou endotérmica ,

por isso, os equipamentos deve ser equipados com um sistema de

transferência de temperatura.

- Sistema de circulação de vapor e água quente podem aquecer o sistema

e também pode ser útil para esterilização do biorre ator antes do início do

processo da fermentação;


2- Temperatura

Para o resfriamento de culturas, o

biorreator pode possuir uma camisa ou

serpentina de resfriamento por onde

podem passar água, por exemplo, com

temperaturas menores.


3- pH

No biorreator deve haver um sistema de determinação de pH

assim como uma entrada para balancear a reação com

ácido/base que não ofereça nenhum risco de contaminação

para o sistema.

Temperatura e pH também ficam mais homogêneos com a agitação


Importância da agitação e mistura

Agitação adequada é essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas três fases:

1- Dispersão do ar no meio de cultivo

2- Homogeneização para igualar a temperatura, pH e concentração de nutrientes

3- Suspensão dos microrganismos e dos nutrientes sólidos

4- Dispersão de líquidos imiscíveis

Importância da agitação e mistura

Quanto maior a agitação, melhor será o crescimento?

CUIDADO!!

Agitação excessiva pode romper as células e

aumentar a temperatura o que ocasiona uma

redução na viabilidade celular!!

Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade

de mistura do meio evitando-se o dano celular.

1. Sistema de agitação;

2. Sistema de distribuição de O2;

3. Sistema de controle de espuma;

4. Sistema de controle de temperatura;

Características básicas de biorreatores

5. Sistema de controle de pH;

6. Portas de amostragem;

7. Sistema de limpeza e esterilização;

8. Linhas para esvaziar o biorreator.

Bibliografia

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 8

Smith JE. Biotechnology. 4th ed. Cambridge University Press, 2004. Cap. 4

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